Bartels, Anna-Maria : Durchflußzytometrische Untersuchungen zur zellulären Pharmakokinetik von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin

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Kapitel 5. Diskussion

Das Ziel dieser Arbeit war es, anhand einer T-lymphatischen Zelllinie (CEM-Zellen) die zelluläre Pharmakokinetik von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin zu untersuchen und miteinander zu vergleichen. Außerdem wurde die Apoptoseinduktion als Parameter der Pharmakodynamik beider Substanzen untersucht.

In dieser Arbeit wurden deutliche Unterschiede der zellulären Pharmakokinetik und der Apoptoseinduktion von Daunorubicin und Daunoxome nachgewiesen. Damit können Ergebnisse, die in ähnlichen Arbeiten ebenfalls unter in vitro-Bedingungen gewonnen wurden, teilweise bestätigt werden. Die Ergebnisse der vergleichbaren Untersuchungen lassen sich wie folgt zusammenfassen.

Forssen et al. [19] untersuchten in vitro die intrazelluläre Verteilung von Daunorubicin und Daunoxome anhand von P1798 Lymphosarkomzellen mittels Lasermikroskopie. Ebenfalls ermittelten sie die Invasion der beiden Substanzen mittels Durchflußzytometrie.

Bei seinen Versuchen zu der intrazellulären Verteilung zeigte sich, dass Daunorubicin sehr rasch in den Zellen akkumulierte. Bereits nach 1,5 h Inkubation wiesen die Zellen eine intensive Fluoreszenz im Zytoplasma und eine signifikante im Kern auf. Es fanden sich teilweise fokale Areale im Zytoplasma mit intensiverer Fluoreszenz, die wahrscheinlich Zellorganellen entsprachen. Nach 3 h und zu allen weiteren Messzeitpunkten ergab sich ein deutlich homogeneres Bild. Daunoxome wies im Gegensatz dazu nach 1,5 h deutlich weniger Fluoreszenz sowohl im Zytoplasma als auch im Kern auf. Erst nach 7 h kam es zu einer kontinuierlichen Zunahme der Fluoreszenz im Kern und im weiteren Verlauf zur Angleichung der Intensität von Daunorubicin.

Die von Forssen et al. ermittelten durchflußzytometrischen Daten entsprachen diesen Ergebnissen zur intrazellulären Verteilung. Auch hier verlief die Invasion von Daunorubicin rasch. Nach einem schnellen Einstrom der Substanz wurde bereits nach kurzer Zeit ein Plateau erreicht. Bei Daunoxome kam es zu einem langsameren Einstrom. Das Plateau wurde deutlich später erreicht. Nach längerer Versuchsdauer kam es aber zur Angleichung der Fluoreszenzwerte. Es ergaben sich zwischen Daunoxome und Daunorubicin keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Fluoreszenzintensitäten.

Nagasawa et al. [18,83] untersuchten in zwei Studien in vitro die Invasion und Evasion von Daunorubicin anhand von HL60 Leukämiezellen. Sie wiesen nach, dass die Invasion zeit-, konzentrations- und temperaturabhängig war und einer Sättigungskinetik folgte. Es kam zu einem raschen, fast linearen Einstrom der Substanz und dem Erreichen eines Plateaus nach 15 min Inkubation. Die Evasion zeigte sich ebenfalls zeitabhängig. Sie


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verlief biphasisch mit einem kurzem, raschem Ausstrom, gefolgt von einem langsamen, anhaltendem.

Nagasawa et al. [18,83] nahmen an, dass das nicht freiwerdende Daunorubicin in Lysosomen akkumulierte oder im Kern fest gebunden war.

Serafino et al. [84,85] untersuchten in zwei Arbeiten die intrazelluläre Verteilung von Anthrazyklinen mittels konfokaler Lasermikroskopie und zusätzlich die morphologischen Veränderungen während der Apoptose anhand von K562 Leukämie- und Melanomzelllinien. Sie bestätigten die Apoptoseinduktion durch Anthrazykline. Ebenfalls stellten sie einen Zusammenhang zwischen der intrazellulären Akkumulation der Substanzen und der Apoptoseinduktion her.

Dabei induzierten Anthrazykline sowohl nach direkter Interaktion mit Kernstrukturen als auch nach Bindung an zytoplasmatischen Komponenten Apoptose.

Trotz dieser beschriebenen Daten und einer Vielzahl anderer über die Pharmakokinetik von Daunorubicin und Daunoxome liegen bislang noch keine Arbeiten vor, in denen alle Teilaspekte (Invasion, Evasion und intrazelluläre Verteilung) der initialen zellulären Pharmakokinetik und die Apoptoseinduktion als Parameter der Pharmakodynamik der beiden Substanzen ermittelt werden. Ebenfalls ist der direkte Vergleich all dieser Daten des freien und des liposomal verkapselten Daunorubicins noch nie durchgeführt worden. Diese Problemstellungen sind das Thema der vorliegenden Arbeit, deren Ergebnisse sich wie folgt darstellen.

5.1 Kurze zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit

Die Invasion des freien Daunorubicins erfolgt sehr rasch und annähernd linear innerhalb der ersten 120 min nach Inkubation. Es kommt bei allen Konzentrationen zu einem steilen Anstieg der Fluoreszenzen und einer schnellen Anreicherung der Substanz in den Zellen und dem Erreichen eines Plateau nach 180 min. Die Invasionskinetik verläuft gemäß der Kurve einer Sättigungskinetik, also einer negativen e-Funktion mit der maximalen Anstiegsgeschwindigkeit in den ersten 30 min nach der Inkubation.

Die intrazelluläre Anreicherung des liposomal verkapselten Daunorubicins erfolgt deutlich langsamer und weniger steil als bei freiem Daunorubicin. Die Fluoreszenzintensität gleicht sich aber über die Zeit (nach 360-540 min) an, auch wenn sowohl die Anfangsgeschwindigkeit als auch die maximale Einstromgeschwindigkeit immer niedriger bleiben als bei freiem Daunorubicin. Die Kurve dieser Invasionskinetik beschreibt einen


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sigmoiden Verlauf mit einer anfangs langsameren Einstromgeschwindigkeit und Erreichen der maximalen Geschwindigkeit nach 180 min.

Diese Beobachtungen führen zu der Annahme, dass die Invasion von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin über unterschiedliche Mechanismen ablaufen könnten. Während Daunorubicin mittels passiver Diffusion einströmt, wird Daunoxome durch Endozytose aufgenommen, wodurch die Vorgänge verlangsamt werden [12, 15, 39].

Bei beiden Substanzen sind die Invasionsvorgänge konzentrations- und zeitabhängig. Dies besagt, dass die Invasionsgeschwindigkeit mit der extrazellulären Konzentration korreliert und sich im Laufe der Inkubationszeit verändert. Je höher die extrazellulären Konzentration ist, desto schneller strömt die Substanz ein und desto höher sind die maximal erreichten Fluoreszenzintensitäten.

Die mittels konfokaler Lasermikroskopie ermittelten Daten zur intrazellulären Verteilung der beiden Substanzen unterstützen diese Ergebnisse zur Invasionskinetik. Freies Daunorubicin strömt schnell in die Zellen ein, befindet sich nach 1,5 h Inkubation zunächst im Zytoplasma, wo es diffus-fleckig verteilt vorliegt mit teilweise stärker fluoreszierenden Arealen. Nach 3 h verteilt sich dann die Fluoreszenz in den Kern. Dort verbleibt sie und nimmt über den gemessenen Zeitraum weiter an Intensität zu.

Das Verhalten des liposomal verkapselten Daunorubicins ähnelt bezüglich der Verteilung dem freien Daunorubicin. Nach 1,5 h Inkubation hält sich die Substanz im Zytoplasma auf. Hier ist sie deutlich homogener verteilt als das freie Daunorubicin nach 1,5 h. Nach 3 h ist die Fluoreszenz im Kern nachweisbar, stellt sich aber im Gegensatz zu Daunorubicin deutlich weniger ausgeprägt dar. Nach 6 h Inkubation befinden sich beide Substanzen im Nukleus. Während bei freiem Daunorubicin die längere Inkubation nicht zu einer Veränderung der Fluoreszenzintensität führt, ist bei Daunoxome eine deutliche Zunahme sichtbar. Auch nach 6 h ist die Intensität im Verhältnis zu freiem Daunorubicin noch schwächer. Nach 24 h Inkubation ist kein Unterschied zwischen den Fluoreszenzintensitäten von Daunorubicin und Daunoxome mehr nachweisbar.

Die Zunahme der Fluoreszenzintensität verläuft bei Daunoxome wie auch die Invasion deutlich langsamer als bei freiem Daunorubicin. Über einen längeren Zeitraum erreicht Daunoxome aber ebenso hohe Fluoreszenzintensitäten wie Daunorubicin.

Es zeigt sich außerdem, dass die rasche Invasion des Daunorubicins schnell zur Apoptoseinduktion führt. Nach kurzer Inkubationszeit induziert Daunorubicin in höheren extrazellulären Konzentrationen (Daunorubicin 10 µg/ml und auch Daunorubicin 5 µg/ml) Apoptose, in niedrigeren Konzentrationen allerdings weniger.


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Über einen längeren Zeitraum (nach 360 min) gleichen sich alle Apoptoseraten der unterschiedlichen Konzentrationen einander an und weisen nach 480 min Inkubation kaum noch Unterschiede auf.

Im Gegensatz zu Daunorubicin erfolgt die Apoptoseinduktion bei Daunoxome deutlich verzögert. Aber auch hier ist erkennbar, dass höhere extrazelluläre Konzentrationen von Daunoxome (Daunoxome 10 µg/ml und 5 µg/ml) anfangs deutlich vermehrt zur Apoptoseinduktion führen als niedrige Konzentrationen. Über die Zeit erfolgt ebenfalls eine Zunahme aller Apoptoseraten. Es kommt nach einer fortdauernden Inkubation (nach 480 min) zu einer Angleichung der Apoptoseraten bei allen drei Daunoxomekonzentrationen. Ebenfalls bestehen nur noch geringe Unterschiede zu den Werten von Daunorubicin nach 480 min Inkubation.

Bei beiden Substanzen korreliert die Geschwindigkeit der Apoptoseinduktion mit der extrazellulären Konzentration. Je höher diese gewählt wird, desto schneller resultiert die Apoptoseinduktion.

Die entstehenden morphologischen Veränderungen, verursacht durch freies und liposomal verkapseltes Daunorubicin während der Apoptose, lassen sich lichtmikroskopisch nachweisen. Diese gestalten sich unabhängig von Substanz, Konzentration und Inkubationszeit immer gleich.

Wie bei der Invasion, der intrazellulären Verteilung und der Apoptoseinduktion deutlich wird, kommt es bei Daunoxome im Vergleich zu Daunorubicin initial zu verzögerten pharmakodynamischen Effekten. Die langsamere Invasion führt zu einer deutlich verzögerten Apoptoseinduktion. Eine längere Exposition (bei dieser Arbeit mindestens 360 bis 540 min) mit Daunoxome führt dann aber zu einer Angleichung der maximal erreichten intrazellulären Konzentrationen und der Apoptoseraten des liposomalen Daunorubicins an die des freien Daunorubicins.

Die Evasion der beiden Substanzen unterscheidet sich grundlegend voneinander. Bei freiem Daunorubicin verläuft sie biphasisch. Es kommt innerhalb der ersten 60 min nach Inkubation zu einem schnellen Ausstrom, gefolgt von einem sehr langsamen über die restliche Versuchszeit. Dies trifft für die hohen extrazellulären Konzentrationen zu. Die niedrige Konzentration verhält sich eher wie das liposomale Daunorubicin. Dies weist darauf hin, dass auch die Evasion konzentrations- und zeitabhängig ist.

Liposomal verkapseltes Daunorubicin weist eine monophasische Evasion auf. Es strömt über die gesamte Versuchszeit sehr wenig bis gar kein Daunoxome aus den Zellen aus. Dies trifft für alle Konzentrationen zu. Hier ergibt sich weder eine Konzentrations- noch eine Zeitabhängigkeit.


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Es kann vermutet werden, dass sich freies Daunorubicin in zwei unterschiedlichen Kompartimenten verteilt (2-Kompartiment-System) und auch aus zwei Kompartimenten ausströmt. Nur das noch nicht gebundene (Zytosol) Daunorubicin kann die Zellen noch verlassen, das gebundene (Kern oder Zellorganellen, intrazelluläre Subkompartimente) dahingegen nicht (siehe auch Abb. 32 ).

Im Gegensatz dazu scheint sich Daunoxome in einem 1-Kompartiment-System zu verteilen. Offenbar strömt liposomal verkapseltes Daunorubicin zwar langsamer in die Zellen ein, wird dann aber fester gebunden (Zellmembran, Zellorganellen, Kern) oder liegt noch verpackt in Liposomen vor, die den Efflux verhindern. Somit strömt Daunoxome sehr langsam oder gar nicht aus den Zellen aus.

Abb. 32: Schematische Darstellung zweier Kompartimente mit der Verteilung von gebundenen und freien Substanzkonzentrationen [aus Forth, [3]], dieses Modell stellt die Verteilung von freiem Daunorubicin dar

5.2 Diskussion der Ergebnisse zur Invasionskinetik

Wie aber verhalten sich diese Ergebnisse zu denen anderer Autoren? Wo bestehen Übereinstimmungen und wo Widersprüche? Wie lassen sich diese erklären?

Wie oben bereits beschrieben, untersuchten Nagasawa et al. [18,83] in zwei Studien die Invasion von Daunorubicin anhand von Leukämiezellen. Wie in der vorliegenden Arbeit folgte diese einer Sättigungskinetik mit einem anfangs raschen Einstrom. Die dabei ermittelten Zeiten der Gleichgewichtseinstellung lagen allerdings deutlich unter denen, die in dieser Arbeit nachgewiesen wurden. Während bei Nagasawa et al. [18,83] nach 15 min ein Plateau erreicht wurde, dauerte dies in der vorliegenden Arbeit 180 min. Dies


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lässt sich möglicherweise durch die Wahl unterschiedlicher Zellen (HL60 versus CEM-Zellen) und deren unterschiedliches Verhalten erklären. Ebenfalls könnte die Wahl der unterschiedlichen Methodik (Durchflußzytometer versus High Performance Liquid Chromatography) eine Rolle spielen.

Sowohl Nagasawa et al. [18,83] als auch diese Arbeit wiesen eine Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit nach. Dies bestätigte sich durch die Ermittlung der maximalen Einstromgeschwindigkeit. In beiden Arbeiten zeigte sich eine annähernd lineare Beziehung zwischen der extrazellulären Konzentration Daunorubicins und des initialen Einstroms, je höher diese Konzentration, desto höher die maximale Einstromgeschwindigkeit (siehe auch Abb. 33, Daten dieser Arbeit).

Abb. 33: Kurvenverlauf der maximalen Einstromgeschwindigkeit von Daunorubicin und Daunoxome in drei Konzentrationen (1 µg/ml, 5 µg/ml und 10 µg/ml)

Anhand dieser Graphik wird deutlich, dass auch bei Daunoxome ein linearer Zusammenhang zwischen der extrazellulären Konzentration und der Einstromgeschwindigkeit besteht. Es werden allerdings in keiner Konzentration die maximalen Einstromgeschwindigkeiten von Daunorubicin erreicht. Ebenfalls wird ersichtlich, dass freies und liposomal verkapseltes Daunorubicin unterschiedliche Steigungen und damit verschiedene Invasionskonstanten aufweisen, wobei Daunoxome eine niedrigere Invasionskonstante als Daunorubicin besitzt.

Leider führten Nagasawa et al. [18,83] keine Untersuchungen durch, um die Invasion und die Einstromgeschwindigkeit von Daunorubicin und Daunoxome direkt miteinander zu vergleichen.

McGown et al. [72] untersuchten ebenfalls die Invasion von Daunorubicin. Sie ermittelten die intrazelluläre Akkumulation von Daunorubicin mittels Durchflußzytometrie anhand von P388-Leukämiezellen und Fluorometrie nach Substanzextraktion. Übereinstimmend mit


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den anderen Arbeiten zeigte sich, dass der initiale Einstrom von Daunorubicin sehr rasch verläuft und nach

1-2 Stunden komplett war. Auch hier wurde das Plateau früher erreicht als in dieser Arbeit aber doch deutlich später als bei Nagasawa et al. [18,83], was sich erneut durch die unterschiedlichen Zelllinien und die unterschiedliche Methodik erklären lassen könnte. Wie auch in der vorliegenden Arbeit nach 540 min kam es bei McGown et al. [72] nach längerer Versuchsdauer zu einem Abfall der Fluoreszenzintensitäten im Kurvenverlauf (siehe Abb. 12). Dieser wurde durch Zellruption erklärt, die durch mikroskopische Aufnahmen bestätigt wurde. Es kam jedoch im Gegensatz zu dieser Arbeit zu keiner genauen Spezifizierung, ob es sich um apoptotische oder nekrotische Zellen handelte.

Anders die bereits beschriebene Arbeit von Forssen et al. [19], welche den direkten Vergleich der Invasion von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin anhand von Lymphosarkomzellen zum Gegenstand hatte. Daunorubicin strömte sehr schnell in die Zellen ein und erreichte nach 7 h das Plateau. Dies ähnelt den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit. Das Erreichen des Plateaus dauert zwar länger, doch handelt es sich auch um eine solide Tumorzelllinie und nicht um eine hämatologische. Aus diesem Grund können insgesamt die Versuchszeiten länger gewählt werden, da die Lymphosarkomzellen nicht so stark zu Apoptose neigen wie die in dieser Arbeit verwendeten CEM-Zellen. Forssen et al. [19] beobachteten, dass Daunoxome deutlich langsamer in den Zellen akkumulierte und erst nach 20 h das Plateau erreichte. Nach 14-20 h konnten dann keine signifikanten Unterschiede zwischen den Fluoreszenzintensitäten von Daunorubicin und Daunoxome festgestellt werden. Diese Ergebnisse unterstützen die der vorliegenden Arbeit, in der Daunoxome anfangs ebenfalls deutlich langsamer akkumuliert, über eine längere Versuchsdauer aber ähnlich hohe Fluoreszenzintensitäten erreicht wie Daunorubicin. Im Gegensatz zu der vorliegenden Arbeit konnten Forssen et al. [19] aber nicht nur eine Angleichung der Invasionskinetik der beiden Substanzen nachweisen, sondern eine verbesserte Kinetik von Daunoxome nach ausreichend langer Versuchszeit.

Forssen et al. [19] leiteten aus ihren Beobachtungen die Schlussfolgerung ab, dass freies Daunorubicin nach kurzer Inkubation durch einen schnelleren Invasionsmechanismus zytotoxischer wirkte als liposomal verkapseltes. Nach einer Inkubation von 48 h sei dann aber Daunoxome deutlich potenter als Daunorubicin.

Ähnlich sind auch die Ergebnisse von Sargent et al. [42] zu werten. Hier wurden K562-Leukämiezellen über einen Zeitraum von 96 h mit Daunorubicin oder Daunoxome inkubiert. Sie zeigten, dass nach 1 h Inkubation freies Daunorubicin die Zellen deutlich mehr invadiert hatte und höhere zytotoxische Effekte als liposomal verkapseltes


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Daunorubicin aufwies. Nach 7 h kam es zu einer Umkehr, Daunoxome war deutlich zytotoxischer und dies nahm über die weitere Versuchszeit noch zu.

Im Gegensatz dazu fanden Pratt et al. [49] heraus, dass freies Daunorubicin die Zellproliferation mehr inhibierte als liposomal verkapseltes. Auch nach einer Inkubationszeit von 24-42 h kam es zu keiner Umkehrung dieser Effekte. Dies erklärten sie mit der liposomalen Verkapselung, wodurch die Freisetzung der Wirksubstanz Daunorubicin verlängert werden sollte. Sie untersuchten die Wirkung von Daunorubicin und Daunoxome anhand von vier Zelllinien, zwei Myelom-, eine Glioblastom- und eine Lymphomzelllinie.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stimmen in sofern mit den anderen Ergebnissen überein, dass initial die Invasion von freiem Daunorubicin deutlich schneller abläuft als die des liposomal verkapselten und es von daher zu Anfang eine höhere Zytotoxizität aufweist. Ebenfalls wird die maximale intrazelluläre Konzentration früher erreicht. Daunoxome weist eine deutlich langsamere Invasionsgeschwindigkeit auf und akkumuliert deshalb verzögert. In dem gewählten Messzeitraum kommt es zwar zu einer Angleichung der Fluoreszenzintensitäten und damit der intrazellulären Konzentration von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin, Daunoxome erreicht aber kein Plateau. Da aber Daunoxome im Gegensatz zu Daunorubicin ein besseres plasmapharmakokinetisches Profil aufweist [19,44,45,47,86] mit verlängerter Halbwertzeit und erniedrigter Totalkörperclearance und deutlich weniger Nebenwirkungen als Daunorubicin [41,49,87] scheint Daunoxome trotz anderer zellulärer Pharmakokinetik mindestens genauso wirksam zu sein wie Daunorubicin.

An dieser Stelle soll auch die unterschiedliche Verlaufsform der Invasionskinetik von Daunorubicin und Daunoxome besprochen werden. Wie oben bereits erwähnt, folgt Daunorubicin einer Sättigungskinetik (negative e-Funktion) während Daunoxome einen sigmoiden Invasionsverlauf aufweist. Für diese sigmoide Form scheinen mehrere Erklärungen in Frage zu kommen. Zuerst könnte es sich um einen Quencheffekt handeln, dieser wird unter 5.5 näher erläutert. Ebenfalls könnte es sich um einen 2-Phasen Prozess handeln, wobei in einer ersten Phase Daunoxome locker an die Zellmembran gebunden vorliegt. Durch das Waschen der Proben vor den einzelnen Messungen, werden diese von der Zellmembran entfernt und dadurch können kaum Fluoreszenzen registriert werden. Nach längerer Exposition kommt es in einer zweiten Phase dann zum Einstrom der Substanz in die Zellen, und zum raschen Anstieg der Fluoreszenzintensität.

Die Untersuchungen zur intrazellulären Verteilung mittels konfokaler Lasermikroskopie unterstützen die Aussagen zur Invasionskinetik, die anhand von der Durchflußzytometrie ermittelt wurden. Freies Daunorubicin strömt schnell in die Zellen ein und verteilt sich


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nach 3 h Inkubation vom Zytoplasma in den Kern um. Die Fluoreszenz ist schon nach dieser Inkubationszeit sehr intensiv und nimmt über die restliche Versuchszeit nur noch gering zu. Liposomal verkapseltes Daunorubicin verteilt sich ebenfalls nach 3 h Inkubation vom Zytoplasma in den Kern um, nimmt aber nach weiterer Inkubation noch an Intensität zu. Nach 24 h bestehen zwischen den beiden Substanzen keine Unterschiede mehr in den Fluoreszenzintensitäten.

Auch die Arbeiten von Forssen et al. [19] belegten, dass freies Daunorubicin zu Anfang eine höhere Fluoreszenzintensität aufwies als liposomal verkapseltes. Eine anhaltende Inkubation führte dann im weiteren Verlauf zu einer Angleichung der Intensitäten von Daunoxome an Daunorubicin. Im Gegensatz zu der vorliegenden Arbeit ermittelten Forssen et al. [19], dass die Umverteilung von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin vom Zytoplasma in den Kern bereits nach 1,5 h Inkubation nachzuweisen war. Grund dafür könnte ebenfalls die Wahl der unterschiedlichen Zelllinien darstellen. Dafür könnten auch Ergebnisse einer Arbeit von

Lautier et al. [88] sprechen. Sie untersuchten die intrazelluläre Verteilung von Daunorubicin anhand unterschiedlicher hämatologischer Zelllinien. Sie fanden heraus, dass einige Zelllinien nach 1 h Inkubation mit Daunorubicin ein Fluoreszenzmuster aufwiesen, bei dem die Substanz hauptsächlich im Kern und diffus im Zytoplasma verteilt war. Bei anderen Zelllinien mit den selben Vorraussetzungen zeigte sich nur wenig Fluoreszenz im Kern und im Zytoplasma, dafür vermehrt perinukleär. Dies zeigt das unterschiedliche Verhalten verschiedener Zelllinien an trotz gleicher Ausgangsbedingungen.

Diese Ergebnisse sprechen ebenfalls dafür, dass die intrazelluläre Akkumulation von freiem Daunorubicin schneller verläuft als die des liposomal verkapselten. Eine längere Versuchsdauer und damit eine längere Expositionszeit mit Daunoxome führt dann aber zu einer Angleichung der intrazellulären Konzentration (Fluoreszenzintensität).


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5.3 Diskussion der Ergebnisse zur Apoptoseinduktion

Ein anderer interessanter Aspekt ist der Zusammenhang zwischen Invasion, intrazellulärer Akkumulation, und der Apoptoseinduktion von Daunorubicin und Daunoxome. Es ist bekannt, dass Anthrazykline durch DNA-Interkalation und Hemmung der Topoisomerase II Apoptose induzieren. Dies stellt einen wichtigen Wirkmechanismus von Anthrazyklinen dar [12]. Es stellt sich allerdings die Frage, inwieweit dies mit der intrazellulären Akkumulation korreliert.

Wie bereits beschrieben, wurde dieser Zusammenhang von Serafino et al. [84,85] in zwei Arbeiten untersucht. Sie bestätigten mittels konfokaler Lasermikroskopie und Durchflußzytometrie, dass Anthrazykline Apoptose induzieren. Sie fanden heraus, dass dies sowohl bei Bindung an Kern- wie auch an Zytoplasmastrukturen auftreten kann.

Auch in dieser Arbeit kann ein deutlicher Zusammenhang zwischen der Invasion, der intrazellulären Akkumulation und der Apoptoseinduktion beobachtet werden. Daunorubicin strömt sehr schnell in die Zellen ein und ist nach 1,5 h im Zytoplasma und nach 3 h im Kern nachweisbar. Ebenfalls ist die Apoptose schon nach 2 h mittels Durchflußzytometrie und Lichtmikroskopie deutlich zu erkennen. Diese nimmt, wie auch die intrazelluläre Akkumulation von Daunorubicin, während des weiteren Verlaufs noch zu. Im Gegensatz dazu strömt Daunoxome langsamer in die Zellen ein. Auch die intrazelluläre Akkumulation verläuft nicht so rasch. Es kommt zu einer allmählichen Zunahme der Fluoreszenzintensität. Auch induziert Daunoxome zunächst weniger Apoptose als Daunorubicin. Eine längere Expositionszeit führt allerdings sowohl zu einer Zunahme der intrazellulären Akkumulation als auch zu einer Zunahme der Apoptoseraten. Nach 480 min bestehen kaum noch Unterschiede in der Apoptoseinduktion von Daunorubicin und Daunoxome.

Sowohl freies als auch liposomal verkapseltes Daunorubicin induzieren bereits nach 2 Stunden Exposition Apoptose. Zu diesem Zeitpunkt können beide Substanzen nur im Zytoplasma und nicht im Zellkern nachgewiesen werden. Aus diesen Ergebnissen könnte wie auch bei Sargent et al. [42] geschlossen werden, dass neben der Bindung von Daunorubicin und Daunoxome an Kernstrukturen auch die Bindung an Zytoplasmaanteile für die Apoptoseinduktion verantwortlich sein könnte.

Die Ergebnisse von Gieseler et al. [56,57] und Chiodini et al. [89] bestätigen diese Annahmen. Gieseler et al. [56,57] untersuchten den Zusammenhang zwischen intrazellulärer Verteilung, DNA-Interkalation und Apoptoseinduktion von Daunorubicin anhand von HL-60 Leukämiezellen. Sie beobachteten die intrazelluläre Akkumulation von Daunorubicin und DNA-Doppelstrangbrüche nach 0-1,5 h und Chromatinkondensation


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nach 1,5-3 h. Sie wiesen eine lineare Korrelation zwischen Invasion der Substanz (DNA-Bindung) und Apoptoseinduktion nach. Dabei befanden sie die DNA-Bindung als wichtigste Vorraussetzung für die Apoptoseentstehung.

Chiodini et al. [89] hatten Untersuchungen über Invasion und Apoptoseinduktion von Daunorubicin zur Grundlage. Auch sie zogen aus ihren Beobachtungen die Schlussfolgerung, dass die Anzahl der apoptotischen Zellen mit der Substanzinvasion- bzw. Akkumulation korrelierte.

Werden alle Ergebnisse miteinander verglichen, bestehen viele Übereinstimmungen. Leider liegen außer bei dieser Arbeit keine anderen Ergebnisse zum direkten Vergleich von Invasion, intrazellulärer Verteilung und Apoptoseinduktion für Daunorubicin und Daunoxome vor.

Ein anderer Ansatzpunkt, der die Abhängigkeit der Apoptoseinduktion von der extrazellulären Konzentration der Substanzen darstellt, ist ebenfalls von Bedeutung.

Vial et al. [55] bestimmten mittels Durchflußzytometrie die Apoptoseinduktion bei U937 Leukämiezellen nach Behandlung mit Daunorubicin in verschiedenen extrazellulären Konzentrationen. Sie fanden heraus, dass Daunorubicin Apoptose induziert. Besonders effizient war diese bei Behandlung mit hohen Anthrazyklinkonzentrationen über eine kurze Inkubationszeit (in der Studie 1 h). Dies bedeutet, je höher die extrazelluläre Konzentration gewählt wurde, desto schneller führte dies zu vermehrter Apoptoseinduktion.

Die Ergebnisse werden durch diese Arbeit bestätigt. Es zeigt sich anfangs eine deutliche Konzentrationsabhängigkeit. Die hohen Konzentrationen Daunorubicins induzieren im Gegensatz zu den niedrigen Konzentrationen in den ersten Stunden nach Inkubation vermehrt Apoptose. Eine längere Exposition mit Daunorubicin führt allerdings zu einer Angleichung der Apoptoseinduktion durch alle Konzentrationen.

Auch bei Daunoxome zeigt sich dies. Die hohen extrazellulären Konzentrationen bewirken anfangs vermehrt Apoptoseinduktion im Vergleich zu den niedrigeren. Eine längere Inkubationszeit führt ebenfalls zur Angleichung aller Apoptoseraten der unterschiedlichen extrazellulären Konzentrationen.

Das Fazit aus allen Ergebnissen lautet demnach, dass die frühe Pharmakokinetik von freiem Daunorubicin gegenüber der des liposomal verkapselten Vorteile aufweist. Es strömt sehr schnell in die Zellen ein und liegt intrazellulär bereits nach kurzer Inkubationszeit gehäuft im Kern vor. Dadurch wird auch sehr rasch Apoptose induziert, besonders durch die höheren extrazellulären Konzentrationen.


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Das liposomal verkapselte Daunorubicin strömt langsamer in die Zellen, akkumuliert intrazellulär verzögert und führt aus diesem Grund zu einer verzögerten Apoptoseinduktion. Diese Unterschiede werden allerdings nach längerer Exposition mit der Substanz aufgehoben, Daunoxome erreicht verspätet dieselben pharmakokinetischen Effekte wie Daunorubicin und weist dadurch keine Nachteile mehr auf.

Dies bedeutet, dass die Geschwindigkeit der Apoptoseinduktion von Daunorubicin und Daunoxome unterschiedlich ist, die Apoptoseraten aber nach längerer Exposition gleich sind.

5.4 Diskussion der Ergebnisse zur Evasionskinetik

Wie oben bereits erläutert, ermittelten sowohl Nagasawa et al. [18,83] und auch
Robert et al. [12] für freies Daunorubicin eine biphasische Evasion mit einem schnellen Ausstrom, gefolgt von einem länger anhaltenden langsamen. Sie beschrieben, dass sich Daunorubicin mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten auf zwei Kompartimente verteilt (offenes 2-Kompartiment-System). Die Elimination aus diesen unterschiedlichen Kompartimenten gehorcht einer Kinetik 1.Ordnung.

Diese Daten unterstützen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, in der ebenfalls eine biphasische Evasion ermittelt wurde. Auch hier folgt einem schnellen anfänglichen ein langsamer Ausstrom über die restliche Versuchszeit. Siehe hierzu auch 5.1 und zur bildlichen Darstellung Abb. 32 .

Die Evasionskinetik für Daunoxome ist nicht so zu interpretieren, und es kann nur relativ wenig ausgesagt werden. Die sehr langsame Evasion deutet auf eine feste intrazelluläre Bindung hin, mehr locker gebundenes Daunoxome scheint offenbar nicht zu bestehen. Dies lässt im Gegensatz zu freiem Daunorubicin ein 1-Kompartiment-Modell vermuten.

Diese Evasionskinetik könnte ebenfalls darauf hinweisen, dass liposomal verkapseltes Daunorubicin besser in den Zellen festgehalten werden könnte als freies Daunorubicin.

Leider liegen zur Zeit neben Daten der vorliegenden Arbeit keine anderen Daten zur zellulären Pharmakokinetik von Daunoxome vor. Daneben gibt es nur Daten zur Evasion der Plasmapharmakokinetik.


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5.5 Diskussion methodischer Probleme

Außer diesen Ergebnissen sind ebenfalls methodische Probleme von Interesse, die die Messungen der Konzentrationen von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin beeinflussen könnten. Ebenfalls interessiert, mit welchen anderen Methoden die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit verifiziert oder sogar erweitert werden könnten.

Zuerst soll bedacht werden, dass die liposomale Verkapselung von Daunorubicin zu Quencheffekten führen könnte. Dies würde bedeuten, dass zu niedrige Fluoreszenzen im Verhältnis zur tatsächlich vorhandenen Gesamtkonzentration des Daunorubicins erfasst werden. Es könnten nur das freie und das DNA-gebundene Daunorubicin richtig gemessen werden, das noch liposomal verkapselte dahingegen nicht.

Der Quencheffekt könnte eine mögliche Erklärung des sigmoiden Verlaufs der Invasion von Daunoxome darstellen. Die Kinetik könnte dadurch zustande kommen, dass Daunoxome in die Zellen aufgenommen wird, aber nur verzögert freigesetzt wird und deshalb erst ein langsamer Anstieg der Fluoreszenz erfolgt (I. Phase). In einer II. Phase wird Daunorubicin dann aus den Liposomen freigesetzt, wodurch die Fluoreszenz stärker ansteigt und sich nach und nach an die maximale Fluoreszenz des freien Daunorubicins angleicht. Dies könnte ebenfalls die verzögerte Apoptose, verursacht durch Daunoxome, erklären.

Dagegen spricht allerdings, dass bei den Versuchen zur Evasion von Daunoxome nach zwei Stunden Inkubation und Mediumwechsel die gemessene Fluoreszenz konstant bleibt und es nicht zu einem Anstieg dieser kommt. Dies wäre zu erwarten, wenn Daunorubicin intrazellulär verzögert aus den Liposomen freigesetzt wird.

Aus diesen Gründen wird angenommen, dass ein relevanter Quencheffekt, der die Ergebnisse beeinflussen könnte, unwahrscheinlich ist. Damit scheint ein anderer Prozess für das Entstehen der sigmoiden Form der Invasionskurve, welche vorher schon erläutert wurden, von Daunoxome verantwortlich zu sein.

Ein anderes Problem stellt die Wahl der Zeiträume dar, in der die Invasionsversuche durchgeführt werden. Da Daunoxome in den festgelegten Zeiträumen kein Plateau erreicht, wäre es sinnvoll, längere Versuchszeiten zu wählen. Dies ist bei CEM-Zellen, die ideal für Untersuchungen zur Apoptoseinduktion und zur zellulären Pharmakokinetik geeignet sind, nicht möglich, da sie sehr stark zu Apoptoseinduktionen neigen. Durch die zunehmende Anzahl von apoptotischen und nekrotischen Zellen bei längerer Versuchsdauer werden weitere aussagekräftige Messungen unmöglich gemacht. Da aber in dieser Arbeit vornehmlich die initiale zelluläre Pharmakokinetik untersucht wird und


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dafür in den gewählten Versuchszeiten sehr gute Ergebnisse erzielt werden, ist auch dies von untergeordneter Bedeutung.

Andere Autoren beobachteten allerdings nach einer längeren Versuchszeit eine Umkehr der Zytotoxizität bei Exposition mit freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin. Nach einer anfänglich besseren zellulären Pharmakokinetik mit höherer Zytotoxizität von Daunorubicin gegenüber Daunoxome kam es nach längeren Versuchszeiten zu einer Angleichung dieser und schließlich zum Nachweis, dass Daunoxome deutlich potenter zu sein scheint als Daunorubicin. Dahingegen konnte in der vorliegenden Arbeit bei der kürzeren Versuchszeit nur eine Angleichung und keine Umkehr der Pharmakokinetik- und dynamik nachgewiesen werden. Zur Klärung dieser Differenzen sollten weitere Versuche anhand von anderen hämatopoetischen Zelllinien über einen längeren Versuchszeitraum angeschlossen werden.

Zusätzlich soll die Wahl der Methodik kurz erörtert werden. Das Durchflußzytometer, besonders in Kombination mit der Mikroskopie, stellt für Untersuchungen zur Apoptose und zur Pharmakokinetik das Instrument der Wahl dar, was durch verschiedene Autoren wie Nooter et al. [90], Durand et al. [91] und Maciorowski et al. [92] bestätigt wird. Das Durchflußzytometer macht einen hohen Analysedurchfluß in geringer Zeit möglich und liefert eine große Anzahl quantitativer Daten auf zellulärer Ebene. Die Fluoreszenz einzelner Zellpopulationen kann erfasst werden und statistisch ausgewertet werden. Aus diesen Gründen wurde für die vorliegende Arbeit die Durchflußzytometrie in Kombination mit konfokaler Lasermikroskopie und Lichtmikroskopie gewählt.

Alternativ dazu könnte die HPLC (High Performance Liquid Chromatography) genutzt werden. Es ist eine aufwendige Methode, die eines großen Zeitaufwandes bedarf. Hierbei kann kein Unterschied zwischen einzelnen Zellpopulationen, also keine Abgrenzung von apoptotischen Zellen, aufgezeigt werden, da die intrazelluläre Konzentration nach Destruktion der Zellen bestimmt wird. Dies wäre für die Untersuchungen dieser Arbeit von Nachteil. Der Vorteil der HPLC liegt jedoch darin, dass tatsächliche Konzentrationen gemessen werden und nicht nur Fluoreszenzintensitäten. Dadurch können Quencheffekte von anderen Effekten, die die Fluoreszenz beeinflussen können, eliminiert werden. Deshalb ist es eine Methode, mit der die ermittelten Daten verifiziert werden können.

Die zelluläre Pharmakokinetik stellt einen wichtigen Aspekt für die Wirksamkeit aller Substanzen dar. Es sind aber auch andere Aspekte sehr wichtig, um die volle Wirksamkeit von Daunorubicin und Daunoxome ausnutzen zu können. Deshalb sollte zusätzlich zu den in vitro Untersuchungen dieser Arbeit über die zelluläre Pharmakokinetik in vivo-Untersuchungen angeschlossen werden. Besonders interessiert


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hierbei die Plasmapharmakokinetik in Verbindung mit der zellulären Pharmakokinetik von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin.

Dabei sollten die Daten zur Kinetik im Zusammenhang mit der Pharmakodynamik und mit klinischen Merkmalen betrachtet werden, um den Vergleich von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin zu vervollständigen.

5.6 Klinisch-Pharmakologische Bedeutung der vorliegenden Arbeit und Ausblick

Als letztes stellt sich nun die Frage, was die ermittelten Daten klinisch pharmakologisch zu bedeuten haben. Wie oben bereits erläutert, verlaufen die Invasion und die intrazelluläre Akkumulation des liposomal verkapselten Daunorubicins im Gegensatz zu freiem Daunorubicin zu Anfang deutlich verlangsamt, wodurch offenbar auch verzögert Apoptose induziert wird. Es ist sehr interessant, dass in dem vorliegenden Tumormodell aufgezeigt wurde, dass dafür unterschiedliche Invasionsmechanismen verantwortlich sein könnten. Während freies Daunorubicin mittels passiver Diffusion in die Zellen einströmt, wird liposomal verkapseltes Daunorubicin durch Endozytose aufgenommen. Es scheint, dass diese in zwei Phasen abläuft. Daunoxome geht in einer ersten Phase zunächst lockere Bindungen mit der Zellmembran ein, bevor es in einer zweiten Phase in die Zellen einströmt. Dies könnte auch den verlangsamten Verlauf der Invasion, das spätere Erreichen der maximalen intrazellulären Konzentrationen und die verzögerte Apoptoseinduktion erklären.

Um diese anfänglich langsameren Effekte auszugleichen, ist für das liposomal verkapselte Daunorubicin eine längere Einwirkdauer der entscheidende Parameter für die zelluläre Kinetik. Da Daunoxome eine längere Halbwertzeit besitzt als Daunorubicin und auch im Serum sehr stabil ist, scheint die längere Expositionszeit in vivo gegeben zu sein. Dadurch dürfte liposomal verkapseltes Daunorubicin trotz anderer Invasionskinetik keine verminderte Wirksamkeit zu freiem Daunorubicin aufweisen.

Wie oben bereits erwähnt, verläuft auch die Evasionskinetik von Daunorubicin und Daunoxome andersartig. Die sehr langsame Evasion von Daunoxome könnte darauf hinweisen, dass länger anhaltende intrazelluläre Konzentrationen erreichbar sind. Auch dies scheint sehr günstig zu sein.

Andere Arbeiten beschreiben anhand verschiedener Tumormodelle allerdings eine deutlich verbesserte Wirkung von liposomal verkapseltem Daunorubicin gegenüber freiem. Deshalb sollte durch gezielte weitere Untersuchungen geklärt werden, ob die Wirksamkeit der beiden Substanzen sich nur angleicht oder ob Daunoxome Daunorubicin tatsächlich überlegen ist. Dafür könnten sich klinische Phase III Studien anbieten, in


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denen insbesondere Patienten mit refraktären Leukämien von Interesse sind, die häufig P-Glykoprotein exponieren. Damit könnte auch geklärt werden, ob der zweiphasige Endozytoseprozess als pharmakokinetisch relevanter Aufnahmemechanismus von Daunoxome eine Rolle bei der Resistenzüberwindung spielen könnte.

Solche Studien wären mit dem vorliegenden zellulären Tumormodell vergleichbar, liegen zur Zeit aber noch nicht vor.

Mittlerweile existieren allerdings schon neuere liposomal verkapselte Substanzen (z.B. Caelyx), die noch längere Halbwertzeiten aufweisen als Daunoxome. Diese könnten günstigere pharmakokinetische Daten als Daunoxome aufweisen und sollten deshalb auch in weitere Untersuchungen mit eingeschlossen werden.

Anhand der Daten der vorliegenden Arbeit kann zusammenfassend gesagt werden, dass liposomal verkapseltes Daunorubicin langsamer in die Zellen einströmt. Nach längerer Exposition können jedoch keine Unterschiede in der maximal erreichten intrazellulären Konzentration und in der Apoptoseinduktion im Vergleich zu freiem Daunorubicin nachgewiesen werden. Ebenfalls strömt das intrazellulär akkumulierte Daunoxome vermindert aus den Zellen aus. Von daher gestaltet sich die Wirksamkeit des liposomal verkapseltem Daunorubicins auf zellulärer Ebene als mindestens genauso gut.

Da die zelluläre Pharmakokinetik einen wichtigen Baustein für die Wirkmechanismen darstellt, kann gefolgert werden, dass die vorliegende Arbeit einen Beitrag zur Aufklärung der Wirksamkeit von Daunorubicin und Daunoxome geliefert hat.


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Tue Nov 19 12:41:05 2002