Bartels, Anna-Maria : Durchflußzytometrische Untersuchungen zur zellulären Pharmakokinetik von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin

Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik Abt. Onkologie und Hämatologie
der Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin


DISSERTATION
Durchflußzytometrische Untersuchungen zur zellulären Pharmakokinetik von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

Vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Von
Anna-Maria Bartels,
geb. Hoffmann
aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. J.W.Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. Possinger
2. PD. Dr. med. Späth-Schwalbe
3. PD. Dr. med. Brockmann

Datum der Promotion: 04. Juli 2002


Seiten: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [82] [83] [84]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteDurchflußzytometrische Untersuchungen zur zellulären Pharmakokinetik von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin
Widmung
1 Einleitung
1.1Aufbau, Metabolismus, Wirkung und Pharmakologie des Daunorubicins
1.2Aufbau, Metabolismus, Wirkung und Pharmakologie des Dauno-
rubicins
1.3Entwicklung, Aufbau und Pharmakologie des liposomal verkapselten Daunorubicins
1.4Pharmakologische Bedeutung der Apoptose
2 Aufgabenstellung
3 Material und Methode
3.1CCRF-CEM Zellen als in vitro-Modell
3.2Versuchsreihen
3.2.1Durchführung der Invasionsversuche
3.2.2Durchführung der Evasionsversuche
3.2.3Durchführung der Apoptoseversuche
3.3Nachweis morphologischer Veränderungen während der Apoptose mittels Lichtmikroskopie
3.4Nachweis morphologischer Veränderungen während der Apoptose mittels Lichtmikroskopie
3.4.1Aufbau und Funktionsweise eines Durchflußzytometers
3.4.2Probenmessung und Datenauswertung
3.5Bestimmung der intrazellulären Verteilung mittels konfokaler Lasermikroskopie
3.5.1Aufbau und Funktionsweise eines konfokalen Lasermikroskops
4 Ergebnisse
4.1Ergebnisse der mittels Durchflußzytometrie durchgeführten Versuche zur Invasionskinetik
4.2Ergebnisse der mittels Durchflußzytometrie durchgeführten Versuche zur Evasionskinetik
4.3Ergebnisse der mittels Durchflußzytometrie durchgeführten Versuche zur Kinetik der Apoptoseinduktion
4.4Darstellung der morphologischen Veränderungen während der Apoptose anhand von Lichtmikroskopie
4.5Vergleich der intrazellulären Verteilung von Daunorubicin und Daunoxome mittels konfokaler Lasermikroskopie
5 Diskussion
5.1Kurze zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit
5.2Diskussion der Ergebnisse zur Invasionskinetik
5.3Diskussion der Ergebnisse zur Apoptoseinduktion
5.4Diskussion der Ergebnisse zur Evasionskinetik
5.5Diskussion methodischer Probleme
5.6Klinisch-Pharmakologische Bedeutung der vorliegenden Arbeit und Ausblick
6 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Danksagung
Selbständigkeitserklärung
Lebenslauf

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Darstellung der Ergebnisse eines Invasionsversuchs mittels Durchflußzytometrie, Abhängigkeit der Fluoreszenzen (Einheit“Mean Channel Number“) von Daunorubicin und Daunoxome in drei Konzentrationen von der Inkubationszeit (in min)
Tab. 2: Vergleich der Ergebnisse der V30-Bestimmung von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1 µg/ml, 5 µg/ml und 10 µg/ml anhand der Invasionsversuche
Tab. 3: Vergleich der Ergebnisse der Vmax-Bestimmung von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1 µg/ml, 5 µg/ml und 10 µg/ml anhand der Invasionsversuche
Tab. 4: Darstellung der Ergebnisse eines Evasionsversuchs mittels Durchflußzytometrie, Abhängigkeit der Fluoreszenzen (Einheit „Mean Channel Number“) von Daunorubicin und Daunoxome in drei Konzentrationen von der Inkubationszeit (in Minuten)

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Strukturformel von Daunorubicin
Abb. 2: Darstellung der Metabolisierung von Daunorubicin zu dessen Hauptmetabolit Daunorubicinol und anderen Metaboliten
Abb. 3: Darstellung der Lipiddoppelschicht und des wässrigen Kerns eines Liposom und des Einbaus von hydrophilen und lipophilen Substanzen [aus Sharma, [38]]
Abb. 4: Struktur des Daunoxome [aus NeXstar [41]]
Abb. 5: Schematische Darstellung der äußeren und inneren Membran von vitalen und apoptotischen Zellen und dem Verlust der Asymmetrie der Lipiddoppelschicht während der Apoptose und der Exposition von Phosphatidylserinen (PS, rote Kreise) auf der äußeren Membran [aus van Engeland, [52]]
Abb. 6: Schematische Darstellung der morphologischen Veränderungen während der Apoptose mit Zelldehydratation (Abnahme der Zellgröße),Chromatinkon- densation, Kernfragmentation und Bildung von apoptotischen Körpernmit Erhalt der Plasmamembranintegrität [aus Darzynkiewicz, [60]]
Abb. 7: Darstellung des optischen Systems eines Durchflußzytometers [ aus Raffael, [74]]
Abb. 8: Qualitative Darstellung von Fluoreszenzsignalen
Abb. 9: Darstellung zur Abgrenzung der vitalen Zellen im Vor-wärts/Seitwärts-Scatter und Darstellung der Häufig-keitsverteilung der Fluoreszenz im FL2-Histogramm
Abb. 10: Log Fluoreszenz Dot Plot von Annexin V und PI gefärbten CEM- Zellen, Trennung von vitalen (R1), apoptotischen (R2), und nekrotischen (R3) Zellen bei unbehandelten CEM-Zellen
Abb. 11:
Schematische Darstellung des optischen Systems eines Lasermikroskops
Abb. 12: Zunahme der Fluoreszenzintensitäten der Zelle in Abhängigkeit von der Zeit
Abb. 13: Beispiel zur Bestimmung von V30 und Vmax anhand der Kurven der Invasionskinetik von Daunorubicin und Daunoxome in drei unterschiedlichen Konzentrationen anhand der Formeln aus 3.2.
Abb. 14: Darstellung der apoptotischen (schwarz markiert) und vitalen (rot markiert) Zellen im Vorwärts/Seitwärts-Scatter bei Inkubation mit 10 µg/ml Daunorubicin im Verlauf von 0 min, 180 min und 540 min
Abb. 15: Kurvenverlauf der Fluoreszenzintensitäten von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1 µg/ml, 5 µg/ml und 10 µg/ml in Abhängigkeit von der Zeit
Abb. 16: Vergleich der Apoptoseraten von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1, 5 und 10 µg/ml nach 120 min Inkubation
Abb. 17: Vergleich der Apoptoseraten von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1, 5 und 10 µg/ml nach 240 min Inkubation
Abb. 18: Vergleich der Apoptoseraten von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1, 5 und 10 µg/ml nach 360 min Inkubation
Abb. 19: Vergleich der Apoptoseraten von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1, 5 und 10 µg/ml nach 480 min Inkubation
Abb. 20: Darstellung des Verlaufs aller Apoptosewerte von Daunorubicin und Daunoxome10 µg/ml, 5 µg/ml und 1 µg/ml in einem Liniendiagramm
Abb. 21: Darstellung einer Übersicht von vitalen CEM-Zellen, es zeigen sich keine Anzeichen von typisch morphologischen Veränderungen während der Apoptose
Abb. 22: Darstellung einer vitalen und zweier apoptotischer Zellen mit charakteristischen Veränderungen der Morphologie wie Zellschrumpfung, Formveränderung Kondensation des Kernchromatins, hyperchromatischer DNA und veränderter Anfärbung der Zellen
Abb. 23: Darstellung von drei vitalen Zellen und einer apoptotischen Zelle mit morphologischen Veränderungen, wie Kernfragmentation und Kernauflösung
Abb. 24: Darstellung von vier apoptotischen Zellen mit charakteristischen Veränderungen, wie stark angefärbten Kernfragmenten im Zytoplasma verteilt und Ablösung eines apoptotischen Körpers an der linken Zelle
Abb. 25: Darstellung von zwei apoptotischen Zellen mit charakteristischen Veränderungen, wie der Ablösung von „apoptotischen Körpern“ bei der unteren Zelle
Abb. 26: Darstellung der intrazellulären Verteilung von Daunorubicin 5 µg/ml nach 1,5 h Inkubation, die Fluoreszenz befindet sich im Zytoplasma, der Kern ist frei
Abb. 27: Darstellung der intrazellulären Verteilung von liposomal verkapseltem Daunorubicin (Daunoxome) 5 µg/ml nach 1,5 h Inkubation anhand multipler Zellen,bei denen sich die Fluoreszenz im Zytoplasma befindet, die Kerne sind frei
Abb. 28: Darstellung der intrazellulären Verteilung von freiem Daunorubicin 5 µg/ml nach 3 h Inkubation, die Fluoreszenz verteilt sich unregelmäßig im Kern mit stärkeren und schwächeren Arealen, das Zytoplasma ist fast frei
Abb. 29: Darstellung der intrazellulären Verteilung von Daunoxome 5 µg/ml nach 3 h Inkubation, das Zytoplasma ist fast frei, im Kern verteilt sich die Fluoreszenz unregelmäßig
Abb. 30: Darstellung der intrazellulären Verteilung von Daunorubicin nach 6 h Inkubation, das Zytoplasma weist keine Fluoreszenz auf, im Kern verteilt sie sich unregelmäßig
Abb. 31: Darstellung der intrazellulären Verteilung von Daunorubicin nach 24 h Inkubation mit sehr starker Fluoreszenz im Kern und keiner im Zytoplasma
Abb. 32: Schematische Darstellung zweier Kompartimente mit der Verteilung von gebundenen und freien Substanzkonzentrationen [aus Forth, [3]], dieses Modell stellt die Verteilung von freiem Daunorubicin dar
Abb. 33: Kurvenverlauf der maximalen Einstromgeschwindigkeit von Daunorubicin und Daunoxome in drei Konzentrationen (1 µg/ml, 5 µg/ml und 10 µg/ml)

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Tue Nov 19 12:41:05 2002