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5.  DISKUSSION

5.1 Effekt des Vitamin-E-Gehalts von HDL auf die Aufnahme von Cholesterol und Vitamin E in Hep G2-Zellen

Cholesterol und Vitamin E sind für eine normale Zellfunktion essentiell. Während Cholesterol die physikochemischen Eigenschaftender Plasmamembran reguliertund eine wichtige Rolle in Signaltransduktions- und Stoffwechselvorgängen spielt, schützt Vitamin E die Zelle vor der Schädigung durch Lipid-Peroxidation und ist in Form von α-Tocopherol an regulativen Prozessen in der Zelle beteiligt.

Cholesterol kann von menschlichen Zellen nur in begrenztem Maße synthetisiert werden, Vitamin E wird von eukariontischen Zellen nicht produziert. Beide Stoffe müssen daher aus dem extrazellulären Raum aufgenommen werden. Cholesterol und Vitamin E sind lipophil und werden im Blutplasma in Bindung anLipoproteine transportiert. Es ist beschrieben, daß sowohl Cholesterol als auch Vitamin E aus High Density Lipoproteinen über Scavenger Receptor B I-vermittelten Selective Lipid Transfer aufgenommen werden kann [20,51].

Daraus ergibt sich die Frage, ob die beiden Moleküle um den Transport am Rezeptor konkurrieren. Hierdurch könnte bei erhöhtem Umsatz von Cholesterol ein zellulärer Vitamin-E-Mangel entstehen, der zu einer verstärkten Apoptoseneigung führen kann [99]. Denkbar wäre auch ein Ko-Transport beider Substanzen in einem festen Verhältnis, wodurch Zellen bei verstärkter Vitamin-E-Aufnahme (z.B. Hyperoxie bei Typ II-Pneumozyten [100]) auch mehr Cholesterol aufnehmen müßten und so zu „Schaumzellen“ werden könnten. Schließlich könnten die Zellen auch in der Lage sein, beide Lipide unabhängig voneinander ihrem Bedarf entsprechend aufzunehmen.

Zur Klärung dieser Fragestellung wurden HepG2-Zellen mit endogenem oder mit unterschiedlich stark Vitamin-E-angereichertem HDL inkubiert. Wir konnten bei ansteigender Vitamin-E-Konzentration im HDL eine zunehmende Aufnahme in die Zelle feststellen, während Cholesterol in gleichbleibender Menge aufgenommen wurde.

Dieses Ergebnis war von der Inkubationszeit unabhängig: Wir fanden zu verschiedenen Zeitpunkten keinen Unterschied in der Cholesterolaufnahme aus beiden HDL-Fraktionen, während die α-Tocopherol-Aufnahme aus Vitamin-E-angereichertem HDL anstieg, aus endogenem HDL [Seite 34↓]jedoch konstant blieb. Zusammengenommen weisen diese Resultate darauf hin, daß der Vitamin-E-Gehalt im HDL-Donorpartikel die zelluläre Vitamin-E-Aufnahme reguliert.

Diese Erklärung deckt sich mit den Ergebnissen von Rodriguez [88], die fanden, daß der Selective Uptake von Cholesterylestern proportional zu ihrem Gehalt in den Donorpartikeln stattfindet. Sie vermuteten, daß der Transport von Lipiden aus dem Inneren des HDL-Partikels in die Zellmembran durch einen bei der Bindung der Lipoproteine an den Rezeptor entstehenden hydrophoben Tunnel stattfindet und vom Konzentrationsgradienten angetrieben wird.

In einem ähnlichen Versuchsansatz haben Greene et al. [89] die Aufnahme von Triglyceriden (TG) und Cholesterylestern (CE) aus HDL untersucht. Dabei war die Menge des aus in vitro modifizierten HDL verschiedenen TG- und CE-Konzentrationen aufgenommenen Substrates abhängig von seinem Anteil im HDL-Partikel, und es ergab sich ein linearer Zusammenhang zwischen dem TG/CE-Verhältnis im HDL und dem Verhältnis der in die Zelle aufgenommenen Lipide. Die jeweiligen Anteile der verschiedenen Substrate im HDL spiegeln sich also im Verhältnis ihrer zellulären Aufnahmewieder. Diese Ergebnisse stimmen mit dem von uns gefundenen linearen Zusammenhang zwischen dem Cholesterol/Vitamin-E-Verhältnis im HDL und der zellulären Aufnahme der beiden Substanzen überein.

Außerdem maßen Greene et al. eine abnehmende CE-Aufnahme mit steigendem TG-Gehalt des HDL. Hingegen konnten wir keine Abnahme der Cholesterolaufnahme bei steigender Vitamin-E-Aufnahme feststellen. Dies ist insofern nicht überraschend, als der Selective Uptake von polaren und apolaren Lipiden vermutlich durch verschiedene Mechanismen vermittelt wird [40]. Ein weiterer möglicher Grund ist, daß das von uns verwendete HDL erheblich weniger Tocopherol als Cholesterol enthielt (0,67 bis 5,86 Moleküle α-Tocopherol auf 100 Moleküle Cholesterol), während in dem von Green modifizierten HDL Triglyceride und Cholesterolester in ähnlicher Menge vorlagen (30 bis 125 Moleküle TG auf 100 Moleküle CE).

In Erweiterung der Ergebnisse von Witt et al. [73] zeigt die vorliegende Arbeit, daß eine schrittweise Erhöhung der zellulären Vitamin-E-Konzentration zu einer schrittweise erniedrigten SR-BI-Expression in HepG2-Zellen führt. Dabei nahm die Vitamin-E-Aufnahme weiter zu, während die Aufnahme von Cholesterol gleich blieb, obwohl SR-BI in geringerem Maße exprimiert wurde. Dieses Ergebnis könnte darauf hinweisen, daß die Kapazität von SR-BI für die Aufnahme von Cholesterol und Vitamin E in HepG2-Zellen sehr hoch ist, so daß eine graduelle Abnahme von SR-BI keine Auswirkungen auf die Menge der aufgenommenen Substrate hat. Diese Vermutung wird durch die Feststellung bestätigt, daß die Reduktion der SR-BI-Expression auf 5,5 % der Kontrollwerte in HepG2-Zellen nur eine Verminderung der Vitamin-E-Aufnahme auf 32 % und der Cholesterolaufnahme lediglich auf 62 % bewirkt [73].


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Eine andere Erklärung wäre, daß die Aufnahme beider Lipide in die Zellen durch SR-BI-unabhängige Mechanismen vermittelt sein könnte. Diese Annahme scheint durch das Ergebnis gestützt zu werden, daß der Vitamin-E-Gehalt in der Leber von SR-BI-Knockout-Mäusen unverändert und der Cholesterolgehalt nur leicht erhöht ist [101,102]. Jedoch könnte dies auch als vollständige Kompensation des SR-BI-Mangels durch andere, unter physiologischen Bedingungen untergeordnete Mechanismen verstanden werden. Für diese Argumentation spricht die physiologischerweise hohe hepatische Expression von SR-BI, die mit der entscheidenden Rolle der Leber für die selektive Cholesterolaufnahme und den HDL-Stoffwechsel in vivo korrespondiert [40].


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5.2  Einfluß des zellulären Vitamin-E-Gehalts auf die Expression von PKCα und SR-BI und auf den Cholesterolefflux

Der Fluß von freiem Cholesterol (FC) zwischen HDL und Zellen ist bidirektional. In Abhängigkeit vom Konzentrationsgradienten zwischen den Zellen und den Donorpartikeln resultiert ein Netto-Influx bzw. –Efflux von freiem Cholesterol [103,104]. Wenn Zellen SR-BI exprimieren, wird der bidirektionale Cholesterolflux beschleunigt [53,54,104]. De la Llera-Moy konnten zeigen, daß SR-BI den Cholesterolefflux über einen weiten Bereich von HDL-Konzentrationen stimuliert, wobei die Konzentrations-Efflux-Kurve einen biphasischen Verlauf mit halbmaximalen Effluxraten bei 30 bzw. 1130 µg HDL-Protein/ml aufwies. Die niedrigere Konzentration liegt im Bereich der Dissoziationskonstante für die Bindung von HDL an SR-BI [38,55]. Diese hocheffiziente Komponente des SR-BI-vermittelten Cholesterolefflux scheint von der HDL-Bindung an den Rezeptor abhängig zu sein [105,106].Jedoch blieb bei höheren HDL- Konzentrationen trotz Sättigung der SR-BI-HDL-Bindung eine Proportionalität zum FC-Efflux bestehen. Dies weist auf die Existenz eines anderen Mechanismus von geringerer Effizienz hin, für den die Bindung des Akzeptors an SR-BI kaum relevant ist. Damit könnte auch erklärt werden, daß SR-BI den zellulären Efflux auch zu Phospholipid-Vesikeln stimuliert [54,55] die keine Bindung mit dem Rezeptor eingehen. Außerdem gehen mehrere Autoren davon aus, daß SR-BI Lipiddomänen in der Plasmamembran modifiziert und so den Flux von freiem Cholesterol erleichtert [40,107]. Die in unseren Experimenten verwendete HDL-Konzentration liegt mit 60 µg Protein/ml im Bereich des hocheffizienten SR-BI-vermittelten Cholesterolefflux.

Bei den Experimenten zur Vitamin-E-Aufnahme in HepG2-Zellen fanden wir eine dosisabhängige Downregulation der SR-BI-Expression in HepG2-Zellen mit steigendem Vitamin-E-Gehalt des angebotenen HDL. Witt et al. [73] konnten zeigen, daß die Anreicherung verschiedener Zelltypen mit Vitamin E zu einer Erniedrigung der SR-BI-Expression führt, die Protein-Kinase-Cα-vermittelt ist und zu einer reduzierten Aufnahme von Cholesterol und α-Tocopherol führt.

Wir fanden keine signifikanten Unterschiede im Cholesterolgehalt der mit endogenem oder Vitamin-E-reichem HDL inkubierten Zellen. Es zeigte sich jedoch eine hochsignifikante Verringerung der Expression des SR-BI und der PKCα in der Membranfraktion von Vitamin-E-angereicheten Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Diese zellulären Veränderungen waren mit einer ebenfalls hochsignifikanten Erniedrigung des Cholesterolefflux in die HDL-Partikel assoziiert.

Unsere Ergebnisse werden bestätigt durch die grundlegenden Arbeiten von J und Jia, die in den ersten Arbeiten zum HDL-vermittelten Cholesterolefflux mit stabil SR-BI-transfizierten Mäusen[Seite 37↓]eine starke Korrelation zwischen der Expression des SR-BI und der Effluxrate in HDL und verschiedene andere Akzeptoren fanden [54,62]. Lange [108] konnten zeigen, daß Testosteron eine Erhöhung der SR-BI-Expression und einen gesteigerten Efflux von Cholesterol aus Makrophagen bewirkt, und so demonstrieren, daß auch die Modifikation der SR-BI-Expression durch exogene Substanzen den Cholesterolefflux beeinflußt.

Die von uns gefundene starke Erniedrigung der SR-BI-Expression durch Vitamin-E-Anreicherung der Zelle sollte eine deutliche Abnahme des Cholesterolefflux bewirken, jedoch führte eine Reduktion des SR-BI-Gehalts in der HepG2-Membran auf 20 % der Kontrolle nur zu einer Erniedrigung des Efflux auf ca. 80 %. Analog zu den moderaten Auswirkungen einer deutlichen SR-BI-Downregulation auf die Cholesterolaufnahme könnte auch diese vergleichsweise leichte Verminderung des Cholesterol-Efflux mit der hohen Kapazität des Rezeptors erklärt werden. Zudem könnte sich der Rezeptor zum Teil nicht in einem voll funktionellen Zustand befunden haben oder funktionell inadäquat in der Zelle lokalisiert gewesen sein [73].

Es scheint unwahrscheinlich, daß der hohe zelluläre Vitamin-E-Gehalt den Efflux von Cholesterol gehemmt hat, da die beiden Lipide nicht um denselben Efflux-Mechanismus konkurrieren. Ein Efflux von Vitamin-E aus Hepatozyten könnte im Rahmen der intrazellulären Bildung von naszierenden VLDL stattfinden [16], währendCholesterolefflux aus der Zelle außer durch SR-BI auch durch verschiedene andere Mechanismen vermittelt werden kann. Zellen können Cholesterolebenso durch freie Diffusion [109] bzw. über aktiven Transport durch die Multidrug Transporter MDR-1 und ABC1 aus der Familie der ABC(ATP-binding cassette)-Transmembrantransporter [110,111] abgeben. Ebenso kommt „Microsolubilization“ für den Efflux von zellulärem Cholesterol in Frage [112] - ein neuer Mechanismus, definiert als multimolekulare Dissoziation von Cholesterol- und Phospholipidkomplexen aus der Zellmembran in Anwesenheit von Apo A-I, dem Hauptapolipoprotein von HDL [113].


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5.3  Einfluß des zellulären Cholesterolgehalts auf die Expression von PKCα und SR-BI und auf den bidirektionalen Cholesterolflux

Während die durch Vitamin-E-Anreicherung der Zellen bewirkte PKC-vermittelte SR-BI-Downregulation gut dokumentiert ist, sind verschiedene Arbeiten zur Regulation von SR-BI durch den Cholesterolgehalt der Zelle zu widersprüchlichen Ergebnissen gekommen. Der dritte Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluß des zellulären Cholesterolgehalts auf die Expression von SR-BI und PKC und den Cholesterolefflux in HepG2-Zellen.

Wie in der Einleitung beschrieben, haben mehrere Studien einen wechselseitigen Zusammenhang zwischen dem Plasmacholesterolgehalt und der Expression von SR-BI festgestellt [61,65,67,71,114]. Diese Ergebnisse führten zu der Annahme, daß Cholesterol die SR-BI-Expression in der Leber regulieren könnte. Jedoch ist der direkte Effekt einer Erhöhung des zellulären Cholesterolgehalts auf die SR-BI-Expression in Leberzellen bislang kaum untersucht worden. Die Erniedrigung des zellulären Cholesterolgehalts mit β-Cyclodextrin in Y1-BS1-Zellen führte zu einer schnellen Erhöhung der SR-BI-Expression auf mRNA- und Proteinebene [115]. Dagegen zeigte die drastische Anreicherung von ovariellen Zellen mit HDL-Cholesterol keinen Effekt auf die SR-BI-Expression [116]. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, daß die Erniedrigung des zellulären Cholesterolgehalts die PKC- und SR-BI-Expression in HepG2-Zellen signifikant reduziert, während die Erhöhung des zellulären Cholesterolgehalts die SR-BI-Expression nicht beeinflußt.

Die Cholesterolanreicherung der Zellen war dennoch mit einem Anstieg des Cholesterolefflux verbunden, weil vermutlich die Kapazität des verbliebenen funktionellen SR-BI für einen gesteigerten Efflux entlang dem Konzentrationsgradienten ausreichend war. Hingegen zeigten sich analog zur unveränderten SR-BI-Expression keine Unterschiede in der Aufnahme von Cholesterol und Vitamin E in Cholesterol-angereicherte Zellen, die offenbar noch nicht vollständig mit Cholesterol gesättigt waren. Wenn bei einer Erhöhung des zellulären Cholesterols also die zellwärts gerichtete Komponente des bidirektionalen Flusses zunächst gleich bleibt, die Effluxrate aber gesteigert ist, verschiebt sich der Netto-Flux von freiem Cholesterol zugunsten des Efflux.

Die Regulation der hepatischen SR-BI-Expression ist von großem Interesse, weil der Reverse Cholesterol Transport SR-BI-vermittelt ist und sich zum Teil in der Leber abspielt. Transformierte Zellinien wie HepG2 sind hierfür ein praktisches Modell, da menschliche Hepatozyten in Zellkultur kaum erhältlich sind und HepG2-Zellen viele biochemische Eigenschaften menschlicher Hepatozyten behalten haben [117,118,119]. Wenn die mit HepG2-Zellen erhaltenen Er[Seite 39↓]gebnisse also auf Leberzellen übertragbar sind, kann man schlußfolgern, daß der zelluläre Vitamin-E- und Cholesterol-Gehalt die hepatische SR-BI-Expression und somit den bidirektonalen Cholesterolfluß regulieren. Während es ein direktes feed back zwischen dem Vitamin-E-Gehalt in den Zellen oder im Plasma und der hepatischen SR-BI-Expression gibt, ist ihre Abhängigkeit vom zellulären Cholesterolgehalt um einiges schwächer.


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25.11.2004