Praesident der Humboldt-Universitaet zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies
The man thinks,
The horse thinks,
The sheep thinks,
The cow thinks,
The dog thinks.
The fish doesn't think.
The fish is mute.
Expressionless.
The fish doesn't think,
Because the fish knows
Everything.
The fish knows
Everything.
Iggy Pop “This is a film”
in „Arizona Dream“
Substanzen, die durch ihr hormonell wirksames Potenzial mit dem Hormonsystem interagieren und adverse Effekte auf die Reproduktion von Invertebraten und Vertebraten ausueben koennen, erlangten in den letzten Jahrzehnten große Aufmerksamkeit. Viele dieser Substanzen reduzieren die Fertilitaet oder die Fekunditaet, fuehren zu Abnormalitaeten in der Ontogenese oder im Verhalten der Tiere und haben Einfluss auf die Geschlechterverhaeltnisse. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aspekte dieses Themengebietes bearbeitet. Das in Europa endemisch vorkommende Rotauge (Rutilus rutilus), ein Sueßwasserfisch, wurde als Modelltier fuer den Nachweis von (anti)androgenen Effekten auf aquatisch lebende Organismen etabliert. Zum Nachweis der (anti)androgenen Wirkmechanismen wurden die Tiere mit Modellsubstanzen aus drei verschiedenen Gruppen exponiert. Aus der Gruppe der Substanzen mit potenziell androgener Wirkung wurden Triphenylzinn (TPT) und Methyltestosteron (MT) verwendet, aus der Gruppe der Antiandrogene Vinclozolin (VIN) und Cyproteronazetat (CYP) und aus der Gruppe der Aromatasehemmer, und somit potenziell androgener Wirkung, Letrozol (LET) und Fenarimol (FEN). Feedbackmechanismen auf die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse (mRNA-Expression des Luteinisierenden Hormons, des Follikel stimulierenden Hormons und der Aromatase), mRNA-Expression potentieller Biomarker in der Leber (Androgen-Rezeptor-mRNA, Oestrogen-Rezeptor-mRNA), Sexsteroidspiegel im Blutplasma (17ß-Oestradiol und 11-keto-Testosteron), Enzymaktivitaeten im Gehirn (Aromatase), Histologie der Gonaden, Totallaenge, Gewicht und Geschlechterverteilung wurden als Endpunkte analysiert, um adverse Effekte auf die Reproduktionsbiologie von R. rutilus zu zeigen. Die untersuchten Endpunkte eigneten sich zum Nachweis verschiedener Wirkmechanismen, besonders die mRNA-Expression in der Leber und die Sexsteroidspiegel im Blut. Als besonders sensitiv zeigte sich die histologische Untersuchung der Gonaden. Hierbei zeigte sich, dass die Exposition mit AACs zu fundamentalen adversen Schaedigungen der Gonaden fuehrt. Ebenso wurde eine Beeinflussung der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse durch alle eingesetzten AACs festgestellt. Es zeigte sich, dass in den fruehen Stadien der Ontogenese Androgene ebenso eine entscheidende Rolle fuer die Entwicklung der Gonaden spielen wie sie bisher vor allen Oestrogenen zugeschrieben wurden.
Substances that are able to interact with the endocrine system and cause adverse effects on the reproduction of invertebrates and vertebrates have gained much attention over the last few decades. Many of these substances reduce fertility or fecundity, lead to developmental abnormalities or abnormalities in the behaviour of animals and have an impact on sex ratios. The present study examines various aspects of these topics. The roach (Rutilus rutilus), a freshwater fish endemic in Europe, was established as a model animal for the detection of (anti)androgenic effects on aquatic organisms. For examination of the (anti)androgenic action, the animals were exposed to model compounds from three different groups: triphenyltin (TPT) and methyltestosterone (MT) from the group of substances with potentially androgenic effect, vinclozolin (VIN) and cyproteronacetate (CYP) from the group of antiandrogens, and letrozol (LET) and fenarimol (FEN) from the group of aromatase inhibitors, which thus have a potentially androgenic effect. Feedback mechanisms on the hypothalamus-pituitary-gonad-axis (mRNA expression of luteinising hormone, follicle stimulating hormone and aromatase), mRNA expression of potential biomarkers in the liver (androgen receptor mRNA, oestrogen receptor mRNA), steroid levels in the blood plasma (17ß-oestradiol and 11-ketotestosterone), enzyme activity in the brain (aromatase), histology of the gonads, total length, weight and sex ratios were analysed as endpoints to show adverse effects on the reproductive biology of R. rutilus. The studied endpoints are suitable for the detection of different modes of action, especially the mRNA expression in the liver and the steroid levels in blood. The histological examination of the gonads proved to be especially sensitive with the exposure to AACs to resulting in fundamental adverse damages to the gonads. Similarly, an affect on the hypothalamus-pituitary-gonad-axis by all used AACs was determined as well. It was ascertained that - in the early stages of ontogeny - androgens play as crucial of a role in the development of the gonads as previously attributed primarily to oestrogens.
Substanzen, die in die Umwelt eingebracht wurden, gelangten immer mehr in das Bewusstsein der Wissenschaft. Zunaechst befassten sich die meisten Forschungen mit toxischen/letalen Wirkungen von Stoffen auf einen gesunden Organismus. Haeufig standen dabei nur Konzentrationen von Substanzen im Mittelpunkt der Untersuchungen, bei denen 50% der behandelten Tiere starben (lethal concentration 50% (LC50)) um aus den Ergebnissen eine Risikoabschaetzung fuer Chemikalien festzulegen (Lloyd und Tooby, 1979; Bucke und Waterman, 1988). Dies erwies sich aber als nicht ausreichend, da einige Substanzen in weit niedrigeren Konzentrationen das Hormonsystem beeinflussen koennen und somit den Organismus schaedigen ohne eine relevante Toxizitaet auf den Organismus zu besitzen (Colborn und Clement, 1992; Colborn et al., 1993; McLachlan und Arnold, 1996). Auf der EU-Konferenz in Weybridge 1996 definierten dann ueber 70 Vertreter aus Wissenschaft und Umweltorganisationen den Begriff „Endocrine Disruptors“ als: "An endocrine disrupter is a substance or mixture that alters function(s) of the endocrine system and consequently causes adverse health effects in an intact organism, or its progeny, or (sub)populations." Dies bedeutet, dass eine exogene Substanz oder eine Mischung von Stoffen, die die Funktion des endokrinen Systems aendert und infolgedessen gesundheitsschaedigende Wirkung in einem gesundem Organismus, seiner Nachkommenschaft oder einer (Sub)Population hervorruft, als „endocrine disruptor“ (ED) bezeichnet wird.
In den letzten drei Dekaden nahm die Anzahl der Veroeffentlichungen hinsichtlich der Wirkung und der Wirkmechanismen von ED, die in niedrigen Konzentrationen in die Umwelt gelangten, staendig zu. Ein besonderer Focus fiel jetzt auf Substanzen, die das Hormonsystem auf verschiedenen Ebenen beeinflussten ohne eine direkte Toxizitaet zu besitzen. Zunaechst erlangten Stoffe das Interesse der internationalen Forschungsgruppen, von denen man oestrogene oder antioestrogene Wirkungen auf das Hormonsystem vermutete. Hierbei konzentrierten sich die Untersuchungen zunaechst auf den fuer den Menschen unmittelbar relevanten Substanzen und deren Wirkung auf das menschliche Hormonsystem (Colborn et al., 1993). Deshalb scheint es auch nicht weiter verwunderlich, das viele Versuche an Saeugetieren durchgefuehrt und validiert wurden (vom Saal, 1978; Risher et al., 1987). Erst spaeter erkannte man die Notwendigkeit die Forschung auch auf aquatisch lebende Tiere zu erweitern, da ein Großteil dieser Substanzen in die Oberflaechengewaesser gelangte und dort auf das Oekosystem Einfluss nahm. Nur wenige Arbeiten wurden zu aquatisch lebenden Invertebraten erstellt. Hier sind vor allem die Arbeiten der Arbeitsgruppe um Ole Kusk in Daenemark zu erwaehnen, denen es gelang einen Test zur Wirkung von umweltrelevanten Substanzen an verschiedenen Copepoden fuer die OECD zu validieren (Kusk und Wollenberger, 2007) und die Arbeiten der Arbeitsgruppe um Joerg Oehlmann an der Johann-Wolfgang-von-Goethe-Universitaet in Frankfurt am Main, die grundlegende Forschung an der im Sueßwasser lebenden Apfelschnecke (Marisa cornuarietis) als einem Vertreter der Invertebraten im Bereich der ED geleistet haben (Oehlmann et al., 2000; Tillmann et al., 2001; Oehlmann et al., 2006). Die meisten Untersuchungen jedoch wurden an Vertretern der Vertrebraten durchgefuehrt. In der Arbeitsgruppe „ED“ am Leibniz-Institut fuer Gewaesseroekologie und Binnenfischerei in Berlin (IGB) wurde diesbezueglich Grundlagenforschung betrieben und der Suedafrikanische Krallenfrosch, Xenopus laevis, als ein Modell zur Detektierung von endokrin wirksamen Substanzen auf aquatisch lebende Amphibien etabliert (Kloas, 2002). Die meisten Untersuchungen zu ED wurden mit oekotoxikologischen Modellfischen wie dem japanischen Reiskaerpfling (Orizias latipes), dem Zebrabaerbling (Danio rerio) oder der Dickkopfelritze (Pimephales promelas) durchgefuehrt aber kaum mit einheimischen frei lebenden Arten. Eine Ausnahme bilden die Arbeiten von Katsiadaki am dreistachligen Stichling (Gasterosteus aculeatus) (Katsiadaki et al., 2002 & 2006). Aber nur wenige beschaeftigten sich mit der Auswirkung von Chemikalien auf das Geschlechterverhaeltnis, das Hormonsystem, die Reproduktion oder die Population bei endemisch vorkommenden Fischen (van Aerle et al., 2001; Jobling et al., 2002; Liney et al., 2005; Katsu et al., 2007).
In Zusammenhang mit diesem Projekt bestand die Aufgabe am IGB Methoden zur Detektion von endokrin wirksamen (anti)androgenen Substanzen (AACs) an einem in Europa endemisch vorkommenden Sueßwasserfisch zu erforschen und zu etablieren. Die Wahl fiel auf das ubiquitaer verbreitete und einmal im Jahr laichende Rotauge, Rutilus rutilus.
Das Hormonsystem ist ein sehr konservatives System im Tierreich. Es gehoert neben dem Immunsystem und dem Nervensystem zu den wichtigsten Kommunikationssystemen des Koerpers. Es reguliert bei Fischen verschiedene physiologische Vorgaenge wie z.B. Osmoregulation, Ontogenese, Geschlechtsdifferenzierung oder Reproduktion. Die Regulation erfolgt ueber Hormone, die in zwei große Gruppen eingeteilt sind. Die eine Gruppe ist die der lipophilen Hormone, zu denen die Steroide und die Schilddruesenhormone zaehlen, die andere ist die der hydrophilen Hormone, zu denen Catecholamine und Peptidhormone zaehlen. Der groeßte Unterschied zwischen diesen beiden besteht darin, dass hydrophile Hormone Rezeptoren die an der Oberflaeche der Zielzellen lokalisiert sind, binden und dadurch eine Signaltransduktionskette in Gang setzen (Norris, 1997). Lipophile Hormone hingegen vermitteln ihre differenzierte Wirkung auf die Genexpression ueber eine Bindung an intrazellulaere Rezeptoren (Beato et al., 1995). Die meisten der bekannten ED sind in ihrer Wirkung den Sexualsteroiden aehnlich, wirken antagonistisch oder beeinflussen deren Synthese und Bioverfuegbarkeit. Daher soll hier am Beispiel der Bildung und Ausschuettung der Sexualsteroide das komplexe System der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse (HHG) erlaeutert werden.
Die Synthese, der Transport, die Rezeptorbindung und die Wirkung der Sexualsteroide unterliegen einer komplexen hierarchischen Kontrolle (s. Abb.2). Oberstes Zentrum dieses endokrinen Regelkreises ist der Hypothalamus, welcher im Zentralen Nervensystem (ZNS) liegt. Die Zellen des Hypothalamus sezernieren das Gonadotropin-releasing Hormon (GnRH), welches zur Hypophyse gelangt. Dort bewirkt es in den Zellen des Hypophysenvorderlappen (HVL) die Freisetzung der Gonadotropine. Diese sind das Follikel stimulierende Hormon (FSH) und das Luteinisierende Hormon (LH). Bei beiden handelt es sich um glandotrope (Glandula = Druese) Hormone. Das heißt, es handelt sich nicht um Hormone, die direkt auf die Zielzellen einwirken (effektorische Hormone), sondern um Hormone, die ihrerseits auf Hormondruesen wirken wie z. B. die Gonaden (Ovarien und Testes). Die Gonadotropine stimulieren die Bildung von Sexualsteroiden in den Gonaden. In den Ovarien stimulieren sie dort vor allem die Bildung von 17β-Estradiol (E2). Zu diesem Zweck wird das hauptsaechlich in den Thekazellen gebildete Testosteron (T) in die Granulosazellen transportiert, dort durch das Enzym Aromatase (ARO) in E2 umgewandelt, und in den Blutstrom abgegeben, wo 90-95% des E2 zum Transport an das Sexualsteroid bindende Protein (SBP) gebunden werden. Ein erhoehter E2-Spiegel wirkt in negativer Rueckkopplung auf Hypothalamus und Hypophyse zurueck und vermindert dort die Freisetzung von GnRH bzw. FSH und LH. Freies E2 im Blut kann an der Zielzelle aufgrund seiner lipophilen Struktur die Zellmembran passieren und im Cytosol an den Oestrogenrezeptor binden. Dieser Hormon/Rezeptor-Komplex wandert in den Zellkern, wo ein Dimer dieser Komplexe durch Bindung an E2-responsive Elemente (ERE) der DNA die Transkription E2-spezifischer Gene ausloest (Beato et al., 1995). Die Steuerung der Androgenfreisetzung in den Testes der maennlichen Fische wird analog zum weiblichen Organismus durch die beschriebene hierarchische Struktur und die integrierten Feedback-Mechanismen geleistet. Die Gegenwart von FSH und LH fuehrt in den interstitiellen (Leydigschen) Zellen (IZ) der Hoden zur Produktion der Androgene, bei Fischen sind das hauptsaechlich T und 11-Keto-Testosteron (11-KT). Androgene binden an das gleiche SBP wie E2 und die Vermittlung der Wirkung an den Zielzellen ueber cytosolische Androgenrezeptoren und entsprechende DANN-Interaktionen erfolgt analog zu den Oestrogenen. Es ist allerdings auch zu betonen, dass auch Androgene in den Ovarien und Oestrogene in den Testes gebildet werden, welche physiologische Funktionen in der Reifung der Gonaden erfuellen (Schulz und Miura, 2002).
Die schematische Darstellung des Hormonsystems (Abb. 2) zeigt wie komplex die Bildung, Ausschuettung, Bindung und Regulation der Steroidsynthese ist. Daher ist es nicht verwunderlich, dass EDs an verschiedenen Stellen dieser HHG angreifen koennen und den physiologischen Ablauf kurzfristig oder nachhaltig schaedigen koennen. So kann es zum Beispiel (vgl. Abb. 2) zu einer Hemmung der GnRH-Ausschuettung (1) im zentralen Nervensystem (ZNS) kommen (Amano et al., 2007). Die Bildung und/oder Sezenierung der Steroide in den Gonaden koennen behindert werden (2) (Evanson & van der Kraak, 2001; Opitz et al., 2002). Die Bindung an das SBP wird unterbunden (3), indem ED selbst an dieses binden (Kloas et al., 2000) oder es koennen Stoerungen des AR in den Zielzellen durch diese hervorgerufen werden (4) (Bauer et al., 1998; Baatrup & Junge, 2001). Eine Beeinflussung des endokrinen Regelsystem kann z. B. eine anormale Proteinbildung zur Folge haben und zu Auswirkungen bei der Sexualdifferenzierung und Gametogenese fuehren (van Aerle et al., 2001; Vinggaard et al., 2005). Weiterhin koennen Stoerungen der hormonabbauenden Aktivitaeten in der Leber (5) oder der Ausscheidung ueber die Niere (6) auftreten (Gunderson et al., 2001).
Viele ED, die mit dem Hormonsystem von Invertebraten und Vertebraten interagieren, sind synthetische Substanzen (z.B. Medikamente, Duengemittel, Pestizide, Herbizide, Fungizide, Bleichmittel, Weichmacher oder andere industrielle Abfaelle, wie zum Beispiel polychlorierte Kohlenwasserstoffe (PAK) oder polychlorierte Biphenyle (PCBs)). Die meisten dieser Substanzen sind lipophil und wurden vor allem hinsichtlich (anti)oestrogener Wirkungen untersucht. Neuste Untersuchungen deuten darauf hin, dass auch eine potentielle Belastung der Umwelt mit (anti)androgenen Substanzen vorliegen koennte (Christiaens et al., 2005; Urbatzka et al., 2007). Es ist daher von großer Bedeutung, ED mit einer voraussichtlich (anti)androgenen Wirkung auch an einem einheimischen Fisch zu untersuchen. Um umfassende Aussagen ueber den Einfluss von AACs machen zu koennen, war es notwendig Versuche sowohl in vivo als auch in vitro durchzufuehren. In vitro Versuche haben den Vorteil, Wirkungen von AACs ohne die Beeinflussung durch andere moegliche endogene Gegenregulationen aufzeigen zu koennen, doch ist es ebenso wichtig, die Auswirkungen von AACs auf die Fische im Ganzen zu betrachten, da auch unsere Umwelt holistisch betrachtet werden muss. Daher war es wichtig R. rutilus zum einen mit verschiedenen in vitro und in vivo Methoden zu untersuchen, die nach kurzer Zeit Ergebnisse zeigen (z.B. RARA, Enzymassay, RT-PCR), als auch laengerfristige in vivo Expositionen vorzunehmen mit verschiedenen Endpunktbestimmungen (z.B. Mortalitaet, Geschlechterverhaeltnis, Gonadenhistologie, RT-PCR).
Der zeitliche Verlauf der Ligandenbindung an die Rezeptoren wurde untersucht, indem eine konstante Menge an Hormonrezeptoren mit einer definierten Menge an radioaktiv markierten Liganden ueber verschieden lange Zeitraeume inkubiert wurde. Die spezifisch gebundene Ligandenmenge (SB „specific binding“) wurde aus der Differenz zwischen der Gesamtbindung (TB „total binding“) und der unspezifischen Bindung (NB „nonspecific binding“) errechnet. Bei der TB wurde nur mit radioaktiven Liganden inkubiert, waehrend bei der NB zusaetzlich ein Ueberschuss an unmarkierten Liganden zugegeben wurde. Der Zeitpunkt, an dem sich ein stabiles Gleichgewicht („steady state“) der Ligandenbindung an den Rezeptoren einstellte, also ein Gleichgewicht von Assoziation und Dissoziation, konnte danach anhand der Bindungskurve abgelesen werden.
Tris-HCl-Pufferloesung:
20 mM Tris-HCl (Boehringer; Ingelheim)
10 mM Na2-Molybdat (Merck; Darmstadt)
5 mM Dithiothreitol (Boehringer; Ingelheim)
Aktivkohlesuspension:
20 mM Tris-HCl-Pufferloesung
0,375 % Dextran T70 (Roth, Karlsruhe)
Die Suspension wurde mehrere Stunden geruehrt und bei 8°C gelagert. Vor dem Gebrauch wurde erneut 15 min geruehrt.
[3H]-T 96 Ci/mmol in Ethanol (Amersham; Braunschweig)
Das radioaktive Hormon wurde unter Stickstoffbegasung entnommen und in 5% Ethanol aufgenommen.
Testosteron (T) (Sigma; Deisenhofen)
17-ß-Oestradiol (E2) (Sigma; Deisenhofen)
Triphenylzinn (TPT)
Cyproteronacetat (CYP)
17-ß-Oestradiol (E2)
Methyltestosteron (MT)
Alle aufgefuehrten exogenen Liganden wurden von Sigma-Aldrich, Steinheim, bezogen.
Die Tiere wurden mit einem Schlag auf dem Kopf betaeubt und das Rueckenmark durchtrennt. Ventral wurde die Bauchhoehle eroeffnet und die Leber sowie die Gonaden entnommen. Sowohl die Leber als auch die Gonaden wurden direkt in eine eiskalte Tris-HCl-Pufferloesung ueberfuehrt und gewogen. Die Gewebe wurden zerkleinert und zweimal in Pufferloesung gewaschen, um das Blut zu entfernen. Danach wurden die Proben in Tris-HCl-Pufferloesung (3 ml/g Gewebe) aufgenommen und anschließend mit einem Teflon Pistill (Braun, Melsungen) in einem Glaspottergefaeß zwanzigmal bei 1000 U/min homogenisiert.
1. Schritt: 12000 g fuer 10 min bei 4°C
2. Schritt: 100000 g fuer 60 min bei 4°C (L-90K Ultrazentrifuge, Beckmann)
Gesamtbindung:
150 µl Puffer
100 µl Homogenat
25 µl [3H]-T
150 µl Puffer
10 µl unmarkiertes Hormon in Ethanol 96%
100 µl Homogenat
25 µl [3H]-T
Nach 24 h Inkubation wurden die nicht gebundenen Hormone von den rezeptorgebundenen Hormonen durch Zugabe von 300 µl Aktivkohlesuspension abgetrennt. Die freien Hormone wurden hierbei durch die Aktivkohle absorbiert. Nach weiteren 5 min Inkubation wurden die Proben fuer 15 min bei 3750 g zentrifugiert und 300 µl Ueberstand, in dem sich das rezeptorgebundene Hormon befindet, in einen Szintillationscocktail (Packard Instrument B.V; Groningen; Niederlande) pipettiert. Die Messung der Radioaktivitaet erfolgte in einem Fluessigkeits-Szintillationszaehler (Liquid Scintillation Counter LSC, Tri Carb 3000; Packard Instrument B.V; Groningen; Niederlande).
In Lebern und Gonaden von maennlichen und weiblichen Ploetzen wurde der Assoziationsverlauf der [3H]-Testosteronbindung an Androgenrezeptoren zur Ermittlung der optimalen Inkubationszeit bestimmt. Alle Experimente wurden mit einer Doppelbestimmung pro Ansatz durchgefuehrt. Die Inkubation fuer TB und NB erfolgte bei den Weibchen mit 0,38 bzw. 1,63 * 10-8 M [3H]-T, bei den Maennchen mit 0,5 bzw. 2,0 * 10-8 M [3H]-T fuer 1, 2, 3, 5, 7, 10, 20 und 24 Stunden. Die Konzentration des unmarkierten T betrug bei der NB 10-5 M. Die Kompetitionsexperimente wurden mit sieben Maennchen und sieben Weibchen von R. rutilus durchgefuehrt. Die Inkubationszeit von 24 Stunden ergab sich aus den Assoziationsexperimenten, die ueber diesen Zeitraum ein „steady state“ der Bindung erkennen ließen. Die Konzentration von [3H]-T wurde bei allen Experimenten konstant eingehalten (1,5 * 10-8 M). Anschließend wurde das Experiment mit Aktivkohlesuspension abgestoppt und der Radioligand in Abhaengigkeit zu den steigenden Konzentrationen der Kompetitoren gemessen. Als endogene Liganden wurden T und E2 in Konzentrationen von 10-8 M bis 10-4 M eingesetzt. MT als artifizielles Hormon, CYP, Tamoxifen (TAM) und Bisphenol A (BPA) als exogene Liganden wurden ebenfalls in einer Konzentration von 10-8 M bis 10-4 M eingesetzt. In einem Konzentrationsbereich von 10-5 M bis 10-3 M wurden die beiden Substanzen TPT und p,p`-DDE verwendet. Die Auswertung zur Bestimmung der individuellen IC50-Werte erfolgte durch die Umformung in den logit-log-Plot.
Fuer die in vivo EX1 und EX2 wurden im Fruehjahr geschlechtsreife, adulte Rotaugen (R. rutilus) aus dem Mueggelsee in Berlin, Deutschland gefangen und bis zum Laichen in 200 L Becken gehaeltert. Unmittelbar nach dem Laichen wurden die Eier gesammelt und nach dem Zufallsverfahren auf 28 Becken mit 10 L Volumen verteilt. Um die Osmolaritaet von Trinkwasser zu erreichen wurden zu 10 L Aqua dest. 2,5 g marines Salz (Tagis Tropical Marine, Dreieich) hinzugegeben. Die antizyklisch angeordneten Becken wurden durch Sprudelsteine belueftet und bei einer Temperatur von 20 ± 1°C gehalten. Waehrend der folgenden 210 Tage wurde dreimal in der Woche die Haelfte des Behandlungsmediums gewechselt. Die Tiere wurden 2-3-mal taeglich mit Artemia salina ad libitum gefuettert. Nach der Expositionszeit wurden die Tiere durch einen Genickschnitt getoetet und die Totallaenge der Fische gemessen. Dies ist die Distanz zwischen der Kopfspitze und dem Hinterende der natuerlich ausgebreiteten Schwanzflosse. Die Ablesegenauigkeit betrug ± 1 mm. Anschließend wurde das Gewicht der R. rutilus mit einer Feinwaage (Sartorius Werk, Goettingen) bestimmt. Die Genauigkeit der Messung betrug ± 0,001 g.
Jedem Fisch wurden Gehirn, Leber und Gonaden entnommen und in Reaktionsgefaeße gegeben, die sofort in fluessigen Stickstoff ueberfuehrt wurden. Anschließend wurden die Proben bis zur weiteren Bearbeitung bei minus 80°C aufbewahrt. Beim EX1 wurden je 30 Eier pro Becken eingesetzt und nach einem Tag wurden die Substanzen hinzugegeben. Die Behandlungen waren: 2 * Loesungsmittelkontrolle (Soco); TPT 2 * (10-8, 0.5*10-8, 10-9, 0.5*10-9 [M]); Vinclozolin (VIN) 2 *(10*-8, 0.5*10-8, 10-9) 1 * (0.5*10-9) [M]) und Fenarimol (FEN) 2 * (10*-8, 0.5*10-8, 10-9) 1 * (0.5*10-9) [M]). In EX2 wurden ebenfalls je 30 Eier pro Becken eingesetzt. Die Behandlungen waren: 2 * Soco; MT 2 * (10-8, 0.5*10-8, 10-9, 0.5*10-9 [M]); CYP 2 * (10*-8, 0.5*10-8, 10-9, 0.5*10-9 [M]) und Letrozol (LET) 2 * (10*-8, 0.5*10-8, 10-9, 0.5*10-9 [M]).
Die RT-PCR ist eine Methode mit deren Hilfe extrem geringe Mengen an mRNA spezifisch detektiert werden koennen, indem die mRNA durch die reverse Transkription in eine komplementaere DNA (cDNA) umgeschrieben wird. Diese cDNA wird dann in einer „Polymerase-Chain-Reaction“ (PCR) durch Einsatz spezifischer Primer und des Enzyms Taq-Polymerase amplifiziert. Die Methode der RT-PCR ist eine weitaus sensitivere Methode als die bisherigen RNA-Blot-Techniken (Byrne et al., 1988; Wang et al., 1989). Die Gesamt-RNA, die auch die mRNA enthaelt, wird aus den Zellen phenolisch extrahiert. Die RT-PCR beginnt mit der cDNA-Erststrangsynthese. Mit Hilfe der „Avian Myeloblastosis Virus-Reverse Transcriptase“ (AMV-RT), einer RNA abhaengigen DNA-Polymerase, kann die cDNA synthetisiert werden. Eine einzelstraengige RNA dient der AMV-RT als Matrize und wird in Anwesenheit eines Primer in 5` ♢ 3`Richtung synthetisiert. Die resultierende cDNA wird zur PCR eingesetzt, welche es ermoeglicht, gezielt diese DNA-Abschnitte zu vervielfaeltigen. Durch zyklische Wiederholung der einzelnen PCR-Schritte kann die geringe Ausgangsmenge der cDNA amplifiziert werden. Mittels der PCR wurde in dieser Untersuchung eine spezifische Amplifikation verschiedener cDNA durchgefuehrt. Als interner Standard fuer die semiquantitative Bestimmung der mRNAs, wurde die mRNA des Elongationsfaktor 1α (EF) als „house-keeping gene“ (Dostal et al., 1994) aus der jeweiligen gleichen Probe mitbestimmt. Die PCR-Produkte wurden in einem ethidiumbromidhaltigen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurde unter UV-Licht mittels Fluoreszenzmessung die Intensitaet der Banden bestimmt. Die Ergebnisse der densitometrischen Auswertung fuer die cDNA wurden mit Hilfe der EF-Werte im Bezug auf etwaige Artefakte normalisiert.
Chemikalien:
Chloroform (Roth, Karlsruhe)
Isopropanol (Roth, Karlsruhe)
DEPC (Diethylpyrocarbonat) behandeltes Wasser (0,01%; 100 µl/l), autoklaviert. (Roth, Karlsruhe)
RNA-Extraktion aus den Geweben:
Der Ueberstand, der sich nach einer weiteren 10-minuetigen Zentrifugation (Heraeus Inc., Hanau) (4°C; 12000 rpm) ergab, wurde entnommen und verworfen. Um das im Eppendorfgefaeß verbliebene RNA-Pellet zu waschen, wurden 300 µl Ethanol (70% p.a.) hinzugegeben. Dieses Gemisch wurde erneut zentrifugiert (5 min; 4°C und 12000 rpm) und anschließend der Ueberstand verworfen. Das RNA-Pellet wurde bei 37°C getrocknet und stand nun allen weiteren Arbeitsschritten, die auf Eis durchgefuehrt wurden, zur Verfuegung.
Zunaechst wurde das Pellet in 20 µl DEPC-Wasser aufgenommen und vorsichtig resuspendiert. Von der resuspendierten RNA-Loesung wurden 2 µl zusammen mit 198 µl DEPC-Wasser in 96-Well-Platten (Greiner, Frickenhausen) pipettiert und in einen Plattenreader (Spectrafluor; Tecan, Crailsheim) gegeben, um die Menge der RNA zu bestimmen. Die Auswertung erfolgte ueber das Computerprogramm Magellan (Tecan, Crailsheim), welches die Absorption bei Wellenlaengen von 260 nm und 280 nm ermittelt. Der bei 260 nm gemessene Extinktionswert wurde mit dem Faktor 4 multipliziert und ergab den RNAGehalt in µg/µl. Die Reinheit der RNA wird durch den Quotienten der Extinktionswerte bei 260/280 nm charakterisiert.
Chemikalien:
Wasser (Aqua bidest., autoklaviert)
dNTP-Loesung (Biometra, Goettingen)
AMV-RT (Biometra, Goettingen)
8 µl der Gesamt-RNA wurden in einem 200 µl Mikrogefaeß vorgelegt und 9 µl Wasser und 3 µl Primer hinzugegeben. Nach dem Mixen und Abzentrifugieren wurden diese Gefaeße in einen Cycler (Thermocycler, Biometra, Goettingen) positioniert und fuer 3 min bei 70°C inkubiert. Unter diesen Bedingungen lagert sich der Poly-(dT)-Primer spezifisch an den Poly-(A)-Schwanz der mRNA an. Anschließend wurden 5 µl Wasser, 3 µl Puffer, 1,5 µl dNTPs und 0,5 µl AMV-RT hinzugegeben, gemixt und abzentrifugiert. Die Gefaeße wurden erneut in den Cycler ueberfuehrt und fuer 60 min bei 37°C inkubiert. Aufgrund der mRNA-spezifischen Primerhybridisierung wurde die mRNA in cDNA transkribiert. Die Reaktion wurde durch zweiminuetiges Erhitzen auf 94°C gestoppt. AMV-RT und mRNA werden dadurch zerstoert. Durch Abkuehlung wurde erreicht, dass sich die Nukleotide komplementaer zum jeweiligen cDNA-Erststrang anlagern und somit doppelstraengige cDNA entsteht.
3 µl cDNA wurden in ein 200 µl Mikrogefaeß vorgelegt. Der PCR-Premix (siehe unten) wurde in einem sterilen Eppendorfgefaeß gemischt und zur cDNA-Vorlage gegeben. Alle PCRs wurden mit Taq-Polymerase und dNTPs von Q-Biogene durchgefuehrt.
18,7 µl PCR-H2O
2,5 µl Taq-Puffer (10x)
0,2 µl EF-Primer forward: Sequenz: 5` - gAC TgT gCC gTg CTg ATT g - 3`
0,2 µl EF-Primer reverse: Sequenz: 5` - ATT ACC CTC CTT gCg CTC AAT - 3`
22 µl Gesamtvolumen
Das EF-Programm des Thermocyclers
25 Zyklen à:
94°C 1 min (Denaturierung)
72°C 1 min (DNA-Synthese)
Abschluss: 72°C 10 min
18,7 µl PCR-H2O
2,5 µl Taq-Puffer (10x)
0,2 µl ER-Primer forward: Seq: 5´ - TAG GGC AGC AAG TGG AAG G - 3`
0,2 µl ER-Primer reverse: Seq: 5´ - TGT CAG CGA GGG TGG TTA G - 3`
22 µl Gesamtvolumen
Das ER-cDNA-Programm im Thermocycler:
33 Zyklen à
94°C 1 min (Denaturierung)
72°C 1 min (DNA-Synthese)
Abschluss: 72°C 10 min
18,7 µl PCR-H2O
2,5 µl Taq-Puffer (10x)
0,2 µl AR-Primer forward: Seq: 5´ - CTS TgC AAA gCT gTg TCC gT - 3`
0,2 µl AR-Primer reverse: Seq: 5´ - TCR TCT gRR CAg ATC Agg CAC gT - 3`
22 µl Gesamtvolumen
Das AR-cDNA-Programm im Thermocycler:
36 Zyklen à
94°C 1 min (Denaturierung)
72°C 1 min (DNA-Synthese)
Abschluss: 72°C 10min
18,7 µl PCR-H2O
2,5 µl Taq-Puffer (10x)
0,2 µl LH-Primer forward: Seq: 5´ - gCT gTg AgC CgA TTA ATg AgA Cg - 3`
0,2 µl LH-Primer reverse: Seq: 5´ - CTg CAg gCT CTC gAT ggT g - 3`
22 µl Gesamtvolumen
Das LH-cDNA-Programm im Thermocycler:
33 Zyklen à
94°C 1 min (Denaturierung)
72°C 1 min (DNA-Synthese)
Abschluss: 72°C 10 min
18,7 µl PCR-H2O
2,5 µl Taq-Puffer (10x)
0,2 µl FSH-Primer forward: Seq: 5´ - gCT ggC TgA gAA CTC CAC AgT CTg - 3`
0,2 µl FSH-Primer reverse: Seq: 5´ - CAg CgC TAA TgA ggg CAg gAT - 3`
22 µl Gesamtvolumen
Das FSH-cDNA-Programm im Thermocycler:
31 Zyklen à
94°C 1 min (Denaturierung)
72°C 1 min (DNASynthese)
Abschluss: 72°C 10 min
18,7 µl PCR-H2O
2,5 µl Taq-Puffer (10x)
0,2 µl ARO-Primer forward: Seq: 5´ - CTA CAT CCC gCT CgC CTA TCT - 3`
0,2 µl ARO-Primer reverse: Seq: 5´ - CTg gCA ggC ggT TCT CAT AT - 3`
22 µl Gesamtvolumen
Das ARO-cDNA-Programm im Thermocycler:
23 Zyklen à
94°C 1 min (Denaturierung)
72°C 1 min (DNA-Synthese)
Abschluss: 72°C 10 min
50 x TAE-Puffer; pH 8,5:
242,0 g Tris (Ultra Qualitaet, Roth, Karlsruhe)
18,6 g NaEDTA
Bromphenolblau-Probenpuffer:
100 µl Glyzerin (Boehringer, Ingelheim)
90 µl DEPC behandeltes Wasser
20 µl; von 100 bis 1000 Basenpaaren (AGS, Heidelberg)
460 µl TAE-Puffer (1x)
9 µl Ethidiumbromid-Lsg. (Roth, Karlsruhe)
Agarosegel:
90 ml 1x TAE-Puffer
Durchfuehrung:
Ein Teil der zur histologischen Bestimmung entnommenen Gonadenproben wurden zur Weiterbehandlung mit Bouin (Sigma-Aldrich, Steinheim) fixiert und nach zweimaliger Waschung in 80%igem Ethanol an das Limnomar-Institut in Hamburg gesendet und dort von Dr. Burkard Watermann bearbeitet. Ein weiterer Teil der gonadalen Proben wurde nach gleicher Behandlung am IGB weiterbearbeitet. Sie wurden in Paraffin eingebettet, am Mikrotom geschnitten und mit Haematoxylin-Eosin gefaerbt (HE-Faerbung). Daraufhin wurden die histologischen Schnitte unter einem Lichtmikroskop angesehen und das Geschlecht morphologisch bestimmt.
Die Geschlechter der juvenilen Fische wurden nach der Beprobung anhand der Gonaden morphologisch bestimmt. Anschließend wurden die Gonaden zur weiteren Bestimmung sofort in Bouin ueberfuehrt und nach zweimaliger Waschung mit 80%igem Ethanol in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit HE gefaerbt. Die Schnitte wurden anschließend lichtmikroskopisch analysiert.
Die adulten R. rutilus (2+) wurden in einer Kreislaufanlage bei 17-20°C am IGB in Berlin aufgezogen. Die ersten drei Monate wurden die Tiere zweimal taeglich mit Artemia salina ad libitum gefuettert. Die restlichen 21 Monate wurden sie mit Trockenfutter gefuettert, wobei die Menge ca. 10 % des Koerpergewichts entsprach. Der Versuchsaufbau beinhaltete, dass je 15 dieser Tiere in ein 30 L-Aquarium ueberfuehrt wurden. Um die Osmolaritaet von Trinkwasser zu erreichen wurden zu 30 L Aqua dest. 7,5 g marines Salz gegeben. Nach einem Tag wurden folgende Expositionsregime aufgebaut: TPT, VIN, CYP und MT wurden in einer nominalen Konzentration von 10-8 M zugegeben. Zum Vergleich wurde eine SoCo mitgefuehrt. Die Becken wurden antizyklisch in Wasserrinnen aufgestellt. Die Wassertemperatur in den Becken wurde auf 20 ± 1°C eingestellt. Nach 14 Tagen wurden 20-40 µl Blut aus der Caudalvene eines jeden Tieres entnommen und sofort in fluessigen Stickstoff ueberfuehrt. Wie schon bei den larvalen Expositionen (EX1 und EX2) wurden auch die adulten Tiere nach dem Versuch gemessen, gewogen und anschließend Gehirne, Leber und Gonaden entnommen und zur weiteren Behandlung bei minus 80°C gelagert.
Die mRNA- und PCR-Protokolle sowie die entsprechenden Primer sind wie unter 2.2.4 aufgefuehrt verwendet worden.
Markiertes Steroid:
[1ß-3H] Androstenedion (25.9 Ci/mmol, PerkinElmer, Rodgau)
(thin-layer chromatography, (TLC)).
Unmarkierte Steroide:
Androstenedion
5α-Dehydrotestosteron
Testosteron
3α-Androstanediol (Referenzsteroid)
Ethylendiamintetraacetat (EDTA)
Folin & Ciocalteu´s Phenolreagenz
TRIZMA®-HCl (Tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid)
Zitronensaeure
Alle oben aufgelisteten Chemikalien und Steroide wurden bei Sigma-Aldrich, Seelze, bezogen.
Szintillationscocktail, Ultima Gold (PerkinElmer, Rodgau)
PolygramTM Kieselgel (Macherey & Nagel, Dueren)
Homogenatpuffer zur Aufnahme der Proben
Der Enzymassay ist eine Methode zur Bestimmung der Aktivitaet bestimmter Enzyme in unterschiedlichen Geweben. In Zusammenarbeit mit der Medizinischen Fakultaet der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universitaet Bonn wurde die Aromataseaktivitaet in den Gonaden und den Gehirnen beider Geschlechter der 2+ Ploetzen nach der Methode von Steckelbroeck (Steckelbroeck, 1999) untersucht. Hierzu wurden die Aliquot (s. Gewebepraeperation) in Homogenatpuffer geloest und ueber einen Zeitraum von 30 min inkubiert, so dass in einem 50 µl Aliquot circa 10 % des Substrates waehrend der Inkubationszeit umgewandelt wurde. 100 µl [1ß-3H] Androstenedion-Loesung (geloest in 0,1 µM Assay-Puffer) wurde danach zu den Proben hinzugegeben.
Durch Zugabe von 50 µl einer 3 mM NADPH-Loesung wurde die Enzymreaktion gestartet. Die verschlossenen Reaktionsgefaeße wurden gemixt und fuer 30 min bei 37°C (ARO), bzw. bei 24 °C (5α-Reduktase) geschuettelt. Das Stoppen der Reaktion erfolgte durch Abkuehlen der Reaktionsgefaeße auf Eis. Die organischen Anteile wurden anschließend in eiskaltem Chloroform aufgenommen.
Der EIA ist eine Methode zur quantitativen Bestimmung kleinster Substanzmengen wie zum Beispiel Hormone in einer Probe durch Antikoerper und gehoert zu den kompetitiven Bindungsassays. Beim EIA handelt es sich um eine immunochemische Reaktion zwischen einem spezifischen Antikoerper, dem Anti-rabbit IgG und einem Kaninchenantikoerper-Hormon-Komplex. Die Oberflaechen der Kavitaeten einer Mikrotiterplatte sind mit diesem spezifischen Antikoerper beschichtet (precoated), an den der Kaninchenantikoerper-Hormon-Komplex bindet. Der Komplex besteht aus einem Antikoerper an den ein enzymmarkierter Tracer (hier Acetylcholinesterase (AchE)) sowie die Hormone aus einer Probe oder Standardmolekuele zur Erstellung der Standardkurve binden. Die Menge des AchE-Tracers, die an das Anti-rabbit IgG in den Kavitaeten der Mikrotitterplatte gebunden wurde, ergibt nach der Zugabe eines Substrates (Ellman`s reagent) eine Reaktion, bei der ein Produkt entsteht, dessen Farbintensitaet photometrisch bei einer Wellenlaenge von 405-420 nm detektiert werden kann. Die gemessene Intensitaet ist der Konzentration des zu messenden Hormons in der Probe umgekehrt proportional. Die Kalibrierung des Enzymimmunoassays wird durch eine Standardloesung des zu bestimmenden Hormons erstellt.
Loesungspuffer:
Waschpuffer:
2 PBS-Tabletten geloest in 200 ml Aqua dest. und Zugabe von 0,2 ml 50% Tween 20
100 µl 11-KT bzw. E2 Standard geloest in 900 µl Loesungspuffer. Ergibt eine Stammloesung von 5 ng/ml
AchE-Tracer (100x):
Antikoerper (50x):
110 µl konzentrierter Antikoerper geloest in 5,4 ml Loesungspuffer
Die extrahierten Proben wurden mit Loesungspuffer nach folgendem Schema verduennt:
1:50 Verduennung: 10 µl Plasmaprobe in 490 µl Loesungspuffer
1:500 Verduennung: 1 µl Plasmaprobe in 499 µl Loesungspuffer
Anschließend wurden die Proben und die Standardreihe auf eine 96-Well-Platte (Greiner, Frickenhausen) nach folgendem Arrangement belegt:
In die NB-wells wurden 100 µl, in die B0-wells 50 µl des Loesungspuffers vorgelegt. Je 50 µl der jeweiligen Standards wurden in die S1 - S8 Wells pipettiert und je 50 µl der entsprechenden verduennten Plasmaproben in die Kavitaeten P1 - P12. Anschließend wurde bei 4°C weitergearbeitet und je 50 µl des AchE-Tracers in jede Kavitaet hinzugegeben mit Ausnahme der TA- und BL-Kavitaeten. Hiernach wurde in jede Kavitaet, mit Ausnahme der TA-, Blank- und NB-Kavitaeten, 50 µl Antikoerperloesung zugefuegt. Die Platte wurde verschlossen und fuer zwei Stunden auf einem Orbitalplattenschuettler bei 400 Rotationen/min und Raumtemperatur geschuettelt. Anschließend wurden die 96-Well-Platten fuenfmal hintereinander vorsichtig mit 200 µl Waschpuffer gewaschen, der durch leichtes schlagen der umgedrehten Platte auf ein Papierhandtuch aus den Kavitaeten entfernt wurde. 200 µl Ellman`s Reagenz wurde in alle Kavitaeten zugegeben. Die TA-Kavitaeten erhielten 5 µl des geloesten Tracers. Die mit Aluminiumfolie abgedeckte Platte wurde fuer eine Stunde auf dem Horizontalschuettler bei Raumtemperatur inkubiert und dann im Tecan®-Plattenreader bei einer Wellenlaenge von 405 - 420 nm photometrisch gemessen. Die Ergebnisse wurden mathematisch transformiert und in pg/mol graphisch dargestellt.
Alle statistischen Analysen wurden mit dem Statistikprogramm GraphPad Prism® (San Diego, CA 92130, USA) erstellt.
Die densitometrische Werte der PCR-Produkte der ausgewaehlten Gene wurden zur statistischen Analyse verwendet und durch die densitometrischen Werte der PCR-Produkte des EF-1α normalisiert. Effekte der behandelten Gruppen im Vergleich zur SoCo wurden nach Geschlechtern getrennt geprueft. Mit ANOVA wurden signifikante Unterschiede zur SoCo getestet und mit dem Dunnetts-Test geprueft. Beim Auftreten von Varianzen der Ergebnisse wurden die Messungen mit dem nicht parametrischen Dunns-Test auf signifikante Unterschiede zur SoCo getestet.
Nach Geschlechtern getrennt wurden signifikante Unterschiede der Ergebnisse der mit AACs exponierten Tiere zur SoCo analysiert. Nach der Untersuchung auf Normalverteilung und Anwendung des ANOVA zur Analyse der Varianz wurde der Dunnetts-Test durchgefuehrt.
Kompetitionsexperimente ermoeglichen es, die Rezeptoren hinsichtlich ihrer Affinitaet fuer verschiedene Liganden zu spezifizieren. Um die kompetitiven Verdraengungen der [³H]-Testosteronbindung an Androgenrezeptoren im Gonaden- bzw. Lebercytosol zu erfassen, wurden fuer die Experimente jeweils sieben maennliche und sieben weibliche Ploetzen eingesetzt. Obwohl die Bindungen auch hier keine geschlechterspezifischen Unterschiede zeigten, werden die Ergebnisse dennoch nach Geschlechter getrennt aufgefuehrt. Die eingesetzten Liganden sind in der gleichen Konzentrationsspanne eingesetzt worden, wie der natuerliche Ligand T, naemlich von 10-4 M bis 10-9 M. Ausnahmen waren die beiden Substanzen TPT und p,p`-DDE, die in Konzentrationen von 10-3 M bis 10-5 M eingesetzt wurden. Als Positivkontrolle wurde T im Parallelansatz mitgefuehrt (Abb. 3.7). Die eingesetzten Umweltchemikalien TPT und p,p`-DDE zeigten keine Bindung an den Androgenrezeptor, CYP wies eine wesentlich geringere Bindung als die endogenen Liganden, T und E2 auf. MT hingegen zeigte die hoechste Bindungsaffinitaet.
Die mittels eines korrespondierenden logit-log-Plots (Abb. 3.8) errechneten IC50-Werte ergaben im Vergleich fuer die mitgefuehrten Liganden eine Affinitaetsreihenfolge zum Androgenrezeptor wie folgt: MT ≥ T > E2 ≥ CYP. TPT und p,p`-DDE wiesen keine Affinitaet zum Androgenrezeptor auf (Tab. 1).
Aus den sieben (n=7) kompetitiven Verdraengungsexperimenten im Lebercytosol weiblicher 2+ Ploetzen und den daraus resultierenden logit-log-Plots konnten folgende Reihenfolgen fuer die Affinitaet der Liganden zum Androgenrezeptor mittels der errechneten IC50-Werte fuer die Mittelwerte (Tab. 3) erstellt werden: MT > T >> E2 ≥ CYP. Es lag keine Affinitaet fuer p,p`-DDE und TPT vor.
Die Raten der Mortalitaet betrugen in der EX1:
Die Mortalitaetsraten in der EX2 betrugen:
Bei der larvalen in vivo EX2 konnte nach 210 Tage bei der niedrigsten Konzentration von Letrozol (LET 0,5*10-9 M) bei der Endpunktmessung eine signifikanten Zunahme des Gewichtes festgestellt werden (Abb. 3.14).
Die in vivo eingesetzten Ploetzen (n=60/Konzentration) wurden nach 210 Tagen Exposition mit verschiedenen Substanzen unterschiedlicher Konzentrationen auf ihre Geschlechtsdifferenzierung untersucht. Das Geschlechterverhaeltnis der larvalen Ploetzen der EX1 wurde bestimmt und zeigte keine signifikanten Unterschiede zur Loesungsmittelkontrolle (Abb. 3.15). Die ebenfalls nach 210 Tagen beprobten larvalen Ploetzen aus der zweiten Exposition (EX2) zeigten im Verhaeltnis zur Loesungsmittelkontrolle bei der niedrigsten Konzentration von Methyltestosteron (MT 0,5*10-9 M) signifikante Unterschiede. 73 % der 60 Ploetzen entwickelten maennliche Gonaden und nur 27 % weibliche. Bei den beiden hoechsten eingesetzten Konzentrationen von Methyltestosteron (MT 0,5*10-8 M und MT 10-8 M) entwickelten sich keine oder nur in wenigen Faellen (n = 8) rudimentaere Gonaden (Abb. 3.16).
Bei Rutilus rutilus nicht vorhandene Sequenzen fuer LH, FSH, AR und EF 1α wurden von bekannten Sequenzen artverwandter Spezies, wie dem Karpfen (C. carpio) abgeleitet und Primer fuer R. rutilus entworfen. Die PCR-Produkte wurden sequenziert und die Basenlaenge (bp) der cDNA bestimmt.
PCR-Produkt (cDNA): ARO Produktlänge [bp]: 332 Seq.homologie [%]: 99,9 homolog R.rutilus
PCR-Produkt (cDNA): FSH Produktlänge [bp]: 385 Seq.homologie [%]: 98,0 homolog C. carpio
PCR-Produkt (cDNA): ges.ER Produktlänge [bp]: 303 Seq.homologie [%]: 99,9 homolog R.rutilus
PCR Produkt (cDNA): EF 1alpha Produktlänge [bp]: 343 Seq.homologie [%]: 98,0 homolog C. carpiob. 7:
Die PCRs wurden fuer alle gewaehlten Biomarker als Doppelbestimmung durchgefuehrt. Sechs larvale Tiere, die nach 210 Tagen Exposition beprobt wurden, gingen pro Geschlecht und Behandlungsgruppe in die Analysen ein. Bei der Exposition der Tiere mit MT bei einer Konzentration von 10-8 M konnte aus Mangel an cDNA die LH-mRNA-Expression fuer weibliche Tiere nicht durchgefuehrt werden. Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte mit Standardfehler dargestellt.
Bei den aus dem gleichen Versuchsansatz stammenden maennlichen Tieren zeigte sich, dass MT die Expression von ARO-mRNA signifikant steigerte (Abb. 3.18).
Bei der Bestimmung der LH-mRNA aus dem Gehirngewebe weiblicher und maennlicher larvaler Ploetzen konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Da die Tiere, die nach der 210-taegiger Exposition mit MT bei einer Konzentration von 10-8 M, entweder maennlichen Geschlechts waren oder keine Gonaden entwickelt hatten, konnte keine Expression von LH-mRNA fuer das weibliche Geschlecht bestimmt werden. Daher sind hier nur die Ergebnisse fuer weibliche larvale Ploetzen aus den Expositionen in Konzentrationen von 10-8 M mit TPT, VIN und LET im Verhaeltnis zur SoCo gezeigt (Abb. 3.19). Die MT-Konzentration von 10-9 M, bei der es zu einer Gonadenentwicklung kam und eine Geschlechterdifferenzierung moeglich war, zeigte, dass die Ergebnisse nicht signifikant unterschiedlich waren (nicht dargestellt). Die Ergebnisse der Expression der LH-mRNA der maennlichen larvalen Tiere bei 10-8 M hingegen sind auch fuer MT dargestellt (Abb. 3.20).
Follikelstimulierendes Hormon (FSH)-mRNA
Die Ergebnisse fuer die FSH-mRNA-Expression der Tiere, die bei einer Konzentration von 10-8 M exponiert wurden, wiesen keine signifikanten Unterschiede, weder fuer die weiblichen (Abb. 3.21) noch fuer die maennlichen Tiere (Abb. 3.22), auf.
Die ER-mRNA-Expression auf zellulaerer Ebene bei den lavalen Tieren wurde in der Leber gemessen. Bei den weiblichen larvalen Tieren zeigte sich nach der 210-taegigen Exposition mit Chemikalien in Konzentrationen von 10-8 M, dass die mRNA-Expression im Falle von TPT signifikant gehemmt wurde (Abb. 3.23). Bei zwei weiteren Substanzen, LET und CYP, konnte im Lebergewebe maennlicher larvaler Ploetzen eine signifikante Steigerung der ER-mRNA-Expression nachgewiesen werden (Abb. 3.24).
Signifikant unterschiedlich zur Loesungsmittelkontrolle zeigte sich die AR-mRNA-Expression im Lebergewebe larvaler weiblicher Ploetzen. TPT hemmte die Expression, waehrend LET, MT und CYP die AR-mRNA bei der eingesetzten Konzentration von 10-8 M steigerten (Abb. 3.25).
Die Testes der SoCo zeigten aktive Spermatogenese mit fruehen Reifungsstadien, bei denen sich Spermatogonien bis Spermatiden zeigten (Abb. 3.27). Bei den weiblichen Tieren waren die Ovarien mit aktiver Oogenese zu sehen. Diese befanden sich ebenfalls nur in fruehen Reifungsstadien, wobei Oogonien bis vitellogene Oocyten vorhanden waren (Abb 3.28).
Die maennlichen Tiere, die ueber 210 Tage mit TPT exponiert waren, wiesen eine aktive Spermatogenese auf. Allerdings waren Reife und Groeße der Testis reduziert und nur Spematogonien vorhanden. Weiterhin waren stark ausgepraegte Lakunenbildungen zu beobachten (Abb. 3.29). Die Ovarien wiesen aktive Oogenese und einzelne atretische Oocyten sowie lokale Resorption von Oogonien (Abb. 3.30) auf.
VIN mit einer Konzentration von 10-8 M fuehrte bei den exponierten Maennchen zu reduzierter Reife und Groeße der Testis. Trotz aktiver Spermatogenese fanden sich nur Spermatogonien in den Testis (Abb. 3.31). In den weiblichen Tieren war eine aktive Oogenese mit normaler Reifung vorhanden (Abb. 3.32).
LET mit einer Konzentration von 10-8 M fuehrte bei den exponierten Maennchen zu normaler Reife und Groeße der Testis und einer aktiven Spermatogenese (Abb. 3.33). In den weiblichen Tieren war eine aktive Oogenese mit normaler Reifung vorhanden (Abb. 3.34).
MT fuehrte zu einer Supprimierung der Gonadenreife beider Geschlechter gegenueber der SoCo. Außerdem kam es zu einer Peritonealduplikation beider Geschlechter bei einer Konzentration von 10-8 M. Daher sind hier die Schnitte aus der Exposition mit der naechst niedrigeren Konzentration, 0,5*10-8 M, dargestellt. Bei den Maennchen (Abb. 3.35) kam es zu einer rudimentaeren Ausbildung der Gonaden in Peritonealduplikation. Die rudimentaeren Ovarien (Abb. 3.36) zeigten ebenfalls Peritonealduplikationen und ein vermehrtes Auftreten von Primordialzellen.
Die Exposition mit CYP mit 10-8 M fuehrte in den maennlichen Gonaden zu einer aktiven aber reduzierten Spermatogenese. Die Reifungsstadien sind nur bis zu Spermatozyten vorhanden, Spermatiden fehlen im Vergleich zur SoCo komplett (Abb. 3.37). Weibliche Tiere bildeten eine aktive Oogenese in den Ovarien mit einzelnen atretischen Oozyten aus (Abb. 3.38).
Bei FEN 10-8 M fand sich in den Testes der Ploetzen nach 210 Tagen eine aktive Spermatogenese mit reduzierter Reifung. Es waren nur Spermatogonien vorhanden (Abb. 3.39). Bei den Weibchen zeigte sich eine normale Reifung der Ovarien mit aktiver Oogenese. Hier waren alle Stadien der Eireife vorhanden (Abb. 3.40).
Die Raten der Mortalitaet betrugen in der EX3:
In den Gehirnen der weiblichen 2+ Tieren kam es zu keinen signifikanten Unterschieden der Aromatase-mRNA-Expression nach vierzehntaegiger Exposition mit TPT, VIN, LET und MT bei einer Konzentration von 10-8 M (Abb. 3.41).
Bei den aus dem gleichen Versuchsansatz stammenden maennlichen Tieren zeigte sich, dass MT die Expression von ARO-mRNA signifikant steigerte gegenueber der SoCo (Abb. 3.42).
Die Expression der mRNA des LH wurde bei den 2+ Tieren nach vierzehntaegiger Exposition mit TPT in den Gehirnen beider Geschlechter untersucht. Obwohl die LH-mRNA in beiden Geschlechtern tendenziell erhoeht war, waren weder bei den 2+ Weibchen (Abb. 3.43) noch bei den maennlichen 2+ Ploetzen (Abb. 3.44) signifikante Unterschiede zur SoCo auf der zellulaeren Ebene darstellbar. Alle weiteren Proben waren hinsichtlich des Vergleichs zur SoCo ohne nennenswerten Befund.
Bei der Analyse der FSH-mRNAExpression zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in allen Proben zur SoCo. Abb. 3.45 zeigt die Ergebnisse fuer die weiblichen Gehirnproben und Abb. 3.46 die der maennlichen 2+ Ploetzen.
Die Expression der ER-mRNA wurde in den Gonaden der adulten Tiere gemessen. Zur SoCo zeigte sich bei den mit MT exponierten weiblichen 2+ Tieren eine Abnahme der Expression (Abb. 3.47), die bei den maennlichen 2+ Ploetzen nicht gefunden wurde (Abb. 3.48).
Bei den weiblichen 2+ Ploetzen, die nach vierzehntaegiger Exposition mit Vinclozolin beprobt wurden, zeigte sich eine deutliche Abnahme im Fall der AR-mRNA in den entnommenen Gonaden (Abb. 3.49). Fuer die maennlichen Tiere traf dies nicht zu (Abb. 3.50).
Bei den Enzymbestimmungen wurden nach vierzehntaegiger Exposition von 2+ Ploetzen mit TPT, VIN, LET, MT und mitgefuehrten SoCo in einer Konzentration von 10-8 M die Aktivitaeten verschiedener Enzyme im Gehirn und in den Gonaden bestimmt. Die Anzahl der Messung zugrunde liegenden Tiere ist in dem jeweiligen Diagrammbalken vermerkt. Signifikante Unterschiede zur Loesungsmittelkontrolle wurden mit Hilfe des Dunnett`s-Test statistisch ausgewertet und gekennzeichnet. Aromatase, ein Enzym das T in E2 umwandelt, wurde vergleichend sowohl in weiblichen Gehirnen als auch in Gehirnen maennlicher Ploetzen untersucht. Die Aktivi-taeten der Enzyme wurden in pmol/h/mg Protein gemessen und ergaben bei den weiblichen Tieren keine signifikanten Unterschiede zur SoCo (Abb. 3.51).
In den maennlichen Tieren hingegen senkte LET die Aromataseaktivitaet und MT steigerte sie (Abb. 3.52).
Nach vierzehntaegiger Exposition (EX3) mit vier verschiedenen Substanzen, TPT, VIN, LET, MT und parallel mitgefuehrten SoCo bei einer Konzentration von jeweils 10-8 M wurden pro Exposition je acht weiblichen (n=8) und acht maennlichen (n=8) 2+ Ploetzen Blut aus der Caudalvene entnommen und mittels eines Enzym-Immuno-Assays (EIA) die Konzentration an 17ß-Oestradiol (E2) und 11-Keto-Testosteron (11-KT) im Blutplasma bestimmt. Hierbei zeigte sich, dass die Konzentrationen von E2 bei den Weibchen gegenueber der Loesungsmittelkontrolle ca. fuenffach hoeher waren als bei den Maennchen. Im Vergleich der weiblichen Tiere untereinander hemmten TPT, LET und MT die Konzentrationen von E2 signifikant zur Loesungsmittelkontrolle (Abb. 3.53). Dargestellt sind die Mittelwerte mit Standardfehler.
Die 11-KT-Spiegel im Blutplasma der maennlichen 2+ Tiere aus den SoCo waren nach vierzehntaegiger Exposition ca. zwoelffach hoeher als bei den Weibchen. Bei den weiblichen Tieren senkte MT die 11-KT-Konzentration im Blutplasma signifikant zur SoCo (Abb. 3.55). Die Mittelwerte der Konzentrationen von 11-KT im Plasma der MT-behandelten maennlichen 2+ Ploetzen waren im Verhaeltnis zur SoCo signifikant niedriger (Abb. 3.56). Dargestellt sind die Mittelwerte der Ergebnisse aus den EIA von acht Tieren pro Geschlecht und die Standardabweichungen. Signifikante Unterschiede zur SoCo wurden mit dem Dunnett`s-Test ermittelt und gekennzeichnet.
Methyltestosteron (MT), ein synthetisch hergestelltes Androgen, das durch Alkylierung von Testosteron in der 17α-Position erzeugt wird, hat eine potenziell androgene Wirkung.
Vinclozolin (VIN), ein Fungizid, zeigte nur eine geringe Affinitaet zum Androgenrezeptor (AR) beim Menschen (Kelce et al., 1994). Durch Hydrolyse entstehen die beiden Metabolite, M1 und M2, welche als AR-Antagonisten die Transkription androgenabhaengiger Gene verhindern (Wong et al., 1995).
Letrozol (LET), einem Medikament aus der Brustkrebs-Rezidivprophylaxe, das in Deutschland erst im Maerz 2006 zugelassen wurde, ist ein Aromatasehemmer und somit potenziell androgen.
Fenarimol (FEN), ein Pflanzenschutzmittel, ist ebenfalls ein Aromatasehemmer und somit potenziell androgen.
Die Gruppe mit androgener Wirkung: TPT und MT.
Die Gruppe mit antiandrogener Wirkung: VIN und CYP.
Um festzustellen, ob Umweltchemikalien eine androgene oder antiandrogene Wirkung ueber die Androgen-Rezeptoren hervorrufen, muss zunaechst die Bindungsfaehigkeit solcher Substanzen an den Rezeptor gezeigt werden. Die Bindung an einen Rezeptor ruft nicht unbedingt eine biologische Wirkung hervor. Ebenso koennte durch die Bindung an den Rezeptor eine Blockierung der transaktivierenden Funktionen, also ein antagonistischer Effekt, auftreten. Die Bindung an den Rezeptor stellt somit die erste Moeglichkeit (anti)androgenen Wirkmechanismen dar. Daher ist es von essentieller Bedeutung den Androgenrezeptor bei R. rutilus daraufhin zu charakterisieren, was innerhalb dieser Arbeit anhand der Methode des Radiorezeptorassays mit cytosolischen Extrakten der Gonaden und der Leber von R. rutilus durchgefuehrt wurde.
Bisher sind noch keine Untersuchungen zur Charakterisierung der Ligandenbindung an Androgen-Rezeptoren bei R. rutilus durchgefuehrt worden. Daher stellen die hier aufgezeigten Befunde die ersten Ergebnisse zur Charakterisierung und Etablierung der Androgen-Rezeptor-Bindung in den Gonaden und der Leber von R. rutilus dar. Optimale Inkubationbedingungen ergaben sich unter der Verwendung von Tris-HCl-Puffer bei einer Temperatur von 4°C wie bei Lutz und Kloas (1999) fuer die Oestrogen-Rezeptor-Bindung bei Xenopus laevis beschrieben, was durch eigene Vorversuche bei R. rutilus bestaetigt wurde. Durch die Ergebnisse des Zeitverlaufs der Bindung von Testosteron an die Androgen-Rezeptoren zeigte sich, ab welchem Zeitraum sich Testosteron an die Androgen-Rezeptoren spezifisch bindet und ueber welchen Zeitraum die Inkubationsbedingungen die Aufrechterhaltung eines stabilen Gleichgewichtes zwischen Assoziation und Dissoziation (steady state) des Liganden und seines Rezeptors ermoeglichten. Bis zu 3 Stunden erfolgte ein kontinuierlicher Anstieg der spezifischen Bindung, um dann eine maximale Bindung als steady state zu erreichen, die fuer 21 Stunden stabil blieb, bevor sie wieder abfiel, was optimale Bedingungen fuer Untersuchungen von AACs hinsichtlich ihrer Bindungsfaehigkeit an die nukleaeren Androgenrezeptoren bei R. rutilus gewaehrleistet.
Somit konnte erstmals gezeigt werden, dass der AR eine hohe Spezifitaet fuer seinen natuerlichen Liganden T und das synthetische Androgen MT, besitzt. Die hohe Spezifitaet wurde auch durch die geringe Bindungsaffinitaet der Oestrogene belegt. In einer Studie, die dies ebenfalls belegt, wurden 202 Chemikalien auf ihre Bindung an den Androgenrezeptor von Ratten untersucht (Fang et al. 2003). Hierbei wurde die gleiche Reihenfolge der Bindungsaffinitaet an den AR gefunden wie in der hier vorliegenden Studie. Das p,p`-DDE keine Affinitaet zum AR in den Gonaden von R. rutilus zeigt, koennte an der Sensitivitaet des RARAs liegen. Wie Fang et al. zeigten, liegt der IC50-Wert fuer p,p`-DDE in der Studie um zwei bis drei Zehnerpotenzen hoeher als der von T oder MT. Obwohl bei R. rutilus die eingesetzte Menge an p,p`-DDE hoeher war als die von T oder MT, koennte der Radiorezeptorassay hier nicht mehr sensibel genug gewesen sein. Eine Verdraengung waere bei hoeheren Konzentrationen von p,p`-DDE aber zu erwarten, was aber aufgrund der Loeslichkeit von p,p`-DDE in diesen Assays nicht mehr durchfuehrbar war. TPT hingegen bindet nicht in der Bindungstasche des AR wie der natuerliche Ligand und zeigt somit keine Affinitaet gegenueber der Bindungsstelle des natuerlichen Liganden (Yamabe et al. 2000). Die gleiche Reihenfolge der Affinitaeten der Liganden und die gleichen Schlussfolgerungen ergaben sich auch bei den Untersuchungen fuer das Bindungsverhalten der AR in der Leber von Maennchen und Weibchen von R. rut i lus.
Alle hier eingesetzten Substanzen fuehrten zu einer Verdraengung des natuerlichen Liganden am AR außer p,p`-DDE und TPT. p,p`-DDE und TPT zeigten eine geringe oder keine Affinitaet zum AR. Bei p,p`-DDE war die eingesetzte Konzentration zu niedrig und TPT bindet an einer anderen Stelle als der Ligand am Rezeptor. Die charakterisierte AR-Bindung zeigt, dass der AR von R. rutilus eine soweit belegte recht aehnliche Spezifitaet wie andere Vertebraten-Modelle aufweist. Hinsichtlich der Wirkungen von AACs stellt R. rutilus somit ein gutes vergleichendes Modell dar.
Nach 210-taegiger Exposition wurden die Gesamtlaengen der larvalen R. rutilus gemessen. Hierbei zeigte sich, dass die Laenge aller Fische der TPT-Expositionen im Mittel signifikant geringer war im Vergleich zur SoCo. Expositionen mit Wasser aus Klaeranlagenauslaeufen zeigten keine Unterschiede im Laengenwachstum bei R. rutilus (Liney et al. 2006). Da bekannt ist, dass bei TPT der Anteil an Zinn hauptverantwortlich ist fuer die adversen Effekte, wurden von den nominellen Konzentrationen, die hier eingesetzt wurden (0,5*10-9 M bis 10-8 M), nach der Exposition der Anteil von Zinn in µg/L Feuchtgewicht bestimmt. In der hier vorliegenden Studie wurden TPT-Sn-Konzentrationen von 60–776 µg/kg Feuchtgewicht gemessen (persoenliche Mitteilung: Thierry Dagnac, BRGM, France). Diese liegen unter denen in der Studie von Harino et al. bei adulten japanischen Barschen gemessenen umweltrelevanten Konzentrationen von 1000-130000 µg/kg Feuchtgewicht (Harino et al. 2000), bei der keine Unterschiede im Laengenwachstum gefunden wurden. So konnte hier erstmals gezeigt werden, dass TPT in geringen umweltrelevanten Konzentrationen bei Larven von R. rutilus einen hemmenden Effekt auf das Laengenwachstum hat.
Weiterhin ist bekannt, dass bei Ambystoma barbouri, einer Art der Querzahnmolche, die im Sueßwasser stattfindende larvale Entwicklung unter Einfluss von TPT in nominellen Konzentrationen von 1 µg/L und 5 µg/L stark beeintraechtigt wurde. Hierbei kam es unter anderem zu einer Dosis abhaengigen extremen Reduktion der Koerperlaenge im Vergleich zur Kontrolle (Rehage et al., 2001). Ebenfalls eine Beeintraechtigung der larvalen Entwicklung und Koerpermissbildungen wurden bei der Elritze (Phoxinus phoxinus) nachgewiesen (Fent und Meier, 1994). Hierbei wurden die Fische bei 21°C und nominellen Konzentrationen von 3,9 µg/L bis 15,9 µg/L gehaeltert. Effekte, wie Koerpermissbildungen und Mortalitaet, traten bereits nach 3 bzw. 5 Tagen auf. In der vorliegenden Studie wurden die larvalen R. rutilus bei 20 ± 1°C und einer nominellen Konzentration von 0,059 µg/L bis 1,187 µg/L TPT exponiert. Diese Konzentrationen liegen unter der Dosis, die Fent und Meier (1994) eingesetzt haben, und bewirkten keine gesteigerte Mortalitaetsrate, hatten aber nach 210 Tagen einen signifikanten Effekt auf die Koerperlaenge der Larven von R. rutilus im Vergleich zur Kontrolle. MT, die zweite hier eingesetzte Substanz mit androgener Wirkung, zeigte hingegen keine signifikanten Unterschiede zur SoCo. Dies erklaert sich aus der schlechteren Gesamtentwicklung, auf die spaeter noch eingegangen wird. Beide Antiandrogene, VIN und CYP, zeigten genau wie FEN, ein potentieller Aromatasehemmer, keine Auswirkung auf das Laengenwachstum der Larven von R. rutilus. Letrozol, ein weiterer potentieller Aromatasehemmer, bewirkte in der niedrigsten Konzentration, dass die Koerperlaenge im Vergleich zur SoCo signifikant hoeher war. Bei einer umfangreichen Studie mit Japanischen Reiskaerpflingen (Oryzias latipes) wurden befruchtete Eier und Larven fuer 14 Tage bei einer maximalen Konzentration von 3125 µg/L Letrozol exponiert. Es zeigten sich allerdings keinerlei Effekte auf die Morphologie (Shuna et al. 2007). Da es sich bei der Exposition von R. rutilus mit Letrozol um die erste Studie ueberhaupt handelt, die ueber einen Zeitraum der gesamten Geschlechtsdifferenzierung durchgefuehrt wurde, ist festzustellen, dass Letrozol in einer Konzentration von 713 µg/L eine signifikante Steigerung der Koerperlaenge hervorgerufen hat, was auf Effekte auf die Wachstumsregulation schließen laesst.
Die signifikante Zunahme des Gewichtes bei einer Vinclozolin-Konzentration und zweier Fenarimol-Konzentrationen sind weder Dosis abhaengig noch durch eine anderen Einfluss zu erklaeren und repraesentieren daher wohl eher die zufaellig auftretende biologische Variabilitaet bei R. rutilus.
MT und TPT sind androgen wirksame Substanzen. Ueber die Auswirkungen von TPT auf das Geschlechter.verhaeltnis bei Sueßwasserfischen ist bis dato nichts bekannt. In Konzentrationen von 38,5 µg/L zeigte sich bei Vorversuchen, dass TPT nach nur 48 h zu 100 % letal auf die Larven von R. rutilus wirkte (van Ballegooy, unveroeffentlicht). Daher wurde in der EX1 als hoechste Konzentration eine Zehnerpotenz niedriger gewaehlt als in den Vorversuchen. Die Fische konnten so ueber einen Zeitraum von 210 Tagen exponiert werden, zeigten aber keine Unterschiede zur SoCo hinsichtlich der Sexualdifferenzierung der Geschlechter.
Von MT hingegen ist bekannt, dass dieses kuenstliche Androgen zu einer Vermaennlichung bei verschiedenen Tierarten - Invertebraten, Amphibien und Fischen - fuehren kann (Schulte-Oehlmann et al., 2000; Boegi et al., 2002; Seki et al. 2004). Bei den in dieser Arbeit eingesetzten niedrigsten Konzentration von MT (0,151 µg/L) kam es zu einer signifikanten Verschiebung des Phaenotypes in Richtung Maennchen. Bei den progynen Zebrafischen (Danio rerio) kam es in einem „partial life-cycle test“ bei jeder der verwendeten Konzentrationen (26-1000 µg/L) zu einer totalen Vermaennlichung der eingesetzten juvenilen Tiere (Orn et al., 2003). In einer Studie mit Reiskaerpflingen (Oryzias latipes) kam es durch Injektion von MT zu einer phaenotypischen maennlichen Ausbildung von genotypischen Weibchen (Papoulias et al., 2000). Die beiden hoechsten Konzentrationen (1,51 bzw. 3,02 µg/L) fuehrten dazu, dass die larvalen R. rutilus keine Gonaden ausbildeten. Dieser Effekt ist bei Fischen bisher noch nicht beschrieben worden.
Die potentiell antiandrogen wirksamen Substanzen VIN und CYP zeigten keine Einfluesse auf die Geschlechtsdifferenzierung bei larvalen R. rutilus in den eingesetzten Konzentrationen. VIN verursachte in einem anderen Versuch ueber 100 Tage nach dem Schluepfen bei einer Konzentration von 2500 µg/L keine Effekte auf die Geschlechtsdifferenzierung bei Japanischen Reiskaerpflingen (Oryzias latipes). Das Gleiche galt auch fuer CYP bei einer eingesetzten Konzentration von 10 µg/L (Kiparissis et al., 2003). Alle bei EX1 und EX2 mit R. rutilus eingesetzten Konzentrationen lagen deutlich unterhalb der von Kiparissis gewaehlten Konzentration, so dass sich auch hier kein Einfluss durch VIN und CYP auf die Geschlechterverteilung festzustellen war.
Um die Wirkung von AACs auf der Ebene der Genexpression nachzuweisen und um den Einfluss weiterer Faktoren, wie sie im Gesamtorganismus vorhanden sind, auszuschließen, wurde die Methode der semiquantitativen Reverse-Transkriptase-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR) bei den Zielorganen Gehirn und Leber durchgefuehrt. Hierbei wurde die Expression der mRNA in verschiedenen Geweben nachgewiesen. Im Gehirn wurde die m-RNA-Expression von ARO, LH und FSH bestimmt. In der Leber von R. rutilus wurde die Expression der m-RNA des ER und des AR detektiert. Um eine semiquantitative Bestimmung der jeweiligen m-RNA zu ermoeglichen, wurde parallel das „housekeeping gene“ EF 1α nachgewiesen. Erstmalig wurde in dieser Arbeit die Expression der LH-mRNA und FSH-mRNA detektiert. Hierzu wurden fuer beide Biomarker neue Primer gestaltet und etabliert. Fuer den Primer der LH-mRNA wurde vor der Erstellung der Arbeit Sequenzen von Carter et al. (2005) veroeffentlich. Diese wurden zunaechst verwendet. Allerdings sind die veroeffentlichen Primersequenzen fehlerhaft und daher fuer die Detektion der LH-mRNA nicht geeignet.
Die im Gehirn der larvalen R. rutilus gemessenen Ergebnisse zeigten bei allen eingesetzten AACs keine signifikanten Unterschiede in der LH-mRNA-Expression und in der FSH-mRNA-Expression im Vergleich zur Kontrolle. In der Literatur ist beschrieben, dass Aromatasehemmer in Fischen zu einem Anstieg der LH-mRNA im Gehirn und zu einer geringen bis zu keiner Regulation der FSH-mRNA-Expression fuehren (Sohn et al., 1998; Mateos et al., 2002). Dies deutet darauf hin, dass LH auch waehrend der Ontogenese bei R. rutilus eine Schluesselrolle in der Sexualdifferenzierung spielen koennte und durch exogene Substanzen dahingehend beeinflusst werden kann, dass es zu einer Vermaennlichung bzw. zur Hemmung der Gonadenentwicklung kommt. Durch die Testosteronerhoehung im Gehirn der Maennchen kommt es sehr wahrscheinlich zu einer negativen Rueckkopplung ueber die Androgene und somit zu einer Gegenregulation, die zu einer Erhoehung der LH-mRNA-Expression fuehrt. Weiterhin kann durch die tendenzielle Erhoehung der LH-mRNA-Expression in manchen Behandlungsgruppen dieser Studie bestaetigt werden, dass FSH weniger stark reguliert ist wie LH. Wuerde man die mRNA-Expressionen nicht wie hier aus dem Gesamthirn messen sondern beispielsweise lokal in der Hypophyse, koennten gegebenenfalls tendenzielle Aenderungen sich signifikant darstellen.
TPT und alle anderen eingesetzten AACs hatten keinen Einfluss auf die Genexpression der Aromatase-m-RNA-Expression. Allerdings wurde eine Inhibierung der Expression durch den Aromatasehemmer LET erwartet. Tendenziell ist dies auch in den Gehirnen maennlicher Tiere aufgetreten ohne aber signifikant zu sein. Bei hoeheren Konzentrationen waere dies eventuell der Fall gewesen.
Um die Auswirkungen der eingesetzten AACs auf Zielorgane des endokrinen Systems bei R. rutilus und um die mit dem RARA gewonnenen Ergebnisse auf ein weiteres endokrines Zielorgan zu untersuchen, wurden die Genexpressionen der ER-mRNA und AR-mRNA in der Leber detektiert. Hierbei zeigte sich, dass TPT die ER-mRNA-Expression in den Weibchen stark hemmt. Da die hier eingesetzte Konzentration um nur eine Zehnerpotenz niedriger war als die letale Dosis aus den Vorversuchen, scheint es sich hier um einen toxischen Effekt zu handeln, der nicht letal wirkt dafuer aber die Autoinduktion der ER-mRNA-Expression bzw. generell jede Genexpression inhibiert. Dies wird auch durch die Ergebnisse der AR-mRNA unterstuetzt, die in beiden Geschlechtern von R. rutilus eine Abnahme der Expression aufweist.
CYP reguliert in der Leber der weiblichen und maennlichen Tiere als potenziell antiandrogene Substanz die Expression der AR-mRNA signifikant nach oben im Vergleich zur SoCo. Genauso wie VIN, ebenfalls mit potenzieller antiandrogener Wirkung, in der Leber der Maennchen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass durch die Blockierung der AR es zu einer Zunahme der Expression der AR kommt, um dadurch wieder funktionelle AR zur Verfuegung zu haben. Der Mechanismus, dem eine solche Regulation zugrunde liegt, ist noch unklar, muss aber unabhaengig von der oben beschriebenen Autoinduktion des AR durch Androgene sein. Der potentielle Aromatasehemmer LET erhoeht die AR-mRNA-Expression in der Leber von R. rutilus bei beiden Geschlechtern signifikant. Hier duerfte es sich um eine Autoinduktion des AR durch die Erhoehung der Androgenkonzentration handeln.
Neben den morphologischen, biochemischen und molekularbiologischen Endpunkten, wurden die Gonaden histologisch untersucht. Hierbei riefen die verschiedenen eingesetzten Substanzen adverse Effekte in den Gonaden von R. rutilus hervor. War zunaechst bekannt, dass vermutlich EDs in den Gonaden von wild lebenden adulten R. rutilus zu Missentwicklungen, Intersex und zur Minderung der Fertilitaet fuehren (Jobling et al., 2002), wurde spaeter gezeigt, dass auch larvale R. rutilus, die ueber einen Zeitraum von 300 Tagen nach der Befruchtung exponiert wurden, adverse Effekte in der Gonadenentwicklung aufwiesen (Liney et al., 2005, 2006). Bei diesen Untersuchungen handelte es sich vorwiegend um die Exposition mit Klaeranlagenauslaeufen. Dabei wurde der Focus hauptsaechlich auf oestrogen wirksame Substanzen gelenkt.
Bei den R. rutilus, die ueber 210 Tage mit MT in Konzentrationen von 1,51 µg/L bzw. 3,02 µg/L exponiert wurden, war die gonadale Entwicklung beider Geschlechter zu 100 % supprimiert, so dass eine histologische Auswertung nicht moeglich war. Bei einer Konzentration von 0,3 µg/L MT waren 6,3 % der maennlichen Gonaden nur rudimentaer ausgebildet und bei den Ovarien kam es bei 6,3 % der Tiere zu Atresien in den Gonaden. Auch bei Pimephales promelas wurde nach einer dreiwoechigen Exposition mit MT in einer Konzentration von 0,1 µg/L bei 5 % der weiblichen Tiere Atresien in den Ovarien detektiert. Bei einer Konzentration von 50 µg/L lag die Rate der Atresien schon bei 11,4 %. Allerdings waren die Fische zum Zeitpunkt der Exposition bereits 10 bis 15 Monate alt (Pawlowski et al., 2004). Dies ist auch der entscheidende Unterschied zu der hier vorgestellten Studie mit R. rutilus, was darauf hindeutet, dass eine Exposition mit dem Androgen MT in der fruehen Ontogenese extrem adverse Effekte auf die Gametogenese bewirkt und sogar zu einer vollstaendigen Supprimierung der Gonadenausbildung fuehren kann.
Bei VIN zeigte sich bei den maennlichen und weiblichen Tieren ein aehnliches Bild wie bei TPT. Auch hier waren die Testes in Reife und Groeße reduziert und es zeigten sich nur Spermatogonien nach 210 Tagen Exposition. Die Ovarien der weiblichen Fische hatten ein histologisch unauffaelliges Bild. Bis zu dieser Arbeit wurde die hemmende Wirkung von VIN auf die Spermatogenese in larvalen Fischen mit der sehr hohen und nicht umweltrelevanten Konzentration von 2500 µg/L bei Reiskaerpflingen (Oryzias latipes) ueber einen Expositionszeitraum von drei Monaten nach dem Schluepfen gezeigt (Kiparissis et al., 2003). In dieser Arbeit wurde als hoechste Konzentration 2,86 µg/L VIN eingesetzt und es zeigten sich mit dieser nahezu 1000fach niedrigeren Konzentration die gleichen Effekte wie bei O. latipes. Entscheidende Unterschiede sind die laengere Expositionszeit und die Tatsache, dass die Exposition bereits einen Tag nach der Fertilisation begann. Dies deutet, wie schon die molekularbiologischen Untersuchungen, darauf hin, dass die ersten Tage eine entscheidende Rolle in der Gametogenese spielen und es hier durch AACs zu adversen Stoerungen der Gametogenese kommen kann.
LET, ein Aromatasehemmer, wurde in dieser Studie erstmals auf Wirkungen auf die Entwicklung der Gonaden bei Fischen untersucht. Rein histologisch entwickelten sich die maennlichen sowie die weiblichen Gonaden nach 210 Tagen Exposition mit Fenarimol (0,5*10-9 M bis 10-8 M) bis zum Vergleich mit den Tieren der SoCo ohne jede Beeinflussung. Das gleiche gilt auch fuer den anderen in dieser Studie untersuchten Aromatasehemmer, FEN, bei Konzentrationen von 0,5*10-9 M bis 10-8 M. Auch hier bildeten sich die Gonaden beider Geschlechter im Vergleich zur SoCo normal aus.
TPT, MT, CYP und VIN wirkten sich also negativ auf die Gametogenese aus und deuten somit darauf, dass in den fruehen Stadien der Ontogenese Androgene ebenso eine entscheidende Rolle fuer die Entwicklung der Gonaden spielen wie sie bisher vor allen den Oestrogenen zugeschrieben wurde. Ein Eingreifen durch AACs in die Gametogenese fuehrt ebenfalls zu fundamentalen adversen Schaeden bei R. rutilus, die die Fortpflanzung einer Population stark einschraenken oder gar unmoeglich machen. Deuteten die bisherigen Untersuchungen dieser Arbeit darauf hin, dass alle eingesetzten AACs verschiedene, molekulare Biomarker beeinflussen und die normale Entwicklung der Tiere stoeren koennen, bestaetigt die Histologie dies fuer vier der Substanzen sehr deutlich. Es ist daher unerlaesslich Versuche zu endokriner Beeinflussung der Reproduktion mit histologischen Untersuchungen zu verifizieren.
Die Mortalitaetsrate betrug bei allen verwendeten Substanzen waehrend der vierzehntaegigen Exposition von 2+ R. rutilus 0,0%. Dies ist vergleichbar zu aehnlichen Studien mit Pimephales promelas (Ankley et al. 2002; Panther et al. 2004). Der Vergleich mit den Expositionen der larvalen R. rutilus (EX1 und EX2) zeigt, dass auch hier die Haelterung unter nahezu optimalen Bedingungen stattgefunden hat und ein Einfluss auf die Kondition der Tiere durch die Haelterung ausgeschlossen werden kann.
Wie auch bei den larvalen R. rutilus zeigte sich, dass MT in den Gehirnen maennlicher Tiere die Expression der ARO-mRNA um ca. das 3-fache im Vergleich zur SoCo steigert. Alle anderen Substanzen fuehrten zu keiner Beeinflussung der Genexpression der ARO-mRNA. Ebenso kam es wie bei den larvalen Tieren durch die Exposition mit den oben beschriebenen Substanzen zu keiner signifikanten Beeintraechtigung der Expression der LH-mRNA und der FSH-mRNA in den Gehirnen der adulten R. rutilus beider Geschlechter.
Dies laesst die Schlussfolgerung zu, dass adulte Tiere, die ueber einen kurzen Zeitraum AACs ausgesetzt sind, zunaechst wenig Effekte auf die HHG zeigen, da der Koerper in der Lage zu sein scheint, das durch exogene Stoffe hervorgerufene Ungleichgewicht bei den hier angewandten Konzentrationen von 0,5*10-9 M bis 10-8 M effizient zu kompensieren. Larvale R. rutilus hingegen sind weitaus empfindlicher und deutlich mehr gefaehrdet adverse Effekte durch AACs zu erhalten. Fuer die weitere Diskussion sei hier nochmals darauf hingewiesen, dass die LH-mRNA-Expression und die FSH-mRNA-Expression weder bei den adulten noch bei den larvalen Tieren eine signifikante Veraenderung gegenueber der SoCo zeigte.
Nach vierzehntaegiger Exposition zeigte sich keine signifikante Beeintraechtigung der Aromataseaktivitaet in den Gehirnen der weiblichen 2+ R. rutilus durch die eingesetzten AACs im Vergleich zur SoCo. Bei den maennlichen Tieren zeigte sich, dass MT die Aromataseaktivitaet in den Gehirnen steigert. Dies korreliert mit den in dieser Arbeit gezeigten Ergebnissen aus der Bestimmung der ARO-mRNA-Expression. Hier steigerte MT die Expression der ARO-mRNA im Gehirn ausschließlich bei den maennlichen 2+ Tieren. Durch die Enzymassays wurden die gezeigten Ergebnisse der Genexpression bestaetigt und auch hier kommt es nur bei den maennlichen Tieren durch das vermehrte Vorhandensein von MT zu einer Gegenregulation, um den androgenen Steroidhaushalt zu regulieren. Bei den Weibchen kommt es durch den im Verhaeltnis zu den Maennchen hoeheren Oestrogenspiegel zu keiner Gegenregulation, da sich das Verhaeltnis von Oestrogenen zu Androgenen nur geringfuegig aendert. Maennliche Tiere haben deutlich mehr Androgen als Oestrogen. Durch die Exposition mit MT wird das Verhaeltnis drastischer gestoert als in den Weibchen und durch das vermehrte Angebot an Substrat kommt es zu einem Anstieg der Aromataseaktivitaet, die einhergeht mit der gesteigerten Expression der ARO-mRNA in maennlichen R. rutilus Gehirnen. TPT zeigte keine Beeinflussung der Aromataseaktivitaet genauso wie VIN.
Obwohl TPT nicht in der Bindungstasche des AR bindet, besitzt diese Substanz eine potenzielle androgene Wirkung. Durch Hemmung der Steroidsynthese fuehrte TPT zu einer signifikanten Erniedrigung von E2 im Blutplasma adulter weiblicher R. rutilus. Bei den maennlichen 2+ R. rutilus ist der natuerliche E2-Spiegel im Plasma schon weitaus geringer als bei den Weibchen, so dass eine Erniedrigung nicht signifikant nachweisbar war.
Das Androgen MT senkte die Konzentrationen von E2 und 11-KT im Blutplasma beider Geschlechter im Vergleich zur SoCo nach 14-taegiger Exposition. Dies ist durch den Mechanismus des negativen Feedbacks zu erklaeren (Kloas und Lutz, 2006). Bedingt durch das Vorhandensein von MT kommt es zu einer vermehrten Bindung an die AR in den Zielorganen sowie in den hoeher regulierenden Zentren des Hypothalamus und der Hypophyse. Durch das negative Feedback wuerde man bei R. rutilus eine Hemmung der Induktion der gonadotropen Hormone der Hypophyse erwarten. Dies ist in diesem Versuch nicht zu belegen gewesen. Allerdings wurde durch Harris et al. (2001) gezeigt, dass es zu einer zyklischen Ausschuettung des Sexualsteroids LH bei Regenbogenforellen (O. mykiss) kommt und sich nach 18 Wochen keine Unterschiede zu den Tieren aus der Kontrollgruppe mehr zeigen. Dies angenommen und mit dem Umstand kombiniert, dass nur zum Ende der Exposition die mRNA der gonadotropen Hormone bestimmt wurde, laesst die Schlussfolgerung zu, dass die Gegenregulation zu diesem Zeitpunkt noch nicht oder nicht mehr ueber die Ausschuettung von LH und FSH geregelt wurde. Es kommt wahrscheinlich zu einer fruehzeitigen Hemmung der Sekretion von LH und FSH, die im Verhaeltnis zur SoCo nach 14 Tagen nicht signifikant nachweisbar ist. Da LH und FSH nicht ausgeschuettet werden, kommt es zu einer Gegenregulation in Form einer vermehrten Produktion von Aromatase im Gehirn von R. rutilus. Dies wurde durch die Messung der Enzymaktivitaet bestaetigt.
Die Auswirkungen von AACs auf R. rutilus wurden auf verschiedenen Untersuchungsebenen (morphologische Parameter, Geschlechterverhaeltnis, EIA, mRNA-Expression, Sexualsteroidspiegel im Blutplasma, Histologie) in dieser Studie erstmalig gezeigt.
Hierbei zeigte sich, dass besonders die histologischen Untersuchungen eine sensitive Nachweismethode fuer die Wirkung von AACs sind. Die Expositionen von R. rutilus mit TPT, CYP, MT und VIN fuehrten zu adversen Effekten in der Gonadenentwicklung. Bei den Untersuchungen der molekularen Biomarker zeigten sich diverse Effekte. Vor allem die TPT exponierten Tiere zeigten auf molekularer Ebene deutliche Unterschiede zur SoCo. Allerdings bestaetigen die untersuchten Biomarker nicht die physiologischen Veraenderungen der Testes der Fische. Es ist somit zu vermuten, dass hier ein anderer Wirkmechanismus durch TPT vorliegt, als durch die Biomarker gezeigt werden konnte. Im Gegensatz dazu korrelieren die drastischen Veraenderungen der MT behandelten maennlichen R. rutilus mit der Erhoehung von ARO (mRNA-Epression und Enzymassay), der AR-mRNA-Expression in der Leber, sowie der verringerten Level der Sexualsteroide (11-KT, E2). R. rutilus wurde in dieser Studie als ein gutes Modell zur Untersuchung von AACs etabliert.
Eine groeßere Anzahl von neuen sensitiven Biomarkern muesste entwickelt werden. Die Trennung von Hyphothalamus und Hypophyse zur Untersuchung verschiedener Biomarker waere essentiell. Weiterhin sollte zur Detektierung ein spezifischer Sexmarker bei R. rutilus gefunden werden, um genauere Aussagen ueber Intersex, Hermaphroditismus und/oder Geschlechtsumwandlung machen zu koennen und dadurch einen wichtigen Biomarker fuer die Oekotoxikologie zu haben. Hierzu wurden bisher verschiedene SOX-Gene (sex-determining region Y-like-box) und DMRT1 (Double Sex - Map Related Transcription Factor 1) als spezifische Primer mit den Methoden der RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) und ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats) ausgetestet, ohne bisher einen Marker zu finden, (muendliche Mitteilung: Wuertz, IGB, Berlin). Weitere spezifische Marker und die Methode der ALFP (Amplified Fragment Length Polymorphism) sollten noch getestet werden.
Die Beeinflussung von Hormonsystem, Schilddruesensystem und Immunsystem durch AACs, sollte parallel an diesem Modell weiter entwickelt und etabliert werden, wie es teilweise in der Arbeitsgruppe „endocrine disruptors“ am Leibniz-Institut fuer Gewaesseroekologie und Binnenfischerei in Berlin schon stattfindet. All diese Untersuchungen sollten am besten mit R. rutilus durchgefuehrt werden, die unter kontrollierten, saisonal angepassten Bedingungen in einer Durchflussanlage in einem „full lifecycle test“ gegenueber verschiedenen AACs exponiert werden.
[3H]-T = Tritium - Testosteron
11-KT = 11-Keto-Testosteron
AAC = (Anti)androgene Substanzen
Abb. = Abbildung
AchE = Acetylcholinesterase
ARO = Aromatase
BPA = Bisphenol A
COMPRENDO = Comperative Research of Endocrine Disruptors
CYP = Cyproteronazetat
DDT = Dichlordiphenyltrichloraethan
DMRT1 = Double Sex - Map Related Transcription Factor 1
DNA = Desoxyribonukleinsaeure
dpm = „dots per minute“
E2 = 17ß-Oestradiol
ED(s) = endocrine disruptor(s)
EF = Elongationsfaktor 1α
EIA = EnzymImmunoAssay
ERE = E2 -responsive Elemente
et al. = et alii
EX1 = erste Exposition larvaler R. rutilus
EX2 = zweite Exposition larvaler R. rutilus
FEN = Fenarimol
FSH = Follikel stimulierende Hormon
GnRH = Gonadotropin-releasing Hormon
HE = Haematoxylin-Eosin
HHG = Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse
HVL = Hypophysenvorderlappen
IC50 = „inhibiting concentration 50 percent“
IGB = Leibniz-Institut fuer Gewaesseroekologie und Binnenfischerei
IgG = Immunglobulin G
IZ = interstitiellen (Leydigschen) Zellen
L = Liter
LC50 = lethal concentration 50%
LET = Letrozol
LH = Luteinisierende Hormon
Lsg = Loesung
mRNA = messenger-Ribonukleinsaeure
MT = Methyltestosteron
NB = „nonspecific binding“ – unspezifische Bindung
OECD = Organisation for Economic Co-operation and Development
p, p`-DDE = Dichlordiphenyldichlorethylen
PAK = polychlorierte Kohlenwasserstoffe
PAN = Pesticide Action Network
PCB = polychlorierte Biphenyle
RARA = Radiorezeptorassay
RT-PCR = Reverse Transcriptase-Polymerase Ketten Reaktion
SB = „specific binding“ – spezifisch gebundene Ligandenmenge
SBP = Sexualsteroid bindende Protein
Seq = Sequenz
SoCo = Loesungsmittelkontrolle
SOX = SRY-like-box
SRY = sex-determining region Y
T = Testosteron
Tab. = Tabelle
TAM = Tamoxifen
TB = „total binding“ – Gesamtbindung
TPT = Triphenylzinn
Tris = Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
UBA = Umweltbundesamt
VIN = Vinclozolin
z. B. = zum Beispiel
ZNS = Zentrales Nervensystem
Ich danke all meinen Kollegen am Institut fuer Gewaesseroekologie und Binnenfischerei in Berlin fuer Ihre Unterstuetzung waehrend meiner Doktorarbeit und eine sehr schoene Zeit, die ich sicher vermissen werde.
Mein spezieller Dank gilt:
Prof. Dr. Werner Kloas fuer die Bereitstellung des Forschungsthemas, konstruktiven Diskussionen, wissenschaftliche Unterrichtung und Unterstuetzung waehrend der Doktorarbeit. Weiterhin fuer sein Vertrauen mich in einem internationalen Projekt zu integrieren.
Prof. Dr. Helmut Segner und Prof. Dr. Joerg Oehlmann fuer Ihre Unterstuetzung und Ihre Bereitschaft diese Arbeit zu beurteilen.
Meiner Arbeitsgruppe (Ralph Urbatzka, Oana Jagnytsch, Ilka Lutz, Claudia Lorenz, Caterina Wiedemann, Antje Tillack, Wibke Schumacher, Ingo Cuppock, Achim Trubiroha, Bjoern Hermelink, Marcel Simon, Constanze Pietsch, Nadja Neumann, Klaus Knopf, Bernhard Rennert, Robert Opitz und Sven Wuertz) fuer die immer gute Zusammenarbeit und fuer Ihre Art der Wissenschaft auch eine lustige Seite abzugewinnen.
Ilka und Claudia fuer den morgendlichen Kaffee und das Laecheln fuer den Tag.
Ralph fuer eine schoene Reise nach Italien zum Fluss Lambro mit vielen neuen wissenschaftlichen und nicht wissenschaftlichen Erkenntnissen.
Robert fuer viele Ratschlaege und neue Musik.
Matti, dem besten Fischer von der ganzen Welt.
Allen Mitstreitern des EU-Projektes COMPRENDO in dessen Rahmen diese Arbeit entstanden ist.
Dr. Burkhard Waterman (Limnomar, Hamburg) fuer die histologische Aufarbeitung der Proben und fuer seine freundliche Unterstuetzung.
Meinen Eltern, Geschwistern und Freunden.
¡Ana mi corazón!