Bartels, Anna-Maria : Durchflußzytometrische Untersuchungen zur zellulären Pharmakokinetik von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin

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Kapitel 4. Ergebnisse

Im folgenden werden die Ergebnisse der einzelnen Versuche dargestellt. Jede Versuchsreihe ist dreimal wiederholt worden, und die Ergebnisse sind reproduzierbar.

Zuerst werden die Ergebnisse der Versuche zur Invasionskinetik, dann die der Versuche zur Evasionskinetik, die mittels Durchflußzytometrie durchgeführt wurden, graphisch und tabellarisch dargestellt und die zelluläre Pharmakokinetik von Daunorubicin und Daunoxome miteinander verglichen. Anschließend werden die Ergebnisse der Apotoseversuche, die ebenfalls mittels Durchflußzytometrie durchgeführt wurden, vorgestellt. Diese werden ebenfalls tabellarisch und graphisch dargestellt. Ebenfalls werden die Unterschiede der Ergebnisse von Daunorubicin und Daunoxome miteinander verglichen. Außerdem werden morphologische Veränderungen durch die Apoptose mittels Lichtmikroskopie bildlich festgehalten und aufgezeigt.

Zuletzt werden die Ergebnisse der Untersuchung zur intrazellulären Verteilung von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin in den CEM-Zellen mittels Lasermikroskopie bildlich dargestellt und miteinander verglichen.

4.1 Ergebnisse der mittels Durchflußzytometrie durchgeführten Versuche zur Invasionskinetik

Für den Vergleich der zellulären Pharmakokinetik von Daunorubicin und Daunoxome stellt die Invasionskinetik einen wichtigen Bestandteil dar. Hierbei spiegelt die gemessene Fluoreszenzintensität die intrazelluläre Konzentration der Substanzen wider.

Diese Kinetik beschreibt, wie schnell die beiden Anthrazykline in die Zellen einströmen und wann sie ihr Plateau erreichen. Desweiteren soll geklärt werden, ob die Invasionskinetik konzentrationsabhängig oder auch zeitabhängig ist. Ebenfalls ist von Interesse, ob sich die Kurvenverläufe der Invasion von Daunorubicin und Daunoxome unterscheiden.

Dazu werden die unter 3.2.1 beschriebenen Versuche durchgeführt. Die Ergebnisse sind anhand eines repräsentativen Versuchs in Tab. 1 und graphisch in Abb. 12 dargestellt.


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Tab. 1: Darstellung der Ergebnisse eines Invasionsversuchs mittels Durchflußzytometrie, Abhängigkeit der Fluoreszenzen (Einheit“Mean Channel Number“) von Daunorubicin und Daunoxome in drei Konzentrationen von der Inkubationszeit (in min)

Zeit in min

0

30

60

120

180

360

540

Fluoreszenz

Kontrolle

1,74

1,72

1,69

1,70

1,70

1,79

1,38

Daunorubicin 1µg/ml

1,73

7,63

13,79

26,07

33,44

37,54

32,0

Dau 5µg/ml

1,75

34,84

64,40

128,07

163,93

169,00

159,46

Dau 10µg/ml

1,76

94,05

175,01

274,83

326,72

313,93

269,41

Daunoxome 1µg/ml

1,74

3,10

3,99

8,26

14,23

30,12

30,48

Dx 5µg/ml

1,75

8,00

12,96

36,83

72,12

157,31

158,10

Dx 10µg/ml

1,76

14,30

27,71

75,38

151,69

258,61

266,59

Abb. 12: Zunahme der Fluoreszenzintensitäten der Zelle in Abhängigkeit von der Zeit


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Wie aus Tab. 1 und der Abb. 12 ersichtlich wird, steigt die Fluoreszenzintensität nach Inkubation mit Daunorubicin in allen drei Konzentrationen steil an. Dies bedeutet, dass Daunorubicin mit hoher Geschwindigkeit in die Zellen einströmt.

Besonders deutlich wird dies anhand der Kurve von freiem Daunorubicin in der Konzentration 10 µg/ml. Die Kurve verläuft sehr steil, erreicht ihr Plateau nach 180 min und erreicht die höchsten maximalen Konzentrationen.

Anhand der Kurven von 5 µg/ml Daunorubicin ist dies ebenfalls zu erkennen. Die Fluoreszenz Daunorubicins steigt schnell und steil an und erreicht ihr Maximum nach
180 min, die maximalen Werte von 10 µg/ml Daunorubicin werden jedoch nicht erreicht.

Die Kurve von 1 µg/ml freiem Daunorubicin zeigt auf, dass Daunorubicin schnell in die Zellen einströmt und ebenfalls nach 180 min ein Plateau erreicht. Die Maximalwerte liegen aber noch niedriger als bei Daunorubicin 5 µg/ml.

Der Kurvenverlauf der Invasion von freiem Daunorubicin gestaltet sich für alle Konzentrationen gleich. Bis zum Erreichen des Gleichgewichts verlaufen alle Kurven annähernd linear und folgen einer Sättigungskinetik.

Anhand der Kurven zur Invasionskinetik von liposomal verkapseltem Daunorubicin wird ersichtlich, dass Daunoxome deutlich langsamer in die Zellen einströmt.

Dies ist anhand der Kurve von Daunoxome 10 µg/ml gut zu erkennen. Daunoxome strömt zunächst langsamer ein und erlangt erst nach 120 min eine schnellere Einstromgeschwindigkeit. Ein Plateau wird nach den Inkubationszeiten der Versuchsreihe nicht erreicht, aber ebenfalls die Maximalwerte von Daunorubicin 10 µg/ml nach
360-540 min.

Daunoxome 5 µg/ml strömt anfangs ebenfalls langsamer ein, später schneller. Es wird kein Plateau erreicht, aber nach 540 min die gleichen Maximalwerte wie Daunorubicin
5 µg/ml.

Dies ist ebenfalls anhand der Kurven von Daunoxome 1 µg/ml zu erkennen.

Die Kurven der Invasionskinetik verlaufen für alle drei Konzentrationen Daunoxome sigmoidförmig.

Daraus ergibt sich, dass der initiale Einstrom von Daunorubicin schneller verläuft als der von Daunoxome, es aber in der Akkumulation der zu Versuchsende maximal erreichten Konzentration keinen signifikanten Unterschied gibt. Die Ergebnisse zeigen außerdem, dass die Einstromgeschwindigkeit zeitabhängig und konzentrationsabhängig ist.

Bei der Kontrolluntersuchung sind überhaupt keine Veränderungen der Fluoreszenzen zu verzeichnen.


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Wie bereits erwähnt, verlaufen die Kurven von Daunorubicin und Daunoxome unterschiedlich. Der Kurvenverlauf des freien Daunorubicins folgt einer Sättigungskinetik mit einem steilen, annähernd linearen Anstieg und Erreichen eines Plateaus, während der des liposomal verkapselten sigmoid verläuft mit anfangs langsameren, später erst steilerem Anstieg.

Daraus ergibt sich die Frage, welche Unterschiede die anfängliche und die maximale Einstromgeschwindigkeiten der beiden Substanzen aufweisen.

Um diese besser aufzeigen zu können, ist es sinnvoll, die Anfangsgeschwindigkeit (V30) und die maximale Geschwindigkeit (Vmax) der Invasion zu bestimmen und graphisch und tabellarisch darzustellen [18].

Diese Berechnungen werden anhand der einzelnen Invasionskurven von Daunorubicin und Daunoxome in allen drei Konzentrationen und mittels der Formeln aus 3.2.1 durchgeführt (siehe Abb. 13 und Tab. 2 und Tab. 3 ).

Abb. 13: Beispiel zur Bestimmung von V30 und Vmax anhand der Kurven der Invasionskinetik von Daunorubicin und Daunoxome in drei unterschiedlichen Konzentrationen anhand der Formeln aus 3.2.


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Tab. 2: Vergleich der Ergebnisse der V30-Bestimmung von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1 µg/ml, 5 µg/ml und 10 µg/ml anhand der Invasionsversuche

 

Dauno

1 µg/ml

Dx

1 µg/ml

Dauno

5 µg/ml

Dx

5 µg/ml

Dauno

10 µg/ml

Dx

10 µg/ml

1.Invasionsversuch

0,16

0,06

-

-

2,90

0,30

2.Invasionsversuch

0,20

0,05

1,10

0,21

3,10

0,42

3.Invasionsversuch

0,26

0,06

1,58

0,27

3,31

0,41

Tab. 3: Vergleich der Ergebnisse der Vmax-Bestimmung von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1 µg/ml, 5 µg/ml und 10 µg/ml anhand der Invasionsversuche

 

Dauno

1 µg/ml

Dx

1 µg/ml

Dauno

5 µg/ml

Dx

5 µg/ml

Dauno

10 µg/ml

Dx

10 µg/ml

1.Invasionsversuch

0,18

0,10

-

-

2,90

0,54

2.Invasionsversuch

0,20

0,09

1,16

0,47

3,10

0,59

3.Invasionsversuch

0,26

0,08

1,58

0,35

3,34

0,41

Die errechneten Werte (siehe Tab. 2 ) für die Anfangsgeschwindigkeit innerhalb der ersten 30 min nach Inkubation von Daunorubicin und Daunoxome zeigen, dass Daunorubicin in allen drei Konzentrationen mit einer deutlich höheren Anfangsgeschwindigkeit in die Zellen einströmt als Daunoxome in den entsprechenden Konzentrationen. Die Höhe der Geschwindigkeit ist abhängig von der extrazellulären Konzentration.

Die Werte für das liposomal verkapselte Daunorubicin zeigen die gleiche Konzentrationsabhängigkeit, erreichen aber in keiner Konzentration ebenso hohe Werte wie Daunorubicin. Daunoxome strömt demnach während der ersten 30 min nach Inkubation mit langsamerer Geschwindigkeit in die Zellen ein als Daunorubicin. Auch hier zeigt sich, dass Daunoxome 10 µg/ml höhere Invasionsgeschwindigkeiten aufweist als Daunoxome 5 µg/ml und als Daunoxome 1 µg/ml.

Die Werte für die maximale Geschwindigkeit ( Tab. 3 ) von Daunorubicin und Daunoxome zeigen, dass Daunorubicin neben einer höheren Anfangsgeschwindigkeit auch eine höhere maximale Einstromgeschwindigkeit aufweist als Daunoxome. Auch diese Werte sind konzentrationsabhängig, 10 µg/ml Daunorubicin weist die höchsten Werte auf, gefolgt von 5 µg/ml Daunorubicin und 1 µg/ml Daunorubicin. Der maximale Einstrom von


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Daunoxome ist ebenfalls konzentrationsabhängig, erreicht aber wie die Anfangsgeschwindigkeit nicht die Werte von Daunorubicin.

Ebenfalls ist deutlich zu erkennen, dass die initiale und die maximale Einstromgeschwindigkeiten für Daunorubicin fast identisch sind. Dies bedeutet, dass der maximale Einstrom von freiem Daunorubicin in allen Konzentrationen in den ersten 30 min nach Inkubation stattfindet. Außerdem ist zu sehen, dass ein annähernd linearer Zusammenhang zwischen der Einstromgeschwindigkeit und der extrazellulären Konzentration besteht.

Bei Daunoxome ist der initiale Einstrom nicht identisch mit der maximalen Konzentration, diese liegt hier zwischen der 180-360sten min nach Inkubation.

Obwohl Daunoxome in der vorgegebenen Versuchszeit kein Plateau erreicht, werden die Invasionsversuche nur über einen Zeitraum von 540 min durchgeführt. Es hat sich gezeigt, dass die Zellen bei längerer Versuchsdauer vermehrt zu Apoptose und Nekrose neigen ( Abb. 14 ). Dies wurde deutlich anhand des einmalig durchgeführten Invasionsversuchs über 720 min (nicht dargestellt). Dabei kam es nach 540 min besonders bei den höheren Konzentrationen zu einem Abfall des Kurvenverlaufs, was auf Zellruption bei Apoptose und Nekrose zurückzuführen sein könnte und dadurch nicht verwertbaren Daten hervorbrachte (siehe auch Abb. 14 ). Daraufhin wurde die Versuchsdauer für alle weiteren Versuche von 720 min auf 540 min festgesetzt.

Abb. 14: Darstellung der apoptotischen (schwarz markiert) und vitalen (rot markiert) Zellen im Vorwärts/Seitwärts-Scatter bei Inkubation mit 10 µg/ml Daunorubicin im Verlauf von 0 min, 180 min und 540 min


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4.2 Ergebnisse der mittels Durchflußzytometrie durchgeführten Versuche zur Evasionskinetik

Neben der Invasion stellt die Evasion einen wichtigen Bestandteil der zellulären Pharmakokinetik dar.

Hierbei wird untersucht, wie die Evasion abläuft, wie schnell freies bzw. liposomal verkapseltes Daunorubicin aus den Zellen strömt und ob dies abhängig ist von der extrazellulären Konzentration oder von der Zeit. Auch hier entsprechen die gemessenen Fluoreszenzintensitäten der intrazellulären Konzentration der Substanzen.

Die Versuche werden nach 3.2.2 durchgeführt, die Ergebnisse werden in Tab. 4 und in Abb. 15 dargestellt.

Tab. 4: Darstellung der Ergebnisse eines Evasionsversuchs mittels Durchflußzytometrie, Abhängigkeit der Fluoreszenzen (Einheit „Mean Channel Number“) von Daunorubicin und Daunoxome in drei Konzentrationen von der Inkubationszeit (in Minuten)

Zeit in min
Fluoreszenz

0

60

120

180

300

Kontrolle

1,61

1,62

1,64

1,66

1,63

Daunorubicin
1 µg/ml

17,01

18,23

18,02

19,91

18,62

Dau 5 µg/ml

77,70

73,52

70,99

71,78

69,63

Dau10 µg/ml

144,33

128,76

123,64

121,55

118,27

Daunoxome
1 µg/ml

6,89

7,30

7,40

8,99

9,08

Dx 5 µg/ml

27,63

28,60

28,73

30,63

28,82

Dx 10 µg/ml

45,72

47,01

47,17

46,98

44,32


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Abb. 15: Kurvenverlauf der Fluoreszenzintensitäten von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1 µg/ml, 5 µg/ml und 10 µg/ml in Abhängigkeit von der Zeit

Tab. 4 und Abb. 15 zeigen, dass auch der Efflux von Daunorubicin und Daunoxome große Unterschiede aufweist. Daunorubicin 10 µg/ml folgt einer biphasischen Evasion. Bis 60 min nach der zweistündigen Inkubation erfolgt der Ausstrom relativ schnell, über die weitere Versuchszeit sehr langsam. Diese biphasische Evasionskinetik ist ebenfalls bei Daunorubicin 5 µg/ml zu beobachten. Nach einem schnelleren Ausstrom in den ersten 60 min nach Inkubation folgt ein sehr langsamer Ausstrom über die verbleibende Versuchszeit. Diese Kinetik tritt bei Daunorubicin 1 µg/ml nicht mehr auf, es kommt zu einem sehr langsamen Ausstrom über die gesamte Zeit. Während bei höheren Konzentrationen Daunorubicin einen biphasischen Evasionsverlauf aufweist, verhält er sich bei niedrigen Konzentrationen monophasisch.

Es zeigt sich hier eine Konzentrationsabhängigkeit der Evasion.

Daunoxome zeigt sehr geringe Veränderungen in den Fluoreszenzintensitäten über die Zeit auf. Es kommt zu keinem signifikanten Ausstrom aus den Zellen bei 1 µg/ml, 5 µg/ml und 10 µg/ml Daunoxome. Dies bedeutet, dass die Evasionskinetik für Daunoxome in allen Konzentrationen monophasisch verläuft und nicht konzentrationsabhängig ist.

Die Inkubationszeit von zwei Stunden wird gewählt, da es zu diesem Zeitpunkt bei freiem und auch bei liposomal verkapseltem Daunorubicin zu einem ausreichenden Einstrom der Substanzen in die Zellen gekommen ist. Die Substanzen sind aber noch nicht irreversibel


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an den Kern oder an Subkompartimente gebunden, weshalb es noch zu Umverteilungsvorgängen kommen kann. Zusätzlich ist der Anteil von apoptotischen und nekrotischen Zellen gegenüber den vitalen noch niedrig, um gut verwertbare Daten zu erlangen.

4.3 Ergebnisse der mittels Durchflußzytometrie durchgeführten Versuche zur Kinetik der Apoptoseinduktion

Sowohl bei den Invasionsversuchen als auch bei den Evasionsversuchen werden mit zunehmender Versuchsdauer und höheren extrazellulären Konzentrationen beider Substanzen avitale Zellen beobachtet. Daraus ergibt sich die Frage, ob es sich um apoptotische oder nekrotische Zellen handelt. Zur Bestimmung bietet sich der Apoptoseversuch mit Zweifachfärbung durch Annexin V und PI (Propidium Iodid) an. Durch die hohe Affinität von Annexin V zu apoptotischen Zellen kann quantitativ der Prozentsatz der Zellen bestimmt werden, der apoptotisch ist, da diese Zellen Annexin V binden und PI ausschließen. Hierfür werden die Versuche aus 3.2.3 durchgeführt. Es soll dabei auch ermittelt werden, ob die durch Daunorubicin und Daunoxome verursachte Apoptose abhängig ist von der extrazellulären Konzentration und wie sich die Anzahl der apoptotischen Zellen über die Zeit verhält.

Die Ergebnisse werden in Abb. 16, Abb. 17, Abb. 18 und Abb. 19 dargestellt.


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Abb. 16: Vergleich der Apoptoseraten von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1, 5 und 10 µg/ml nach 120 min Inkubation

Abb. 17: Vergleich der Apoptoseraten von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1, 5 und 10 µg/ml nach 240 min Inkubation


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Abb. 18: Vergleich der Apoptoseraten von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1, 5 und 10 µg/ml nach 360 min Inkubation

Abb. 19: Vergleich der Apoptoseraten von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1, 5 und 10 µg/ml nach 480 min Inkubation


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Aus den Abb. 16-19 wird ersichtlich, dass auch in der Kinetik der Apoptoseinduktion Unterschiede zwischen freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin bestehen.

Bei Daunorubicin werden bereits nach 120 min ( Abb. 16 ) apoptotische Zellen nachgewiesen. Daunorubicin 10 µg/ml weist die höchste Apoptoserate auf, gefolgt von Daunorubicin 5 µg/ml. Daunorubicin 1 µg/ml weist deutlich niedrigere Werte auf als diese beiden, aber höhere Werte als Daunoxome 5 µg/ml und Daunoxome 1 µg/ml.

Daunoxome 10 µg/ml induziert nach 120 min mehr Apoptose als Daunoxome 5 µg/ml und Daunoxome 1 µg/ml, aber weniger als Daunorubicin 5 und 10 µg/ml.

Nach 240 min ( Abb. 17 ) findet bei allen Konzentrationen von Daunorubicin und Daunoxome eine deutliche Zunahme der Apoptose statt. Daunorubicin weist höhere Werte auf als Daunoxome, wobei Daunorubicin 10 µg/ml am meisten Apoptose induziert, gefolgt von Daunorubicin 5 µg/ml und Daunorubicin 1 µg/ml. Daunoxome 10 µg/ml und
5 µg/ml weisen ebenso hohe Werte auf wie Daunorubicin 1 µg/ml, dahingegen weist Daunoxome 1 µg/ml noch deutlich geringere Werte auf.

Nach 360 min ( Abb. 18 ) kommt es wieder zu einer deutlichen Zunahme der Apoptose sowohl bei Daunorubicin als auch bei Daunoxome. Die Werte aller drei Konzentrationen von Daunorubicin gleichen sich an. Es bestehen nur noch geringe Unterschiede in der Apoptoseinduktion.

Ebenfalls nehmen die Apoptoseraten von Daunoxome 10 µg/ml und 5 µg/ml stark zu und weisen keine deutliche Differenzen zu den Werten von Daunorubicin auf. Daunoxome
1 µg/ml ruft noch weniger Apoptose hervor.

Nach 480 min ( Abb. 19 ) kommt es zu einer allgemeinen Angleichung aller Apoptoseraten. Die Apoptosewerte von Daunorubicin 10 µg/ml, 5 µg/ml und 1 µg/ml gleichen sich wie schon nach 360 min beobachtet einander an.

Auch die Werte von Daunoxome in allen drei Konzentrationen gleichen sich untereinander an. Daunoxome 1 µg/ml erreicht ebenfalls deutlich höhere Werte. Insgesamt bestehen keine deutlichen Differenzen mehr zwischen der Apoptoseinduktion von Daunorubicin und Daunoxome nach 480 min.

Bei den Kontrollen kommt es über die gesamte Versuchszeit zu keiner Zunahme der Apoptoseraten, d.h. es findet keine Apoptoseinduktion statt.

Abb. 20 zeigt zusammenfassend den Verlauf des Anteils apoptotischer Zellen für Daunorubicin und Daunoxome in den drei Konzentrationen.

Wie schon in den Abbildungen 16-19 wird ersichtlich, dass Daunorubicin 10 µg/ml und Daunorubicin 5 µg/ml deutlich schneller und mehr Apoptose induzieren als Daunorubicin


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1 µg/ml und Daunoxome in allen drei Konzentrationen. Sowohl nach 120 min als auch nach 240 min liegen die Werte für Daunorubicin 10 µg/ml und 5 µg/ml höher. Daunorubicin 1 µg/ml und Daunoxome 10 µg/ml und 5 µg/ml folgen einem ähnlichen Verlauf in den ersten 240 min nach Inkubation.

Nach 360 min erreichen dann Daunorubicin 10 µg/ml, 5 µg/ml und 1 µg/ml und Daunoxome 10 µg/ml und 5 µg/ml ein gemeinsames Maximum in der Apoptoseinduktion.

Daunoxome 1 µg/ml induziert bis zu 360 min nach Inkubation deutlich weniger Apoptose als Daunorubicin und Daunoxome in allen anderen Konzentrationen, erreicht aber nach 480 min annähernd gleiche Werte wie diese.

Abb. 20: Darstellung des Verlaufs aller Apoptosewerte von Daunorubicin und Daunoxome10 µg/ml, 5 µg/ml und 1 µg/ml in einem Liniendiagramm


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4.4 Darstellung der morphologischen Veränderungen während der Apoptose anhand von Lichtmikroskopie

Obwohl die Durchflußzytometrie als das Mittel der Wahl zur Bestimmung von Apoptose angesehen ist, wird allgemein die Meinung vertreten, dass die Kombination mit der Mikroskopie die besten Ergebnisse erbringt [19,61,65]. Die einzigartig morphologischen Veränderungen der Apoptose können bildhaft dargestellt werden und unterstützen dadurch die Unterscheidung zwischen apoptotischen und anderen Zellen.

Die Versuche werden nach 3.3 durchgeführt und die Aufnahmen hier dargestellt.

Es ergeben sich keine morphologischen Veränderungen in den Kontrollpräparaten. Die entstehenden Veränderungen der Apoptose zeigen weder zwischen Daunorubicin und Daunoxome noch den einzelnen Konzentrationen (1, 5 und 10 µg/ml) der beiden Substanzen Unterschiede auf. Deshalb werden die apoptotischen Veränderungen zusammen aufgezeigt.

Abb. 4.10 zeigt eine Übersichtsaufnahme von der Kontrollgruppe mit CEM-Zellen. Es sind nur vitale Zellen zu sehen ohne Anzeichen von apoptotischen Veränderungen.

Abb. 21: Darstellung einer Übersicht von vitalen CEM-Zellen, es zeigen sich keine Anzeichen von typisch morphologischen Veränderungen während der Apoptose


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Abb. 22 zeigt eine unveränderte vitale Zelle (obere einzelne Zelle) und zwei apoptotische Zellen (zusammenstehende Zellen unten) mit klassischen morphologischen Veränderungen der frühen Phase der Apoptose.

Die apoptotischen Zellen sind deutlich kleiner als die vitale Zelle. Dies erklärt sich durch Zelldehydratation und damit verbundener Zellschrumpfung. Außerdem zeigt sich bei den apoptotischen Zellen eine Formveränderung. Der eine Kern ist leicht konkav und das Zytoplasma wirkt schmaler. Die Plasmamembranen von beiden apoptotischen Zellen sind dennoch intakt. Insgesamt scheinen diese Zellen ovaler zu sein.

Ebenfalls fällt bei den apoptotischen Zellen das kondensierte Chromatin im Kern auf. Die DNA darin ist hyperchromatisch (Kernpyknose) und deutlich stärker angefärbt als die der vitalen Zellen.

Abb. 22: Darstellung einer vitalen und zweier apoptotischer Zellen mit charakteristischen Veränderungen der Morphologie wie Zellschrumpfung, Formveränderung Kondensation des Kernchromatins, hyperchromatischer DNA und veränderter Anfärbung der Zellen


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Auf Abb. 23 sind vier Zellen abgebildet, drei vitale Zellen ohne morphologische Veränderungen und eine apoptotische Zelle (rechts außen) mit Veränderungen.

Diese Zelle lässt die Desintegration der Kernstruktur mit Karyorrhexis (Fragmentation des Kerns) erkennen. Dies führt später zur Karyolysis, der Kernauflösung. Wie in Abb. 22 schon erkennbar ist, weist der Kern auch auf diesem Bild trotz Fragmentation eine vermehrte Anfärbung gegenüber den vitalen Zellen auf. Das Zytoplasma und auch die Plasmamembran sind im Vergleich zu den vitalen Zellen ebenfalls stark verändert.

Abb. 23: Darstellung von drei vitalen Zellen und einer apoptotischen Zelle mit morphologischen Veränderungen, wie Kernfragmentation und Kernauflösung

Abb. 24 zeigt vier apoptotische Zellen. Die drei zusammenliegenden Zellen weisen wie in Abb. 22 bereits beschriebene Veränderungen auf. Zusätzlich sind einige Kernfragmente im Zytoplasma verteilt, besonders deutlich bei der Zelle links außen. Die Fragmente sind wie der Kern stark angefärbt und befinden sich homogen verteilt. Bei einer Zelle (links außen) löst sich ein „apoptotischer Körper“ am oberen Pol, siehe auch Beschreibung zu Abb. 25.


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Abb. 24: Darstellung von vier apoptotischen Zellen mit charakteristischen Veränderungen, wie stark angefärbten Kernfragmenten im Zytoplasma verteilt und Ablösung eines apoptotischen Körpers an der linken Zelle

In Abb. 25 werden zwei apoptotische Zellen dargestellt. Die obere weist morphologische Veränderungen auf, die schon zu den anderen Abbildungen erklärt worden sind.

Die untere apoptotische Zelle zeigt neben diesen Veränderungen noch die Ablösung von zwei „apoptotischen Körpern“ (apoptotic bodies). Diese beinhalten Kernfragmente und intakte Zellorganellen und werden von Fragmenten der Plasmamembran umhüllt.


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Abb. 25: Darstellung von zwei apoptotischen Zellen mit charakteristischen Veränderungen, wie der Ablösung von „apoptotischen Körpern“ bei der unteren Zelle

Die Abb. 21-25 zeigen alle charakteristische, morphologische Veränderungen während des Apoptoseprozesses. Diese bildhaften Darstellungen machen deutlich, dass wirklich Apoptose stattgefunden hat und dass die mittels Durchflußzytometrie ermittelten Daten zur Apoptose verwertbar sind.

Es zeigen sich keine Unterschiede in der Morphologie der Apoptose, die durch Daunorubicin oder Daunoxome induziert wird.


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4.5 Vergleich der intrazellulären Verteilung von Daunorubicin und Daunoxome mittels konfokaler Lasermikroskopie

Für die zelluläre Pharmakokinetik von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin ist neben Invasion und Evasion die intrazelluläre Verteilung der Substanzen von großer Bedeutung. Diese lässt sich wegen der starken Fluoreszenz Daunorubicins sehr gut mittels konfokaler Lasermikroskopie bestimmen. Um die Ergebnisse mit denen der Invasion vergleichen zu können, werden ähnliche Zeitpunkte wie bei den Invasionsversuchen ausgewählt. Die Versuche werden nach 3.5 durchgeführt.

Abb. 26 zeigt die intrazelluläre Verteilung von freiem Daunorubicin 5 µg/ml nach 1,5 h Inkubation. Es ist zu einem Einstrom der Substanz gekommen. Dies ist an beiden Zellen deutlich sichtbar. Es ist zu erkennen, dass die Kerne keine Fluoreszenz aufweisen. Sie sind als dunkle Schatten mit typischen Einschnürungen im Zentrum der Zelle zu sehen. Die Fluoreszenz befindet sich im Zytoplasma. Sie ist diffus verteilt mit teilweise lokalisierten Arealen stärkerer Fluoreszenz, die Zellorganellen (Mitochondrien, Golgi- Apparate) entsprechen könnten.

Abb. 26: Darstellung der intrazellulären Verteilung von Daunorubicin 5 µg/ml nach 1,5 h Inkubation, die Fluoreszenz befindet sich im Zytoplasma, der Kern ist frei


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Abb. 27 stellt eine Übersicht von Zellen mit der intrazellulären Verteilung von liposomal verkapseltem Daunorubicin (Daunoxome) 5 µg/ml nach 1,5 h Inkubation dar. Auch hier wird ersichtlich, dass dies zur Invasion der Substanz geführt hat.

Auf der Abbildung ist zu erkennen, dass die mit Daunoxome behandelten Zellen eine deutlich schwächere Fluoreszenz aufweisen im Vergleich zu den mit Daunorubicin behandelten Zellen ( Abb. 26 ). Auch bei diesen Zellen befindet sich die gesamte Fluoreszenz im Zytoplasma. Sie ist nicht diffus-fleckig, sondern homogen verteilt ohne stärker lokalisierte Areale wie bei Daunorubicin nach 1,5 h Inkubation.

Die Kerne sind frei von Fluoreszenz. Sie stellen sich als dunkle Areale, teilweise mit Einschnürungen, umgeben vom fluoreszierendem Zytoplasma dar.

Abb. 27: Darstellung der intrazellulären Verteilung von liposomal verkapseltem Daunorubicin (Daunoxome) 5 µg/ml nach 1,5 h Inkubation anhand multipler Zellen,bei denen sich die Fluoreszenz im Zytoplasma befindet, die Kerne sind frei


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Abb. 28 zeigt die intrazelluläre Verteilung von Daunorubicin 5 µg/ml nach 3 h Inkubation.

Bei der abgebildeten Zelle stellt sich der Kern mit seiner charakteristischen Einschnürung heller dar. Das Zytoplasma umgibt diesen als schmalen Saum und wirkt dunkler.

Daraus wird deutlich, dass es bei freiem Daunorubicin in dem Zeitraum von 1,5 h-3 h Inkubation zu einer Verschiebung der Fluoreszenz vom Zytoplasma in den Kern gekommen ist.

Die Fluoreszenz ist nur noch zu einem geringen Anteil im Zytoplasma verteilt, der größte Anteil befindet sich im Nukleus. Die Fluoreszenz ist dort sehr intensiv und verteilt sich unregelmäßig mit stärkeren und schwächeren Arealen.

Abb. 28: Darstellung der intrazellulären Verteilung von freiem Daunorubicin 5 µg/ml nach 3 h Inkubation, die Fluoreszenz verteilt sich unregelmäßig im Kern mit stärkeren und schwächeren Arealen, das Zytoplasma ist fast frei


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Auf Abb. 29 ist die Verteilung von Daunoxome 5µg/ml nach 3 h Inkubation zu betrachten. Es zeigt fünf Zellen im Kreis, mit heller abgebildeten Kernen mit Einschnürungen und dunklen Säume, die das Zytoplasma darstellen.

Es hat wie auch bei Daunorubicin nach 3 h Inkubation eine Verschiebung der Fluoreszenzintensität vom Zytoplasma in den Kern stattgefunden, wobei das Zytoplasma fast keine Fluoreszenz mehr aufweist, die Kerne dahingegen eine deutliche.

Die Fluoreszenz im Kern ist unregelmäßig verteilt, aber homogener als bei Daunorubicin nach 3 h Inkubation (siehe Abb. 28 ). Es ist auch zu erkennen, dass nach der entsprechenden Inkubationszeit die Fluoreszenz nicht so intensiv ist wie bei Daunorubicin.

Abb. 29: Darstellung der intrazellulären Verteilung von Daunoxome 5 µg/ml nach 3 h Inkubation, das Zytoplasma ist fast frei, im Kern verteilt sich die Fluoreszenz unregelmäßig


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Die Ergebnisse der intrazellulären Verteilung von Daunorubicin und Daunoxome 5 µg/ml nach 6 h Inkubation werden zusammen besprochen und anhand einer Abbildung verdeutlicht.

Abb. 30 zeigt eine Übersichtsaufnahme der Fluoreszenzverteilung von Daunorubicin nach 6 h. Auch hier sind die Kerne heller dargestellt, das Zytoplasma umgibt diese als dunkle Säume. Es ist erneut zu erkennen, dass das Zytoplasma fast frei von Fluoreszenz ist. Diese verteilt sich unregelmäßig im Kern. Im Vergleich zur Untersuchung der intrazellulären Verteilung von Daunorubicin nach 3 h Inkubation ist keine weitere Zunahme der Fluoreszenzintensität zu erkennen.

Bei Daunoxome ergibt sich ein ähnliches Bild nach 6 h Inkubation. Es befindet sich keine Fluoreszenz im Zytoplasma, die Verteilung im Kern ist unregelmäßig. Bei Daunoxome führt die längere Inkubationszeit von 6 h (im Gegensatz zu 3 h) zu einer Zunahme der Fluoreszenz im Kern.

Nach 6 h Inkubation ist auch zu erkennen, dass die Fluoreszenz von Daunoxome geringer ist als die von Daunorubicin, hier nicht bildlich dargestellt.

Abb. 30: Darstellung der intrazellulären Verteilung von Daunorubicin nach 6 h Inkubation, das Zytoplasma weist keine Fluoreszenz auf, im Kern verteilt sie sich unregelmäßig


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Abb. 31 zeigt die intrazelluläre Verteilung von Daunorubicin nach 24 h und stellvertretend für Daunoxome nach 24 h Inkubation. Es zeigt sich bei der Untersuchung, dass nur ein geringer Anteil der Zellen Vitalität aufweist. Diese Zellen weisen bei beiden Substanzen keine Fluoreszenz im Zytoplasma auf, aber eine sehr starke im Kern. Unterschiede zwischen den beiden Substanzen in der Fluoreszenzintensität existieren nicht mehr.

Abb. 31: Darstellung der intrazellulären Verteilung von Daunorubicin nach 24 h Inkubation mit sehr starker Fluoreszenz im Kern und keiner im Zytoplasma

Die Ergebnisse der Experimente zur Invasionskinetik mittels Durchflußzytometrie und der intrazellulären Verteilung mittels konfokaler Lasermikroskopie zeigen eine Übereinstimmung bezüglich der Zunahme der intrazellulären Konzentration, dargestellt als Fluoreszenzintensität.

Freies Daunorubicin verursacht schon nach 1,5 h Inkubation eine hohe intrazelluläre Fluoreszenz und erreicht nach 3 h ein Plateau. Weder nach 6 h noch nach 24 h sind weitere Änderungen erkennbar.

Bei Zellen, die mit liposomal verkapseltem Daunorubicin behandelt werden, nimmt die Fluoreszenz langsamer zu und erreicht in den ersten 6 h nach Inkubation nicht so hohe Werte wie freies Daunorubicin. Nach 24 h lassen beide Substanzen gleiche Fluoreszenzintensitäten erkennen.


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Tue Nov 19 12:41:05 2002