3  Ergebnisse

Zur Bestimmung des zeitlichen Verlaufs der Bindung von [3H]-T an die Androgenrezeptoren in Leber- bzw. Gonadengewebe wurden Versuche an weiblichen und maennlichen Ploetzen durchgefuehrt. Die Ergebnisse zeigten, dass die spezifische Bindung bei beiden Geschlechtern in den ersten beiden Stunden stark ansteigt und sich nach drei Stunden ein Gleichgewicht zwischen Assoziation und Dissoziation einstellt. Um eine Unabhaengigkeit der zeitlichen Bindung von den eingesetzten Konzentrationen des [3H]-T zu zeigen, wurden die kinetischen Experimente mit jeweils einer hohen und einer niedrigen Konzentration bei 4°C durchgefuehrt. Weder wiesen die jeweils eingesetzten Konzentrationen (Abb. 3.1 und 3.2) noch die verschiedenen Geschlechter (Abb. 3.3 und 3.4) Unterschiede im zeitlichen Verlauf der Bindung auf. Dies galt auch fuer den Vergleich von Lebergewebe mit Gonadengewebe (Abb. 3.5 und 3.6). Die aus den Differenzen zwischen Totalbindung (TB) und nichtspezifischer Bindung (NB) resultierende spezifische Bindung (SB) unterschieden sich nur hinsichtlich ihrer Menge.

Kompetitionsexperimente ermoeglichen es, die Rezeptoren hinsichtlich ihrer Affinitaet fuer verschiedene Liganden zu spezifizieren. Um die kompetitiven Verdraengungen der [³H]-Testosteronbindung an Androgenrezeptoren im Gonaden- bzw. Lebercytosol zu erfassen, wurden fuer die Experimente jeweils sieben maennliche und sieben weibliche Ploetzen eingesetzt. Obwohl die Bindungen auch hier keine geschlechterspezifischen Unterschiede zeigten, werden die Ergebnisse dennoch nach Geschlechter getrennt aufgefuehrt. Die eingesetzten Liganden sind in der gleichen Konzentrationsspanne eingesetzt worden, wie der natuerliche Ligand T, naemlich von 10^-4 M bis 10^-9 M. Ausnahmen waren die beiden Substanzen TPT und p,p`-DDE, die in Konzentrationen von 10<sup>-3</sup> M bis 10<sup>-5</sup> M eingesetzt wurden. Als Positivkontrolle wurde T im Parallelansatz mitgefuehrt (Abb. 3.7). Die eingesetzten Umweltchemikalien TPT und p,p`-DDE zeigten keine Bindung an den Androgenrezeptor, CYP wies eine wesentlich geringere Bindung als die endogenen Liganden, T und E2 auf. MT hingegen zeigte die hoechste Bindungsaffinitaet.

Die mittels eines korrespondierenden logit-log-Plots (Abb. 3.8) errechneten IC₅₀-Werte ergaben im Vergleich fuer die mitgefuehrten Liganden eine Affinitaetsreihenfolge zum Androgenrezeptor wie folgt: MT ≥ T > E2 ≥ CYP. TPT und p,p`-DDE wiesen keine Affinitaet zum Androgenrezeptor auf (Tab. 1).

Tab. 1: Korrespondierende Tabelle zu Abb.3.8. Dargestellt sind die mit Hilfe der logit-log-Transformation ermittelten IC50-Werte aus den Mittelwerten (n=7) bei weiblichen 2+ Ploetzen.

Bei den maennlichen 2+ Ploetzen wurden die gleichen Substanzen in den gleichen Konzentrationen wie bei den Kompetitionsexperimenten mit den weiblichen 2+ Ploetzen eingesetzt (Abb. 3.9). Die IC50-Werte wurden mittels des korrespondieren logit-log-Plots errechnet (Abb. 3.10). Aus den ermittelten Ergebnissen, lies sich folgende Affinitaetsreihenfolge zum Androgenrezeptor im Gonadencytosol erstellen: MT > T >> E2 > CYP. p,p`-DDE und TPT zeigten keine Affinitaet zum Androgenrezeptor (Tab.2).

Tab. 2: Korrespondierende Tabelle zu Abb. 3.10. Dargestellt sind die mit Hilfe der logit-log-Transformation ermittelten IC50-Werte aus den Mittelwerten (n=7) bei maennlichen 2+ Ploetzen.

Aus den sieben (n=7) kompetitiven Verdraengungsexperimenten im Lebercytosol weiblicher 2+ Ploetzen und den daraus resultierenden logit-log-Plots konnten folgende Reihenfolgen fuer die Affinitaet der Liganden zum Androgenrezeptor mittels der errechneten IC50-Werte fuer die Mittelwerte (Tab. 3) erstellt werden: MT > T >> E2 ≥ CYP. Es lag keine Affinitaet fuer p,p`-DDE und TPT vor.

Tab. 3: Tabelle zu den Verdraengungsexperimenten an den Androgenrezeptoren (nicht dargestellt) im Lebercytosol. Dargestellt sind die mit Hilfe der logit-log-Transformation ermittelten IC50-Werte aus den Mittelwerten (n=7) bei weiblichen 2+ Ploetzen.

Bei den maennlichen 2+ Ploetzen (n=7) ergibt sich aus den Resultaten folgende Ordnung der Liganden nach ihrer Bindungsaffinitaet an den Androgenrezeptor im Lebercytosol (Tab. 4): MT > T > E2 > CYP. p,p`-DDE und TPT zeigten keine Affinitaet zum Androgenrezeptor.

Tab. 4: Tabelle zu den Verdraengungsexperimenten an den Androgenrezeptoren (nicht dargestellt) im Lebercytosol. Dargestellt sind die mit Hilfe der logit-log-Transformation ermittelten IC50-Werte aus den Mittelwerten (n=7) bei maennlichen 2+ Ploetzen.

Die Raten der Mortalitaet betrugen in der EX1:

Tab. 5: Mortalitaetsraten der ersten Exposition larvaler Ploetzen ueber einen Zeitraum von 210 Tagen (EX1).

Die Mortalitaetsraten in der EX2 betrugen:

Tab. 6: Mortalitaetsraten der zweiten Exposition larvaler Ploetzen ueber einen Zeitraum von 210 Tagen (EX2).

Die Mittelwerte der Totallaengen larvaler Ploetzen von den Expositionen 1 (EX1) und 2 (EX2) wurden im Verhaeltnis zur jeweiligen SoCo verglichen. Alle eingesetzten Konzentrationen von TPT fuehrten zu einer signifikanten Hemmung des Wachstums in der EX1 (Abb. 3.11). Die jeweils niedrigsten Konzentrationen von CYP 0,5*10-9 M und LET 0,5*10-9 M steigerten das Wachstum im Vergleich zur Loesungsmittelkontolle in der EX2 signifikant (Abb. 3.12).

Das Gewicht der larvalen Ploetzen wurde nach 210 Tagen ermittelt. Daraus ergab sich bei der EX1, dass bezogen auf die Mittelwerte der SoCo, TPT in allen Konzentration das Gewicht reduziert, wobei nur bei der niedrigsten Konzentration (TPT 0,5*10-9 M) ein signifikanter Unterschied vorhanden war. VIN und FEN fuehrten bei allen Konzentrationen zu einer tendenziellen Gewichtszunahme der larvalen Ploetzen, aber nur bei einer Vinclozolinkonzentration (VIN 0,5*10-8 M) und zwei Konzentrationen von Fenarimol (FEN 0,5*10-8 M und FEN 0,5*10-9 M) unterscheiden sich die Ergebnisse signifikant zur Loesungsmittelkontrolle (Abb. 3.13).

Bei der larvalen in vivo EX2 konnte nach 210 Tage bei der niedrigsten Konzentration von Letrozol (LET 0,5*10-9 M) bei der Endpunktmessung eine signifikanten Zunahme des Gewichtes festgestellt werden (Abb. 3.14).

Die in vivo eingesetzten Ploetzen (n=60/Konzentration) wurden nach 210 Tagen Exposition mit verschiedenen Substanzen unterschiedlicher Konzentrationen auf ihre Geschlechtsdifferenzierung untersucht. Das Geschlechterverhaeltnis der larvalen Ploetzen der EX1 wurde bestimmt und zeigte keine signifikanten Unterschiede zur Loesungsmittelkontrolle (Abb. 3.15). Die ebenfalls nach 210 Tagen beprobten larvalen Ploetzen aus der zweiten Exposition (EX2) zeigten im Verhaeltnis zur Loesungsmittelkontrolle bei der niedrigsten Konzentration von Methyltestosteron (MT 0,5*10^-9 M) signifikante Unterschiede. 73 % der 60 Ploetzen entwickelten maennliche Gonaden und nur 27 % weibliche. Bei den beiden hoechsten eingesetzten Konzentrationen von Methyltestosteron (MT 0,5*10^-8 M und MT 10^-8 M) entwickelten sich keine oder nur in wenigen Faellen (n = 8) rudimentaere Gonaden (Abb. 3.16).

Bei Rutilus rutilus nicht vorhandene Sequenzen fuer LH, FSH, AR und EF 1α wurden von bekannten Sequenzen artverwandter Spezies, wie dem Karpfen (C. carpio) abgeleitet und Primer fuer R. rutilus entworfen. Die PCR-Produkte wurden sequenziert und die Basenlaenge (bp) der cDNA bestimmt.

PCR-Produkt (cDNA): ARO Produktlänge [bp]: 332 Seq.homologie [%]: 99,9 homolog R.rutilus

PCR-Produkt (cDNA): LH Produktlänge [bp]: 278 Seq.homologie [%]: 97,0 homolog C. carpio

PCR-Produkt (cDNA): FSH Produktlänge [bp]: 385 Seq.homologie [%]: 98,0 homolog C. carpio

PCR-Produkt (cDNA): ges.ER Produktlänge [bp]: 303 Seq.homologie [%]: 99,9 homolog R.rutilus

PCR-Produkt (cDNA): AR Produktlänge [bp]: 423 Seq.homologie [%]: 98,0 homolog C. carpio

PCR Produkt (cDNA): EF 1alpha Produktlänge [bp]: 343 Seq.homologie [%]: 98,0 homolog C. carpiob. 7:

Die PCRs wurden fuer alle gewaehlten Biomarker als Doppelbestimmung durchgefuehrt. Sechs larvale Tiere, die nach 210 Tagen Exposition beprobt wurden, gingen pro Geschlecht und Behandlungsgruppe in die Analysen ein. Bei der Exposition der Tiere mit MT bei einer Konzentration von 10^-8 M konnte aus Mangel an cDNA die LH-mRNA-Expression fuer weibliche Tiere nicht durchgefuehrt werden. Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte mit Standardfehler dargestellt.

Aromatase (ARO)-mRNA

Bei den weiblichen larvalen Tieren kam es im Gehirn zu keinen signifikanten Unterschieden der Aromatase-mRNA-Expression (Abb. 3.17).

Bei den aus dem gleichen Versuchsansatz stammenden maennlichen Tieren zeigte sich, dass MT die Expression von ARO-mRNA signifikant steigerte (Abb. 3.18).

Luteinisierendes Hormon (LH)-mRNA

Bei der Bestimmung der LH-mRNA aus dem Gehirngewebe weiblicher und maennlicher larvaler Ploetzen konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Da die Tiere, die nach der 210-taegiger Exposition mit MT bei einer Konzentration von 10^-8 M, entweder maennlichen Geschlechts waren oder keine Gonaden entwickelt hatten, konnte keine Expression von LH-mRNA fuer das weibliche Geschlecht bestimmt werden. Daher sind hier nur die Ergebnisse fuer weibliche larvale Ploetzen aus den Expositionen in Konzentrationen von 10^-8 M mit TPT, VIN und LET im Verhaeltnis zur SoCo gezeigt (Abb. 3.19). Die MT-Konzentration von 10^-9 M, bei der es zu einer Gonadenentwicklung kam und eine Geschlechterdifferenzierung moeglich war, zeigte, dass die Ergebnisse nicht signifikant unterschiedlich waren (nicht dargestellt). Die Ergebnisse der Expression der LH-mRNA der maennlichen larvalen Tiere bei 10^-8 M hingegen sind auch fuer MT dargestellt (Abb. 3.20).

Follikelstimulierendes Hormon (FSH)-mRNA

Die Ergebnisse fuer die FSH-mRNA-Expression der Tiere, die bei einer Konzentration von 10^-8 M exponiert wurden, wiesen keine signifikanten Unterschiede, weder fuer die weiblichen (Abb. 3.21) noch fuer die maennlichen Tiere (Abb. 3.22), auf.

Oestrogenrezeptor (ER)-mRNA

Die ER-mRNA-Expression auf zellulaerer Ebene bei den lavalen Tieren wurde in der Leber gemessen. Bei den weiblichen larvalen Tieren zeigte sich nach der 210-taegigen Exposition mit Chemikalien in Konzentrationen von 10^-8 M, dass die mRNA-Expression im Falle von TPT signifikant gehemmt wurde (Abb. 3.23). Bei zwei weiteren Substanzen, LET und CYP, konnte im Lebergewebe maennlicher larvaler Ploetzen eine signifikante Steigerung der ER-mRNA-Expression nachgewiesen werden (Abb. 3.24).

Androgenrezeptor (AR)-mRNA

Signifikant unterschiedlich zur Loesungsmittelkontrolle zeigte sich die AR-mRNA-Expression im Lebergewebe larvaler weiblicher Ploetzen. TPT hemmte die Expression, waehrend LET, MT und CYP die AR-mRNA bei der eingesetzten Konzentration von 10^-8 M steigerten (Abb. 3.25).

Bei den maennlichen larvalen Ploetzen kam es durch TPT tendenziell auch zu einer Hemmung der Expression. Signifikant gesteigert zur SoCo wurde die mRNA-Expression durch VIN, LET, MT und CYP (Abb. 3.26).

Die in den Expositionen (EX1) und (EX2) in vivo exponierten Ploetzen wurden nach 210 Tagen untersucht. Hierbei wurden allen Tieren die Gonaden entnommen und nach der phenotypischen Festellung des Geschlechtes je eine Haelfte fuer die Bestimmung der Biomarker eingesetzt und die andere Haelfte fuer histologische Untersuchungen am IGB in Berlin oder am Limnomar-Institut in Hamburg verwendet. Dargestellt sind vergleichende HaemotoxylinEosinSchnitte (HE) aus den 10^-8 M Konzentrationen beider Expositionen.

Die Testes der SoCo zeigten aktive Spermatogenese mit fruehen Reifungsstadien, bei denen sich Spermatogonien bis Spermatiden zeigten (Abb. 3.27). Bei den weiblichen Tieren waren die Ovarien mit aktiver Oogenese zu sehen. Diese befanden sich ebenfalls nur in fruehen Reifungsstadien, wobei Oogonien bis vitellogene Oocyten vorhanden waren (Abb 3.28).

Die maennlichen Tiere, die ueber 210 Tage mit TPT exponiert waren, wiesen eine aktive Spermatogenese auf. Allerdings waren Reife und Groeße der Testis reduziert und nur Spematogonien vorhanden. Weiterhin waren stark ausgepraegte Lakunenbildungen zu beobachten (Abb. 3.29). Die Ovarien wiesen aktive Oogenese und einzelne atretische Oocyten sowie lokale Resorption von Oogonien (Abb. 3.30) auf.

VIN mit einer Konzentration von 10^-8 M fuehrte bei den exponierten Maennchen zu reduzierter Reife und Groeße der Testis. Trotz aktiver Spermatogenese fanden sich nur Spermatogonien in den Testis (Abb. 3.31). In den weiblichen Tieren war eine aktive Oogenese mit normaler Reifung vorhanden (Abb. 3.32).

LET mit einer Konzentration von 10^-8 M fuehrte bei den exponierten Maennchen zu normaler Reife und Groeße der Testis und einer aktiven Spermatogenese (Abb. 3.33). In den weiblichen Tieren war eine aktive Oogenese mit normaler Reifung vorhanden (Abb. 3.34).

MT fuehrte zu einer Supprimierung der Gonadenreife beider Geschlechter gegenueber der SoCo. Außerdem kam es zu einer Peritonealduplikation beider Geschlechter bei einer Konzentration von 10^-8 M. Daher sind hier die Schnitte aus der Exposition mit der naechst niedrigeren Konzentration, 0,5*10^-8 M, dargestellt. Bei den Maennchen (Abb. 3.35) kam es zu einer rudimentaeren Ausbildung der Gonaden in Peritonealduplikation. Die rudimentaeren Ovarien (Abb. 3.36) zeigten ebenfalls Peritonealduplikationen und ein vermehrtes Auftreten von Primordialzellen.

Die Exposition mit CYP mit 10^-8 M fuehrte in den maennlichen Gonaden zu einer aktiven aber reduzierten Spermatogenese. Die Reifungsstadien sind nur bis zu Spermatozyten vorhanden, Spermatiden fehlen im Vergleich zur SoCo komplett (Abb. 3.37). Weibliche Tiere bildeten eine aktive Oogenese in den Ovarien mit einzelnen atretischen Oozyten aus (Abb. 3.38).

Bei FEN 10^-8 M fand sich in den Testes der Ploetzen nach 210 Tagen eine aktive Spermatogenese mit reduzierter Reifung. Es waren nur Spermatogonien vorhanden (Abb. 3.39). Bei den Weibchen zeigte sich eine normale Reifung der Ovarien mit aktiver Oogenese. Hier waren alle Stadien der Eireife vorhanden (Abb. 3.40).

Die Raten der Mortalitaet betrugen in der EX3:

Tab. 7: Mortalität adulter Plötzen nach vierzehntägiger Exsposition (EX3).

Je sechs Tiere (n = 6) pro Behandlungsgruppe und Geschlecht wurden untersucht. Pro Probe wurde eine Doppelbestimmung bei jeder PCR durchgefuehrt.

Aromatase (ARO)-mRNA

In den Gehirnen der weiblichen 2+ Tieren kam es zu keinen signifikanten Unterschieden der Aromatase-mRNA-Expression nach vierzehntaegiger Exposition mit TPT, VIN, LET und MT bei einer Konzentration von 10^-8 M (Abb. 3.41).

Bei den aus dem gleichen Versuchsansatz stammenden maennlichen Tieren zeigte sich, dass MT die Expression von ARO-mRNA signifikant steigerte gegenueber der SoCo (Abb. 3.42).

Luteinisierendes Hormon (LH)-mRNA

Die Expression der mRNA des LH wurde bei den 2+ Tieren nach vierzehntaegiger Exposition mit TPT in den Gehirnen beider Geschlechter untersucht. Obwohl die LH-mRNA in beiden Geschlechtern tendenziell erhoeht war, waren weder bei den 2+ Weibchen (Abb. 3.43) noch bei den maennlichen 2+ Ploetzen (Abb. 3.44) signifikante Unterschiede zur SoCo auf der zellulaeren Ebene darstellbar. Alle weiteren Proben waren hinsichtlich des Vergleichs zur SoCo ohne nennenswerten Befund.

Follikel stimulierendes Hormon (FSH)-mRNA

Bei der Analyse der FSH-mRNAExpression zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in allen Proben zur SoCo. Abb. 3.45 zeigt die Ergebnisse fuer die weiblichen Gehirnproben und Abb. 3.46 die der maennlichen 2+ Ploetzen.

Oestrogenrezeptor (ER)-mRNA

Die Expression der ER-mRNA wurde in den Gonaden der adulten Tiere gemessen. Zur SoCo zeigte sich bei den mit MT exponierten weiblichen 2+ Tieren eine Abnahme der Expression (Abb. 3.47), die bei den maennlichen 2+ Ploetzen nicht gefunden wurde (Abb. 3.48).

Androgenrezeptor (AR)-mRNA

Bei den weiblichen 2+ Ploetzen, die nach vierzehntaegiger Exposition mit Vinclozolin beprobt wurden, zeigte sich eine deutliche Abnahme im Fall der AR-mRNA in den entnommenen Gonaden (Abb. 3.49). Fuer die maennlichen Tiere traf dies nicht zu (Abb. 3.50).

Bei den Enzymbestimmungen wurden nach vierzehntaegiger Exposition von 2+ Ploetzen mit TPT, VIN, LET, MT und mitgefuehrten SoCo in einer Konzentration von 10^-8 M die Aktivitaeten verschiedener Enzyme im Gehirn und in den Gonaden bestimmt. Die Anzahl der Messung zugrunde liegenden Tiere ist in dem jeweiligen Diagrammbalken vermerkt. Signifikante Unterschiede zur Loesungsmittelkontrolle wurden mit Hilfe des Dunnett`s-Test statistisch ausgewertet und gekennzeichnet. Aromatase, ein Enzym das T in E2 umwandelt, wurde vergleichend sowohl in weiblichen Gehirnen als auch in Gehirnen maennlicher Ploetzen untersucht. Die Aktivi-taeten der Enzyme wurden in pmol/h/mg Protein gemessen und ergaben bei den weiblichen Tieren keine signifikanten Unterschiede zur SoCo (Abb. 3.51).

In den maennlichen Tieren hingegen senkte LET die Aromataseaktivitaet und MT steigerte sie (Abb. 3.52).

Da die Kollegen in der Universitaetklinik Bonn zum Zeitpunkt der Untersuchungen nur die Aromatase-Enzymaktivitaeten in den Gehirnen von beiden Geschlechtern bearbeiten konnten, gibt es keine weiteren Ergebnisse zu den Aktivitaeten von 17ß-Hydroxysteroid-Dehydrogenaseaktivitaet und 5α-Reduktase.

Nach vierzehntaegiger Exposition (EX3) mit vier verschiedenen Substanzen, TPT, VIN, LET, MT und parallel mitgefuehrten SoCo bei einer Konzentration von jeweils 10-8 M wurden pro Exposition je acht weiblichen (n=8) und acht maennlichen (n=8) 2+ Ploetzen Blut aus der Caudalvene entnommen und mittels eines Enzym-Immuno-Assays (EIA) die Konzentration an 17ß-Oestradiol (E2) und 11-Keto-Testosteron (11-KT) im Blutplasma bestimmt. Hierbei zeigte sich, dass die Konzentrationen von E2 bei den Weibchen gegenueber der Loesungsmittelkontrolle ca. fuenffach hoeher waren als bei den Maennchen. Im Vergleich der weiblichen Tiere untereinander hemmten TPT, LET und MT die Konzentrationen von E2 signifikant zur Loesungsmittelkontrolle (Abb. 3.53). Dargestellt sind die Mittelwerte mit Standardfehler.

Bei den Maennchen senkte nur MT bei einer Konzentration von 10-8 M die im Blutplasma gemessene Menge an E2 signifikant zur Loesungsmittelkontrolle (Abb. 3.54).

Die 11-KT-Spiegel im Blutplasma der maennlichen 2+ Tiere aus den SoCo waren nach vierzehntaegiger Exposition ca. zwoelffach hoeher als bei den Weibchen. Bei den weiblichen Tieren senkte MT die 11-KT-Konzentration im Blutplasma signifikant zur SoCo (Abb. 3.55). Die Mittelwerte der Konzentrationen von 11-KT im Plasma der MT-behandelten maennlichen 2+ Ploetzen waren im Verhaeltnis zur SoCo signifikant niedriger (Abb. 3.56). Dargestellt sind die Mittelwerte der Ergebnisse aus den EIA von acht Tieren pro Geschlecht und die Standardabweichungen. Signifikante Unterschiede zur SoCo wurden mit dem Dunnett`s-Test ermittelt und gekennzeichnet.