4 Diskussion

Zur Bestimmung endokriner Wirkungen von AACs bei R. rutilus wurden verschiedene Methoden in vitro und in vivo erstmalig entwickelt, etabliert und angewendet, um potentielle Stoerungen dieser EDs zu bestimmen. Als AACs wurden verwendet:

Triphenylzinn (TPT) ist eine Substanz, die in Pflanzenschutzmitteln vorkommt und Androgenrezeptor (AR) vermittelte Transkriptionen aktiviert ohne an der Androgenbindungsstelle des Rezeptors zu binden und ohne die Autoinduktion des AR zu behindern (Yamabe et al. 2000). TPT besitzt in Mammalia eine potenziell androgene Wirkung, da durch TPT auch die Aromatase gehemmt wird und somit anstelle von E2 vermehrt Androgene sezerniert werden (Nakanishi et al., 2006).

Methyltestosteron (MT), ein synthetisch hergestelltes Androgen, das durch Alkylierung von Testosteron in der 17α-Position erzeugt wird, hat eine potenziell androgene Wirkung.

Vinclozolin (VIN), ein Fungizid, zeigte nur eine geringe Affinitaet zum Androgenrezeptor (AR) beim Menschen (Kelce et al., 1994). Durch Hydrolyse entstehen die beiden Metabolite, M1 und M2, welche als AR-Antagonisten die Transkription androgenabhaengiger Gene verhindern (Wong et al., 1995).

Cyproteronazetat (CYP), ein synthetisches Gestagen, das zur Therapie bei Prostatakarzinomen eingesetzt wird, gehoert zu der Wirkstoffklasse der Rezeptorblocker, und weist eine potenzielle antiandrogene Wirkung auf.

Letrozol (LET), einem Medikament aus der Brustkrebs-Rezidivprophylaxe, das in Deutschland erst im Maerz 2006 zugelassen wurde, ist ein Aromatasehemmer und somit potenziell androgen.

Fenarimol (FEN), ein Pflanzenschutzmittel, ist ebenfalls ein Aromatasehemmer und somit potenziell androgen.

Zusammengefasst wurden drei Gruppen von AACs eingesetzt.

Die Gruppe mit androgener Wirkung: TPT und MT.

Die Gruppe mit antiandrogener Wirkung: VIN und CYP.

Die Gruppe der Aromatasehemmer, und somit androgener Wirkung: LET und FEN.

Um festzustellen, ob Umweltchemikalien eine androgene oder antiandrogene Wirkung ueber die Androgen-Rezeptoren hervorrufen, muss zunaechst die Bindungsfaehigkeit solcher Substanzen an den Rezeptor gezeigt werden. Die Bindung an einen Rezeptor ruft nicht unbedingt eine biologische Wirkung hervor. Ebenso koennte durch die Bindung an den Rezeptor eine Blockierung der transaktivierenden Funktionen, also ein antagonistischer Effekt, auftreten. Die Bindung an den Rezeptor stellt somit die erste Moeglichkeit (anti)androgenen Wirkmechanismen dar. Daher ist es von essentieller Bedeutung den Androgenrezeptor bei R. rutilus daraufhin zu charakterisieren, was innerhalb dieser Arbeit anhand der Methode des Radiorezeptorassays mit cytosolischen Extrakten der Gonaden und der Leber von R. rutilus durchgefuehrt wurde.

Bisher sind noch keine Untersuchungen zur Charakterisierung der Ligandenbindung an Androgen-Rezeptoren bei R. rutilus durchgefuehrt worden. Daher stellen die hier aufgezeigten Befunde die ersten Ergebnisse zur Charakterisierung und Etablierung der Androgen-Rezeptor-Bindung in den Gonaden und der Leber von R. rutilus dar. Optimale Inkubationbedingungen ergaben sich unter der Verwendung von Tris-HCl-Puffer bei einer Temperatur von 4°C wie bei Lutz und Kloas (1999) fuer die Oestrogen-Rezeptor-Bindung bei Xenopus laevis beschrieben, was durch eigene Vorversuche bei R. rutilus bestaetigt wurde. Durch die Ergebnisse des Zeitverlaufs der Bindung von Testosteron an die Androgen-Rezeptoren zeigte sich, ab welchem Zeitraum sich Testosteron an die Androgen-Rezeptoren spezifisch bindet und ueber welchen Zeitraum die Inkubationsbedingungen die Aufrechterhaltung eines stabilen Gleichgewichtes zwischen Assoziation und Dissoziation (steady state) des Liganden und seines Rezeptors ermoeglichten. Bis zu 3 Stunden erfolgte ein kontinuierlicher Anstieg der spezifischen Bindung, um dann eine maximale Bindung als steady state zu erreichen, die fuer 21 Stunden stabil blieb, bevor sie wieder abfiel, was optimale Bedingungen fuer Untersuchungen von AACs hinsichtlich ihrer Bindungsfaehigkeit an die nukleaeren Androgenrezeptoren bei R. rutilus gewaehrleistet.

Die Ergebnisse zur Spezifizierung des Androgen-Rezeptors in der Leber und den Gonaden von R. rutilus wurden mit maennlichen und weiblichen Tieren durchgefuehrt. Die Affinitaet der verschiedenen Liganden ergab innerhalb einer Gewebeart keine signifikanten statistischen Unterschiede zwischen Maennchen und Weibchen, weshalb die Ergebnisse zusammengefasst betrachtet werden koennen. Bezueglich der IC₅₀-Werte ergab sich fuer die kompetitiven Wirkungen der Liganden und den daraus resultierenden Affinitaeten zum Androgen-Rezeptor in den Gonaden folgende Reihenfolge: MT ≥ T > E2 ≥ CYP. TPT und p,p`-DDE besaßen keine Affinitaet zum Rezeptor. Die IC₅₀-Werte zeigen, dass T, der natuerliche Ligand, und MT, ein synthetisch hergestelltes Steroidhormon, die hoechsten Affinitaeten zum Androgen-Rezeptor besitzen. E2, eines der wichtigsten natuerlichen Oestrogene, und CYP weisen eine deutlich geringere Affinitaet zum AR auf als T und MT.

Somit konnte erstmals gezeigt werden, dass der AR eine hohe Spezifitaet fuer seinen natuerlichen Liganden T und das synthetische Androgen MT, besitzt. Die hohe Spezifitaet wurde auch durch die geringe Bindungsaffinitaet der Oestrogene belegt. In einer Studie, die dies ebenfalls belegt, wurden 202 Chemikalien auf ihre Bindung an den Androgenrezeptor von Ratten untersucht (Fang et al. 2003). Hierbei wurde die gleiche Reihenfolge der Bindungsaffinitaet an den AR gefunden wie in der hier vorliegenden Studie. Das p,p`-DDE keine Affinitaet zum AR in den Gonaden von R. rutilus zeigt, koennte an der Sensitivitaet des RARAs liegen. Wie Fang et al. zeigten, liegt der IC<sub>50</sub>-Wert fuer p,p`-DDE in der Studie um zwei bis drei Zehnerpotenzen hoeher als der von T oder MT. Obwohl bei R. rutilus die eingesetzte Menge an p,p`-DDE hoeher war als die von T oder MT, koennte der Radiorezeptorassay hier nicht mehr sensibel genug gewesen sein. Eine Verdraengung waere bei hoeheren Konzentrationen von p,p`-DDE aber zu erwarten, was aber aufgrund der Loeslichkeit von p,p`-DDE in diesen Assays nicht mehr durchfuehrbar war. TPT hingegen bindet nicht in der Bindungstasche des AR wie der natuerliche Ligand und zeigt somit keine Affinitaet gegenueber der Bindungsstelle des natuerlichen Liganden (Yamabe et al. 2000). Die gleiche Reihenfolge der Affinitaeten der Liganden und die gleichen Schlussfolgerungen ergaben sich auch bei den Untersuchungen fuer das Bindungsverhalten der AR in der Leber von Maennchen und Weibchen von R. rut i lus.

Alle hier eingesetzten Substanzen fuehrten zu einer Verdraengung des natuerlichen Liganden am AR außer p,p`-DDE und TPT. p,p`-DDE und TPT zeigten eine geringe oder keine Affinitaet zum AR. Bei p,p`-DDE war die eingesetzte Konzentration zu niedrig und TPT bindet an einer anderen Stelle als der Ligand am Rezeptor. Die charakterisierte AR-Bindung zeigt, dass der AR von R. rutilus eine soweit belegte recht aehnliche Spezifitaet wie andere Vertebraten-Modelle aufweist. Hinsichtlich der Wirkungen von AACs stellt R. rutilus somit ein gutes vergleichendes Modell dar.

Die Aufzucht und Exposition in einem semistatischem System von R. rutilus vom Eistadium ueber 210 Tage nach der Fertilisation mit AACs wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals durchgefuehrt. Die Mortalitaet betrug bei der ersten Exposition (EX1) in allen Faellen unter 6,6 %. TPT, VIN, und FEN wurden hierbei in vier Konzentrationen (0,5*10^-9 M, 10^-9 M, 0,5*10^-8 M und 10^-8 M) eingesetzt sowie zwei Becken mit Loesungsmittel zur Kontrolle. Eine Ausnahme bildet die Mortalitaetsrate in einem Becken bei einer TPT-Konzentration von 0,5*10^-8 M. Hier starben aus nicht zu klaerenden Ursachen 80,0 % des Beckenbesatzes. Bei der zweiten Exposition (EX2) betrug die Mortalitaet in allen Faellen 0,0 %. Die verwendeten AACs waren hier MT, CYP und LET in den gleichen Konzentrationen wie bei der EX1 (0,5*10^-9 bis 10^-8 M). Ebenfalls gab es zwei Loesungsmittelkontrollen (SoCo). Im Vergleich dazu haben Liney et al. (2006) R. rutilus nach der Fertilisation ueber 300 Tage in einer Durchflussanlage exponiert, konnten aber nach Abschluss der Exposition keine Aussagen ueber die Mortalitaet treffen. In aehnlichen Studien mit Danio rerio betrugen die Mortalitaetsraten 21 % bis 34 % (Nash et al., 2004) bzw. 50 % (Hill and Janz, 2003). Somit ist die Mortalitaetsrate von 0,0 % bis 6,6 % bei R. rutilus als sehr gering einzuschaetzen, was auf nahezu optimal entwickelte Haelterungsbedingungen schließen laesst.

Nach 210-taegiger Exposition wurden die Gesamtlaengen der larvalen R. rutilus gemessen. Hierbei zeigte sich, dass die Laenge aller Fische der TPT-Expositionen im Mittel signifikant geringer war im Vergleich zur SoCo. Expositionen mit Wasser aus Klaeranlagenauslaeufen zeigten keine Unterschiede im Laengenwachstum bei R. rutilus (Liney et al. 2006). Da bekannt ist, dass bei TPT der Anteil an Zinn hauptverantwortlich ist fuer die adversen Effekte, wurden von den nominellen Konzentrationen, die hier eingesetzt wurden (0,5*10^-9 M bis 10^-8 M), nach der Exposition der Anteil von Zinn in µg/L Feuchtgewicht bestimmt. In der hier vorliegenden Studie wurden TPT-Sn-Konzentrationen von 60–776 µg/kg Feuchtgewicht gemessen (persoenliche Mitteilung: Thierry Dagnac, BRGM, France). Diese liegen unter denen in der Studie von Harino et al. bei adulten japanischen Barschen gemessenen umweltrelevanten Konzentrationen von 1000-130000 µg/kg Feuchtgewicht (Harino et al. 2000), bei der keine Unterschiede im Laengenwachstum gefunden wurden. So konnte hier erstmals gezeigt werden, dass TPT in geringen umweltrelevanten Konzentrationen bei Larven von R. rutilus einen hemmenden Effekt auf das Laengenwachstum hat.

Weiterhin ist bekannt, dass bei Ambystoma barbouri, einer Art der Querzahnmolche, die im Sueßwasser stattfindende larvale Entwicklung unter Einfluss von TPT in nominellen Konzentrationen von 1 µg/L und 5 µg/L stark beeintraechtigt wurde. Hierbei kam es unter anderem zu einer Dosis abhaengigen extremen Reduktion der Koerperlaenge im Vergleich zur Kontrolle (Rehage et al., 2001). Ebenfalls eine Beeintraechtigung der larvalen Entwicklung und Koerpermissbildungen wurden bei der Elritze (Phoxinus phoxinus) nachgewiesen (Fent und Meier, 1994). Hierbei wurden die Fische bei 21°C und nominellen Konzentrationen von 3,9 µg/L bis 15,9 µg/L gehaeltert. Effekte, wie Koerpermissbildungen und Mortalitaet, traten bereits nach 3 bzw. 5 Tagen auf. In der vorliegenden Studie wurden die larvalen R. rutilus bei 20 ± 1°C und einer nominellen Konzentration von 0,059 µg/L bis 1,187 µg/L TPT exponiert. Diese Konzentrationen liegen unter der Dosis, die Fent und Meier (1994) eingesetzt haben, und bewirkten keine gesteigerte Mortalitaetsrate, hatten aber nach 210 Tagen einen signifikanten Effekt auf die Koerperlaenge der Larven von R. rutilus im Vergleich zur Kontrolle. MT, die zweite hier eingesetzte Substanz mit androgener Wirkung, zeigte hingegen keine signifikanten Unterschiede zur SoCo. Dies erklaert sich aus der schlechteren Gesamtentwicklung, auf die spaeter noch eingegangen wird. Beide Antiandrogene, VIN und CYP, zeigten genau wie FEN, ein potentieller Aromatasehemmer, keine Auswirkung auf das Laengenwachstum der Larven von R. rutilus. Letrozol, ein weiterer potentieller Aromatasehemmer, bewirkte in der niedrigsten Konzentration, dass die Koerperlaenge im Vergleich zur SoCo signifikant hoeher war. Bei einer umfangreichen Studie mit Japanischen Reiskaerpflingen (Oryzias latipes) wurden befruchtete Eier und Larven fuer 14 Tage bei einer maximalen Konzentration von 3125 µg/L Letrozol exponiert. Es zeigten sich allerdings keinerlei Effekte auf die Morphologie (Shuna et al. 2007). Da es sich bei der Exposition von R. rutilus mit Letrozol um die erste Studie ueberhaupt handelt, die ueber einen Zeitraum der gesamten Geschlechtsdifferenzierung durchgefuehrt wurde, ist festzustellen, dass Letrozol in einer Konzentration von 713 µg/L eine signifikante Steigerung der Koerperlaenge hervorgerufen hat, was auf Effekte auf die Wachstumsregulation schließen laesst.

Der signifikante Unterschied im Gewicht von R. rutilus bei der niedrigsten TPT-Konzentration im Vergleich zur Loesungsmittelkontrolle ist konform mit der niedrigeren Koerperlaenge. Genauso wie das hoehere Gewicht bei der niedrigsten Letrozol-Konzentration mit der Zunahme der Koerperlaenge.

Die signifikante Zunahme des Gewichtes bei einer Vinclozolin-Konzentration und zweier Fenarimol-Konzentrationen sind weder Dosis abhaengig noch durch eine anderen Einfluss zu erklaeren und repraesentieren daher wohl eher die zufaellig auftretende biologische Variabilitaet bei R. rutilus.

MT und TPT sind androgen wirksame Substanzen. Ueber die Auswirkungen von TPT auf das Geschlechter.verhaeltnis bei Sueßwasserfischen ist bis dato nichts bekannt. In Konzentrationen von 38,5 µg/L zeigte sich bei Vorversuchen, dass TPT nach nur 48 h zu 100 % letal auf die Larven von R. rutilus wirkte (van Ballegooy, unveroeffentlicht). Daher wurde in der EX1 als hoechste Konzentration eine Zehnerpotenz niedriger gewaehlt als in den Vorversuchen. Die Fische konnten so ueber einen Zeitraum von 210 Tagen exponiert werden, zeigten aber keine Unterschiede zur SoCo hinsichtlich der Sexualdifferenzierung der Geschlechter.

TPT fuehrt in Gastropoden zur Vermaennlichung (Horiguchi, 2006). Bei Fischen wurde gezeigt, dass es zu einer Akkumulation von TPT in verschiedenen Geweben kommt. Dies ergaben Auswertungen von Proben diverser Sueßwasserfische aus verschiedenen Fluessen und Seen in Deutschland zwischen 1988 und 2003 (Rudel et al., 2007). Allerdings hat die Exposition von larvalen R. rutilus mit hoeheren Konzentrationen letale Folgen, so dass TPT wohl hinsichtlich der Geschlechtsdifferenzierung eher toxisch als endokrin wirksam ist.

Von MT hingegen ist bekannt, dass dieses kuenstliche Androgen zu einer Vermaennlichung bei verschiedenen Tierarten - Invertebraten, Amphibien und Fischen - fuehren kann (Schulte-Oehlmann et al., 2000; Boegi et al., 2002; Seki et al. 2004). Bei den in dieser Arbeit eingesetzten niedrigsten Konzentration von MT (0,151 µg/L) kam es zu einer signifikanten Verschiebung des Phaenotypes in Richtung Maennchen. Bei den progynen Zebrafischen (Danio rerio) kam es in einem „partial life-cycle test“ bei jeder der verwendeten Konzentrationen (26-1000 µg/L) zu einer totalen Vermaennlichung der eingesetzten juvenilen Tiere (Orn et al., 2003). In einer Studie mit Reiskaerpflingen (Oryzias latipes) kam es durch Injektion von MT zu einer phaenotypischen maennlichen Ausbildung von genotypischen Weibchen (Papoulias et al., 2000). Die beiden hoechsten Konzentrationen (1,51 bzw. 3,02 µg/L) fuehrten dazu, dass die larvalen R. rutilus keine Gonaden ausbildeten. Dieser Effekt ist bei Fischen bisher noch nicht beschrieben worden.

Die potentiell antiandrogen wirksamen Substanzen VIN und CYP zeigten keine Einfluesse auf die Geschlechtsdifferenzierung bei larvalen R. rutilus in den eingesetzten Konzentrationen. VIN verursachte in einem anderen Versuch ueber 100 Tage nach dem Schluepfen bei einer Konzentration von 2500 µg/L keine Effekte auf die Geschlechtsdifferenzierung bei Japanischen Reiskaerpflingen (Oryzias latipes). Das Gleiche galt auch fuer CYP bei einer eingesetzten Konzentration von 10 µg/L (Kiparissis et al., 2003). Alle bei EX1 und EX2 mit R. rutilus eingesetzten Konzentrationen lagen deutlich unterhalb der von Kiparissis gewaehlten Konzentration, so dass sich auch hier kein Einfluss durch VIN und CYP auf die Geschlechterverteilung festzustellen war.

In dieser Arbeit zeigten die beiden eingesetzten Aromatasehemmer FEN und LET keine Effekte auf das Geschlechterverhaeltnis bei larvalen R. rutilus im Verhaeltnis zur SoCo. Dies laesst den Rueckschluss zu, dass die hoechsten gewaehlten Konzentrationen von 2,83 µg/L (LET) bzw. 3,31 µg/L (FEN) unterhalb der effektiven Konzentrationen liegen und ueber den Expositionzeitraum von 210 Tage nach dem Schluepfen der Fische keine direkte Auswirkung auf die Geschlechtsdifferenzierung bei larvalen R. rutilus haben. Bei hoeheren Konzentrationen waere eventuell bei R. rutilus mit einer Verschiebung des Geschlechterverhaeltnisses in Richtung der Maennchen zu rechnen. So fuehrte eine Konzentration von 500 µg/g Futter/Tag eines zur Therapie bei Mammakarzinomen eingesetzten Aromatasehemmers, Fadrozol, bei Zebrafischen (Danio rerio) zu einer 100%igen Vermaennlichung (Fenske und Segner, 2004). In der Japanischen Flunder (Paralichthys olivaceus) kam es durch die taegliche Fuetterung von larvalen Fischen mit Fadrozol in einer Konzentration von 100 µg/g Futter/d vom dreißigsten bis zum 100sten Tag nach dem Schluepfen bei 100 % der genetisch weiblichen Fische zur Entwicklung von maennlichen Gonaden. Bei der niedrigsten Konzentration, 1 µg/g Futter/Tag, belief sich der Anteil der vermaennlichten Tiere nur noch auf 30% (Kitano et al., 2000).

Um die Wirkung von AACs auf der Ebene der Genexpression nachzuweisen und um den Einfluss weiterer Faktoren, wie sie im Gesamtorganismus vorhanden sind, auszuschließen, wurde die Methode der semiquantitativen Reverse-Transkriptase-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR) bei den Zielorganen Gehirn und Leber durchgefuehrt. Hierbei wurde die Expression der mRNA in verschiedenen Geweben nachgewiesen. Im Gehirn wurde die m-RNA-Expression von ARO, LH und FSH bestimmt. In der Leber von R. rutilus wurde die Expression der m-RNA des ER und des AR detektiert. Um eine semiquantitative Bestimmung der jeweiligen m-RNA zu ermoeglichen, wurde parallel das „housekeeping gene“ EF 1α nachgewiesen. Erstmalig wurde in dieser Arbeit die Expression der LH-mRNA und FSH-mRNA detektiert. Hierzu wurden fuer beide Biomarker neue Primer gestaltet und etabliert. Fuer den Primer der LH-mRNA wurde vor der Erstellung der Arbeit Sequenzen von Carter et al. (2005) veroeffentlich. Diese wurden zunaechst verwendet. Allerdings sind die veroeffentlichen Primersequenzen fehlerhaft und daher fuer die Detektion der LH-mRNA nicht geeignet.

Die im Gehirn der larvalen R. rutilus gemessenen Ergebnisse zeigten bei allen eingesetzten AACs keine signifikanten Unterschiede in der LH-mRNA-Expression und in der FSH-mRNA-Expression im Vergleich zur Kontrolle. In der Literatur ist beschrieben, dass Aromatasehemmer in Fischen zu einem Anstieg der LH-mRNA im Gehirn und zu einer geringen bis zu keiner Regulation der FSH-mRNA-Expression fuehren (Sohn et al., 1998; Mateos et al., 2002). Dies deutet darauf hin, dass LH auch waehrend der Ontogenese bei R. rutilus eine Schluesselrolle in der Sexualdifferenzierung spielen koennte und durch exogene Substanzen dahingehend beeinflusst werden kann, dass es zu einer Vermaennlichung bzw. zur Hemmung der Gonadenentwicklung kommt. Durch die Testosteronerhoehung im Gehirn der Maennchen kommt es sehr wahrscheinlich zu einer negativen Rueckkopplung ueber die Androgene und somit zu einer Gegenregulation, die zu einer Erhoehung der LH-mRNA-Expression fuehrt. Weiterhin kann durch die tendenzielle Erhoehung der LH-mRNA-Expression in manchen Behandlungsgruppen dieser Studie bestaetigt werden, dass FSH weniger stark reguliert ist wie LH. Wuerde man die mRNA-Expressionen nicht wie hier aus dem Gesamthirn messen sondern beispielsweise lokal in der Hypophyse, koennten gegebenenfalls tendenzielle Aenderungen sich signifikant darstellen.

Bei den hier verwendeten maennlichen R. rutilus stieg die ARO-mRNA-Expression in der mit 0,151 µg/L MT behandelten Tiere in den Gehirnen signifikant um das ca. 4,5-fache im Vergleich zu den Tieren aus der SoCo. Die ARO-mRNA-Expression im Gehirn steht im direkten Zusammenhang mit der gonadalen Sexualdifferenzierung. Viele verschiedene Pestizide und Chemikalien, die weltweit im Gebrauch sind, haben in vitro Effekte auf die Aromataseaktivitaet in verschiedenen Gruppen der Vertebraten (z.B. Mason et al., 1987; Vinggaard et al., 2000; Sanderson et al., 2002; Zarn et al., 2003; Heneweer et al., 2004) und Invertebraten (Janer et al., 2006; Duft et al., 2007) gezeigt. Die Hemmung des Enzyms ARO, das maßgeblich an der Umwandlung von T in E2 beteiligt ist, kann zu einer Vermaennlichung fuehren. Allerdings wurde auch eine 100 %ige Verweiblichung von protogynen Zebrafischen (Danio rerio) bei einer Exposition mit 10 µg/L MT beobachtet. Dies ging einher mit dem Anstieg der ARO-mRNA-Expression im Gehirn (Fenske und Segner, 2004). Im Gegensatz zu den Zebrafischen kam es hier bei den gonochoristischen R. rutilus zu einer signifikanten phaenotypischen Vermaennlichung waehrend der gonadalen Entwicklung. Im Gehirn der maennlichen Tiere fuehrt MT voraussichtlich zu einer Gegenregulation. Um dem hohen Anteil an Androgenen gegenzusteuern, kommt es zu einer vermehrten ARO-Synthetisierung. Im weiblichen Gehirn hat der Effekt, der von der erhoehten MT-Konzentration ausgeloest wurde, durch die natuerlich vorkommende hohe Konzentration von E2 keine Auswirkungen auf die Aromatasesynthese. Genau wie bei dem Zebrafisch zeigt das Ergebnis, dass das exogene Androgen MT in den Prozeß der Aromatasesynthese im Gehirn bei R. rutilus drastisch eingreift.

TPT und alle anderen eingesetzten AACs hatten keinen Einfluss auf die Genexpression der Aromatase-m-RNA-Expression. Allerdings wurde eine Inhibierung der Expression durch den Aromatasehemmer LET erwartet. Tendenziell ist dies auch in den Gehirnen maennlicher Tiere aufgetreten ohne aber signifikant zu sein. Bei hoeheren Konzentrationen waere dies eventuell der Fall gewesen.

Um die Auswirkungen der eingesetzten AACs auf Zielorgane des endokrinen Systems bei R. rutilus und um die mit dem RARA gewonnenen Ergebnisse auf ein weiteres endokrines Zielorgan zu untersuchen, wurden die Genexpressionen der ER-mRNA und AR-mRNA in der Leber detektiert. Hierbei zeigte sich, dass TPT die ER-mRNA-Expression in den Weibchen stark hemmt. Da die hier eingesetzte Konzentration um nur eine Zehnerpotenz niedriger war als die letale Dosis aus den Vorversuchen, scheint es sich hier um einen toxischen Effekt zu handeln, der nicht letal wirkt dafuer aber die Autoinduktion der ER-mRNA-Expression bzw. generell jede Genexpression inhibiert. Dies wird auch durch die Ergebnisse der AR-mRNA unterstuetzt, die in beiden Geschlechtern von R. rutilus eine Abnahme der Expression aufweist.

Das Androgen MT steigert die AR-mRNA-Expression in der Leber beider Geschlechter signifikant. Da MT einen erhoehten Androgenspiegel induziert, liegt hier die Vermutung nahe, dass es sich um eine Autoinduktion handelt.

CYP reguliert in der Leber der weiblichen und maennlichen Tiere als potenziell antiandrogene Substanz die Expression der AR-mRNA signifikant nach oben im Vergleich zur SoCo. Genauso wie VIN, ebenfalls mit potenzieller antiandrogener Wirkung, in der Leber der Maennchen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass durch die Blockierung der AR es zu einer Zunahme der Expression der AR kommt, um dadurch wieder funktionelle AR zur Verfuegung zu haben. Der Mechanismus, dem eine solche Regulation zugrunde liegt, ist noch unklar, muss aber unabhaengig von der oben beschriebenen Autoinduktion des AR durch Androgene sein. Der potentielle Aromatasehemmer LET erhoeht die AR-mRNA-Expression in der Leber von R. rutilus bei beiden Geschlechtern signifikant. Hier duerfte es sich um eine Autoinduktion des AR durch die Erhoehung der Androgenkonzentration handeln.

Neben den morphologischen, biochemischen und molekularbiologischen Endpunkten, wurden die Gonaden histologisch untersucht. Hierbei riefen die verschiedenen eingesetzten Substanzen adverse Effekte in den Gonaden von R. rutilus hervor. War zunaechst bekannt, dass vermutlich EDs in den Gonaden von wild lebenden adulten R. rutilus zu Missentwicklungen, Intersex und zur Minderung der Fertilitaet fuehren (Jobling et al., 2002), wurde spaeter gezeigt, dass auch larvale R. rutilus, die ueber einen Zeitraum von 300 Tagen nach der Befruchtung exponiert wurden, adverse Effekte in der Gonadenentwicklung aufwiesen (Liney et al., 2005, 2006). Bei diesen Untersuchungen handelte es sich vorwiegend um die Exposition mit Klaeranlagenauslaeufen. Dabei wurde der Focus hauptsaechlich auf oestrogen wirksame Substanzen gelenkt.

In der hier vorliegenden Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass AACs die Gametogenese bei larvalen R. rutilus stark beeintraechtigen. So zeigten die maennlichen Tiere nach einer Expositionszeit von 210 Tagen post Fertilisation mit TPT, eine aktive Spermatognese, die aber mit Lakunenbildung einherging und in der nur Spermatogonien und keine weiterfuehrenden Reifestadien wie in den Loesungsmittel-Kontrolltieren vorhanden waren. Wieterhin waren Reife und Groeße der Testes im Verhaeltnis zu den Maennchen der SoCo reduziert. Hier liegt eine Hemmung der Gonadenentwicklung vor, die sich vermutlich durch die nahe an der Toxizitaetsgrenze liegenden Konzentration von 10^-8 M erklaeren laesst. Die Weibchen weisen eine aktive Oogenese auf, zeigten aber einzelne atretische Oocyten sowie lokale Resorption von Oogonien auf. Dass der Effekt von TPT, einer androgen wirksamen Substanz (Fang et al., 2003), staerker auf die maennlichen Tiere als auf die weiblichen Tiere wirkte, war zu erwarten. Der Wirkmechanismus koennte die Hemmung der Glucuronidisierung von T in Fischen durch TPT sein (Lavado et al., 2004) oder die von Saeugern und Mollusken bekannte Wirkung als Aromatasehemmer (Naganishi et al., 2006; Duft et al., 2007).

Bei den R. rutilus, die ueber 210 Tage mit MT in Konzentrationen von 1,51 µg/L bzw. 3,02 µg/L exponiert wurden, war die gonadale Entwicklung beider Geschlechter zu 100 % supprimiert, so dass eine histologische Auswertung nicht moeglich war. Bei einer Konzentration von 0,3 µg/L MT waren 6,3 % der maennlichen Gonaden nur rudimentaer ausgebildet und bei den Ovarien kam es bei 6,3 % der Tiere zu Atresien in den Gonaden. Auch bei Pimephales promelas wurde nach einer dreiwoechigen Exposition mit MT in einer Konzentration von 0,1 µg/L bei 5 % der weiblichen Tiere Atresien in den Ovarien detektiert. Bei einer Konzentration von 50 µg/L lag die Rate der Atresien schon bei 11,4 %. Allerdings waren die Fische zum Zeitpunkt der Exposition bereits 10 bis 15 Monate alt (Pawlowski et al., 2004). Dies ist auch der entscheidende Unterschied zu der hier vorgestellten Studie mit R. rutilus, was darauf hindeutet, dass eine Exposition mit dem Androgen MT in der fruehen Ontogenese extrem adverse Effekte auf die Gametogenese bewirkt und sogar zu einer vollstaendigen Supprimierung der Gonadenausbildung fuehren kann.

Bei VIN zeigte sich bei den maennlichen und weiblichen Tieren ein aehnliches Bild wie bei TPT. Auch hier waren die Testes in Reife und Groeße reduziert und es zeigten sich nur Spermatogonien nach 210 Tagen Exposition. Die Ovarien der weiblichen Fische hatten ein histologisch unauffaelliges Bild. Bis zu dieser Arbeit wurde die hemmende Wirkung von VIN auf die Spermatogenese in larvalen Fischen mit der sehr hohen und nicht umweltrelevanten Konzentration von 2500 µg/L bei Reiskaerpflingen (Oryzias latipes) ueber einen Expositionszeitraum von drei Monaten nach dem Schluepfen gezeigt (Kiparissis et al., 2003). In dieser Arbeit wurde als hoechste Konzentration 2,86 µg/L VIN eingesetzt und es zeigten sich mit dieser nahezu 1000fach niedrigeren Konzentration die gleichen Effekte wie bei O. latipes. Entscheidende Unterschiede sind die laengere Expositionszeit und die Tatsache, dass die Exposition bereits einen Tag nach der Fertilisation begann. Dies deutet, wie schon die molekularbiologischen Untersuchungen, darauf hin, dass die ersten Tage eine entscheidende Rolle in der Gametogenese spielen und es hier durch AACs zu adversen Stoerungen der Gametogenese kommen kann.

Bei den maennlichen Tieren von R. rutilus, die mit CYP bei einer maximalen Konzentration von 4,16 µg/L exponiert wurden, zeigte sich, dass es zu einer Reduzierung der Spermatogenese kam. Diese Ergebnisse gehen konform mit denen, die bei O. latipes gefunden wurden (Kiparissis et al., 2003). Auch hier kam es bei einer Exposition ueber 90 Tage mit CYP bei einer Konzentration von 10 µg/L bei 18% der exponierten Tiere zu testikulaeren Effekten. Bei R. rutilus lag der Anteil der rudimentaeren maennlichen Gonaden bei 6,3 %. Auch die Befunde der weiblichen Gonaden fanden sich bei O. latipes ebenso wie bei R. rutilus. Es traten im Vergleich zur SoCo keine nennenswerten Unterschiede in der Reife der Ovarien auf. Die Oogenese wurde durch CYP in keiner der verwendeten Konzentrationen sichtlich beeinflusst. Vereinzelnd auftretende Atresien in den weiblichen Gonaden sind als Artefakte anzusehen.

LET, ein Aromatasehemmer, wurde in dieser Studie erstmals auf Wirkungen auf die Entwicklung der Gonaden bei Fischen untersucht. Rein histologisch entwickelten sich die maennlichen sowie die weiblichen Gonaden nach 210 Tagen Exposition mit Fenarimol (0,5*10^-9 M bis 10^-8 M) bis zum Vergleich mit den Tieren der SoCo ohne jede Beeinflussung. Das gleiche gilt auch fuer den anderen in dieser Studie untersuchten Aromatasehemmer, FEN, bei Konzentrationen von 0,5*10^-9 M bis 10^-8 M. Auch hier bildeten sich die Gonaden beider Geschlechter im Vergleich zur SoCo normal aus.

TPT, MT, CYP und VIN wirkten sich also negativ auf die Gametogenese aus und deuten somit darauf, dass in den fruehen Stadien der Ontogenese Androgene ebenso eine entscheidende Rolle fuer die Entwicklung der Gonaden spielen wie sie bisher vor allen den Oestrogenen zugeschrieben wurde. Ein Eingreifen durch AACs in die Gametogenese fuehrt ebenfalls zu fundamentalen adversen Schaeden bei R. rutilus, die die Fortpflanzung einer Population stark einschraenken oder gar unmoeglich machen. Deuteten die bisherigen Untersuchungen dieser Arbeit darauf hin, dass alle eingesetzten AACs verschiedene, molekulare Biomarker beeinflussen und die normale Entwicklung der Tiere stoeren koennen, bestaetigt die Histologie dies fuer vier der Substanzen sehr deutlich. Es ist daher unerlaesslich Versuche zu endokriner Beeinflussung der Reproduktion mit histologischen Untersuchungen zu verifizieren.

Zusammenfassend zeigte sich bei den larvalen Tieren, dass TPT zu einer Hemmung des Wachstums fuehrte, die die mRNA-Expression der Gonadotropine nicht nachweisbar beeintraechtigte, in der Leber die mRNA-Expression der Steroidrezeptoren signifikant beeinflusste und in den Gonaden extrem adverse Effekte hervorrief. Noch drastischer zeigte sich die Schaedigung der Gametogenese durch MT. Hierbei wurden auf zellulaerer Ebene tief greifende Veraenderungen festgestellt bis hin zum Fehlen der Gonadenanlage. Wenn Oberflaechengewaesser mit den in dieser Studie gewaehlten AACs TPT, MT, CYP und VIN oder AACs mit aehnlichen Wirkungspotenzial belastet sind, koennte es zu dramatischen Einschnitten in Populationen von der in Europa endemisch vorkommenden R. rutilus kommen bis hin zur lokalen Extinktion. Wie hier erstmalig gezeigt werden konnte, sind einige der Substanzen in umweltrelevanten Konzentrationen eingesetzt worden oder haben diese sogar unterschritten. Im Fall von TPT zum Beispiel um ein Vielfaches weniger als die von Harino bestimmten Konzentrationen (Harino et al., 2000). Auch bei den antiandrogenen Substanzen zeigte sich, dass niedrigere Konzentrationen (wie hier 10^-8 M) als in der Umwelt gefundene Konzentrationen von antiandrogenen Flutamid-Aequivalenten (10^-6 M; Urbatzka et al., 2007) zu adversen Effekten bei der Gametogenese von R. rutilus fuehren. Weitere Untersuchungen zu Auswirkungen von AACs auf die Sexualdifferenzierung und Gametogenese sind daher zwingend notwendig sowohl bei Modellorganismen wie auch bei endemischen Spezies.

Die Mortalitaetsrate betrug bei allen verwendeten Substanzen waehrend der vierzehntaegigen Exposition von 2+ R. rutilus 0,0%. Dies ist vergleichbar zu aehnlichen Studien mit Pimephales promelas (Ankley et al. 2002; Panther et al. 2004). Der Vergleich mit den Expositionen der larvalen R. rutilus (EX1 und EX2) zeigt, dass auch hier die Haelterung unter nahezu optimalen Bedingungen stattgefunden hat und ein Einfluss auf die Kondition der Tiere durch die Haelterung ausgeschlossen werden kann.

Wie auch bei den larvalen R. rutilus zeigte sich, dass MT in den Gehirnen maennlicher Tiere die Expression der ARO-mRNA um ca. das 3-fache im Vergleich zur SoCo steigert. Alle anderen Substanzen fuehrten zu keiner Beeinflussung der Genexpression der ARO-mRNA. Ebenso kam es wie bei den larvalen Tieren durch die Exposition mit den oben beschriebenen Substanzen zu keiner signifikanten Beeintraechtigung der Expression der LH-mRNA und der FSH-mRNA in den Gehirnen der adulten R. rutilus beider Geschlechter.

Die Beeinflussung der ARO-mRNA durch ein kuenstliches Androgen koennte bei laengerer Exposition ein Mechanismus sein, der, wie bei den larvalen Tieren in dieser Studie nachgewiesen, zur Vermaennlichung weiblicher Tiere fuehren kann. Eine dauerhafte Kontamination mit kuenstlichen Androgenen veraendert auch bei adulten Tieren ueber ein negatives Feedback die normale Homoeostase der HHG. Auffaellig bei der Exposition der adulten R. rutilus im Vergleich zu der der larvalen Tiere ist, dass es nur in zwei Faellen zu einer signifikanten Aenderung der mRNA-Expression kam, naemlich der Inhibierung der ER-mRNA in der Leber weiblicher Tiere und der Abnahme der AR-mRNA in den Gonaden weiblicher Tiere durch MT.

Dies laesst die Schlussfolgerung zu, dass adulte Tiere, die ueber einen kurzen Zeitraum AACs ausgesetzt sind, zunaechst wenig Effekte auf die HHG zeigen, da der Koerper in der Lage zu sein scheint, das durch exogene Stoffe hervorgerufene Ungleichgewicht bei den hier angewandten Konzentrationen von 0,5*10^-9 M bis 10^-8 M effizient zu kompensieren. Larvale R. rutilus hingegen sind weitaus empfindlicher und deutlich mehr gefaehrdet adverse Effekte durch AACs zu erhalten. Fuer die weitere Diskussion sei hier nochmals darauf hingewiesen, dass die LH-mRNA-Expression und die FSH-mRNA-Expression weder bei den adulten noch bei den larvalen Tieren eine signifikante Veraenderung gegenueber der SoCo zeigte.

Nach vierzehntaegiger Exposition zeigte sich keine signifikante Beeintraechtigung der Aromataseaktivitaet in den Gehirnen der weiblichen 2+ R. rutilus durch die eingesetzten AACs im Vergleich zur SoCo. Bei den maennlichen Tieren zeigte sich, dass MT die Aromataseaktivitaet in den Gehirnen steigert. Dies korreliert mit den in dieser Arbeit gezeigten Ergebnissen aus der Bestimmung der ARO-mRNA-Expression. Hier steigerte MT die Expression der ARO-mRNA im Gehirn ausschließlich bei den maennlichen 2+ Tieren. Durch die Enzymassays wurden die gezeigten Ergebnisse der Genexpression bestaetigt und auch hier kommt es nur bei den maennlichen Tieren durch das vermehrte Vorhandensein von MT zu einer Gegenregulation, um den androgenen Steroidhaushalt zu regulieren. Bei den Weibchen kommt es durch den im Verhaeltnis zu den Maennchen hoeheren Oestrogenspiegel zu keiner Gegenregulation, da sich das Verhaeltnis von Oestrogenen zu Androgenen nur geringfuegig aendert. Maennliche Tiere haben deutlich mehr Androgen als Oestrogen. Durch die Exposition mit MT wird das Verhaeltnis drastischer gestoert als in den Weibchen und durch das vermehrte Angebot an Substrat kommt es zu einem Anstieg der Aromataseaktivitaet, die einhergeht mit der gesteigerten Expression der ARO-mRNA in maennlichen R. rutilus Gehirnen. TPT zeigte keine Beeinflussung der Aromataseaktivitaet genauso wie VIN.

In den Gehirnen von maennlichen 2+ R. rutilus fuehrte LET zu einer signifikanten Hemmung der Aromataseaktivitaet. Aus der Literatur ist bekannt, dass FEN, ein Aromatasehemmer, bei C. carpio die Aktivitaet des Enzyms senkte (Thibaut und Porte, 2004). LET, der in dieser Studie verwendete Aromatasehemmer, reduzierte die Aktivitaet von ARO bei Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) um 90% (Shilling et al. 1999). Der Mechanismus, der zu dieser Hemmung fuehrt, ist noch nicht geklaert. Die innerhalb dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse lassen vermuten, dass dieser Effekt der Hemmung der Aromataseaktivitaet durch den Aromatasehemmer LET vermutlich bei allen Teleosteern zu finden sein wird.

Obwohl TPT nicht in der Bindungstasche des AR bindet, besitzt diese Substanz eine potenzielle androgene Wirkung. Durch Hemmung der Steroidsynthese fuehrte TPT zu einer signifikanten Erniedrigung von E2 im Blutplasma adulter weiblicher R. rutilus. Bei den maennlichen 2+ R. rutilus ist der natuerliche E2-Spiegel im Plasma schon weitaus geringer als bei den Weibchen, so dass eine Erniedrigung nicht signifikant nachweisbar war.

Das Androgen MT senkte die Konzentrationen von E2 und 11-KT im Blutplasma beider Geschlechter im Vergleich zur SoCo nach 14-taegiger Exposition. Dies ist durch den Mechanismus des negativen Feedbacks zu erklaeren (Kloas und Lutz, 2006). Bedingt durch das Vorhandensein von MT kommt es zu einer vermehrten Bindung an die AR in den Zielorganen sowie in den hoeher regulierenden Zentren des Hypothalamus und der Hypophyse. Durch das negative Feedback wuerde man bei R. rutilus eine Hemmung der Induktion der gonadotropen Hormone der Hypophyse erwarten. Dies ist in diesem Versuch nicht zu belegen gewesen. Allerdings wurde durch Harris et al. (2001) gezeigt, dass es zu einer zyklischen Ausschuettung des Sexualsteroids LH bei Regenbogenforellen (O. mykiss) kommt und sich nach 18 Wochen keine Unterschiede zu den Tieren aus der Kontrollgruppe mehr zeigen. Dies angenommen und mit dem Umstand kombiniert, dass nur zum Ende der Exposition die mRNA der gonadotropen Hormone bestimmt wurde, laesst die Schlussfolgerung zu, dass die Gegenregulation zu diesem Zeitpunkt noch nicht oder nicht mehr ueber die Ausschuettung von LH und FSH geregelt wurde. Es kommt wahrscheinlich zu einer fruehzeitigen Hemmung der Sekretion von LH und FSH, die im Verhaeltnis zur SoCo nach 14 Tagen nicht signifikant nachweisbar ist. Da LH und FSH nicht ausgeschuettet werden, kommt es zu einer Gegenregulation in Form einer vermehrten Produktion von Aromatase im Gehirn von R. rutilus. Dies wurde durch die Messung der Enzymaktivitaet bestaetigt.

Die vierzehntaegige Exposition adulter R. rutilus zeigt, dass auf der Ebene der Gonadotropine zu diesem Zeitpunkt keine Aenderung der mRNA-Expression stattfand. Ebenfalls gab es nur vereinzelte geringfuegige Aenderungen in der Expression von ER und AR, die in der Leber gemessen wurden. Dagegen sind nach 14 Tagen die Steroidspiegel im Plasma der Fische durch MT drastisch gesenkt worden und im Gehirn kommt es zu einer Steigerung der Aromatasesynthese, bedingt durch negatives Feedback. Wuerde man die Exposition weiterfuehren, duerfte man wohl nach einiger Zeit bei den adulten Tieren massive adverse Effekte auf die Gametogenese erkennen, die den Fortbestand einer Population stark gefaehrden koennten.

Die Auswirkungen von AACs auf R. rutilus wurden auf verschiedenen Untersuchungsebenen (morphologische Parameter, Geschlechterverhaeltnis, EIA, mRNA-Expression, Sexualsteroidspiegel im Blutplasma, Histologie) in dieser Studie erstmalig gezeigt.

Hierbei zeigte sich, dass besonders die histologischen Untersuchungen eine sensitive Nachweismethode fuer die Wirkung von AACs sind. Die Expositionen von R. rutilus mit TPT, CYP, MT und VIN fuehrten zu adversen Effekten in der Gonadenentwicklung. Bei den Untersuchungen der molekularen Biomarker zeigten sich diverse Effekte. Vor allem die TPT exponierten Tiere zeigten auf molekularer Ebene deutliche Unterschiede zur SoCo. Allerdings bestaetigen die untersuchten Biomarker nicht die physiologischen Veraenderungen der Testes der Fische. Es ist somit zu vermuten, dass hier ein anderer Wirkmechanismus durch TPT vorliegt, als durch die Biomarker gezeigt werden konnte. Im Gegensatz dazu korrelieren die drastischen Veraenderungen der MT behandelten maennlichen R. rutilus mit der Erhoehung von ARO (mRNA-Epression und Enzymassay), der AR-mRNA-Expression in der Leber, sowie der verringerten Level der Sexualsteroide (11-KT, E2). R. rutilus wurde in dieser Studie als ein gutes Modell zur Untersuchung von AACs etabliert.