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4.  ERGEBNISSE

4.1 Effekt des Vitamin-E-Gehalts von HDL auf die Aufnahme von Cholesterol und Vitamin E in HepG2-Zellen

Zur Klärung der Frage, ob HDL-gebundenes Cholesterol (Chol) und Vitamin E (VitE) um die Aufnahme in HepG2-Zellen konkurrieren oder ob ihre Aufnahme unabhängig voneinander reguliert wird, wurden HepG2-Zellen für 3 h in Gegenwart von HDL mit steigendem Vitamin-E-Gehalt in RPMI-Medium inkubiert und die zelluläre Aufnahme von Vitamin E und Cholesterol bestimmt. Aus Abbildung 1 A geht hervor, daß mit zunehmendem Vitamin-E-Gehalt im HDL die zelluläre Vitamin-E-Aufnahme stieg, während die Aufnahme von Cholesterol aus HDL sich nicht veränderte. Der zelluläre Gesamtcholesterolgehalt blieb konstant (siehe Tabelle 1), so daß ein signifikanter Cholesterol-Efflux ausgeschlossen werden kann.

Tabelle 4.1.1. Zellulärer Cholesterolgehalt der mit HDL von ansteigendem VitE-Gehalt inkubierten HepG2-Zellen.

Vitamin E-Gehalt des
HDL [µg/mg Protein]

zelluläres Gesamtcholesterol
[µg/mg Protein]

1,8

28,01

±

7,91

6,22

28,46

±

5,64

10,64

29,95

±

4,15

15,06

30,42

±

7,28

19,48

33,71

±

5,87

Abbildung 1 B zeigt, daß eine lineare Abhängigkeit zwischen dem Verhältnis von Vitamin E und Cholesterol in den HDL-Partikeln und dem Verhältnis der von HepG2 Zellen aufgenommenen Lipide besteht (lineare Regressionsgerade, r²=0,9832, Analyse mit GraphPadPrism Software, Version 3.00). In der Western Blot-Analyse zeigt sich eine schrittweise Verminderung der SR-BI-Expression mit ansteigender Vitamin-E-Konzentration im HDL (Abb. 1 C).

Um auszuschließen, daß die gefundene Unabhängigkeit der Cholesterolaufnahme vom α-Tocopherolgehalt des HDL mit der Inkubationszeit variiert, wurden HepG2-Zellen für verschiedene Zeiträume mit ³H-Cholesterol-markiertem HDL mit endogenem (0.019 µg/mg Protein) bzw. erhöhtem Vitamin-E-Gehalt (19,48 µg/mg Protein) in RPMI-HDL-Medium inkubiert. In Abbildung 1 D ist die zelluläre Aufnahme beider Lipide aus endogenem (weiße Kreise) und Vitamin-E-angereichertem HDL (schwarze Dreiecke) in Abhängigkeit von der Inkubationszeit dar[Seite 24↓]gestellt: Eine Zunahme der α-Tocopherolaufnahme kann nur bei Vitamin-E-angereichertem, nicht aber bei endogenem HDL gemessen werden. Hingegen zeigt die Cholesterolaufnahme aus beiden HDL-Populationen keine signifikanten Unterschiede im zeitlichen Verlauf (zur besseren Übersicht ist die nichtlineare Regressionskurve der arithmetischen Mittel aus den Wertepaaren für endogenes und Vitamin-E-reiches HDL dargestellt). Das Ergebnis aus Abb. 1 A ist also nicht von der Inkubationszeit abhängig.



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Abbildung 1 . Vitamin-E- und Cholesterol-Aufnahme aus HDL in HepG2-Zellen. A:

HepG2-Zellen wurden für 3h mit 3H-Cholesterol-markiertem HDL mit unterschiedlichen Vitamin-E-Gehalt inkubiert und die zelluläre Aufnahme von Vitamin-E und Cholesterol gemessen. B: Verhältnis der Lipidaufnahme als Funktion des Verhältnisses von VitE/Chol im Donor-HDL. C: Western Blot-Analyse der SR-BI Expression in Abhängigkeit vom Vitamin-E-Gehalt der Donor-HDL-Partikel. D: Cholesterol- und Vitamin-E-Aufnahme aus 3H-Cholesterol-markiertemendogenem (weiße Kreise) und 3H-Cholesterol-markiertemVitamin-E-angereichertem HDL (schwarze Dreiecke) in Abhängigkeit von der Inkubationszeit. Mittelwerte ± Standardfehler aus n = 6 (A) bzw. 3 (D) unabhängigen Versuchen.


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4.2  Einfluß des zellulären Vitamin-E-Gehalts auf die Expression von PKCα und SR-BI und auf den Cholesterolefflux

Um den Einfluß einer durch Vitamin-E-Anreicherung der Zellen modulierten SR-BI-Expression auf den Cholesterolefflux zu messen, wurden HepG2-Zellen über 40 h mit ³H-Cholesterol-markiertem HDL mit endogenem oder erhöhtem Vitamin-E-Gehalt präinkubiert. Durch die Inkubation mit Vitamin-E-angereichertem HDL verringerte sich die SR-BI-Expression. Die so vorbehandelten Zellen wurden dann mit nativem HDL als Cholesterolakzeptor (60 µg Protein/ml) inkubiert und der Cholesterolefflux anhand der ins HDL aufgenommenen Radioaktivität berechnet. Um auszuschließen, daß zelluläres Cholesterol unspezifisch durch Zellzerstörung ins Medium gelangt, wurde gezeigt, daß mehr als 90 % der Radioaktivität nach Dichtegradientenultrazentrifugation des Überstandes an HDL gebunden waren (Abbildung 2, Analyse mit GraphPadPrism Software, Version 3.00).

Abbildung 2. Cholesterolefflux aus HepG2-Zellen zu HDL als Akzeptor.

Mit ³H-Cholesterol markierte Zellen wurden für 30 min mit RPMI-Medium unter Zusatz von nativem HDL (60 µg Protein/ml) inkubiert. Nach Dichtegradientenultrazentrifugation des Überstandes befindet sich der Großteil der Radioaktivität in der HDL-Fraktion (d = 1,12-1,21 g/ml).

Die Ergebnisse des oben beschriebenen Experimentes sind in Abbildung 3 zusammengefasst:

Abbildung 3 A zeigt, daß sich durch die Präinkubation mit Vitamin-E-angereichertem HDL erwartungsgemäß der zelluläre Vitamin-E-Gehalt, nicht aber der Cholesterolgehalt verändert hat. [Seite 27↓]Die Erhöhung der zellulären Vitamin-E-Konzentration vermindert die Expression des SR-BI und der PKCα (3 B).

Es wird vermutet, daß die Vitamin-E-induzierten Veränderungen der SR-BI-Expression über die Modulation der Protein-Kinase-Cα-Aktivität vermitteltet werden [73]. In Abbildung 3 C ist die densitometrische Auswertung verschiedener SR-BI- und PKCα-Western Blots dargestellt. Die beobachtete hochsignifikante Reduktion der SR-BI-Expression war mit einer ebenfalls hochsignifikanten ca. 50 % igen Verminderung der PKCα in der Membranfraktion der HepG2-Zellen verbunden. Gleichzeitig war der Cholesterolefflux in natives HDL signifikant erniedrigt (3 D).


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Abbildung 3. Effekt der Vitamin-E-vermittelten Erniedrigung der SR-BI-Expression auf den Cholesterolefflux.

HepG2-Zellen wurden für 40 h mit endogenem HDL oder Vitamin-E-angereichertem ³H-Cholesterol-markiertem HDL inkubiert. A: der zelluläre Vitamin-E- und Cholesterolgehalt wurde gemessen und die SR-BI- und PKCα-Expression mittels Western Blot bestimmt (B, C). Nach dem Waschen erfolgte die Inkubation der Zellen mit nativem HDL (60 µg Protein/ml) für 30 min. D: Vitamin-E-angereicherte Zellen mit PKC-vermittelter Reduktion der SR-BI-Expression zeigten einen signifikant (*P < 0,05) verminderten Efflux von freiem Cholesterol (FC) zu HDL als Akzeptorpartikeln. Mittelwerte ± Standardabweichung aus n = 3 unabhängigen Versuchen.


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4.3  Einfluß des zellulären Cholesterolgehalts auf die Expression von PKCα und SR-BI und auf den bidirektionalen Cholesterolflux

Zur Modifikation des Cholesterolgehalts der HepG2-Zellen wurde Methyl-β-Cyclodextrin (M-β-CD) gewählt, da es den Zellen sehr rasch Cholesterol entziehen, in Form M-β-CD-Cholesterol-Komplexen dagegen die zelluläre Cholesterolkonzentration erhöhen kann (auf ca. ein Drittel bzw. das Doppelte der Kontrolle innerhalb von 1 h). Im Unterschied zu dem für die Cholesterolanreicherung ebenfalls einsetzbaren LDL kann bei Verwendung von M-β-CD eine zelluläre Aufnahme von anderen Lipiden - insbesondere Vitamin E - ausgeschlossen werden, welche die SR-BI-Expression verändern könnten.

Die in ihrem Cholesterolgehalt veränderten Zellen wurden für 3 h bzw. 6 h mit lipoproteinfreiem Serum inkubiert und auf ihren Cholesterol- und Vitamin-E-Gehalt bzw. die Expression von SR-BI und PKC untersucht. Da SR-BI ein mäßig stabiles Protein ist [41], sollten Expressionsveränderungen von SR-BI nach 3 bzw. 6 h gut messbar sein. Ein Teil der Cholesterol-angereicherten Zellen wurde mit nativem HDL (60 µg Protein/ml) für 30 min inkubiert und der Efflux von freiem Cholesterol zu HDL als Akzeptorpartikel bestimmt.

Erhöhung des zellulären Cholesterolgehalts:

Wie aus Abbildung 4 A hervorgeht, bewirkte die Inkubation mit dem M-β-CD-Cholesterol-Komplex eine Erhöhung des zellulären Gesamtcholesterols auf 198 ± 22 %, während der Vitamin-E-Gehalt keine signifikanten Veränderungen zeigte. Die Expression von SR-BI und PKCα blieb in Cholesterol-angereicherten Zellen sowohl nach 3, als auch nach 6 Stunden konstant (4 B, C). Dennoch war der zelluläre Cholesterolefflux zu HDL als Akzeptor signifikant erhöht (4 D).


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Abbildung 4. Effekt der zellulären Cholesterolanreicherung auf die Expression von SR-BI und PKC und den Cholesterolefflux.

HepG2-Zellen wurden für 1 h mit M-β-CD-Cholesterol-Komplex an Cholesterol angereichert, gewaschen und für 3 bzw. 6 h mit lipoproteinfreiem Medium inkubiert. Der zelluläre Cholesterolgehalt wurde so auf 198 ± 22 % der Kontrolle erhöht, während der Vitamin-E-Gehalt gleich blieb (A). In der Western Blot-Analyse ergaben sich keine signifikanten Veränderungen der SR-BI- bzw. PKC-Expression (B,C). D: Densitometrische Auswertung verschiedener Western Blots.E: Der Cholesterolefflux zu HDL als Akzeptor aus Cholesterol-angereicherten Zellen war signifikant erhöht (*signifikant, P < 0,01). Mittelwerte ± Standardabweichung aus n = 3 unabhängigen Versuchen.


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Kontrollzellen und Cholesterol-angereicherte Zellen wurden mit ³H-Cholesterol-markiertem und Vitamin-E-angereichertem HDL (19,48 µg/mg Protein; 1h; 37 oC) inkubiert. Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede in der Aufnahme beider Lipide (siehe Abbildung 5) nach 1 h bzw. 2 h Inkubationszeit, während der Cholesterolefflux trotz unveränderter SR-BI Expression erhöht war (vgl. Abbildung 4 D).

Abbildung 5. Vitamin-E- und Cholesterol-Aufnahme aus HDL in Cholesterol-angereicherte und Kontrollzellen.

Zelluläre Aufnahme von HDL-gebundenem Cholesterol und Vitamin E in Kontroll- und Cholesterol-angereicherte Zellen nach 1 h (A) und 2 h (B) Inkubationszeit. Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardabweichung aus n = 3 unabhängigen Versuchen.

Erniedrigung des zellulären Cholesterolgehalts:

Durch Inkubation mit 5 mM M-β-CD für 1 h wurde der zelluläre Cholesterolgehalt auf 34 ± 9 % der Kontrolle gesenkt. Der endogene Vitamin-E-Gehalt der Zellen war sehr niedrig und lag hauptsächlich in Form von Vitamin-E-Chinon vor. Nach einstündiger Inkubation mit M-β-CD [Seite 32↓]blieb der zelluläre Vitamin-E-Gehalt unverändert (siehe Abbildung 6A). Hingegen war die SR-BI- und PKC-Expression nach der anschließenden Inkubation der Cholesterol-verarmten Zellen mit lipoproteinfreiem Medium zunehmend erniedrigt (6 B-D).

Abbildung 6. Effekt der Cholesterolverarmung von HepG2-Zellen auf die Expression von SR-BI und PKC.

HepG2-Zellen wurden durch Inkubation mit 5 mM M-β-CD in RPMI-Medium an Cholesterol verarmt und nach dem Waschen für 3 bzw. 6 h mit lipoproteinfreiem Medium inkubiert. A: Der zelluläre Cholesterolgehalt wurde so auf 34 ± 9 % der Kontrolle reduziert, während der zelluläre Vitamin-E-Gehalt keine signifikanten Veränderungen zeigte. Die Western Blot-Analyse der SR-BI- (B) und PKC- (C) Expression zeigte eine schrittweise Reduktion in Cholesterol-verarmten Zellen nach 3 bzw. 6 h. D: Quantifizierung der Proteinexpression durch densitometrische Analyse. Mittelwerte ± Standardabweichung aus n = 3 unabhängigen Versuchen.


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25.11.2004