Bartels, Anna-Maria : Durchflußzytometrische Untersuchungen zur zellulären Pharmakokinetik von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin

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Kapitel 3. Material und Methode

3.1 CCRF-CEM Zellen als in vitro-Modell

CCRF-CEM ist eine humane T-lymphatische Zelllinie, die1964 aus peripherem Blut eines

4-jährigen Mädchens mit akuter lymphatischer Leukämie von G. E. Foley et al. [70] gewonnen wurde (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland ).

Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Zellen werden in einer Suspension kultiviert und wachsen in einem Medium bestehend aus 90% RPMI Medium und 10% inaktiviertem fetalem Kälberserum (Seromed Biochrom KG, Berlin). Als Behältnisse werden FALCON Gewebekulturflaschen (200 ml) verwendet (Nunc Brand Products, Denmark).

Die zunächst tiefgefrorenen CEM-Zellen (Stickstoff, -125°C, konserviert in 95% RPMI und 5% DMSO) werden nach dem Auftauen in 10 ml PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, Sigma Chemie) resuspendiert und anschliessend über 10 min bei 1200 U/min zentrifugiert (Hettich

Universal 30RF Zentrifuge) und dann mit Wachstumsmedium aufgefüllt.

Der anschließende Trypanblautest zeigt den prozentualen Anteil vitaler Zellen auf. Dafür wird 10 µl Zellsuspension zu 90 µl einer 0,2%igen Trypanblau-Lösung (Sigma Chemie) pipettiert und in die Zählkammer gegeben. Der Anteil gefärbter Zellen wird bestimmt, welcher als avital anzusehen ist. Die Formel hierfür lautet:

Die Gesamtzellzahl wird analog mit 90 µl 10%iger Essigsäure bestimmt.

Danach erfolgt die Aussaat der Zellen in die Gewebekulturflaschen mit Zugabe von 20 ml Wachstumsmedium (siehe oben). Die Zellzahl soll 2-3 x 106 betragen. Die Inkubation erfolgt im Brutschrank (Cytoperm Heraeus, Berlin) bei +37°C und 5% CO2, und alle 2-3 Tage wird die Zellsuspension geteilt („splitten“) und mit frischem Medium aufgefüllt. So lässt sich zuverlässig ein exponentielles Wachstum der Zellen erzielen. Vor den Messungen werden die Proben bei


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0-4°C aufbewahrt, um weitere Diffusionsvorgänge zu reduzieren [18].

Die Versuche sind alle 24 Stunden nach dem so genannten Splitten durchzuführen, da sich die Zellen in der Wachstumsphase befinden. Der Zellzyklus wird nicht synchronisiert, da gezeigt wurde, dass dies nur einen geringen Effekt auf den Ein- und Ausstrom von Anthrazyklinen hat [71]. Diese konstanten Vorraussetzungen werden bei allen Versuchen eingehalten.

3.2 Versuchsreihen

3.2.1 Durchführung der Invasionsversuche

Um Unterschiede in der zellulären Pharmakokinetik von Daunorubicin (Daunoblastin, Pharmacia&Upjohn GmbH, Erlangen) und Daunoxome (Nexstar Pharmaceuticals, Martinsried) erfassen zu können, sind verschiedene Versuche erforderlich. Die ersten Versuche konzentrieren sich auf die Invasion der beiden Chemotherapeutika bei verschiedenen extrazellulären Konzentrationen. Es werden die Fluoreszenzintensitäten der CEM-Zellen nach Gabe von Daunorubicin oder Daunoxome bei zunehmenden Inkubationszeiten gemessen.

Hierfür werden sieben Kulturflaschen mit jeweils 10 ml Zellsuspension aufgefüllt, zu denen dann Daunorubicin oder Daunoxome pipettiert werden (nach Vorverdünnungen der Stammlösung von 2 mg/ml Daunorubicin oder Daunoxome). Es werden Endkonzentrationen von 1, 5 und 10 µg/ml erreicht. Eine Kulturflasche mit Zellsuspension bleibt ohne Zusatz als Kontrolle.

Für die Untersuchungen werden zu den Zeitpunkten 0, 30, 60, 120, 180, 360, 540 und einmalig 720 Minuten nach Zusatz von Daunorubicin bzw. Daunoxome Aliquote aus den Kulturflaschen entnommen, aufgearbeitet und mittels Durchflußzytometrie (siehe unten) bestimmt.

Der Ablauf im einzelnen ist folgender:

  1. Abnahme von je 500 µl Zellsuspension von allen sieben Kulturflaschen und Gabe in Reagenzröhrchen und Zusatz von 2 ml auf 4°C gekühltem PBS
  2. Fünf Minuten Zentrifugation mit 1000 U/min bei 4°C
  3. Überstand dekantieren und Zellpellet mit 2 ml 4°C gekühltem PBS resuspensieren
  4. Erneut fünf Minuten zentrifugieren mit 1000 U/min bei 4°C
  5. Resuspension des Zellpellets mit 500 µl PBS nach Dekantieren
  6. Messungen mittels Durchflußzytometer (siehe unten)


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Die Kulturflaschen befinden sich zwischen den Abnahmen im Inkubator. Die Arbeitsschritte finden unter sterilen Bedingungen in der Laminarflowbox (Integra Biosciences) statt.

Anhand der Fluoreszenz gegen die Zeit-Kurve können zusätzlich die Anfangsgeschwindigkeit (V30) und die maximale Geschwindigkeit (Vmax) für jeden Invasionsversuch berechnet werden. Hierzu gelten die Formeln:

Vmax

=

Tangente der maximalen Steigung (maximale Änderung der Fluoreszenz)

V 30

=

Tangente der Anfangssteigerung (Anfangsgeschwindigkeit)

DF

=

Fluoreszenzdifferenz

Dt

=

Zeitdifferenz

3.2.2 Durchführung der Evasionsversuche

Als zweite Versuchsreihe werden die Evasionsversuche durchgeführt. In diesen Versuchen soll der Ausstrom des Medikaments nach zweistündiger Inkubation der Zellsuspensionen nach Gabe von Daunorubicin oder Daunoxome bei unterschiedlichen extrazellulären Konzentrationen ermittelt werden.

Es werden ebenfalls sieben Kulturflaschen mit 10 ml Zellsuspension gefüllt. Dazu werden entweder Daunorubicin oder Daunoxome gegeben und Endkonzentrationen von 1 µg/ml, 5 µg/ml oder 10 µg/ml erreicht. Eine Flasche bleibt ohne Zusatz als Kontrolle. Danach werden alle für zwei Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.

Die weiteren Arbeitsschritte sind folgende:

  1. Zentrifugation der gesamten Zellsuspensionen bei 4°C und 1000 U/min für fünf Minuten
  2. Dekantieren und Auffüllen des Zellpellets mit 2 ml 4°C gekühltem PBS
  3. Wiederholung des 1. Arbeitsschrittes
  4. Dekantieren und mit 10 ml frischem RPMI-Medium resuspendieren
  5. Präparation vor den Messungen siehe Invasionsversuche Arbeitsschritte 1-5
  6. Durchflußzytometrische Analyse

Die Messungen erfolgen 0, 60, 120, 180 und 300 Minuten nach Inkubation, da nach 2 h ausreichend hohe Konzentrationen der Substanzen in den Zellen vorliegen, aber keine


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irreversiblen Bindungen eingegangen sind und somit Rückverteilungsvorgänge noch stattfinden können.

Die Arbeitsschritte finden ebenfalls unter sterilen Bedingungen in der Laminarflowbox statt.

3.2.3 Durchführung der Apoptoseversuche

Die Apoptoseversuche werden mit Zweifachfärbung durch Annexin V (Bender Med Systems Diagnostics GmbH, Wien) und PI (Propidium Iodid, Sigma Chemie) durchgeführt. Da apoptotische Zellen die Asymmetrie ihrer Phospholipiddoppelmembran verlieren und dabei Phosphatidylserine (PS) auf der äußeren Seite der Membran exponieren, bindet Annexin V wegen seiner hohen Affinität zu PS an die apoptotischen Zellen. Dadurch kann quantitativ der Prozentsatz der Zellen, die apoptotisch werden, bestimmt werden. Durch Fluoreszenzmarkierung des Annexins kann dies mittels Durchflußzytometrie dargestellt werden.

Es werden 11 Kulturflaschen mit je 10 ml Zellsuspension gefüllt und Daunorubicin oder Daunoxome dazu pipettiert, um Endkonzentrationen von 1, 5 oder 10 µg/ml zu erreichen. Eine Kulturflasche ohne Zusatz gilt als Kontrolle. Die Versuchsreihe wird als Doppelversuch durchgeführt.

Die Messungen werden nach 120, 240, 360 und 480 min Inkubation durchgeführt, zwischenzeitlich befinden sich die Zellen im Inkubator bei 37°C und 5% CO2.

Die Arbeitsschritte sind folgende:

  1. Abnahme von 400 µl Zellsuspension und Umfüllen in ein Eppendorfgefäß
  2. Zweimaliges Waschen mit PBS und Zentrifugieren (siehe Arbeitsschritte bei 3.2.1)
  3. Resuspension mit 1X Binding Buffer (dieser wird hergestellt aus 1 ml 10X Konzentrat und 9 ml sterilem destilliertem Wasser) zu einer Konzentration von 1x10 6 Zellen/ml
  4. Transfer von 100 µl der Zellsuspension in ein anderes Gefäß
  5. Zugabe von 10 µl Fluoreszin-konjugiertem Annexin V und 10 µl PI Reagenz
  6. Mit Vortex mixen und Inkubation für 15 min bei 20-25°C in Dunkelheit
  7. Danach Zugabe von 400 µl 1X Binding Buffer und durchflußzytometrische Analyse

Alle Arbeitsschritte laufen unter sterilen Bedingungen ab.


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3.3 Nachweis morphologischer Veränderungen während der Apoptose mittels Lichtmikroskopie

Zur besseren Unterscheidung von nekrotischen, apoptotischen und vitalen Zellen ist es sinnvoll, neben durchflußzytometrischen Messungen lichtmikroskopische Untersuchungen durchzuführen (Leitz Labor Lux S Mikroskop). Dies gilt als Bestätigung, dass die mittels Durchflußzytometrie als apoptotisch erfassten Zellen wirklich apoptotisch sind und die typischen morphologischen Veränderungen aufweisen. Zur Dokumentation werden diese apoptotischen Veränderungen fotographisch festgehalten.

Der Ablauf ist folgender:

  1. 500 µl Zellsuspension abnehmen und in die Zytozentrifuge geben
  2. Bei 1000 U/min 5 min zentrifugieren
  3. Objektträger mit May-Grünwald/Giemsa-Lösung (Merck-Darmstadt) färben
  4. Mikroskopieren und mittels Kamera (Leitz mit Bildautomatik) Bilder festhalten

Diese Arbeitsschritte werden parallel zu allen Apoptoseversuchen (wie unter 3.2 beschrieben) von Daunorubicin und Daunoxome zu allen Zeitpunkten durchgeführt.

3.4 Nachweis morphologischer Veränderungen während der Apoptose mittels Lichtmikroskopie

Das Durchflußzytometer gilt als schnelle und elegante Methode, um eine hohe Anzahl von Zellen in einer geringen Zeit zu messen und quantitativ zu erfassen [65].

Da sich Daunorubicin bei 488 nm zu einer intensiven Fluoreszenz im Rotbereich anregen lässt, ist es möglich, die intrazelluläre Konzentration der Substanzen über die Fluoreszenzintensitäten mittels Durchflußzytometer zu bestimmen. CEM-Zellen besitzen eine sehr niedrige Autofluoreszenz, deshalb lässt sich die Anthrazyklin-bedingte Fluoreszenz bei ihnen gut abgrenzen [72]. Dies macht funktionelle Messungen zur zellulären Pharmakokinetik mit Ein- und Ausstrom und der Apoptoseinduktion durch Anthrazykline mittels Durchflußzytometrie möglich [73].


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3.4.1 Aufbau und Funktionsweise eines Durchflußzytometers

Das Funktionsprinzip eines Durchflußzytometers besteht darin, dass nach „hydrodynamischer Fokussierung“ die Zellen einzeln wie Perlen an einer Perlenkette die Messkammer an einer definierten Stelle passieren. Dort werden sie von einem fokussierten Laserstrahl (Argonlaser,

488 nm) getroffen. Es kommt zur Anregung der von den Zellen gebundenen Fluorochrome (Daunorubicin, Daunoxome, Annexin V, PI) und zur Entstehung von Fluoreszenzsignalen. Durch die Lichtstreuung an der Zelle kommt es zur Entstehung von Streusignalen, wobei die Vorwärtsstreuung der Größe der Zelle und die Seitwärtsstreuung der Granularität der Zelle entspricht. Photoröhren und Photodioden konvertieren die optischen Signale in elektrische Impulse, die mit der Intensität des Lichtsignals korrelieren. Mit Hilfe eines Schwellenwertes werden Rausch- und Störsignale eliminiert [74]. Einen Überblick über den Aufbau des optischen Systems eines Durchflußzytometers gibt Abb. 7.

Abb. 7: Darstellung des optischen Systems eines Durchflußzytometers [ aus Raffael, [74]]

Über die Bestimmung der Fluoreszenzintensität mittels Durchflußzytometrie lässt sich die intrazelluläre Konzentration der Substanzen messen. Dabei korreliert die Fluoreszenzintensität mit der Konzentration des intrazellulär gebundenen Anthrazyklins [75]. Wird die Fluoreszenzintensität zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen und gegen


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die Zeit aufgetragen, so kann die Einstrom- und Ausstromkinetik im entnommenen Zellgut untersucht werden. Die daraus resultierende Kurve zeigt einen Anstieg, eine Maximalhöhe und einen Ausstrom.

Die Festlegung eines Basiswertes geschieht mit Hilfe einer Negativkontrolle, die keinen Fluorochromzusatz enthält. Dadurch wird die Autofluoreszenz der Zellen bestimmt und von den Fluorochromsignalen abgegrenzt [74].

Abb. 8: Qualitative Darstellung von Fluoreszenzsignalen

3.4.2 Probenmessung und Datenauswertung

Bei der vorliegenden Arbeit erfolgten die Messungen mit einem Durchflußzytometer vom Typ FACSort der Firma Becton Dickinson GmbH Heidelberg in Anlehnung an Raffael et al. [74] und Longobardi Givan et al. [76].

Die Geräteeinstellung wird mit fluoreszenzmarkierten Mikropartikeln (Mikrobeads: Calibrate 3, Becton Dickinson Worldwide, Inc.) durchgeführt.

Das Vorwärts/Seitwärts-Scatter wird linear dargestellt, die Fluoreszenzdaten (FL2) werden logarithmisch aufgezeichnet (siehe Abb. 9 ).

Die gemessenen Fluoreszenzsignale werden nicht nur in den für die Messung des Fluorochroms vorgesehenen Kanal, sondern in mehreren Kanälen registriert, was zu Messfehlern führen kann. Um diese zu kompensieren, wird ein gewisser Anteil des jeweiligen Fluoreszenzsignals in den Kanälen proportional zur Fluoreszenzintensität im eigentlich vorgesehenen Kanal subtrahiert. Dieser Vorgang heißt Kompensation. Sie wird regelmäßig mit einfach gefärbten Zellen oder Mikrobeads durchgeführt.

Es werden 5-10.000 Zellen bei einer Messrate von 30-50 Zellen/s gemessen (Messeinstellung „langsam“). Registriert werden die Fluoreszenzen im Kanal 2, der mit einem Filter (585/42 BP) ausgestattet ist.


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Der Ablauf und die Auswertung mittels Cellquest Software werden bei jeder Messung gemäß eines Standardprotokolls beibehalten.

Bei den Invasions- und Evasionsversuchen wird wie folgt vorgegangen: Die gemessenen Lichtstreuungen werden zuerst im Forward/Sideward-Scatter (Vorwärts/Seitwärtsstreuung) dargestellt, um die Zellen nach ihrer Größe (Vorwärtsstreuung) und nach ihrer Granularität (Seitwärtsstreuung) festzulegen. Die zu messenden Zellen werden so eingegatet, dass nur die vitalen Zellen markiert werden, die sich bezüglich der Lichtstreuung als größere, wenig granulierte Zellen darstellen, (hier rot dargestellt). In einer zweiten Darstellung wird die Fluoreszenz der vitalen, vorher eingegateten Zellen gemessen ( Abb. 9 ). Bei Zellproben, zu denen noch kein fluoreszierender Farbstoff zugesetzt ist, wird die Autofluoreszenz der Zellen dargestellt.

Abb. 9: Darstellung zur Abgrenzung der vitalen Zellen im Vor-wärts/Seitwärts-Scatter und Darstellung der Häufig-keitsverteilung der Fluoreszenz im FL2-Histogramm

Die Fluoreszenzintensität wird im so genannten Histogramm wiedergegeben. Hierbei wird die Häufigkeitsverteilung der Zellen bezüglich ihrer Fluoreszenzintensität dargestellt. Als Intensität wird die mittlere Fluoreszenzintensität als „Mean Channel Number“ gemessen. Es handelt es sich um einen dimensionslosen Wert, der angibt, in welchem Intensitätskanal die meisten Zellen registriert werden. Somit sind zwar die Messwerte innerhalb der Versuche vergleichbar, stellen aber keine Absolutwerte dar. Anhand dieser Histogramme werden dann im zeitlichen Verlauf der Versuchsreihen die Fluoreszenzintensitäten bestimmt. Diese werden in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen, und anhand der Kurven können die Parameter der Invasions- und Evasionskinetik (u.a. Anstiegsgeschwindigkeit, Höhe der Kurve, Ausstrom der Fluorochrome) bestimmt werden.

Danach erfolgt die Durchführung der Apoptoseversuche und die Darstellung der Messergebnisse im Dot Plot (siehe Abb. 10 zur Abgrenzung von apoptotischen Zellen von vitalen und nekrotischen).


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Zum Vergleich der Apoptose bei Behandlung mit Daunorubicin oder Daunoxome werden auch bei diesen Versuchen die Fluoreszenzen in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen.

Abb. 10: Log Fluoreszenz Dot Plot von Annexin V und PI gefärbten CEM- Zellen, Trennung von vitalen (R1), apoptotischen (R2), und nekrotischen (R3) Zellen bei unbehandelten CEM-Zellen


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3.5 Bestimmung der intrazellulären Verteilung mittels konfokaler Lasermikroskopie

Um Unterschiede in der intrazellulären Verteilung von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin aufweisen zu können, werden nach Inkubation von CEM-Zellen mit Daunorubicin oder Daunoxome lasermikroskopische Untersuchungen durchgeführt.

Dazu wird ein konfokales Lasermikroskop (Leica Microsystem-Wetzlar GmbH) mit einem Argon-Krypton Laser (488 nm) verwendet. Die Daten werden mittels SCANware ausgewertet.

Es werden drei Kulturflaschen mit 10 ml Zellsuspension gefüllt. Eine Flasche bleibt ohne Substanzzusatz als Kontrolle, in die anderen Kulturflaschen werden entweder Daunorubicin oder Daunoxome nach Vorverdünnung pipettiert. Die entstehende Endkonzentration beträgt 5 µg/ml.

Für die Untersuchungen werden nach 90, 180 und 360 Minuten und nach 24 Stunden Aliquote entgenommen, aufgearbeitet und bildlich mittels Lasermikroskop festgehalten.

Der Ablauf ist folgender:

  1. Abnahme von 500 µl Zellsuspension aller drei Kulturflaschen und Gabe in Reagenzröhrchen
  2. Waschen mittels Zugabe von 2 ml 4°C gekühltem PBS und 5 min Zentrifugation bei 1000 U/min und 4°C
  3. Dekantieren des Überstandes und Auffüllen des Zellpellets mit PBS (4°C gekühlt)
  4. Erneutes Zentrifugieren und Resuspension mit 50 µl PBS
  5. 2 Tropfen (ca. 50 µl) Zellpellet auf Objektglas pipettieren und leicht antrocknen lassen
  6. Zugabe von Mounting Medium und Abdecken mittels Deckglas
  7. Lasermikroskopische Untersuchung

Bis zur lasermikroskopischen Aufnahme müssen die Zellpellets in Dunkelheit und bei 4°C verwahrt werden, um weitere zellulär pharmakokinetische Vorgänge zu reduzieren [18].

Zwischen den einzelnen Abnahmen befinden sich die Kulturflaschen im Inkubator. Die Arbeitsschritte werden unter der Laminarflowbox durchgeführt.


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3.5.1 Aufbau und Funktionsweise eines konfokalen Lasermikroskops

Seit 1987 ist das konfokale Lasermikroskop kommerziell erhältlich, nachdem jahrelang an der optischen und elektronischen Theorie geforscht wurde. Es eignet sich hervorragend zur Darstellung von biologischen Substanzen, da es möglich ist, dünne optische Scheiben aus komplexen Objekten zu schneiden und diese darzustellen. Dadurch werden tieferliegende Gewebeschichten ebenfalls erfasst [77,78].

Abb. 11 zeigt den Aufbau des optischen Systems eines Lasermikroskops.

Abb. 11:
Schematische Darstellung des optischen Systems eines Lasermikroskops

Das Licht eines Lasers (in der vorliegenden Arbeit ein Argon-Krypton-Laser mit einer Emissionswellenlänge von 275-528 nm) wird durch eine Objektivlinse konvergiert und auf ein Objekt fokussiert. Der Scanner deflektiert den Strahl und scannt den fokussierten Punkt des Objekts. Das reflektierte Licht kommt zurück, läuft wieder durch den Scanner, wird durch den „Beam Splitter“ separiert und auf das Zentrum des „Pinholes“ zentriert. Der Punkt im Pinhole konjugiert mit dem Punkt auf dem Objekt und wird deshalb „konfokaler Punkt“ genannt.


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Die Lichtintensität, die das Pinhole durchläuft, wird durch einen photoelektronischen Sensor, z.B. eine Silikon Photodiode, aufgenommen und verarbeitet.

Das transmittierte Licht wird durch eine Kondenslinse gesammelt und mittels eines anderen Sensors detektiert. Dieser Sensor ist groß, um den gesamten transmittierten Strahl zu erfassen.

Diese konfokalen Effekte bringen deshalb gegenüber der konventionellen Mikroskopie Verbesserungen in der lateralen und axialen Auflösung mit sich.

Das Bild wird durch Scannen des fokussierten Punkts des Objekts aufgebaut und dann im Computer mittels Software verarbeitet und gespeichert [79,80,81,82].


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Tue Nov 19 12:41:05 2002