HepG2-Zellen werden in Zellkulturflaschen in RPMI-Medium mit 25 mM Glucose und Zusatz von 10 % Fetalem Kälberserum (FKS), Streptomycin (50 µg/ml) und 2 mM Glutamin unter 5 % CO₂ bei 37 °C kultiviert. Ein Mediumwechsel erfolgt alle 2-3 Tage.

Pro Ansatz werden 0,5∙10⁶ Zellen in 10 cm-Petrischalen überführt und für einen Tag in RPMI-Medium und für 2 weitere Tage in 10 %-BMS (Basales Medium Supplement, lipoproteinfrei, Biochrom KG, Berlin)-RPMI-Medium kultiviert, bis ca. 80 % Konfluenz erreicht sind.

Für die Bestimmung des Efflux von freiem Cholesterol aus Kontrollzellen werden diese dann für 24 h mit ³H-Cholesterol-markiertem BMS-RPMI-Medium inkubiert.

In Glasgefäßen werden 4,8 mg Cholesterol in Chloroform-Methanol und 50 µCi ³H-Cholesterol zusammengegeben und unter N₂ getrocknet. Anschließend werden 10 ml 5 mM M-β-CD in RPMI-Medium zugesetzt und bei 60 °C über Nacht gerührt. Die Lösung wird gefiltert (Porenweite 0,45 µm) und auf 37 °C abgekühlt. Die zu ca. 80-90 % konfluierten HepG2-Zellen werden einmal mit warmem PBS gewaschen und mit M-β-CD-Cholesterol-Komplex in Medium für 1 h inkubiert. Danach werden die Zellen drei mal mit warmem PBS gewaschen und für 3 h oder 6 h mit lipoproteinfreiem Medium inkubiert. Ein Teil dieser Zellen wird drei mal in eiskaltem PBS gewaschen und in 1,5 ml Homogenisationspuffer modifiziert nach Rooney abgekratzt. Nach der Homogenisation durch Ultraschall (2 mal 20 Stöße à 200 W, je 0,6 s) unter Eiskühlung werden 900 µl für die Messung von Protein, Cholesterol, Vitamin E und Radioaktivität verwendet, die restlichen 600 µl der Zell-Membranpräparation zugeführt. Die restlichen Zelllkulturschalen werden zur Bestimmung des Cholesterolefflux verwendet: Nach erneutem Waschen in warmem PBS erfolgt die 30-minütige Inkubation mit nativem HDL (60 µg Protein/ml RPMI-Medium). Anschließend wird das Medium abgenommen und nach dreimaligem Waschen des Zellrasens in eiskaltem PBS Protein, Cholesterol, Vitamin E und Radioaktivität in den Zellen und im Medium gemessen. Dazu wird das Medium 10 min bei 1000 rpm zentrifugiert, um Zellreste zu entfernen. Das weitere Vorgehen erfolgt analog zu 3.3.6; aus der Radioaktivität des Mediums und der spezifischen Radioaktivität des zellulären Cholesterols wird schließlich der zelluläre Efflux von Cholesterol in µg/mg HDL-Protein berechnet.

Die zu ca. 80-90 % konfluierten HepG2-Zellen werden einmal mit warmem PBS gewaschen und mit 5 mM M-β-CD in RPMI-Medium für 1 h inkubiert. Danach werden die Zellen drei mal mit warmem PBS gewaschen und für 3 h oder 6 h mit lipoproteinfreiem Medium inkubiert, dann drei mal in eiskaltem PBS gewaschen und in 1,5 ml Homogenisationspuffer modifiziert nach Rooney abgekratzt. Nach der Homogenisation durch Ultraschall (2 mal 20 Stöße à 200 W, je 0,6 s) unter Eiskühlung werden 900 µl für die Messung von Protein, Cholesterol, und Vitamin E verwendet, die restlichen 600 µl der Zell-Membranpräparation zugeführt.

HepG2-Zellen werden in Zellkulturflaschen in RPMI-Medium mit 25 mM Glucose und Zusatz von 10 % Fetalem Kälberserum (FKS), Streptomycin (50 µg/ml) und 2 mM Glutamin unter 5 % CO₂ bei 37 °C kultiviert. Ein Mediumwechsel erfolgt alle 2-3 Tage.

Pro Ansatz werden 0,5∙10⁶ Zellen in 10 cm-Petrischalen überführt und für einen Tag in RPMI-Medium und für 2 weitere Tage in 10 %-BMS (Basales Medium Supplement, lipoproteinfrei, Biochrom KG, Berlin)-RPMI-Medium kultiviert, bis eine ca. 80 %ige Konfluenz erreicht ist.

In Glasgefäßen werden 4,8 mg Cholesterol in Chloroform-Methanol unter N₂ getrocknet. Anschließend werden 10 ml 5 mM M-β-CD in RPMI-Medium zugesetzt und bei 60 °C über Nacht gerührt. Die Lösung wird gefiltert (Porenweite 0,45 µm) und auf 37 °C abgekühlt.

Die zu ca. 80-90 % konfluierten HepG2-Zellen werden einmal mit warmem PBS gewaschen und mit dem M-β-CD-Cholesterol-Komplex in Medium für 3 h inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit warmem PBS werden den Cholesterol-angereicherten Zellen, wie auch den Kontrollzellen, die in BMS-RPMI verblieben sind, für 1 h bzw. 2 h ³H-Cholesterol-markiertes, Vitamin-E-angereichertes (19,48 µg/mg Protein) HDL angeboten. Danach werden die Zellen drei mal mit eiskaltem PBS gewaschen und in 1,5 ml Homogenisationspuffer modifiziert nach Rooney abgekratzt. Nach der Homogenisation durch Ultraschall (2 mal 20 Stöße à 200 W, je 0,6 s) unter Eiskühlung werden 900 µl für die Messung von Protein, Cholesterol, Vitamin E und Radioaktivität verwendet, aus den restlichen 600 µl wird die Membranfraktion isoliert. Ausgehend von der spezifischen Radioaktivität des Cholesterol im HDL und der Radioaktivität in den Zellen, wird die Aufnahme von Cholesterol in µg berechnet und auf 1 mg Zellprotein bezogen.

Homogenisationspuffer:

20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 250 mM Saccharose, 1 mM EDTA,

1 mM EGTA, 1 mM Dithiothreitol, 1 mM Phenylmethylsulfonyl-

fluorid, 1 µg/ml Pepstatin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml

Leupeptin, 1 Boehringer Proteinaseinhibitortablette /10ml.

Lysepuffer:

Homogenisationspuffer mit 1% Triton X-100 (v/v).

doppelt konzentrierter SDS-

62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 20 % Glycerol,

PAGE-Auftragspuffer:

75 mM DTT, Bromphenolblau ad libitum.

Aus den einzelnen Versuchen werden 600 µl HepG2-Schallat für die Membranpräparation verwendet. Nach Differentialzentrifugation bei 800 g, 4 °C über 10 min zur Entfernung nicht zerstörter Zellreste, erfolgt die Ultrazentrifugation bei 100.000 x g, 4 °C über 1h. Das Membranpellet wird mit 100-200 µl Lysepuffer über 1 h bei 4 °C aufgenommen und anschließend für 3 min bei 20.000 x g abzentrifugiert. Nach Proteinbestimmung mittels der BCA-Methode und Versetzen mit Auftragspuffer können nun 20 µg Protein für die SDS-PAGE mit aufgetragen werden.

Bei der eindimensionalen SDS-PAGE nach Laemmli [95] werden die Proteine einer Probe nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Beim Erhitzen im Auftragspuffer werden die Polypeptide hitzedenaturiert, während durch den Zusatz von SDS (Natriumlaurylsulfat) Eigenladungen überdeckt werden und anionische Micellen mit konstanter Nettoladung pro Masseeinheit entstehen. DTT (Dithiothreitol) reduziert Disulfidbrücken in den Proteinen. Durch diese Behandlung entsteht ein linearer Zusammenhang zwischen dem Logarithmus des jeweiligen Molekulargewichts eines Proteins und seiner Wanderungsstrecke im Polyacrylamidgel. Mit Hilfe von Markerproteinen von definierter Molekülmasse lassen sich die Molekulargewichte der Moleküle bestimmen.

Der Name „diskontinuierliche SDS-PAGE“ bezieht sich auf die Verwendung eines Sammelgels mit großer Polyacrylamid-Porenweite (5 %) vor dem eigentlichen Trenngel. Die im Sammelpuffer enthaltenen Chlorid-Ionen wandern schneller als die zu trennenden Proteine, während im Elektrophoresepuffer Glycin-Ionen vorherrschen, die langsamer als die Proteine wandern. Zwischen den Chlorid-Ionen und den Proteinen entsteht im Resultat eine Zone geringer Leitungsfähigkeit und somit ein größerer Spannungsgradient. Die dadurch erhöhte Wanderungsgeschwindigkeit bewirkt eine Fokussierung der Proteine in einer scharfen Bande beim Eintritt ins Trenngel [96].

Stammlösungen:

8 % Trenngel:

4,5 % Sammelgel:

Acryl/Bisacrylamid

40 % / 0,8 % (wt/v)

6000 µl

1126 µl

Tris/HCL-Puffer (Sammelgel)

0,5 M , pH 6,8

2500 µl

Tris/HCL-Puffer (Trenngel)

1,5 M , pH 8,8

7500 µl

SDS

10 % (wt/v)

300 µl

100 µl

TEMED

20 µl

6 µl

Ammoniumperoxidsulfat

10 % (wt/v)

300 µl

100 µl

ad 30 ml
Aqua dest.

ad 10 ml
Aqua dest.

doppelt konzentrierter SDS- PAGE-Auftragspuffer:

62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 20 % Glycerol, 75 mM DTT, Bromphenolblau ad lib.

Elektrophoresepuffer:

Tris 25 mM, Glycin 192 mM, SDS 0,1 % (wt/v).

Zur Durchführung der Elektrophorese wird eine Kammer (HOEFER SE 200 Mighty Small) mit einer Gelgröße von 180 x 150 x 1 mm verwendet. Zunächst wird ca. 20 ml Trenngel in die Kammer gegossen, das Trenngel mit ca. 100 µl Aqua dest. überschichtet und die Polymerisation des Gels abgewartet. Nach Abgießen des überschüssigen Aqua dest. wird ca. 7,5 ml Sammelgel in die Kammer gefüllt und der Probenkamm mit zehn Vertiefungen eingesetzt. Während des gesamten Gießvorganges ist die Oberseite der Gießkammer stets feucht zu halten.

Nach Polymerisation des Sammelgels wird die Kammer in die Elektrophorese-Apparatur (LKB Bromma 2050) gestellt, mit Elektrophoresepuffer bedeckt und der Kamm entfernt. Die mit Probenpuffer versetzten Proteinlösungen und der Proteinstandard werden für drei Minuten im Thermomixer auf 95 °C erhitzt und daraufhin je nach Versuchsanordnung 10 – 60 µl der Proben in die Geltaschen transferiert.

Dann wird die Elektrophorese pro Gel mit 30 mA (max. 250 V) etwa 1 h lang durchgeführt.

Die statistische Auswertung der Versuchsergebnisse erfolgte mit Hilfe der SoftwareGraphPadPrism, Version 3.00. Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test untersucht. p<0,05 gilt als statistisch signifikant (siehe Beschrifung der Abbildungen).