Bartels, Anna-Maria : Durchflußzytometrische Untersuchungen zur zellulären Pharmakokinetik von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin

1

Kapitel 1. Einleitung

1.1 Aufbau, Metabolismus, Wirkung und Pharmakologie des Daunorubicins

In der Bundesrepublik Deutschland erkranken jährlich 164.900 Männer und 173.400 Frauen neu an Krebs. Seit den 70er Jahren zeigt sich zwar eine Verbesserung der Überlebensraten, trotzdem ergeben sich nur 5-Jahresüberlebensraten von 53% für Frauen und 40% für Männer. Damit steht Krebs als Gruppendiagnose in der Todesursachenstatistik mit ca. 160.000 Todesfällen (23% der Gesamtsterblichkeit) an zweiter Stelle. Diese epidemiologischen Daten machen deutlich, dass Krebserkrankungen einen hohen Stellenwert in der Gesundheitspolitik einnehmen und dadurch auch der Therapie dieser Erkrankungen eine besondere Bedeutung beigemessen wird [1,2].
Lange Zeit allerdings konnten solide Tumoren nur lokal durch Bestrahlung und chirurgische Intervention behandelt werden, während nichtlokalisierte Tumoren wie Leukämien und Metastasen auf diesem Weg nicht oder nur sehr schlecht zu erreichen waren. In der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts kam es zu einer „therapeutischen Revolution“, da sich tiefgreifende Veränderungen in der Behandlung von Malignomen ergaben. Die Entwicklung von Chemotherapeutika als systemische Therapiemöglichkeit machte große Fortschritte und führte zu besseren Behandlungsergebnissen. Heute wird die Chemotherapie mit Zytostatika als Monotherapie, Polychemotherapie oder in Kombination mit anderen verfügbaren Methoden angewandt [3,4]. Die Wirkung dieser Zytostatika beruht auf der unselektiven Hemmung des Zellwachstums, wobei sowohl Tumorzellen als auch Normalgewebe mit hohem Zellumsatz betroffen sind. Jene unterscheiden sich im wesentlichen durch ungehemmtes Wachstum der Tumorzellen und durch Ausfall der normalen Wachstumsregulation. Eine spezifische Elimination der Tumorzellen ist bisher nicht möglich, obwohl eine große Anzahl verschiedener Zytostatika existiert [5].

Eine bedeutende Rolle in der Behandlung von Tumoren (besonders der akuten Leukämien) spielen die Anthrazykline. Daunorubicin, das erste Anthrazyklin, wurde 1963 entdeckt und gehört auch heute noch zur Standardtherapie in der Onkologie. Da aber die Behandlung mit Daunorubicin u.a. zu schwerer Kardiotoxizität führen kann und vermehrt Resistenzen auftreten, wird stetig an der Weiterentwicklung gearbeitet, um potentere und nebenwirkungsärmere Anthrazykline zu finden. Ein wichtiger Schritt könnte die Verkapselung von Anthrazyklinen in Liposomen darstellen [6,7]. Eines dieser so genannten „liposomalen Anthrazykline“ ist Daunoxome, das aus Daunorubicin in


2

wässriger Phase umgeben von einer liposomalen Hülle besteht.
Trotz der zunehmenden Anzahl dieser liposomal verkapselten Anthrazykline, die sich im klinischen Gebrauch oder in der Entwicklung befinden, ist vergleichsweise wenig über deren pharmakologische Wirkmechanismen bekannt. Erfolg und Misserfolg der Krebsbehandlung sind aber sowohl von der Sensitivität der Tumorzellen als auch von der Pharmakodynamik der Zytostatika abhängig. Neben der Pharmakodynamik stellt ebenfalls die Pharmakokinetik der Substanzen eine wesentliche Determinante der Wirksamkeit eines Zytostatikums dar, da sie die pharmakologisch relevanten Konzentrationen der Substanzen am Wirkort bestimmt. Deshalb ist es besonders wichtig, diese zu erforschen [8,9].

Aus diesem Grund soll Gegenstand dieser Arbeit der Vergleich der zellulären Pharmakokinetik von Daunorubicin und des liposomal verkapselten Daunoxome sein. Im folgenden wird zunächst kurz auf die Systematik und Pharmakologie der beiden Anthrazykline eingegangen.

1.2 Aufbau, Metabolismus, Wirkung und Pharmakologie des Dauno-
rubicins

Daunorubicin wurde 1963 gleichzeitig von einer italienischen Arbeitsgruppe unter der Bezeichnung „daunomycinia“ [10] und von einer französischen Arbeitsgruppe als „rubidomycine“ [11] aus Streptomyces peucetius-Kulturen isoliert und erstmals beschrieben. Der heutige Name Daunorubicin ist dann aus beiden Namen zusammengesetzt worden.

Daunorubicin besteht aus einem tetrazyklischen, planaren, polyaromatischen Ringsystem, dem Daunomycinon und einem Aminozucker, dem Daunosamin.

Abb. 1: Strukturformel von Daunorubicin


3

Der Hauptmetabolit von Daunorubicin ist Daunorubicinol, der durch Reduktion der C-13-Ketogruppe zum entsprechenden C-13-Alkohol entsteht. Daunorubicinol hat ebenfalls Antitumorwirkung und liegt im Plasma in höherer Konzentration als Daunorubicin vor.

Ebenfalls können u.a. 7-Desoxyaglykone und 7-Hydroxyaglykone bei der Metabolisierung entstehen (siehe Abb. 2 ). Diese Metabolite weisen eine bedeutend geringere zytostatische Aktivität als die Ausgangsverbindungen auf.

Abb. 2: Darstellung der Metabolisierung von Daunorubicin zu dessen Hauptmetabolit Daunorubicinol und anderen Metaboliten

Daunorubicin ist intensiv orange-rot und absorbiert sowohl im UV-Bereich (bei 254 nm) als auch im sichtbaren Bereich (bei ca. 480 nm) Licht. Es ist daher sehr sensibel gegenüber Licht und sollte deshalb während der Aufbewahrung und der Versuche geschützt werden.

Die polyaromatische Struktur des Daunorubicins bewirkt eine starke Fluoreszenz, weswegen Daunorubicin sehr gut mittels Durchflußzytometrie, konfokaler Lasermikroskopie und auch anderer fluorometrischer Nachweisverfahren erfasst werden kann [12].


4

Daunorubicin besitzt ein breites Spektrum der Antitumorwirkung, sowohl epitheliale als auch mesenchymale Tumoren sprechen an. Vornehmlich wird Daunorubicin allerdings bei akuter myeloischer und lymphatischer Leukämie angewandt [13,14]. Wechselwirkungen mit anderen Antitumorsubstanzen sind nicht bekannt [15].

Die Wirkung des Anthrazyklins besteht aus einer Vielfalt von Mechanismen und ist in der S-und der G2-Phase des Zellzyklus am ausgeprägtesten. Einige der Wirkmechanismen sind DNA-Interkalation, Hemmung der Topoisomerase I und II, Inhibition der Helicase, Bildung freier Sauerstoffradikale, Veränderung von Membranstruktur- und funktion und letztlich durch Induktion von Apoptose (siehe unter 1.4) [15,16,17].

Die zelluläre Invasion (Einstrom) des nicht-ionisierten Anthrazyklins verläuft durch passive Diffusion. Eine wichtige Rolle für die Invasion spielen der intrazelluläre und der extrazelluläre pH-Wert. Zum Beispiel kommt es bei intrazellulärer Azidose zu gesteigerter intrazellulärer Akkumulation, da die nicht-ionisierte Substanz invadiert, protoniert wird und dadurch unfähig ist, die Zelle wieder zu verlassen. Dementsprechend kommt es bei extrazellulärer Azidose zu einer verminderten Akkumulation. Ebenfalls spielt die Temperatur eine große Rolle für den Einstrom von Daunorubicin in die Zellen, wobei bei 37°C pharmakologische Vorgänge ablaufen, die bei 0°C reduziert oder gehemmt werden [18].

Charakteristisch für die zelluläre Pharmakokinetik der Anthrazykline ist, dass es in kernhaltigen Zellen zu einer starken Akkumulation der Substanzen kommt. Dies erklärt sich durch die Bindung an die Zellmembran, Aufnahme von Daunorubicin in verschiedene intrazelluläre Subkompartimente und die hohe Affinität zur DNA. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt, dass sich Daunorubicin diffus im Zytoplasma verteilt, teilweise mit stärker fluoreszierenden Arealen, die Zellorganellen (morphologisches Substrat der Subkompartimente) entsprechen. Ebenfalls kommt es zu einer starken Fluoreszenz im Zellkern [19].

Der Efflux (Ausstrom) der freien, nicht gebundenen Anthrazykline erfolgt passiv durch Diffusion und zusätzlich aktiv durch ein Membranprotein, dem P-170-Glykoprotein. Die Wirkung dieser Efflux-Pumpe ist ATP-abhängig. Der Verlauf des zellulären Ausstroms ist biphasisch.

Die t1/2alpha beträgt bei Daunorubicin 40 min, die terminale Halbwertzeit (t1/2beta) 45-55 h, und es wird rasch aus dem Plasma in die Gewebe aufgenommen. Die Ausscheidung von Daunorubicin erfolgt zu 40-60% langsam über die Galle und in bis zu 15-20% über die Niere [21]. Innerhalb der ersten 24 h p.I. werden etwa 70% der Gesamtmenge ausgeschieden, der Rest in den folgenden Tagen [22,23]. Die Elimination erfolgt zu


5

36,6% unverändert, zu 30% als Daunorubicinol und zu 33,3% in Form anderer Metabolite [24].

Da Daunorubicin sowohl von Tumorzellen als auch von Normalgewebe mit hohem Zellumsatz aufgenommen wird, kommt es neben der gewünschten Antitumor-Wirkung auch zu unerwünschten Nebenwirkungen. Knochenmarksuppression mit Thrombo-, Lympho- und Erythrozytopenie und Mukositis stellen häufige akute Toxizitäten dar. Ebenfalls treten gastrointestinale Nebenwirkungen mit Übelkeit und Appetitsverlust, Alopezie, Nephrotoxizität und weitere Nebenwirkungen auf [25]. Ein besonderes Problem ist die Karditoxizität, die in eine akute („Soforttyp“) und eine chronische („Spättyp“) Manifestationsform untergliedert wird und welche die verzögert auftretende (kumulative) dosislimitierende Toxizität darstellt. Im fortgeschrittenen Stadium kann sich daraus eine diffuse Myokardfibrose entwickeln. Dies kann zum Herzversagen führen und endet häufig tödlich [26,27,28].

Ein weiteres großes Problem stellt die Resistenzentwicklung von Tumorzellen gegenüber Anthrazyklinen dar. Bei einem Großteil der resistenten Zelllinien kommt es zur Überexpression des P-170-Glykoproteins („Multidrug resistance“). Dies führt zu einem erhöhten Daunorubicin-efflux und einer verminderten Akkumulation in der Zelle, was zu einem Wirksamkeitsverlust führt. Außer dem „Multidrug resistance“ Phänotyp (MDR) sind noch andere Resistenzmechanismen identifiziert worden, z.B. „multidrug resistance-associated protein“ (MRP), veränderte DNA-Topoisomerase-II-Aktivität und Veränderungen im Gluthation-Stoffwechsel [16,17,29].

Aufgrund dieser zunehmenden Resistenzentwicklung gegenüber den häufig klinisch verwendeten Anthrazyklinen und deren dosislimitierender Kardiotoxizität wird stetig an der Weiterentwicklung neuer Substanzen gearbeitet. Diese sollten potenter und nebenwirkungsärmer sein und ebenfalls eine verbesserte Antitumorwirkung und Pharmakokinetik aufweisen [30,31]. Eines dieser weiterentwickelten Anthrazykline könnte das liposomal verkapselte Daunorubicin, genannt Daunoxome darstellen.


6

1.3 Entwicklung, Aufbau und Pharmakologie des liposomal verkapselten Daunorubicins

Liposome sind geschlossene, runde Vesikel, die durch eine Reihe amphipathischer Substanzen, z.B. Phospholipide, gebildet werden. Bei Kontakt mit wässrigen Lösungen ordnen sich die Substanzen in Membrandoppelschichten an. Hierbei können verschiedene Substanzen in die Liposome eingeschlossen werden.

Die erste Beschreibung von Liposomen verfassten 1965 Bangham et al. [32], den Namen „Liposome“ erhielten sie dann 1968 von Sessa und Weissmann [33]. Es kam zu einer stetigen Weiterentwicklung, besonders im Bereich der Stabilität im Plasma. Die erste Generation von Liposomen war gekennzeichnet durch eine niedrige Zirkulationszeit im Serum und eine hohe Aufnahme durch das retikulo-endotheliale System (RES). Mitte der 80er Jahre kam es dann zur Entwicklung der zweiten Generation, bei denen die Affinität zum RES deutlich verringert war. Dies gelang durch die Konstruktion stabiler Liposome, bei denen auf der Liposomoberfläche Polyethylenglykol kovalent an Phospholipide gebunden war und durch die Kombination mit Cholesterin. Dadurch wurde die Oberfläche hydrophil, die Bindung an Plasmaproteine und die Aufnahme durch das RES nahm ab, und die Zirkulationszeit nahm zu [34,35,36,37].

Abb. 3: Darstellung der Lipiddoppelschicht und des wässrigen Kerns eines Liposom und des Einbaus von hydrophilen und lipophilen Substanzen [aus Sharma, [38]]


7

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Liposomen, z.B. Größe, Membranfluidität und Oberflächenladung, hängen von der Lipidzusammensetzung und der Herstellungsmethode ab. Hydrophile Substanzen werden im inneren wässrigen Kern eingeschlossen, lipophile (hydrophobe) und amphiphile Stoffe werden in die Phospholipidschicht integriert (siehe Abb. 3 ) [39].

Eines dieser Substanzen ist das Daunoxome. Es sind kleine (60-80 nm), unilamelläre, negativ geladene Liposome. Im inneren wässrigen Kern befindet sich das Citratsalz von Daunorubicin, welches von einer einzigen doppelschichtigen Membran umgeben wird. Diese besteht aus Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) und Cholesterin im molekularen Verhältnis 2:1 (siehe Abb. 4 ) [40].

Abb. 4: Struktur des Daunoxome [aus NeXstar [41]]

Diese besondere Zusammensetzung verleiht Daunoxome eine große physikalische Stabilität. Die Zugabe von Cholesterin verstärkt die Lididdoppelschicht und dadurch die Resistenz gegenüber dem Austritt des eingeschlossenen Daunorubicins. Ebenfalls führt es zu einer gesteigerten liposomalen Stabilität im Serum, da es den Verlust von Phospholipiden an Lipoproteine kontrolliert.

Anwendung in der klinischen Behandlung von Tumoren findet Daunoxome meistens im Rahmen von klinischen Studien z.B. beim HIV-assoziiertem Kaposi-Sarkom und bei hämatologischen Erkrankungen.

Es wird angenommen, dass die Wirkmechanismen denen des freien Daunorubicins entsprechen, wobei noch nicht ausreichend geklärt ist, ob die Liposomen selbst eine


8

Antitumoraktivität besitzen [42]. Einige Autoren postulieren, dass im Vergleich zum freien Daunorubicin das verkapselte Daunorubicin eine höhere Zytotoxizität (zwei-dreifach erhöht) aufweist und eine größere Menge der Substanz den Tumor erreicht [19,42,43,44,45].

Die zellulär pharmakokinetischen Daten von Daunoxome unterscheiden sich wesentlich gegenüber denen von freiem Daunorubicin. Die Invasion des intakten Daunoxome erfolgt über Endozytose. Da eine fortwährende Freisetzung des Daunorubicins aus den Liposomen zu erfolgen scheint, akkumuliert Daunoxome deutlich langsamer und länger anhaltend in die Zellen und erreicht so höhere Tumorspitzenkonzentrationen [19]. Die Halbwertzeit ist gegenüber freiem Daunorubicin ebenfalls erhöht, t½alpha beträgt 2,8-5,2 h [45]. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt, dass sich Daunoxome eher lokalisiert und weniger diffus im Zytoplasma verteilt mit einer anfangs geringeren Kernfluoreszenz. Diese nimmt aber nach längerer Inkubationszeit stark zu und übertrifft die des Zytoplasmas.

Die Daten zur Plasmapharmakokinetik beschreiben für das verkapselten Daunorubicins im Gegensatz zu freiem Daunorubicin eine monophasische Evasion [45,46,47].

Die Metabolisierungsschritte des liposomal verkapselten Daunorubicins ähneln denen des freien Daunorubicins (siehe Abb. 2 ). Der Hauptmetabolit des Daunoxome ist nach Freisetzung des Daunorubicins ebenfalls Daunorubicinol. Allerdings wird eine starke Abnahme der Reduktion der C-13-Ketogruppe zum entsprechenden C-13-Alkohol beobachtet. Deshalb liegt die Konzentration von Daunorubicinol bei Patienten, die mit Daunoxome behandelt werden, deutlich niedriger als nach Behandlung mit freiem Daunorubicin [46].

Das Toxizitätsprofil von Daunoxome scheint im Gegensatz zu freiem Daunorubicin beträchtlich reduziert zu sein. Am häufigsten treten hämatologische Toxizitäten auf, neben Neutropenie ebenfalls Thrombozytopenie und Anämie. Andere Nebenwirkungen erscheinen selten und mild, wie z.B. Alopezie, Übelkeit und Mukositis. In einigen Studien wird von Patienten berichtet, die neben hämatologischen Toxizitäten keine weiteren aufweisen [43,45,48]. Auch die kardiale Beteiligung ist bei Behandlung mit verkapseltem Daunorubicin deutlich seltener und geringer ausgeprägt gegenüber Behandlungen mit anderen Anthrazyklinen. In echokardiographischen Befunden konnten bei einigen Patienten vor und nach Therapie mit liposomal verkapseltem Daunorubicin keine Unterschiede in der Myokardfunktion ausgemacht werden [43, 49,50].

Die Entwicklung der liposomalen Verkapselung von Daunorubicin könnte einen großen Fortschritt in der Behandlung von resistenten Zellen im Vergleich zur Behandlung mit freiem Daunorubicin darstellen. Daunoxome scheint P-170-Glykoprotein-assoziierte Resistenzen überwinden zu können, vermehrt in resistenten Zellen zu akkumulieren und


9

dadurch zytotoxisch agieren zu können [34,42,50,51]. Bisher liegen allerdings nur sehr wenig Daten über die zelluläre Pharmakokinetik von Daunoxome im Vergleich zu Daunorubicin vor, welche die Grundlage für weitere Forschungen zu Toxizität und Resistenzen darstellen könnten.

1.4 Pharmakologische Bedeutung der Apoptose

Apoptose ist eine aktive, physiologische Art des Zelltods. Sie wird auch programmierter Zelltod genannt, da es sich um einen „suizidalen Prozess“ handelt, bei dem die Zelle selbst ein genetisch determiniertes Programm aktiviert, welches zum Zelltod führt. Apoptose spielt eine wichtige Rolle in der Homeostase der Gewebe, indem ein Gleichgewicht zwischen Zellproliferation und Zelltod aufrechterhalten wird [52,53].

Bei der Apoptose handelt es sich um einen vielseitigen Mechanismus, in den viele Regulatoren und Trigger involviert sind und der durch typische biochemische und morphologische Veränderungen gekennzeichnet ist. Viele dieser Prozesse sind allerdings noch unbekannt.

Als Trigger für das Apoptoseprogramm gelten Entzug der Wachstumsfaktoren, der Tumor-Nekrose-Faktor, DNA-Schäden, Fas-Ligandenbindung, Glukokortikoide und Behandlung mit UV-Strahlen oder Chemotherapeutika [54]. Hier entsteht Apoptose häufig als finaler Prozess der Zytotoxizität, besonders bei Substanzen, die stabile Komplexe mit der DNA bilden, wie z.B. Anthrazykline [55]. Wie unter 1.2 bereits erwähnt, spielt auch bei Daunorubicin die Apoptoseinduktion als Wirkmechanismus eine Rolle. Da es eine lipophile Substanz ist, verteilt sich Daunorubicin relativ schnell in den Zellen und diffundiert in den Kern. Dort interkaliert es in die DNA und inhibiert gleichzeitig die Topoisomerase II, nachdem dieses Enzym Doppelstrangbrüche verursacht und zu DNA-Schäden geführt hat. Diese Vorgänge scheinen als Trigger für die Apoptoseinduktion von Daunorubicin verantwortlich zu sein [56,57,58,59].

Es gibt allerdings keine Beweise, dass der durch Anthrazykline induzierte Zelltod ausschließlich durch Apoptose hervorgerufen wird [12].

Die Trigger initiieren eine Kaskade von Ereignissen, die mit Apoptose (Zelltod) enden. Die Dauer zwischen Exposition mit dem Trigger und Erscheinen der ersten Zeichen morphologischer Veränderungen („Triggerphase“) von Apoptose variiert stark. Sie ist u.a. abhängig vom Zelltyp, Triggerart und Wachstumsverhältnissen der Zellen. Alle unterschiedlichen Induktionssysteme scheinen aber eine proteolytische Kaskade zu aktivieren, in die das „Interleukin Converting Enzym“ (ICE) und ICE-ähnliche Proteaseformen (Caspase-Familie) involviert sind.


10

Es sind ebenfalls einige Gene benannt worden, die im Zusammenhang mit der initialen Phase von Apoptose stehen. Dazu zählt das bcl2-Gen, welches Zellen gegen Apoptose protektiert. Dies geschieht durch Entgegenwirken der Effekte der bax-Genfamilie, die apoptoseinduzierend wirken [60,61,62].

Die Aktivierung der proteolytischen Kaskade scheint der Anfang der „Exekutionsphase“ (Spätphase) im apoptotischen Prozess zu sein. Diese ist relativ kurz und weist nur eine geringe Variation der Dauer auf. Durch die Aktivierung der Caspase-Familie kommt es zur Zerstörung von zellulären Proteinen, was nach und nach zur totalen Desintegration und letztendlich zur Phagozytose der apoptotischen Zellen führt.

Zu diesem Zeitpunkt kommt es auch zu Veränderungen der Plasmamembran. Vitale Zellen halten eine asymmetrische Verteilung von verschiedenen Phospholipiden zwischen der äußeren und inneren Membran der Lipiddoppelmembran aufrecht. Phosphatidylserine (PS) erscheinen nur auf der inneren Membran zum Zytoplasma zeigend. Während der Apoptose kommt es zu einem Verlust dieser Asymmetrie und zum Auftreten von Phosphatidylserinen auf der äußeren Membran (siehe Abb. 5). Dies führt zur spezifischen Erkennung der apoptotischen Zellen durch Makrophagen und zur Phagozytose. Das Auftreten von PS auf der äußeren Seite der Zellmembran scheint von der frühen „Exekutionsphase“ der Apoptose bis zum Ende zu dauern [52].

Durch das Auftreten von Phosphatidylserinen auf der äußeren Membran der Lipiddoppelschicht ist es möglich, apoptotische Zellen zu markieren und von vitalen und nekrotischen Zellen getrennt darzustellen. Annexin V besitzt eine hohe Affinität zu diesen exponierten Phosphatidylserine und bindet deshalb dieses in Gegenwart von Kalzium an apoptotische Zellen. Durch Fluoreszenzmarkierung des Annexins wird es so möglich, apoptotische Zellen mittels Durchflußzytometrie zu erfassen und von vitalen Zellen abzugrenzen (siehe Abb. 10 ).

Durch Doppelmarkierung mit Propidium Iodid (PI) ist zusätzlich die Abgrenzung von apoptotischen zu nekrotischen Zellen möglich, da apoptotische Zellen Annexin V binden und PI ausschließen. Nekrotische Zellen nehmen auch PI auf und werden dadurch PI positiv.


11

Abb. 5: Schematische Darstellung der äußeren und inneren Membran von vitalen und apoptotischen Zellen und dem Verlust der Asymmetrie der Lipiddoppelschicht während der Apoptose und der Exposition von Phosphatidylserinen (PS, rote Kreise) auf der äußeren Membran [aus van Engeland, [52]]

Während viele molekulare Vorgänge der Apoptose noch unbekannt sind, gelten bestimmte morphologische Veränderungen als relativ spezifisch für die Apoptose. Ein frühes Ereignis stellt die Zelldehydratation dar. Der Verlust von intrazellulärem Wasser führt zur Kondensation des Zytoplasmas, gefolgt von Veränderungen in der Zellgröße und dem Zellaussehen. Die physiologisch runden Zellen werden ovaler und kleiner.

Charakteristisch ist auch die Kondensation des nuklearen Chromatins. Dies nimmt häufig eine konkave Form an (halbmond-, hufeisen- oder sichelförmig). Die DNA im kondensierten Chromatin wird zuerst hyperchromatisch (Kernpyknose) und lässt sich stark anfärben. Daraufhin kommt es zu Desintegration der Kernstruktur durch proteolytischen Abbau, und es folgen die nukleare Fragmentation (Karyorrhexis) und die Kernauflösung (Karyolysis). Einzelne Kernfragmente verteilen sich im Zytoplasma und werden zusammen mit intakten Organellen in Teile der Plasmamembran verpackt. Diese werden „apoptotische Körper“ genannt (siehe Abb. 6) und trennen sich von der sterbenden Zelle. Später werden sie dann phagozytiert [63,64].

Die strukturelle Integrität der Plasmamembran und auch der größte Teil ihrer Funktion bleibt während der initialen Phase der Apoptose erhalten. Auch die Zellorganellen verändern sich während der Apoptose zunächst nicht, auch wenn das mitochondriale transmembrane Potential deutlich abnimmt [65,66,67].


12

Abb. 6: Schematische Darstellung der morphologischen Veränderungen während der Apoptose mit Zelldehydratation (Abnahme der Zellgröße),Chromatinkon- densation, Kernfragmentation und Bildung von apoptotischen Körpernmit Erhalt der Plasmamembranintegrität [aus Darzynkiewicz, [60]]

Da Apoptose durch eine Vielzahl von Triggern induziert werden kann und durch ein großes Netzwerk regulatorischer Prozesse gesteuert wird, ergibt sich die Frage, ob durch Eingreifen in diesen Ablauf die Sensitivität von Tumor- und Normalzellen gegenüber Antitumorsubstanzen veränderbar ist, um die Effizienz zu erhöhen und die Toxizität zu senken.

Es ist ebenfalls deutlich geworden, dass Tumorprogression und Zunahme der Malignität mit Veränderungen der Fähigkeit assoziiert sein können, spontan Apoptose zu durchlaufen [60,68]. Aus diesen Gründen ist es von Interesse, die Apoptoserate bei Behandlung mit Antitumorsubstanzen zu messen und miteinander zu vergleichen. Trotz stetig zunehmender Zahl von Untersuchungen über Apoptosevorgänge liegen bislang sehr wenig Daten über die Apoptoseinduktion durch liposomal verkapseltes Daunorubicin und über den direkten Vergleich der Apoptoseinduktion durch freies und verkapseltes Daunorubicin vor. Ebenfalls ist die Geschwindigkeit der

Apoptoseinduktion als Parameter der Pharmakodynamik (besonders der Wirksamkeit) bisher nicht in Untersuchungen über den direkten Vergleich der zellulären Pharmakokinetik von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin miteinbezogen worden. Von daher wird dies und die

allgemeinen Untersuchungen zur zellulären Pharmakokinetik von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin in dieser Arbeit zum Gegenstand gemacht.


13

Für diese Untersuchungen werden CEM-Leukämiezellen verwendet, da sie sich besonders gut für Messungen zur Kinetik und zu Apoptosevorgänge eignen, da sie allgemein zu Apoptoseinduktion neigen.

Für die meisten Untersuchungen wird in dieser Arbeit die Durchflußzytometrie als Methode gewählt. Sie liefert schnell quantitative, objektive und vergleichbare Daten. Diese sollten allerdings durch lichtmikroskopische Aufnahmen bestätigt werden, da die morphologischen Veränderungen während der Apoptose einzigartig sind und die Abgrenzung zu vitalen Zellen möglich machen [60,65,69].

Die Untersuchungen zur intrazellulären Verteilung der beiden Substanzen werden mittels konfokaler Lasermikroskopie durchgeführt und dokumentiert.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Tue Nov 19 12:41:05 2002