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3.  MATERIAL UND METHODEN

3.1 Materialien

3.1.1 Chemikalien

Alle verwendeten Chemikalien haben den Reinheitsgrad „zur Analyse“ (p.a.) und wurden von verschiedenen kommerziellen Anbietern bezogen.

3.1.2 Zellinien

HepG2-Zellen (ATCC HB 8065) aus menschlichem hepatozellulärem Karzinom wurden von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkultur, Braunschweig, bezogen.

3.2 Geräte und Hilfsmittel

für die Vitamin-E-Bestimmung: Hochdruckchromatograph SHIMADZU, Pumpe LC-6A, UV-Detektor SPD-6A

für die Radioaktivitätsmessung: WALLAC Liquid Scintillation Counter 1410

für die photometrischen Messungen: BIO-RAD Microplate Reader Model 450 und UV 2101PC SHIMADZU UV Vis Scanning Spectrophotometer

für die Ultrazentrifugationen: BECKMANN Ultrazentrifuge L8-70 mit den Rotoren SW 28 und Ti 70.1

für die Kultivierung der HepG2-Zellen: HERAEUS INSTRUMENTS Begasungsbrutschrank BB6220

für die SDS-PAGE: Gelgießkammer HOEFER SE 200 Mighty Small und Elektrophoresevorrichtung LKB Bromma 2050

für das Semi-Dry-Blotverfahren: Semi-Dry-Blotvorrichtung PHASE (max. 40 V) und Nitrocellulosemembran SCHUELLER & SCHLEICHER Protran 45 µm

für die Auswertung der Immunoblots X-Omat Filme (Kodak Eastman, Rochester, NY) und Densitometer mit automatischer Kalibrierung GS-710 (BIO-RAD, Hercules, CA)

N2-Trockenvorrichtung : TECHNE Dri-Bloc DB 3


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3.3 Methoden

3.3.1 Lipoprotein-Gewinnung

Alle in den Versuchen verwendeten Lipoproteine wurden aus frischem Plasma gesunder männlicher Spender mittels KBr-Dichtegradientenultrazentrifugation, modifiziert nach Chapman [90], gewonnen.

3.3.2 Proteinbestimmung

Die Proteinbestimmung erfolgte mittels eines kommerziellen Kits mit Bradford-Reagenz oder nach der Bicinchonic-Acid (BCA)-Methode [91].

3.3.3 Cholesterolbestimmung

Die quantitative Bestimmung des Cholesterols wurde mit einem enzymatischen Farbtest der Firma Boehringer Mannheimdurchgeführt. Dabei entsteht durch enzymatische Oxidation des Cholesterols u.a. H2O2 , welches in einer Peroxidase-katalysierten Reaktion zu einem farbigen Chinonimin umgesetzt wird. Die Extinktion des Farbstoffs ist zur Cholesterolkonzentration proportional und wird photometrisch (UV 2101PC SHIMADZU UV Vis Scanning Spectrophotometer) gemessen.

3.3.4 Vitamin-E-Bestimmung

Vitamin E wird nach Catignani und Bieri [92] mittels HPLC auf einer LiChrosorb RP-18 Säule bestimmt. Als interner Standard wird der Probe vor der Hexanextraktion der Zellen Tocopherolacetat zugesetzt.

3.3.5 Effekt des Vitamin-E-Gehalts von HDL auf die Aufnahme von Cholesterol und Vitamin E in HepG2-Zellen

Aufnahme in Abhängigkeit vom α-Tocopherolgehalt des HDL

HepG2-Zellen werden in Zellkulturflaschen in RPMI-Medium mit 25 mM Glucose und Zusatz von 10 % Fetalem Kälberserum (FKS), Streptomycin (50 µg/ml) und 2 mM Glutamin unter 5 % CO2 bei 37 °C kultiviert. Ein Mediumwechsel erfolgt alle 2-3 Tage.

Pro Ansatz werden 0,5∙106 Zellen in 10 cm-Petrischalen überführt und für einen Tag in RPMI-Medium und für 2 weitere Tage in 10 %-BMS (Basales Medium Supplement, lipoproteinfrei, Biochrom KG, Berlin)-RPMI-Medium kultiviert, bis eine ca. 90 %ige Konfluenz erreicht ist.


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Die Zellen werden dann drei mal mit BMS-Medium gewaschen und schließlich für 3 h mit ³H-Cholesterol-markiertem HDL (je 20000 DPM 2/ml BMS-Medium) inkubiert. HDL wurde mit endogenem Vitamin-E-Gehalt von 1,8 µg/mg Protein oder mit Vitamin E angereichert (19,48 µg/mg Protein), sowie mit drei durch Mischen dieser beiden erzeugten mittleren Konzentrationen (6,22 und 10,54 bzw. 15,06 µg α-Tocopherol/mg Protein) angeboten.

Danach werden die Zellen drei mal in eiskaltem PBS (Phosphate Buffered Saline) gewaschen und in 1,5 ml Homogenisationspuffer modifiziert nach Rooney abgekratzt. Nach der Homogenisation durch Ultraschall (2 mal 20 Stöße à 200 W, je 0,6 s) unter Eiskühlung werden 900 µl für die Messung von Protein, Cholesterol, Vitamin E und Radioaktivität verwendet, die restlichen 600 µl der Zell-Membranpräparation zugeführt. Ausgehend von der spezifischen Radioaktivität des HDL-Cholesterols und der Radioaktivität in den Zellen, wird die Aufnahme von Cholesterol in µg berechnet und auf 1 mg Zellprotein bezogen.

Zeitabhängigkeit der Aufnahme

HepG2-Zellen werden in Zellkulturflaschen in RPMI-Medium mit 25 mM Glucose und Zusatz von 10 % Fetalem Kälberserum (FKS), Streptomycin (50 µg/ml) und 2 mM Glutamin unter 5 % CO2 bei 37 °C kultiviert. Ein Mediumwechsel erfolgt alle 2-3 Tage.

Pro Ansatz werden 0,5∙106 Zellen in 10 cm-Petrischalen überführt und für einen Tag in RPMI-Medium und für 2 weitere Tage in 10 %-BMS (Basales Medium Supplement, lipoproteinfrei, Biochrom KG, Berlin)-RPMI-Medium kultiviert, bis eine ca. 80 %ige Konfluenz erreicht ist.

Nach dreimaligem Waschen mit BMS-Serum werden die Zellen für 1 h, 3 h, 6 h, 9 h und 12 h mit ³H-Cholesterol-markiertem HDL mit endogenem (1,8 µg/mg Protein) bzw. erhöhtem Vitamin-E-Gehalt (19,48 µg/mg Protein) in BMS-RPMI-Medium inkubiert.

Danach werden die Zellen drei mal in eiskaltem PBS (Phosphate Buffered Saline) gewaschen und in 1,5 ml Homogenisationspuffer modifiziert nach Rooney abgekratzt. Nach der Homogenisation durch Ultraschall (2 mal 20 Stöße à 200 W, je 0,6 s) unter Eiskühlung werden 900 µl für die Messung von Protein, Cholesterol, Vitamin E und Radioaktivität verwendet, die restlichen 600 µl der Membranpräparation zugeführt. Ausgehend von der spezifischen Radioaktivität des HDL-3H-Cholesterols und der Radioaktivität in den Zellen, wird die Aufnahme von Cholesterol in µg berechnet und auf 1 mg Zellprotein bezogen.


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3.3.6  Einfluß des zellulären Vitamin-E-Gehalts auf die Expression von PKCα und SR-BI und auf den Cholesterolefflux

HepG2-Zellen werden in Zellkulturflaschen in RPMI-Medium mit 25 mM Glucose und Zusatz von 10 % Fetalem Kälberserum (FKS), Streptomycin (50 µg/ml) und 2 mM Glutamin unter 5 % CO2 bei 37 °C kultiviert. Ein Mediumwechsel erfolgt alle 2-3 Tage.

Pro Ansatz werden 0,5∙106 Zellen in 10 cm-Petrischalen überführt und für 2 Tage in 10 %-BMS (Basales Medium Supplement, lipoproteinfrei, Biochrom KG, Berlin)-RPMI-Medium kultiviert, bis eine ca. 50 %ige Konfluenz erreicht ist. Nach der anschließenden Inkubation über 40 h mit ³H-Cholesterol-markierten HDL mit endogenem (1,8 µg/mg Protein) oder erhöhtem Vitamin-E-Gehalt (19,48 µg/mg Protein) werden die Zellen drei mal mit PBS gewaschen und anschließend für 30 min mit nativem HDL (60 µg Protein/ml RPMI-Medium) als Cholesterol-Akzeptor inkubiert. Das Medium wird abgenommen und nach dreimaligem Waschen des Zellrasens mit eiskaltem PBS Protein, Cholesterol, Vitamin E und Radioaktivität in den Zellen und im Medium gemessen. Dazu wird das Medium 10 min bei 1000 rpm zentrifugiert, um Zellreste zu entfernen. Aus der spezifischen Radioaktivität des zellulären Cholesterols wird schließlich der Efflux von Cholesterol in µg/mg HDL-Proteinberechnet.

3.3.7 Einfluß des zellulären Cholesterolgehalts auf die Expression von PKCα und SR-BI und auf den Cholesterolefflux

Ansetzen der Zellkulturen

HepG2-Zellen werden in Zellkulturflaschen in RPMI-Medium mit 25 mM Glucose und Zusatz von 10 % Fetalem Kälberserum (FKS), Streptomycin (50 µg/ml) und 2 mM Glutamin unter 5 % CO2 bei 37 °C kultiviert. Ein Mediumwechsel erfolgt alle 2-3 Tage.

Pro Ansatz werden 0,5∙106 Zellen in 10 cm-Petrischalen überführt und für einen Tag in RPMI-Medium und für 2 weitere Tage in 10 %-BMS (Basales Medium Supplement, lipoproteinfrei, Biochrom KG, Berlin)-RPMI-Medium kultiviert, bis ca. 80 % Konfluenz erreicht sind.

Für die Bestimmung des Efflux von freiem Cholesterol aus Kontrollzellen werden diese dann für 24 h mit ³H-Cholesterol-markiertem BMS-RPMI-Medium inkubiert.

Erhöhung des zellulären Cholesterolgehalts

In Glasgefäßen werden 4,8 mg Cholesterol in Chloroform-Methanol und 50 µCi ³H-Cholesterol zusammengegeben und unter N2 getrocknet. Anschließend werden 10 ml 5 mM M-β-CD in RPMI-Medium zugesetzt und bei 60 °C über Nacht gerührt. Die Lösung wird gefiltert (Porenweite 0,45 µm) und auf 37 °C abgekühlt. Die zu ca. 80-90 % konfluierten HepG2-Zellen werden [Seite 17↓]einmal mit warmem PBS gewaschen und mit M-β-CD-Cholesterol-Komplex in Medium für 1 h inkubiert. Danach werden die Zellen drei mal mit warmem PBS gewaschen und für 3 h oder 6 h mit lipoproteinfreiem Medium inkubiert. Ein Teil dieser Zellen wird drei mal in eiskaltem PBS gewaschen und in 1,5 ml Homogenisationspuffer modifiziert nach Rooney abgekratzt. Nach der Homogenisation durch Ultraschall (2 mal 20 Stöße à 200 W, je 0,6 s) unter Eiskühlung werden 900 µl für die Messung von Protein, Cholesterol, Vitamin E und Radioaktivität verwendet, die restlichen 600 µl der Zell-Membranpräparation zugeführt. Die restlichen Zelllkulturschalen werden zur Bestimmung des Cholesterolefflux verwendet: Nach erneutem Waschen in warmem PBS erfolgt die 30-minütige Inkubation mit nativem HDL (60 µg Protein/ml RPMI-Medium). Anschließend wird das Medium abgenommen und nach dreimaligem Waschen des Zellrasens in eiskaltem PBS Protein, Cholesterol, Vitamin E und Radioaktivität in den Zellen und im Medium gemessen. Dazu wird das Medium 10 min bei 1000 rpm zentrifugiert, um Zellreste zu entfernen. Das weitere Vorgehen erfolgt analog zu 3.3.6; aus der Radioaktivität des Mediums und der spezifischen Radioaktivität des zellulären Cholesterols wird schließlich der zelluläre Efflux von Cholesterol in µg/mg HDL-Protein berechnet.

Erniedrigung des zellulären Cholesterolgehalts

Die zu ca. 80-90 % konfluierten HepG2-Zellen werden einmal mit warmem PBS gewaschen und mit 5 mM M-β-CD in RPMI-Medium für 1 h inkubiert. Danach werden die Zellen drei mal mit warmem PBS gewaschen und für 3 h oder 6 h mit lipoproteinfreiem Medium inkubiert, dann drei mal in eiskaltem PBS gewaschen und in 1,5 ml Homogenisationspuffer modifiziert nach Rooney abgekratzt. Nach der Homogenisation durch Ultraschall (2 mal 20 Stöße à 200 W, je 0,6 s) unter Eiskühlung werden 900 µl für die Messung von Protein, Cholesterol, und Vitamin E verwendet, die restlichen 600 µl der Zell-Membranpräparation zugeführt.

3.3.8 Einfluß der zellulären Cholesterolanreicherung auf die Vitamin-E- und Cholesterol-Aufnahme aus HDL

Ansetzen der Zellkulturen

HepG2-Zellen werden in Zellkulturflaschen in RPMI-Medium mit 25 mM Glucose und Zusatz von 10 % Fetalem Kälberserum (FKS), Streptomycin (50 µg/ml) und 2 mM Glutamin unter 5 % CO2 bei 37 °C kultiviert. Ein Mediumwechsel erfolgt alle 2-3 Tage.

Pro Ansatz werden 0,5∙106 Zellen in 10 cm-Petrischalen überführt und für einen Tag in RPMI-Medium und für 2 weitere Tage in 10 %-BMS (Basales Medium Supplement, lipoproteinfrei, Biochrom KG, Berlin)-RPMI-Medium kultiviert, bis eine ca. 80 %ige Konfluenz erreicht ist.


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Präparation des Cyclodextrin-Cholesterol-Mediums

In Glasgefäßen werden 4,8 mg Cholesterol in Chloroform-Methanol unter N2 getrocknet. Anschließend werden 10 ml 5 mM M-β-CD in RPMI-Medium zugesetzt und bei 60 °C über Nacht gerührt. Die Lösung wird gefiltert (Porenweite 0,45 µm) und auf 37 °C abgekühlt.

Versuchsansatz

Die zu ca. 80-90 % konfluierten HepG2-Zellen werden einmal mit warmem PBS gewaschen und mit dem M-β-CD-Cholesterol-Komplex in Medium für 3 h inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit warmem PBS werden den Cholesterol-angereicherten Zellen, wie auch den Kontrollzellen, die in BMS-RPMI verblieben sind, für 1 h bzw. 2 h ³H-Cholesterol-markiertes, Vitamin-E-angereichertes (19,48 µg/mg Protein) HDL angeboten. Danach werden die Zellen drei mal mit eiskaltem PBS gewaschen und in 1,5 ml Homogenisationspuffer modifiziert nach Rooney abgekratzt. Nach der Homogenisation durch Ultraschall (2 mal 20 Stöße à 200 W, je 0,6 s) unter Eiskühlung werden 900 µl für die Messung von Protein, Cholesterol, Vitamin E und Radioaktivität verwendet, aus den restlichen 600 µl wird die Membranfraktion isoliert. Ausgehend von der spezifischen Radioaktivität des Cholesterol im HDL und der Radioaktivität in den Zellen, wird die Aufnahme von Cholesterol in µg berechnet und auf 1 mg Zellprotein bezogen.

3.3.9 Membranpräparation

Verwendete Puffer

Homogenisationspuffer:

20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 250 mM Saccharose, 1 mM EDTA,

 

1 mM EGTA, 1 mM Dithiothreitol, 1 mM Phenylmethylsulfonyl-

 

fluorid, 1 µg/ml Pepstatin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml

 

Leupeptin, 1 Boehringer Proteinaseinhibitortablette /10ml.

 

Lysepuffer:

Homogenisationspuffer mit 1% Triton X-100 (v/v).

 

doppelt konzentrierter SDS-

62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 20 % Glycerol,

PAGE-Auftragspuffer:

75 mM DTT, Bromphenolblau ad libitum.

[Seite 19↓]Durchführung der Membranpräparation (modifiziert nach [93,94])

Aus den einzelnen Versuchen werden 600 µl HepG2-Schallat für die Membranpräparation verwendet. Nach Differentialzentrifugation bei 800 g, 4 °C über 10 min zur Entfernung nicht zerstörter Zellreste, erfolgt die Ultrazentrifugation bei 100.000 x g, 4 °C über 1h. Das Membranpellet wird mit 100-200 µl Lysepuffer über 1 h bei 4 °C aufgenommen und anschließend für 3 min bei 20.000 x g abzentrifugiert. Nach Proteinbestimmung mittels der BCA-Methode und Versetzen mit Auftragspuffer können nun 20 µg Protein für die SDS-PAGE mit aufgetragen werden.

3.3.10 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Bei der eindimensionalen SDS-PAGE nach Laemmli [95] werden die Proteine einer Probe nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Beim Erhitzen im Auftragspuffer werden die Polypeptide hitzedenaturiert, während durch den Zusatz von SDS (Natriumlaurylsulfat) Eigenladungen überdeckt werden und anionische Micellen mit konstanter Nettoladung pro Masseeinheit entstehen. DTT (Dithiothreitol) reduziert Disulfidbrücken in den Proteinen. Durch diese Behandlung entsteht ein linearer Zusammenhang zwischen dem Logarithmus des jeweiligen Molekulargewichts eines Proteins und seiner Wanderungsstrecke im Polyacrylamidgel. Mit Hilfe von Markerproteinen von definierter Molekülmasse lassen sich die Molekulargewichte der Moleküle bestimmen.

Der Name „diskontinuierliche SDS-PAGE“ bezieht sich auf die Verwendung eines Sammelgels mit großer Polyacrylamid-Porenweite (5 %) vor dem eigentlichen Trenngel. Die im Sammelpuffer enthaltenen Chlorid-Ionen wandern schneller als die zu trennenden Proteine, während im Elektrophoresepuffer Glycin-Ionen vorherrschen, die langsamer als die Proteine wandern. Zwischen den Chlorid-Ionen und den Proteinen entsteht im Resultat eine Zone geringer Leitungsfähigkeit und somit ein größerer Spannungsgradient. Die dadurch erhöhte Wanderungsgeschwindigkeit bewirkt eine Fokussierung der Proteine in einer scharfen Bande beim Eintritt ins Trenngel [96].

[Seite 20↓]Verwendete Puffer

Stammlösungen:

 

8 % Trenngel:

4,5 % Sammelgel:

 

Acryl/Bisacrylamid

40 % / 0,8 % (wt/v)

6000 µl

1126 µl

Tris/HCL-Puffer (Sammelgel)

0,5 M , pH 6,8

 

2500 µl

Tris/HCL-Puffer (Trenngel)

1,5 M , pH 8,8

7500 µl

 

SDS

 

10 % (wt/v)

300 µl

100 µl

TEMED

  

20 µl

6 µl

Ammoniumperoxidsulfat

10 % (wt/v)

300 µl

100 µl

   

ad 30 ml
Aqua dest.

ad 10 ml
Aqua dest.

doppelt konzentrierter SDS- PAGE-Auftragspuffer:

62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 20 % Glycerol, 75 mM DTT, Bromphenolblau ad lib.

 
 

Elektrophoresepuffer:

Tris 25 mM, Glycin 192 mM, SDS 0,1 % (wt/v).

Durchführung der SDS-PAGE

Zur Durchführung der Elektrophorese wird eine Kammer (HOEFER SE 200 Mighty Small) mit einer Gelgröße von 180 x 150 x 1 mm verwendet. Zunächst wird ca. 20 ml Trenngel in die Kammer gegossen, das Trenngel mit ca. 100 µl Aqua dest. überschichtet und die Polymerisation des Gels abgewartet. Nach Abgießen des überschüssigen Aqua dest. wird ca. 7,5 ml Sammelgel in die Kammer gefüllt und der Probenkamm mit zehn Vertiefungen eingesetzt. Während des gesamten Gießvorganges ist die Oberseite der Gießkammer stets feucht zu halten.

Nach Polymerisation des Sammelgels wird die Kammer in die Elektrophorese-Apparatur (LKB Bromma 2050) gestellt, mit Elektrophoresepuffer bedeckt und der Kamm entfernt. Die mit Probenpuffer versetzten Proteinlösungen und der Proteinstandard werden für drei Minuten im Thermomixer auf 95 °C erhitzt und daraufhin je nach Versuchsanordnung 10 – 60 µl der Proben in die Geltaschen transferiert.

Dann wird die Elektrophorese pro Gel mit 30 mA (max. 250 V) etwa 1 h lang durchgeführt.


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3.3.11  Western Blot

Das Verfahren des „Western Blotting“ [97] wird zum Nachweis eines bestimmten Proteins innerhalb einer Proteinmischung verwendet. Hierzu wird die Probe zunächst mittels der diskontinuierlichen SDS-PAGE (siehe 3.3.9) aufgetrennt und im Semi-Dry-Blotverfahren elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, so daß die Proteine darauf im gleichen Muster wie auf dem Gel immobilisiert sind. Optional findet dann die reversible Färbung mit Ponceau S [98] zur Kontrolle der Tansfereffizienz statt. Danach erfolgt das „Blocken“ in 5 % Magermilchpulver (MMP) in TBSt (5 % wt/v) zur Absättigung überschüssiger Proteinbindungsstellen der Membran und zum Verhindern unspezifischer Antikörperbindung.

Schließlich wird die Folie mit einer Lösung des ersten Antikörpers inkubiert, der spezifisch an das gesuchte Protein bindet. Danach wird die Folie zur Entfernung überschüssiger freier Antikörper gespült und schließlich mit dem zweiten Antikörper inkubiert, der gegen konstante Anteile des ersten Antikörpers gerichtet ist. Zur Visualisierung ist dieser mit einem Enzym (zum Beispiel Meerrettichperoxidase) gekoppelt, das durch Umsetzen eines Substrats ein Chemilumineszenz-Signal erzeugt, welches durch Schwärzung eines Röntgenfilms sichtbar gemacht wird [96]. Die Größe und Dichte der entstandenen Bande läßt Rückschlüsse auf die Menge des Proteins auf der Folie zu.

Verwendete Puffer

Kathodenpuffer:

 

0,025 M Tris-Base, 0,040 M e-Aminocapronsäure /

   

20 % Methanol (v/v).

  
       

Anode-I-Puffer:

 

0,03 M Tris-Base / 20 % Methanol (v/v).

 

      

Anode-II-Puffer:

 

0,3 M Tris-Base / 20 % Methanol (v/v).

 

 

      

TBSt:

  

Tris-Base 50 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,1 % (v/v).

Durchführung des Western Blots

Unmittelbar nach Ende der Elektrophorese werden die bei (Gelgröße in cm2 x 0,8) mA im Semi-Dry-Blottingverfahren 70 min horizontal auf Nitrocellulosemembran übertragen und mit Ponceau S reversibel angefärbt.

Anschließend wird die Nitrocellulosemembran über Nacht bei 4 °C in 5 % Magermilchpulver (MMP) in TBSt (5 % wt/v) geblockt. Nach dem Blocken erfolgt dreimaliges Spülen mit TBSt über 10 min und die Inkubation mit dem jeweiligen ersten Antikörper in einer Verdünnung von 1 [Seite 22↓]: 100 bis 1 : 1000 (5 % MMP / TBSt wt/v bzw. Blotting-Reagenz) über 1-2 h. Hierauf folgt wieder ein dreimaliger Spülvorgang, dann die Inkubation mit dem zweiten Antikörper (Horse-Raddish-Peroxidase) in einer Verdünnung von 1: 1.000 bis 1: 2.000 ( 5 % MMP / TBSt bzw. Blotting Reagenz) für 1 Stunde mit anschließendem oben beschriebenen dreimaligen Spülvorgang. Danach werden die nun Antikörper-markierten Proteine mittels Enhanced Chemoluminescence Verfahren photographisch sichtbar gemacht.

3.3.12 Statistik

Die statistische Auswertung der Versuchsergebnisse erfolgte mit Hilfe der SoftwareGraphPadPrism, Version 3.00. Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test untersucht. p<0,05 gilt als statistisch signifikant (siehe Beschrifung der Abbildungen).


Fußnoten und Endnoten

2 DPM = Desintegrations Per Minute



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25.11.2004