1 Einleitung

Ab den 20er Jahren des letzten Jahrhunderts nahm die Produktion von industriell produzierten Chemikalien drastisch zu. Der Umgang der Menschheit mit diesen Chemikalien war zunaechst sehr sorglos. Dadurch gelangten Unmengen vom Menschen geschaffener Substanzen oder deren Abbauprodukte in die Umwelt und ueber verschiedene Eintragswege in das aquatische System. Als die US Amerikanerin Rachel Carson 1962 zusammen mit ihrer Assistentin Bette Haney das Buch „Silent Spring“ veroeffentlichte, in dem sie den Missbrauch synthetischer Pflanzenschutzmittel vor allem von Dichlordiphenyltrichloraethan (DDT) anprangerte, war dies ein Anstoß in zahlreichen Industriestaaten zur Schaffung von bis zu diesem Zeitpunkt noch nicht vorhandenen Gesetzen zur Handhabung von Pestiziden. So wurde z.B. 1974 das Umweltbundesamt (UBA) in Deutschland gegruendet und zwanzig Jahre nach der Veroeffentlichung des Buches 1982 wurde auf dem "Workshop ueber globalen Pestizidhandel" (Workshop on the global pesticide trade) in Penang/Malaysia das internationale Pesticide Action Network (PAN) gegruendet.

Substanzen, die in die Umwelt eingebracht wurden, gelangten immer mehr in das Bewusstsein der Wissenschaft. Zunaechst befassten sich die meisten Forschungen mit toxischen/letalen Wirkungen von Stoffen auf einen gesunden Organismus. Haeufig standen dabei nur Konzentrationen von Substanzen im Mittelpunkt der Untersuchungen, bei denen 50% der behandelten Tiere starben (lethal concentration 50% (LC₅₀)) um aus den Ergebnissen eine Risikoabschaetzung fuer Chemikalien festzulegen (Lloyd und Tooby, 1979; Bucke und Waterman, 1988). Dies erwies sich aber als nicht ausreichend, da einige Substanzen in weit niedrigeren Konzentrationen das Hormonsystem beeinflussen koennen und somit den Organismus schaedigen ohne eine relevante Toxizitaet auf den Organismus zu besitzen (Colborn und Clement, 1992; Colborn et al., 1993; McLachlan und Arnold, 1996). Auf der EU-Konferenz in Weybridge 1996 definierten dann ueber 70 Vertreter aus Wissenschaft und Umweltorganisationen den Begriff „Endocrine Disruptors“ als: "An endocrine disrupter is a substance or mixture that alters function(s) of the endocrine system and consequently causes adverse health effects in an intact organism, or its progeny, or (sub)populations." Dies bedeutet, dass eine exogene Substanz oder eine Mischung von Stoffen, die die Funktion des endokrinen Systems aendert und infolgedessen gesundheitsschaedigende Wirkung in einem gesundem Organismus, seiner Nachkommenschaft oder einer (Sub)Population hervorruft, als „endocrine disruptor“ (ED) bezeichnet wird.

In den letzten drei Dekaden nahm die Anzahl der Veroeffentlichungen hinsichtlich der Wirkung und der Wirkmechanismen von ED, die in niedrigen Konzentrationen in die Umwelt gelangten, staendig zu. Ein besonderer Focus fiel jetzt auf Substanzen, die das Hormonsystem auf verschiedenen Ebenen beeinflussten ohne eine direkte Toxizitaet zu besitzen. Zunaechst erlangten Stoffe das Interesse der internationalen Forschungsgruppen, von denen man oestrogene oder antioestrogene Wirkungen auf das Hormonsystem vermutete. Hierbei konzentrierten sich die Untersuchungen zunaechst auf den fuer den Menschen unmittelbar relevanten Substanzen und deren Wirkung auf das menschliche Hormonsystem (Colborn et al., 1993). Deshalb scheint es auch nicht weiter verwunderlich, das viele Versuche an Saeugetieren durchgefuehrt und validiert wurden (vom Saal, 1978; Risher et al., 1987). Erst spaeter erkannte man die Notwendigkeit die Forschung auch auf aquatisch lebende Tiere zu erweitern, da ein Großteil dieser Substanzen in die Oberflaechengewaesser gelangte und dort auf das Oekosystem Einfluss nahm. Nur wenige Arbeiten wurden zu aquatisch lebenden Invertebraten erstellt. Hier sind vor allem die Arbeiten der Arbeitsgruppe um Ole Kusk in Daenemark zu erwaehnen, denen es gelang einen Test zur Wirkung von umweltrelevanten Substanzen an verschiedenen Copepoden fuer die OECD zu validieren (Kusk und Wollenberger, 2007) und die Arbeiten der Arbeitsgruppe um Joerg Oehlmann an der Johann-Wolfgang-von-Goethe-Universitaet in Frankfurt am Main, die grundlegende Forschung an der im Sueßwasser lebenden Apfelschnecke (Marisa cornuarietis) als einem Vertreter der Invertebraten im Bereich der ED geleistet haben (Oehlmann et al., 2000; Tillmann et al., 2001; Oehlmann et al., 2006). Die meisten Untersuchungen jedoch wurden an Vertretern der Vertrebraten durchgefuehrt. In der Arbeitsgruppe „ED“ am Leibniz-Institut fuer Gewaesseroekologie und Binnenfischerei in Berlin (IGB) wurde diesbezueglich Grundlagenforschung betrieben und der Suedafrikanische Krallenfrosch, Xenopus laevis, als ein Modell zur Detektierung von endokrin wirksamen Substanzen auf aquatisch lebende Amphibien etabliert (Kloas, 2002). Die meisten Untersuchungen zu ED wurden mit oekotoxikologischen Modellfischen wie dem japanischen Reiskaerpfling (Orizias latipes), dem Zebrabaerbling (Danio rerio) oder der Dickkopfelritze (Pimephales promelas) durchgefuehrt aber kaum mit einheimischen frei lebenden Arten. Eine Ausnahme bilden die Arbeiten von Katsiadaki am dreistachligen Stichling (Gasterosteus aculeatus) (Katsiadaki et al., 2002 & 2006). Aber nur wenige beschaeftigten sich mit der Auswirkung von Chemikalien auf das Geschlechterverhaeltnis, das Hormonsystem, die Reproduktion oder die Population bei endemisch vorkommenden Fischen (van Aerle et al., 2001; Jobling et al., 2002; Liney et al., 2005; Katsu et al., 2007).

Es gibt nur relativ wenige Untersuchungen zu Substanzen, die androgene und/oder antiandrogene Wirkungen aufweisen. Im Rahmen des EU-Forschungsprojektes COMPRENDO wurden ueber 20 Modellorganismen wie Prosobranchier (Vorderkiemerschnecken: Marisa cornuarietis, Potamopyrgus antipodarum, Nassarius reticul a tus), Crustaceen (Krebstiere: Acartia tonsa, Hyalella azteca), Echinodermen (Stachelhaeuter: Antedon medite r ranea, Paracentrotus lividus), Amphibien (Xenopus laevis), Fische (Rutilus rutilus, Pimephales promelas), Voegel (Gallus domesticus) und Saeugetiere (Rattus norvegicus) sowie menschliche Zelllinien mit bis zu 15 Testsubstanzen (Mono-, Di-, Tributylzinn, Triphenylzinn, Fenarimol, Vinclozolin, Linuron, Diuoron, 4,4`-Dichlordiphenyldichlorethylen, Prochloraz, Methyltestosteron, Letrozol, Cyproteronazetat, Flutamid) und nativen Umweltproben als Beispiel fuer komplexe Mischungen mit meist mehreren Testkonzentrationen in dreizehn verschiedenen Laboratorien aus neun europaeischen Laendern exponiert. Endpunkte aus den Bereichen Vitalitaet (Gewicht, Wachstum, Sterblichkeit), Reproduktion (Geschlechterverhaeltnis, Reifegrad der Keimdruesen, Groesse der Sexualdruesen und Geschlechtsorgane, Missbildungen, Vermaennlichung weiblicher Tiere, Spermienbeweglichkeit und -qualitaet, Stoerung der Spermato- und Oogenese, Befruchtungserfolg, Anzahl produzierter Eier/Gelege, Gelegegroeße), Entwicklung (Schlupferfolg, Larvalentwicklung, Regeneration, Zeit bis zur sexuellen Reife) und Physiologie (Sexualsteroid-Konzentrationen, Vitellogenin-Konzentrationen, Enzym-Aktivitaeten, Apoptose, Proteingehalt) wurden, sofern anwendbar, bei allen Testmodellen hinsichtlich adverser Wirkungen dieser potentiellen ED mit androgenen/antiandrogenen Eigenschaften analysiert.

In Zusammenhang mit diesem Projekt bestand die Aufgabe am IGB Methoden zur Detektion von endokrin wirksamen (anti)androgenen Substanzen (AACs) an einem in Europa endemisch vorkommenden Sueßwasserfisch zu erforschen und zu etablieren. Die Wahl fiel auf das ubiquitaer verbreitete und einmal im Jahr laichende Rotauge, Rutilus rutilus.

Hiermit verbunden waren die Entwicklung neuer Untersuchungstechniken und Haelterungsbedingungen, da die hier vorliegende Arbeit sich erstmalig mit der Aufzucht von R. rutilus in einem semistatischen System beschaeftigte. Bei den Endpunktbestimmungen wurde darauf Wert gelegt, dass diese mit den bis dato bekannten Ergebnissen fuer diese Art und der Gruppe der Teleosteer und auch mit dem innerhalb des COMPRENDO-Projektes gewaehlten anderen Modellorganismen und Parametern vergleichbar waren. Die hier vorliegende Arbeit soll somit zu einem besseren Verstaendnis der Wirkungen von AACs auf das Hormonsystem des heimischen Fisches R. rutilus beitragen.

Das Hormonsystem ist ein sehr konservatives System im Tierreich. Es gehoert neben dem Immunsystem und dem Nervensystem zu den wichtigsten Kommunikationssystemen des Koerpers. Es reguliert bei Fischen verschiedene physiologische Vorgaenge wie z.B. Osmoregulation, Ontogenese, Geschlechtsdifferenzierung oder Reproduktion. Die Regulation erfolgt ueber Hormone, die in zwei große Gruppen eingeteilt sind. Die eine Gruppe ist die der lipophilen Hormone, zu denen die Steroide und die Schilddruesenhormone zaehlen, die andere ist die der hydrophilen Hormone, zu denen Catecholamine und Peptidhormone zaehlen. Der groeßte Unterschied zwischen diesen beiden besteht darin, dass hydrophile Hormone Rezeptoren die an der Oberflaeche der Zielzellen lokalisiert sind, binden und dadurch eine Signaltransduktionskette in Gang setzen (Norris, 1997). Lipophile Hormone hingegen vermitteln ihre differenzierte Wirkung auf die Genexpression ueber eine Bindung an intrazellulaere Rezeptoren (Beato et al., 1995). Die meisten der bekannten ED sind in ihrer Wirkung den Sexualsteroiden aehnlich, wirken antagonistisch oder beeinflussen deren Synthese und Bioverfuegbarkeit. Daher soll hier am Beispiel der Bildung und Ausschuettung der Sexualsteroide das komplexe System der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse (HHG) erlaeutert werden.

Die Synthese, der Transport, die Rezeptorbindung und die Wirkung der Sexualsteroide unterliegen einer komplexen hierarchischen Kontrolle (s. Abb.2). Oberstes Zentrum dieses endokrinen Regelkreises ist der Hypothalamus, welcher im Zentralen Nervensystem (ZNS) liegt. Die Zellen des Hypothalamus sezernieren das Gonadotropin-releasing Hormon (GnRH), welches zur Hypophyse gelangt. Dort bewirkt es in den Zellen des Hypophysenvorderlappen (HVL) die Freisetzung der Gonadotropine. Diese sind das Follikel stimulierende Hormon (FSH) und das Luteinisierende Hormon (LH). Bei beiden handelt es sich um glandotrope (Glandula = Druese) Hormone. Das heißt, es handelt sich nicht um Hormone, die direkt auf die Zielzellen einwirken (effektorische Hormone), sondern um Hormone, die ihrerseits auf Hormondruesen wirken wie z. B. die Gonaden (Ovarien und Testes). Die Gonadotropine stimulieren die Bildung von Sexualsteroiden in den Gonaden. In den Ovarien stimulieren sie dort vor allem die Bildung von 17β-Estradiol (E2). Zu diesem Zweck wird das hauptsaechlich in den Thekazellen gebildete Testosteron (T) in die Granulosazellen transportiert, dort durch das Enzym Aromatase (ARO) in E2 umgewandelt, und in den Blutstrom abgegeben, wo 90-95% des E2 zum Transport an das Sexualsteroid bindende Protein (SBP) gebunden werden. Ein erhoehter E2-Spiegel wirkt in negativer Rueckkopplung auf Hypothalamus und Hypophyse zurueck und vermindert dort die Freisetzung von GnRH bzw. FSH und LH. Freies E2 im Blut kann an der Zielzelle aufgrund seiner lipophilen Struktur die Zellmembran passieren und im Cytosol an den Oestrogenrezeptor binden. Dieser Hormon/Rezeptor-Komplex wandert in den Zellkern, wo ein Dimer dieser Komplexe durch Bindung an E2-responsive Elemente (ERE) der DNA die Transkription E2-spezifischer Gene ausloest (Beato et al., 1995). Die Steuerung der Androgenfreisetzung in den Testes der maennlichen Fische wird analog zum weiblichen Organismus durch die beschriebene hierarchische Struktur und die integrierten Feedback-Mechanismen geleistet. Die Gegenwart von FSH und LH fuehrt in den interstitiellen (Leydigschen) Zellen (IZ) der Hoden zur Produktion der Androgene, bei Fischen sind das hauptsaechlich T und 11-Keto-Testosteron (11-KT). Androgene binden an das gleiche SBP wie E2 und die Vermittlung der Wirkung an den Zielzellen ueber cytosolische Androgenrezeptoren und entsprechende DANN-Interaktionen erfolgt analog zu den Oestrogenen. Es ist allerdings auch zu betonen, dass auch Androgene in den Ovarien und Oestrogene in den Testes gebildet werden, welche physiologische Funktionen in der Reifung der Gonaden erfuellen (Schulz und Miura, 2002).

Die schematische Darstellung des Hormonsystems (Abb. 2) zeigt wie komplex die Bildung, Ausschuettung, Bindung und Regulation der Steroidsynthese ist. Daher ist es nicht verwunderlich, dass EDs an verschiedenen Stellen dieser HHG angreifen koennen und den physiologischen Ablauf kurzfristig oder nachhaltig schaedigen koennen. So kann es zum Beispiel (vgl. Abb. 2) zu einer Hemmung der GnRH-Ausschuettung (1) im zentralen Nervensystem (ZNS) kommen (Amano et al., 2007). Die Bildung und/oder Sezenierung der Steroide in den Gonaden koennen behindert werden (2) (Evanson & van der Kraak, 2001; Opitz et al., 2002). Die Bindung an das SBP wird unterbunden (3), indem ED selbst an dieses binden (Kloas et al., 2000) oder es koennen Stoerungen des AR in den Zielzellen durch diese hervorgerufen werden (4) (Bauer et al., 1998; Baatrup & Junge, 2001). Eine Beeinflussung des endokrinen Regelsystem kann z. B. eine anormale Proteinbildung zur Folge haben und zu Auswirkungen bei der Sexualdifferenzierung und Gametogenese fuehren (van Aerle et al., 2001; Vinggaard et al., 2005). Weiterhin koennen Stoerungen der hormonabbauenden Aktivitaeten in der Leber (5) oder der Ausscheidung ueber die Niere (6) auftreten (Gunderson et al., 2001).

Viele ED, die mit dem Hormonsystem von Invertebraten und Vertebraten interagieren, sind synthetische Substanzen (z.B. Medikamente, Duengemittel, Pestizide, Herbizide, Fungizide, Bleichmittel, Weichmacher oder andere industrielle Abfaelle, wie zum Beispiel polychlorierte Kohlenwasserstoffe (PAK) oder polychlorierte Biphenyle (PCBs)). Die meisten dieser Substanzen sind lipophil und wurden vor allem hinsichtlich (anti)oestrogener Wirkungen untersucht. Neuste Untersuchungen deuten darauf hin, dass auch eine potentielle Belastung der Umwelt mit (anti)androgenen Substanzen vorliegen koennte (Christiaens et al., 2005; Urbatzka et al., 2007). Es ist daher von großer Bedeutung, ED mit einer voraussichtlich (anti)androgenen Wirkung auch an einem einheimischen Fisch zu untersuchen. Um umfassende Aussagen ueber den Einfluss von AACs machen zu koennen, war es notwendig Versuche sowohl in vivo als auch in vitro durchzufuehren. In vitro Versuche haben den Vorteil, Wirkungen von AACs ohne die Beeinflussung durch andere moegliche endogene Gegenregulationen aufzeigen zu koennen, doch ist es ebenso wichtig, die Auswirkungen von AACs auf die Fische im Ganzen zu betrachten, da auch unsere Umwelt holistisch betrachtet werden muss. Daher war es wichtig R. rutilus zum einen mit verschiedenen in vitro und in vivo Methoden zu untersuchen, die nach kurzer Zeit Ergebnisse zeigen (z.B. RARA, Enzymassay, RT-PCR), als auch laengerfristige in vivo Expositionen vorzunehmen mit verschiedenen Endpunktbestimmungen (z.B. Mortalitaet, Geschlechterverhaeltnis, Gonadenhistologie, RT-PCR).

Da, wie oben erwaehnt, das Hormonsystem auf diversen Ebenen gestoert werden kann, war es erforderlich auch Untersuchungen auf diesen verschiedenen Ebenen durchzufuehren. Daher sollten die Expression von FSH und LH sowie der ARO im Gehirn und den Gonaden der exponierten Tiere bestimmt werden. Als weitere Biomarker sollten die Expression von AR und ER in der Leber und den Gonaden der Fische bestimmt werden. Fuer diese Untersuchungen sollten im Rahmen der vorliegenden Arbeit die notwendigen Versuchsprotokolle fuer die RT-PCR zum semiquantitativen Nachweis der Genexpression von FSH und LH erstmalig etabliert und validiert werden. Ebenso sollten in Kooperation mit der Universitaet Bonn bestimmte Enzymaktivitaeten analysiert werden, um einen Effekt durch AACs nachweisen zu koennen (z.B. Aromatase und 17ß-Hydroxysteroid-Dehydrogenaseaktivitaet (17ß-HSD)) und die Sexualsteroidbestimmung im Blutplasma bestimmt werden (E2 und 11-KT). Da waehrend der Ontogenese Hormone eine groeßere Bedeutung haben und das Hormonsystem hoechstwahrscheinlich nachhaltiger beeinflussbar ist als in einem ausgewachsenen Tier, wurden zum Nachweis dieser Hypothese Versuche sowohl bei larvalen Fischen als auch bei adulten Fischen durchgefuehrt. Ziel war es hierbei die Wirkungen von AACs auf R. rutilus moeglichst differenziert und auf verschiedenen Wegen zu bestimmen.