2 Material und Methoden

Die Methode des RARA dient dazu die biologische Bindungsaktivitaet verschiedener Hormonrezeptoren mittels radioaktiver markierter Hormone quantitativ zu bestimmen, ohne dass die Markierung die Bindung beeinflusst. Die radioaktive Markierung ermoeglicht die rezeptorgebundenen Liganden zu charakterisieren. Diese quantitative Bestimmung gibt Auskunft ueber das Bindungsverhalten der Rezeptoren gegenueber bestimmten Liganden. Um eine Aussage ueber den zeitlichen Verlauf treffen zu koennen, in dem die Liganden an die Rezeptoren binden, wurden kinetische Experimente durchgefuehrt.

Der zeitliche Verlauf der Ligandenbindung an die Rezeptoren wurde untersucht, indem eine konstante Menge an Hormonrezeptoren mit einer definierten Menge an radioaktiv markierten Liganden ueber verschieden lange Zeitraeume inkubiert wurde. Die spezifisch gebundene Ligandenmenge (SB „specific binding“) wurde aus der Differenz zwischen der Gesamtbindung (TB „total binding“) und der unspezifischen Bindung (NB „nonspecific binding“) errechnet. Bei der TB wurde nur mit radioaktiven Liganden inkubiert, waehrend bei der NB zusaetzlich ein Ueberschuss an unmarkierten Liganden zugegeben wurde. Der Zeitpunkt, an dem sich ein stabiles Gleichgewicht („steady state“) der Ligandenbindung an den Rezeptoren einstellte, also ein Gleichgewicht von Assoziation und Dissoziation, konnte danach anhand der Bindungskurve abgelesen werden.

Um Wechselwirkungen der Rezeptoren mit exogenen Substanzen aufzeigen zu koennen, nutzt man indirekt die Bindung des Radioliganden an die Rezeptoren, indem man im Experiment Rezeptoren und den Radioliganden in fest definierten Konzentrationen und parallel hierzu die Kompetitoren in steigenden Konzentrationen inkubierte. Die fuer jede Konzentration der Kompetitoren gemessene Bindung des Radioliganden wurde in Prozent der spezifischen Bindung des Ausgangwertes ohne Kompetitor (Basis = 100%) in Kompetitionskurven dargestellt. Mittels dieser Kompetitionskurven konnte der IC₅₀-Wert („inhibiting concentration 50 percent) errechnet werden. Hierbei handelt es sich um den Wert, bei dem 50 % des spezifisch gebundenen Radioliganden durch den unmarkierten Kompetitor ersetzt wird. Die Berechnung der IC₅₀-Werte erfolgt ueber die Formel: logit (P) = ln (P/ (1P)). Hierzu wurde die Kompetitionskurve durch eine logit-log-Transformation linearisiert. Somit entspricht P dem prozentualen Anteil der spezifischen Bindung des Ausgangswertes (Basis = 1). Die graphische Darstellung erfolgt in einem logit-log-Plot, wodurch der IC₅₀-Wert bei logit = 0 (P = 0,5) mittels einer linearen Regressionsanalyse bestimmt werden kann.

Tris-HCl-Pufferloesung:

20 mM Tris-HCl (Boehringer; Ingelheim)

250 mM Saccharose (Merck; Darmstadt)

10 mM Na₂-Molybdat (Merck; Darmstadt)

5 mM Dithiothreitol (Boehringer; Ingelheim)

Die Pufferloesung wurde unmittelbar vor jedem Versuchsansatz neu angesetzt.

Aktivkohlesuspension:

20 mM Tris-HCl-Pufferloesung

3,75 % Aktivkohle Norit A (Boehringer; Ingelheim)

0,375 % Dextran T70 (Roth, Karlsruhe)

Die Suspension wurde mehrere Stunden geruehrt und bei 8°C gelagert. Vor dem Gebrauch wurde erneut 15 min geruehrt.

Hormonloesung:

[³H]-T 96 Ci/mmol in Ethanol (Amersham; Braunschweig)

Das radioaktive Hormon wurde unter Stickstoffbegasung entnommen und in 5% Ethanol aufgenommen.

Unmarkierte endogene Liganden:

Testosteron (T) (Sigma; Deisenhofen)

17-ß-Oestradiol (E2) (Sigma; Deisenhofen)

Unmarkierte exogene Liganden:

Triphenylzinn (TPT)

Cyproteronacetat (CYP)

4, 4`-Dichlordiphenyldichlorethylen (p, p`-DDE)

17-ß-Oestradiol (E2)

Methyltestosteron (MT)

Testosteron (T)

Alle aufgefuehrten exogenen Liganden wurden von Sigma-Aldrich, Steinheim, bezogen.

Die Tiere wurden mit einem Schlag auf dem Kopf betaeubt und das Rueckenmark durchtrennt. Ventral wurde die Bauchhoehle eroeffnet und die Leber sowie die Gonaden entnommen. Sowohl die Leber als auch die Gonaden wurden direkt in eine eiskalte Tris-HCl-Pufferloesung ueberfuehrt und gewogen. Die Gewebe wurden zerkleinert und zweimal in Pufferloesung gewaschen, um das Blut zu entfernen. Danach wurden die Proben in Tris-HCl-Pufferloesung (3 ml/g Gewebe) aufgenommen und anschließend mit einem Teflon Pistill (Braun, Melsungen) in einem Glaspottergefaeß zwanzigmal bei 1000 U/min homogenisiert.

Das Homogenat wurde zweimal zentrifugiert:

1. Schritt: 12000 g fuer 10 min bei 4°C

2. Schritt: 100000 g fuer 60 min bei 4°C (L-90K Ultrazentrifuge, Beckmann)

Mit einer Pasteurpipette wurde das Homogenat in eisgekuehlte Erlenmeierkolben ueberfuehrt und das Pellet sowie die Lipidschicht verworfen. Zur Bestimmung der spezifisch gebundenen Ligandenmenge wurden Inkubationsansaetze fuer TB und NB nach folgendem Schema pipettiert:

Gesamtbindung:

150 µl Puffer

10 µl Ethanol 96%

100 µl Homogenat

25 µl [³H]-T

Unspezifische Bindung:

150 µl Puffer

10 µl unmarkiertes Hormon in Ethanol 96%

(1000–facher Ueberschuss)

100 µl Homogenat

25 µl [³H]-T

Bei den Kompetitionsexperimenten wurden anstelle des unmarkierten natuerlichen Liganden die entsprechenden Mengen (s. 2.1.6) an unmarkierten Kompetitoren zugegeben. Die Inkubationsansaetze zur Bestimmung der Hormonrezeptorbindung erfolgten bei 4°C.

Nach 24 h Inkubation wurden die nicht gebundenen Hormone von den rezeptorgebundenen Hormonen durch Zugabe von 300 µl Aktivkohlesuspension abgetrennt. Die freien Hormone wurden hierbei durch die Aktivkohle absorbiert. Nach weiteren 5 min Inkubation wurden die Proben fuer 15 min bei 3750 g zentrifugiert und 300 µl Ueberstand, in dem sich das rezeptorgebundene Hormon befindet, in einen Szintillationscocktail (Packard Instrument B.V; Groningen; Niederlande) pipettiert. Die Messung der Radioaktivitaet erfolgte in einem Fluessigkeits-Szintillationszaehler (Liquid Scintillation Counter LSC, Tri Carb 3000; Packard Instrument B.V; Groningen; Niederlande).

In Lebern und Gonaden von maennlichen und weiblichen Ploetzen wurde der Assoziationsverlauf der [³H]-Testosteronbindung an Androgenrezeptoren zur Ermittlung der optimalen Inkubationszeit bestimmt. Alle Experimente wurden mit einer Doppelbestimmung pro Ansatz durchgefuehrt. Die Inkubation fuer TB und NB erfolgte bei den Weibchen mit 0,38 bzw. 1,63 * 10^-8 M [³H]-T, bei den Maennchen mit 0,5 bzw. 2,0 * 10^-8 M [³H]-T fuer 1, 2, 3, 5, 7, 10, 20 und 24 Stunden. Die Konzentration des unmarkierten T betrug bei der NB 10^-5 M. Die Kompetitionsexperimente wurden mit sieben Maennchen und sieben Weibchen von R. rutilus durchgefuehrt. Die Inkubationszeit von 24 Stunden ergab sich aus den Assoziationsexperimenten, die ueber diesen Zeitraum ein „steady state“ der Bindung erkennen ließen. Die Konzentration von [³H]-T wurde bei allen Experimenten konstant eingehalten (1,5 * 10^-8 M). Anschließend wurde das Experiment mit Aktivkohlesuspension abgestoppt und der Radioligand in Abhaengigkeit zu den steigenden Konzentrationen der Kompetitoren gemessen. Als endogene Liganden wurden T und E2 in Konzentrationen von 10^-8 M bis 10^-4 M eingesetzt. MT als artifizielles Hormon, CYP, Tamoxifen (TAM) und Bisphenol A (BPA) als exogene Liganden wurden ebenfalls in einer Konzentration von 10^-8 M bis 10^-4 M eingesetzt. In einem Konzentrationsbereich von 10^-5 M bis 10^-3 M wurden die beiden Substanzen TPT und p,p`-DDE verwendet. Die Auswertung zur Bestimmung der individuellen IC50-Werte erfolgte durch die Umformung in den logit-log-Plot.

Die Anzahl der R. rutilus (n = 30/ Becken) zu Beginn der Expositionen 1 und 2 (EX1 und EX2) wurden 100 % gesetzt. Waehrend der 210-taegigen Expositionszeit wurde die Anzahl der toten Fische dokumentiert. Nach Beendigung wurden die prozentualen Mortalitaeten fuer jede einzelne Behandlungsgruppe errechnet.

Fuer die in vivo EX1 und EX2 wurden im Fruehjahr geschlechtsreife, adulte Rotaugen (R. rutilus) aus dem Mueggelsee in Berlin, Deutschland gefangen und bis zum Laichen in 200 L Becken gehaeltert. Unmittelbar nach dem Laichen wurden die Eier gesammelt und nach dem Zufallsverfahren auf 28 Becken mit 10 L Volumen verteilt. Um die Osmolaritaet von Trinkwasser zu erreichen wurden zu 10 L Aqua dest. 2,5 g marines Salz (Tagis Tropical Marine, Dreieich) hinzugegeben. Die antizyklisch angeordneten Becken wurden durch Sprudelsteine belueftet und bei einer Temperatur von 20 ± 1°C gehalten. Waehrend der folgenden 210 Tage wurde dreimal in der Woche die Haelfte des Behandlungsmediums gewechselt. Die Tiere wurden 2-3-mal taeglich mit Artemia salina ad libitum gefuettert. Nach der Expositionszeit wurden die Tiere durch einen Genickschnitt getoetet und die Totallaenge der Fische gemessen. Dies ist die Distanz zwischen der Kopfspitze und dem Hinterende der natuerlich ausgebreiteten Schwanzflosse. Die Ablesegenauigkeit betrug ± 1 mm. Anschließend wurde das Gewicht der R. rutilus mit einer Feinwaage (Sartorius Werk, Goettingen) bestimmt. Die Genauigkeit der Messung betrug ± 0,001 g.

Jedem Fisch wurden Gehirn, Leber und Gonaden entnommen und in Reaktionsgefaeße gegeben, die sofort in fluessigen Stickstoff ueberfuehrt wurden. Anschließend wurden die Proben bis zur weiteren Bearbeitung bei minus 80°C aufbewahrt. Beim EX1 wurden je 30 Eier pro Becken eingesetzt und nach einem Tag wurden die Substanzen hinzugegeben. Die Behandlungen waren: 2 * Loesungsmittelkontrolle (Soco); TPT 2 * (10^-8, 0.5*10^-8, 10^-9, 0.5*10^-9 [M]); Vinclozolin (VIN) 2 *(10*^-8, 0.5*10^-8, 10^-9) 1 * (0.5*10^-9) [M]) und Fenarimol (FEN) 2 * (10*^-8, 0.5*10^-8, 10^-9) 1 * (0.5*10^-9) [M]). In EX2 wurden ebenfalls je 30 Eier pro Becken eingesetzt. Die Behandlungen waren: 2 * Soco; MT 2 * (10^-8, 0.5*10^-8, 10^-9, 0.5*10^-9 [M]); CYP 2 * (10*^-8, 0.5*10^-8, 10^-9, 0.5*10^-9 [M]) und Letrozol (LET) 2 * (10*^-8, 0.5*10^-8, 10^-9, 0.5*10^-9 [M]).

Nach dem Wiegen der Fische wurde ventral von der Kloake bis zur Kiemenkonjungation mit einem Sagitalschnitt der Bauchraum eroeffnet und nach dem Entnehmen von Leber und Darm, das Geschlecht anhand der Gonaden morphologisch bestimmt. Zur Ueberpruefung der morphologischen Geschlechtsbestimmung sowie zur Bestimmung von Veraenderungen auf zellulaerer Ebene wurde ein Teil der Gonaden histologisch untersucht.

Die RT-PCR ist eine Methode mit deren Hilfe extrem geringe Mengen an mRNA spezifisch detektiert werden koennen, indem die mRNA durch die reverse Transkription in eine komplementaere DNA (cDNA) umgeschrieben wird. Diese cDNA wird dann in einer „Polymerase-Chain-Reaction“ (PCR) durch Einsatz spezifischer Primer und des Enzyms Taq-Polymerase amplifiziert. Die Methode der RT-PCR ist eine weitaus sensitivere Methode als die bisherigen RNA-Blot-Techniken (Byrne et al., 1988; Wang et al., 1989). Die Gesamt-RNA, die auch die mRNA enthaelt, wird aus den Zellen phenolisch extrahiert. Die RT-PCR beginnt mit der cDNA-Erststrangsynthese. Mit Hilfe der „Avian Myeloblastosis Virus-Reverse Transcriptase“ (AMV-RT), einer RNA abhaengigen DNA-Polymerase, kann die cDNA synthetisiert werden. Eine einzelstraengige RNA dient der AMV-RT als Matrize und wird in Anwesenheit eines Primer in 5` ♢ 3`Richtung synthetisiert. Die resultierende cDNA wird zur PCR eingesetzt, welche es ermoeglicht, gezielt diese DNA-Abschnitte zu vervielfaeltigen. Durch zyklische Wiederholung der einzelnen PCR-Schritte kann die geringe Ausgangsmenge der cDNA amplifiziert werden. Mittels der PCR wurde in dieser Untersuchung eine spezifische Amplifikation verschiedener cDNA durchgefuehrt. Als interner Standard fuer die semiquantitative Bestimmung der mRNAs, wurde die mRNA des Elongationsfaktor 1α (EF) als „house-keeping gene“ (Dostal et al., 1994) aus der jeweiligen gleichen Probe mitbestimmt. Die PCR-Produkte wurden in einem ethidiumbromidhaltigen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurde unter UV-Licht mittels Fluoreszenzmessung die Intensitaet der Banden bestimmt. Die Ergebnisse der densitometrischen Auswertung fuer die cDNA wurden mit Hilfe der EF-Werte im Bezug auf etwaige Artefakte normalisiert.

Chemikalien:

Trizol-RNA-Isolationsmedium (Gibco BRL, Eggenstein)

Chloroform (Roth, Karlsruhe)

Isopropanol (Roth, Karlsruhe)

Ethanol 70% (Merck, Darmstadt)

DEPC (Diethylpyrocarbonat) behandeltes Wasser (0,01%; 100 µl/l), autoklaviert. (Roth, Karlsruhe)

RNA-Extraktion aus den Geweben:

Die Proben in einem 2 ml Eppendorfgefaeß wurden kurz angetaut und 700 µl Trizol hinzugegeben und mit einem Ultra-Turrax (IKA Labortechnik, Staufen) homogenisiert. Nach einer 5-minuetigen Inkubationszeit (Membranen und sonstige Kompartimente wurden geloest) wurden 160 µl Chloroform zur Trennung der lipophilen von der hydrophilen Phase hinzugegeben. Dieses Gemisch wurde 15 s gemixt und erneut fuer 3 min bei Raumtemperatur inkubiert. Zur vollstaendigen Trennung der beiden Phasen wurden die Eppendorfgefaeße 15 min lang zentrifugiert (4°C; 12000 rpm). Von dem Gesamt-RNA enthaltenen Ueberstand wurden 200 µl abgenommen und in sterile Eppendorfgefaeße (1,5 ml) ueberfuehrt. Unmittelbar nach der darauf folgenden Zugabe von 300 µl Isopropanol wurden die Gefaeße kurz geschuettelt und bei Raumtemperatur 10 min inkubiert (Faellung der RNA).

Der Ueberstand, der sich nach einer weiteren 10-minuetigen Zentrifugation (Heraeus Inc., Hanau) (4°C; 12000 rpm) ergab, wurde entnommen und verworfen. Um das im Eppendorfgefaeß verbliebene RNA-Pellet zu waschen, wurden 300 µl Ethanol (70% p.a.) hinzugegeben. Dieses Gemisch wurde erneut zentrifugiert (5 min; 4°C und 12000 rpm) und anschließend der Ueberstand verworfen. Das RNA-Pellet wurde bei 37°C getrocknet und stand nun allen weiteren Arbeitsschritten, die auf Eis durchgefuehrt wurden, zur Verfuegung.

Zunaechst wurde das Pellet in 20 µl DEPC-Wasser aufgenommen und vorsichtig resuspendiert. Von der resuspendierten RNA-Loesung wurden 2 µl zusammen mit 198 µl DEPC-Wasser in 96-Well-Platten (Greiner, Frickenhausen) pipettiert und in einen Plattenreader (Spectrafluor; Tecan, Crailsheim) gegeben, um die Menge der RNA zu bestimmen. Die Auswertung erfolgte ueber das Computerprogramm Magellan (Tecan, Crailsheim), welches die Absorption bei Wellenlaengen von 260 nm und 280 nm ermittelt. Der bei 260 nm gemessene Extinktionswert wurde mit dem Faktor 4 multipliziert und ergab den RNAGehalt in µg/µl. Die Reinheit der RNA wird durch den Quotienten der Extinktionswerte bei 260/280 nm charakterisiert.

Die Gesamt-RNA-Loesung wurde auf 1 µg/8 µl verduennt.

Chemikalien:

Wasser (Aqua bidest., autoklaviert)

Poly-(dT)-Primer (Intron, Kaltenbrunn;CH)

dNTP-Loesung (Biometra, Goettingen)

AMV-RT (Biometra, Goettingen)

AMV-RT-Puffer (10x) (Biometra, Goettingen)

8 µl der Gesamt-RNA wurden in einem 200 µl Mikrogefaeß vorgelegt und 9 µl Wasser und 3 µl Primer hinzugegeben. Nach dem Mixen und Abzentrifugieren wurden diese Gefaeße in einen Cycler (Thermocycler, Biometra, Goettingen) positioniert und fuer 3 min bei 70°C inkubiert. Unter diesen Bedingungen lagert sich der Poly-(dT)-Primer spezifisch an den Poly-(A)-Schwanz der mRNA an. Anschließend wurden 5 µl Wasser, 3 µl Puffer, 1,5 µl dNTPs und 0,5 µl AMV-RT hinzugegeben, gemixt und abzentrifugiert. Die Gefaeße wurden erneut in den Cycler ueberfuehrt und fuer 60 min bei 37°C inkubiert. Aufgrund der mRNA-spezifischen Primerhybridisierung wurde die mRNA in cDNA transkribiert. Die Reaktion wurde durch zweiminuetiges Erhitzen auf 94°C gestoppt. AMV-RT und mRNA werden dadurch zerstoert. Durch Abkuehlung wurde erreicht, dass sich die Nukleotide komplementaer zum jeweiligen cDNA-Erststrang anlagern und somit doppelstraengige cDNA entsteht.

3 µl cDNA wurden in ein 200 µl Mikrogefaeß vorgelegt. Der PCR-Premix (siehe unten) wurde in einem sterilen Eppendorfgefaeß gemischt und zur cDNA-Vorlage gegeben. Alle PCRs wurden mit Taq-Polymerase und dNTPs von Q-Biogene durchgefuehrt.

PCR-Premix fuer den Elongationsfaktor 1 α (EF) pro Probe:

18,7 µl PCR-H₂O

2,5 µl Taq-Puffer (10x)

0,2 µl dNTP-Loesung

0,2 µl EF-Primer forward: Sequenz: 5` - gAC TgT gCC gTg CTg ATT g - 3`

0,2 µl EF-Primer reverse: Sequenz: 5` - ATT ACC CTC CTT gCg CTC AAT - 3`

0,2 µl Taq-Polymerase

22 µl Gesamtvolumen

Das EF-Programm des Thermocyclers

Beginn: 94°C 1 min

25 Zyklen à:

94°C 1 min (Denaturierung)

59°C 1 min (Annealing)

72°C 1 min (DNA-Synthese)

Abschluss: 72°C 10 min

PCR-Premix fuer die ER-cDNA pro Probe:

18,7 µl PCR-H₂O

2,5 µl Taq-Puffer (10x)

0,2 µl dNTP-Loesung

0,2 µl ER-Primer forward: Seq: 5´ - TAG GGC AGC AAG TGG AAG G - 3`

0,2 µl ER-Primer reverse: Seq: 5´ - TGT CAG CGA GGG TGG TTA G - 3`

0,2 µl Taq-Polymerase

22 µl Gesamtvolumen

Das ER-cDNA-Programm im Thermocycler:

Beginn: 94°C 1 min

33 Zyklen à

94°C 1 min (Denaturierung)

66°C 1 min (Annealing)

72°C 1 min (DNA-Synthese)

Abschluss: 72°C 10 min

PCR-Premix fuer die AR-cDNA pro Probe:

18,7 µl PCR-H₂O

2,5 µl Taq-Puffer (10x)

0,2 µl dNTP-Loesung

0,2 µl AR-Primer forward: Seq: 5´ - CTS TgC AAA gCT gTg TCC gT - 3`

0,2 µl AR-Primer reverse: Seq: 5´ - TCR TCT gRR CAg ATC Agg CAC gT - 3`

0,2 µl Taq-Polymerase

22 µl Gesamtvolumen

Das AR-cDNA-Programm im Thermocycler:

Beginn: 94°C 1 min

36 Zyklen à

94°C 1 min (Denaturierung)

60°C 1 min (Annealing)

72°C 1 min (DNA-Synthese)

Abschluss: 72°C 10min

PCR-Premix fuer die LH-cDNA pro Probe:

18,7 µl PCR-H₂O

2,5 µl Taq-Puffer (10x)

0,2 µl dNTP-Loesung

0,2 µl LH-Primer forward: Seq: 5´ - gCT gTg AgC CgA TTA ATg AgA Cg - 3`

0,2 µl LH-Primer reverse: Seq: 5´ - CTg CAg gCT CTC gAT ggT g - 3`

0,2 µl Taq-Polymerase

22 µl Gesamtvolumen

Das LH-cDNA-Programm im Thermocycler:

Beginn: 94°C 1 min

33 Zyklen à

94°C 1 min (Denaturierung)

60°C 1 min (Annealing)

72°C 1 min (DNA-Synthese)

Abschluss: 72°C 10 min

PCR-Premix fuer die FSH-cDNA pro Probe:

18,7 µl PCR-H₂O

2,5 µl Taq-Puffer (10x)

0,2 µl dNTP-Loesung

0,2 µl FSH-Primer forward: Seq: 5´ - gCT ggC TgA gAA CTC CAC AgT CTg - 3`

0,2 µl FSH-Primer reverse: Seq: 5´ - CAg CgC TAA TgA ggg CAg gAT - 3`

0,2 µl Taq-Polymerase

22 µl Gesamtvolumen

Das FSH-cDNA-Programm im Thermocycler:

Beginn: 94°C 1 min

31 Zyklen à

94°C 1 min (Denaturierung)

64°C 1 min (Annealing)

72°C 1 min (DNASynthese)

Abschluss: 72°C 10 min

PCR-Premix fuer die ARO-cDNA pro Probe:

18,7 µl PCR-H₂O

2,5 µl Taq-Puffer (10x)

0,2 µl dNTP-Loesung

0,2 µl ARO-Primer forward: Seq: 5´ - CTA CAT CCC gCT CgC CTA TCT - 3`

0,2 µl ARO-Primer reverse: Seq: 5´ - CTg gCA ggC ggT TCT CAT AT - 3`

0,2 µl Taq-Polymerase

22 µl Gesamtvolumen

Das ARO-cDNA-Programm im Thermocycler:

Beginn: 94°C 1 min

23 Zyklen à

94°C 1 min (Denaturierung)

60°C 1 min (Annealing)

72°C 1 min (DNA-Synthese)

Abschluss: 72°C 10 min

Chemikalien:

50 x TAE-Puffer; pH 8,5:

242,0 g Tris (Ultra Qualitaet, Roth, Karlsruhe)

90,0 ml Essigsaeure

18,6 g NaEDTA

Bromphenolblau-Probenpuffer:

10 µl gesaettigte Bromphenolblau-Loesung (Sigma, Deisenhofen)

100 µl Glyzerin (Boehringer, Ingelheim)

90 µl DEPC behandeltes Wasser

Basenpaarleiter:

20 µl; von 100 bis 1000 Basenpaaren (AGS, Heidelberg)

460 µl TAE-Puffer (1x)

Ethidiumbromid-Faerbeloesung:

9 µl Ethidiumbromid-Lsg. (Roth, Karlsruhe)

Agarosegel:

1,35 g Agarose

90 ml 1x TAE-Puffer

Durchfuehrung:

Die amplifizierte cDNA wurde als Horizontal-Gelelektrophorese bei einer Spannung von 80 mV fuer 30 min in einem ethidiumbromidhaltigen Agarose-Gel (1,5%) mit 1x TAE-Puffer aufgetrennt. Die cDNA-Menge korreliert mit der im UV-Licht hervorgerufenen Fluoreszenz, die aus der Anlagerung des Ethidiumbromids in die doppelstraengige cDNA resultiert. Das Gel wird auf einer UV-Bank bei 254 nm ueber eine Videoapparatur (Gel Doc 2000, Bio-Rad, Hercules, CA, US) aufgenommen und durch ein Computerprogramm (Quantity one, Bio-Rad, Hercules, CA, US) densitometrisch ausgewertet.

Ein Teil der zur histologischen Bestimmung entnommenen Gonadenproben wurden zur Weiterbehandlung mit Bouin (Sigma-Aldrich, Steinheim) fixiert und nach zweimaliger Waschung in 80%igem Ethanol an das Limnomar-Institut in Hamburg gesendet und dort von Dr. Burkard Watermann bearbeitet. Ein weiterer Teil der gonadalen Proben wurde nach gleicher Behandlung am IGB weiterbearbeitet. Sie wurden in Paraffin eingebettet, am Mikrotom geschnitten und mit Haematoxylin-Eosin gefaerbt (HE-Faerbung). Daraufhin wurden die histologischen Schnitte unter einem Lichtmikroskop angesehen und das Geschlecht morphologisch bestimmt.

Die Geschlechter der juvenilen Fische wurden nach der Beprobung anhand der Gonaden morphologisch bestimmt. Anschließend wurden die Gonaden zur weiteren Bestimmung sofort in Bouin ueberfuehrt und nach zweimaliger Waschung mit 80%igem Ethanol in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit HE gefaerbt. Die Schnitte wurden anschließend lichtmikroskopisch analysiert.

Die Mortalitaet der vierzehntaegigen EX3 wurde wie bei EX1 und EX2 bestimmt.

Die adulten R. rutilus (2+) wurden in einer Kreislaufanlage bei 17-20°C am IGB in Berlin aufgezogen. Die ersten drei Monate wurden die Tiere zweimal taeglich mit Artemia salina ad libitum gefuettert. Die restlichen 21 Monate wurden sie mit Trockenfutter gefuettert, wobei die Menge ca. 10 % des Koerpergewichts entsprach. Der Versuchsaufbau beinhaltete, dass je 15 dieser Tiere in ein 30 L-Aquarium ueberfuehrt wurden. Um die Osmolaritaet von Trinkwasser zu erreichen wurden zu 30 L Aqua dest. 7,5 g marines Salz gegeben. Nach einem Tag wurden folgende Expositionsregime aufgebaut: TPT, VIN, CYP und MT wurden in einer nominalen Konzentration von 10^-8 M zugegeben. Zum Vergleich wurde eine SoCo mitgefuehrt. Die Becken wurden antizyklisch in Wasserrinnen aufgestellt. Die Wassertemperatur in den Becken wurde auf 20 ± 1°C eingestellt. Nach 14 Tagen wurden 20-40 µl Blut aus der Caudalvene eines jeden Tieres entnommen und sofort in fluessigen Stickstoff ueberfuehrt. Wie schon bei den larvalen Expositionen (EX1 und EX2) wurden auch die adulten Tiere nach dem Versuch gemessen, gewogen und anschließend Gehirne, Leber und Gonaden entnommen und zur weiteren Behandlung bei minus 80°C gelagert.

Die mRNA- und PCR-Protokolle sowie die entsprechenden Primer sind wie unter 2.2.4 aufgefuehrt verwendet worden.

Gonaden- und Gehirnproben der exponierten 2+ Ploetzen (R. rutilus) wurden nach der Exposition in der SoCo, in TPT, VIN, LET und MT mit einer Konzentration von jeweils 10^-8 M entnommen und unmittelbar in fluessigen Stickstoff eingefroren. Die Aufarbeitung der Proben erfolgte wie bei Steckelbroeck (Steckelbroeck et al., 1999) beschrieben. Die Proben wurden gewogen, in einen Glasmoerser mit Homogenatpuffer ueberfuehrt und mit einem Glaspistill homogenisiert. Anschließend wurden die Proben in Plastikgefaeße pipettiert und in einem Ultraschallbad bei 50 Watt behandelt. Das Homogenat wurde bei 4°C und 4000 rpm fuer 15 min zentrifugiert, der Ueberstand abgenommen und in Aliquots aufgeteilt, welche erneut in fluessigen Stickstoff gefroren wurden. Die anschließende Proteinbestimmung erfolgte nach der Methode von Lowry (Lowry et al., 1951).

Markiertes Steroid:

[1ß-³H] Androstenedion (25.9 Ci/mmol, PerkinElmer, Rodgau)

(Aufgereinigt durch eine Duennschicht-Chromatographie

(thin-layer chromatography, (TLC)).

Unmarkierte Steroide:

Androstanedion

Androstenedion

5α-Dehydrotestosteron

Androsteron

Testosteron

3α-Androstanediol (Referenzsteroid)

Weitere Chemikalien:

Ethylendiamintetraacetat (EDTA)

Folin & Ciocalteu´s Phenolreagenz

TRIZMA^®-puffer (Tris[hydroxymethyl]aminomethan)

TRIZMA^®-HCl (Tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid)

Zitronensaeure

4-Methoxybenzaldehyd

Alle oben aufgelisteten Chemikalien und Steroide wurden bei Sigma-Aldrich, Seelze, bezogen.

Szintillationscocktail, Ultima Gold (PerkinElmer, Rodgau)

Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (Hoffmann-La Roche, Grenzach-Wyhlen)

PolygramTM Kieselgel (Macherey & Nagel, Dueren)

Homogenatpuffer zur Aufnahme der Proben

Der Puffer enthaelt 10 mM TRIZMA®-HCl und 1 mM EDTA bei einem pH Wert von 7,4.

Der Enzymassay ist eine Methode zur Bestimmung der Aktivitaet bestimmter Enzyme in unterschiedlichen Geweben. In Zusammenarbeit mit der Medizinischen Fakultaet der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universitaet Bonn wurde die Aromataseaktivitaet in den Gonaden und den Gehirnen beider Geschlechter der 2+ Ploetzen nach der Methode von Steckelbroeck (Steckelbroeck, 1999) untersucht. Hierzu wurden die Aliquot (s. Gewebepraeperation) in Homogenatpuffer geloest und ueber einen Zeitraum von 30 min inkubiert, so dass in einem 50 µl Aliquot circa 10 % des Substrates waehrend der Inkubationszeit umgewandelt wurde. 100 µl [1ß-³H] Androstenedion-Loesung (geloest in 0,1 µM Assay-Puffer) wurde danach zu den Proben hinzugegeben.

Durch Zugabe von 50 µl einer 3 mM NADPH-Loesung wurde die Enzymreaktion gestartet. Die verschlossenen Reaktionsgefaeße wurden gemixt und fuer 30 min bei 37°C (ARO), bzw. bei 24 °C (5α-Reduktase) geschuettelt. Das Stoppen der Reaktion erfolgte durch Abkuehlen der Reaktionsgefaeße auf Eis. Die organischen Anteile wurden anschließend in eiskaltem Chloroform aufgenommen.

Zur Quantifizierung wurden 100 µl der organischen Phase unter Stickstoffbegasung durch Verdunstung getrocknet. Die getrockneten Aliquots wurden in 50 µl Chloroform geloest, das je 100 µg der unmarkierten Steroide enthielt. Die geloesten Aliquots wurden auf eine 20x20 cm Duennschicht-Chromatographie-Platte (TLC) aufgetragen, die mit Kieselgel in einer Hoehe von 0,25 mm beschichtet waren. Die Separierung wurde auf einer ein-dimensionalen TLC durch Verwendung von Dichlormethan und Azeton in einem Volumenverhaeltnis von 92,5:7,5 erreicht. Die Kieselgelschicht wurde getrocknet, die Referenzsteroide durch Bespruehen einer Mixtur aus Essigsaeure (100 ml), Schwefelsaeure (2 ml) und Anisaldehyd (1 ml) angefaerbt und anschließend bei 130°C wieder getrocknet. Jede Bande wurde ausgeschnitten und in ein Vial mit 15 ml Szintillations-Cocktail transferiert. Nach 48 Stunden wurde die Radioaktivitaet automatisch mit einem Wallac 1409 Liquid-Szintillationszaehler (Wallac, Turku, Finnland) in dots per minute (dpm) gemessen. Die relative Anzahl der korrespondierenden radioaktiven Steroide wurde prozentual zur totalen Radioaktivitaet (100 %) kalkuliert. Der Blindwert wurde von den gemessenen Metabolismusraten der verschiedenen Gewebe subtrahiert. Die Aktivitaet der Enzyme wurde in pmol/h/mg Protein dargestellt.

Der EIA ist eine Methode zur quantitativen Bestimmung kleinster Substanzmengen wie zum Beispiel Hormone in einer Probe durch Antikoerper und gehoert zu den kompetitiven Bindungsassays. Beim EIA handelt es sich um eine immunochemische Reaktion zwischen einem spezifischen Antikoerper, dem Anti-rabbit IgG und einem Kaninchenantikoerper-Hormon-Komplex. Die Oberflaechen der Kavitaeten einer Mikrotiterplatte sind mit diesem spezifischen Antikoerper beschichtet (precoated), an den der Kaninchenantikoerper-Hormon-Komplex bindet. Der Komplex besteht aus einem Antikoerper an den ein enzymmarkierter Tracer (hier Acetylcholinesterase (AchE)) sowie die Hormone aus einer Probe oder Standardmolekuele zur Erstellung der Standardkurve binden. Die Menge des AchE-Tracers, die an das Anti-rabbit IgG in den Kavitaeten der Mikrotitterplatte gebunden wurde, ergibt nach der Zugabe eines Substrates (Ellman`s reagent) eine Reaktion, bei der ein Produkt entsteht, dessen Farbintensitaet photometrisch bei einer Wellenlaenge von 405-420 nm detektiert werden kann. Die gemessene Intensitaet ist der Konzentration des zu messenden Hormons in der Probe umgekehrt proportional. Die Kalibrierung des Enzymimmunoassays wird durch eine Standardloesung des zu bestimmenden Hormons erstellt.

Loesungspuffer:

15 ml des Konzentrates geloest in 135 ml Aqua dest.

Waschpuffer:

2 PBS-Tabletten geloest in 200 ml Aqua dest. und Zugabe von 0,2 ml 50% Tween 20

Standardloesung:

100 µl 11-KT bzw. E2 Standard geloest in 900 µl Loesungspuffer. Ergibt eine Stammloesung von 5 ng/ml

AchE-Tracer (100x):

55 µl konzentrierter Tracer geloest in 5,45 ml Loesungspuffer

Antikoerper (50x):

110 µl konzentrierter Antikoerper geloest in 5,4 ml Loesungspuffer

Das Blut wurde mit heparinisierten Haematokritroehrchen (Brand Micro haematocrit tubes, Roth, Karlsruhe) aus den Bulbus ateriosus entnommen und in ein 1,0 ml Reaktionsgefaeß (Eppendorf, Hamburg) ueberfuehrt. Dieses wurde zur Weiterverarbeitung bei -80°C gelagert. Nach dem Auftauen wurden die Blutproben zentrifugiert und 150 µl Plasma zur Weiterbearbeitung in 1 ml 99,9% Ethanol p.a. aufgenommen. Dieses wurde gevortext und anschließend bei 2500 rpm fuer 5 min zentrifugiert (Eppendorfzentrifuge, Eppendorf, Hamburg). Der Ueberstand wurde in Glasvials ueberfuehrt und unter einem Abzug extrahiert. Anschließend wurde der Extrakt in 250 µl 99,9% Ethanol p.a. aufgenommen und fuer die Hormonbestimmung eingesetzt. Den jeweiligen Protokollen folgend wurden die Doppelbestimmungen von E2 im Serum der Ploetzen mit einem Estradiol-EIA-Kit (Cayman Chemical Company, Michigan, USA) und die des 11-KT mit einem 11-Keto-EIA-Kit (Biosense, Bornheim) durchgefuehrt. Nachdem die Proben auf Eis standen, wurde zunaechst eine Standardreihe erstellt. In ein Reaktionsgefaeß (SL) wurden 900 µl und in acht weitere jeweils 500 µl des Loesungspuffers vorgelegt. In das erste Reaktionsgefaeß wurden 100 µl der Standardloesung hinzugegeben, so dass eine Loesung mit einer Konzentration von 500 pg/ml des Standards hergestellt wurde. Diese Loesung wurde gemixt und 500 µl davon in das zweite Reaktionsgefaeß (S1) ueberfuehrt. Das zweite Reaktionsgefaeß (S1) wurde ebenfalls gemixt und 500 µl in das naechste Gefaeß (S2) gegeben, welches nun 250pg/ml Standardmolekuels erhielt. Dieses Verfahren wiederholt man bis hin zum letzten Reaktionsgefaeß (S8) und erhaelt so die Standardreihe.

Die extrahierten Proben wurden mit Loesungspuffer nach folgendem Schema verduennt:

1:50 Verduennung: 10 µl Plasmaprobe in 490 µl Loesungspuffer

1:100 Verduennung: 5 µl Plasmaprobe in 495 µl Loesungspuffer

1:500 Verduennung: 1 µl Plasmaprobe in 499 µl Loesungspuffer

Anschließend wurden die Proben und die Standardreihe auf eine 96-Well-Platte (Greiner, Frickenhausen) nach folgendem Arrangement belegt:

Abkuerzungen:BL = Blank → Hintergrund Absorption des Ellman`s Reagenz
NB = Nonspecific Binding → Unspezifische Bindung des 11-KT- bzw. E2-tracers
TA = Total Activity → Gesamte enzymatische Aktivitaet des Tracers
B0 = Maximum Binding → Die gesamte Menge des Tracers, der an den Antikoerper in Abwesenheit der Standards und der Proben enthaltenden Enzyme binden konnte.
S1-S8 = Standardreihe
P1/50 = Probe 1 in einer Verduennung von 1:50

In die NB-wells wurden 100 µl, in die B0-wells 50 µl des Loesungspuffers vorgelegt. Je 50 µl der jeweiligen Standards wurden in die S1 - S8 Wells pipettiert und je 50 µl der entsprechenden verduennten Plasmaproben in die Kavitaeten P1 - P12. Anschließend wurde bei 4°C weitergearbeitet und je 50 µl des AchE-Tracers in jede Kavitaet hinzugegeben mit Ausnahme der TA- und BL-Kavitaeten. Hiernach wurde in jede Kavitaet, mit Ausnahme der TA-, Blank- und NB-Kavitaeten, 50 µl Antikoerperloesung zugefuegt. Die Platte wurde verschlossen und fuer zwei Stunden auf einem Orbitalplattenschuettler bei 400 Rotationen/min und Raumtemperatur geschuettelt. Anschließend wurden die 96-Well-Platten fuenfmal hintereinander vorsichtig mit 200 µl Waschpuffer gewaschen, der durch leichtes schlagen der umgedrehten Platte auf ein Papierhandtuch aus den Kavitaeten entfernt wurde. 200 µl Ellman`s Reagenz wurde in alle Kavitaeten zugegeben. Die TA-Kavitaeten erhielten 5 µl des geloesten Tracers. Die mit Aluminiumfolie abgedeckte Platte wurde fuer eine Stunde auf dem Horizontalschuettler bei Raumtemperatur inkubiert und dann im Tecan^®-Plattenreader bei einer Wellenlaenge von 405 - 420 nm photometrisch gemessen. Die Ergebnisse wurden mathematisch transformiert und in pg/mol graphisch dargestellt.

Alle statistischen Analysen wurden mit dem Statistikprogramm GraphPad Prism^® (San Diego, CA 92130, USA) erstellt.

Die Ergebnisse der Messungen wurden mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test (KS) auf ihre Normalverteilung getestet. Signifikante Unterschiede zwischen der SoCo und den Behandlungsgruppen wurden bei normalverteilten Daten mit der one-way analysis of variance (ANOVA) gefolgt von Dunnetts-Test geprueft. Bei nicht normalverteilten Daten wurden die Messungen mit dem nicht parametrischen Dunns-Test auf signifikante Unterschiede zur SoCo getestet.

Die densitometrische Werte der PCR-Produkte der ausgewaehlten Gene wurden zur statistischen Analyse verwendet und durch die densitometrischen Werte der PCR-Produkte des EF-1α normalisiert. Effekte der behandelten Gruppen im Vergleich zur SoCo wurden nach Geschlechtern getrennt geprueft. Mit ANOVA wurden signifikante Unterschiede zur SoCo getestet und mit dem Dunnetts-Test geprueft. Beim Auftreten von Varianzen der Ergebnisse wurden die Messungen mit dem nicht parametrischen Dunns-Test auf signifikante Unterschiede zur SoCo getestet.

Nach Geschlechtern getrennt wurden signifikante Unterschiede der Ergebnisse der mit AACs exponierten Tiere zur SoCo analysiert. Nach der Untersuchung auf Normalverteilung und Anwendung des ANOVA zur Analyse der Varianz wurde der Dunnetts-Test durchgefuehrt.