| Bartels, Anna-Maria : Durchflußzytometrische Untersuchungen zur zellulären Pharmakokinetik von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin |
Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik Abt. Onkologie und Hämatologie
der Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin
Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)
Vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin
Dekan: Prof. Dr. med. J.W.Dudenhausen
Gutachter:
1. Prof. Dr. med. Possinger
2. PD. Dr. med. Späth-Schwalbe
3. PD. Dr. med. Brockmann
Datum der Promotion: 04. Juli 2002
| Seiten: | [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [82] [83] [84] |
Inhaltsverzeichnis | |
| Titelseite | Durchflußzytometrische Untersuchungen zur zellulären Pharmakokinetik von freiem und liposomal verkapseltem Daunorubicin |
| Widmung | |
| 1 | Einleitung |
| 1.1 | Aufbau, Metabolismus, Wirkung und Pharmakologie des Daunorubicins |
| 1.2 | Aufbau, Metabolismus, Wirkung und Pharmakologie des Dauno- rubicins |
| 1.3 | Entwicklung, Aufbau und Pharmakologie des liposomal verkapselten Daunorubicins |
| 1.4 | Pharmakologische Bedeutung der Apoptose |
| 2 | Aufgabenstellung |
| 3 | Material und Methode |
| 3.1 | CCRF-CEM Zellen als in vitro-Modell |
| 3.2 | Versuchsreihen |
| 3.2.1 | Durchführung der Invasionsversuche |
| 3.2.2 | Durchführung der Evasionsversuche |
| 3.2.3 | Durchführung der Apoptoseversuche |
| 3.3 | Nachweis morphologischer Veränderungen während der Apoptose mittels Lichtmikroskopie |
| 3.4 | Nachweis morphologischer Veränderungen während der Apoptose mittels Lichtmikroskopie |
| 3.4.1 | Aufbau und Funktionsweise eines Durchflußzytometers |
| 3.4.2 | Probenmessung und Datenauswertung |
| 3.5 | Bestimmung der intrazellulären Verteilung mittels konfokaler Lasermikroskopie |
| 3.5.1 | Aufbau und Funktionsweise eines konfokalen Lasermikroskops |
| 4 | Ergebnisse |
| 4.1 | Ergebnisse der mittels Durchflußzytometrie durchgeführten Versuche zur Invasionskinetik |
| 4.2 | Ergebnisse der mittels Durchflußzytometrie durchgeführten Versuche zur Evasionskinetik |
| 4.3 | Ergebnisse der mittels Durchflußzytometrie durchgeführten Versuche zur Kinetik der Apoptoseinduktion |
| 4.4 | Darstellung der morphologischen Veränderungen während der Apoptose anhand von Lichtmikroskopie |
| 4.5 | Vergleich der intrazellulären Verteilung von Daunorubicin und Daunoxome mittels konfokaler Lasermikroskopie |
| 5 | Diskussion |
| 5.1 | Kurze zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit |
| 5.2 | Diskussion der Ergebnisse zur Invasionskinetik |
| 5.3 | Diskussion der Ergebnisse zur Apoptoseinduktion |
| 5.4 | Diskussion der Ergebnisse zur Evasionskinetik |
| 5.5 | Diskussion methodischer Probleme |
| 5.6 | Klinisch-Pharmakologische Bedeutung der vorliegenden Arbeit und Ausblick |
| 6 | Zusammenfassung |
| Bibliographie | Literaturverzeichnis |
| Danksagung | |
| Selbständigkeitserklärung | |
| Lebenslauf | |
Tabellenverzeichnis | |
| Tab. 1: | Darstellung der Ergebnisse eines Invasionsversuchs mittels Durchflußzytometrie, Abhängigkeit der Fluoreszenzen (Einheit“Mean Channel Number“) von Daunorubicin und Daunoxome in drei Konzentrationen von der Inkubationszeit (in min) |
| Tab. 2: | Vergleich der Ergebnisse der V30-Bestimmung von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1 µg/ml, 5 µg/ml und 10 µg/ml anhand der Invasionsversuche |
| Tab. 3: | Vergleich der Ergebnisse der Vmax-Bestimmung von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1 µg/ml, 5 µg/ml und 10 µg/ml anhand der Invasionsversuche |
| Tab. 4: | Darstellung der Ergebnisse eines Evasionsversuchs mittels Durchflußzytometrie, Abhängigkeit der Fluoreszenzen (Einheit „Mean Channel Number“) von Daunorubicin und Daunoxome in drei Konzentrationen von der Inkubationszeit (in Minuten) |
Abbildungsverzeichnis | |
| Abb. 1: | Strukturformel von Daunorubicin |
| Abb. 2: | Darstellung der Metabolisierung von Daunorubicin zu dessen Hauptmetabolit Daunorubicinol und anderen Metaboliten |
| Abb. 3: | Darstellung der Lipiddoppelschicht und des wässrigen Kerns eines Liposom und des Einbaus von hydrophilen und lipophilen Substanzen [aus Sharma, [38]] |
| Abb. 4: | Struktur des Daunoxome [aus NeXstar [41]] |
| Abb. 5: | Schematische Darstellung der äußeren und inneren Membran von vitalen und apoptotischen Zellen und dem Verlust der Asymmetrie der Lipiddoppelschicht während der Apoptose und der Exposition von Phosphatidylserinen (PS, rote Kreise) auf der äußeren Membran [aus van Engeland, [52]] |
| Abb. 6: | Schematische Darstellung der morphologischen Veränderungen während der Apoptose mit Zelldehydratation (Abnahme der Zellgröße),Chromatinkon- densation, Kernfragmentation und Bildung von apoptotischen Körpernmit Erhalt der Plasmamembranintegrität [aus Darzynkiewicz, [60]] |
| Abb. 7: | Darstellung des optischen Systems eines Durchflußzytometers [ aus Raffael, [74]] |
| Abb. 8: | Qualitative Darstellung von Fluoreszenzsignalen |
| Abb. 9: | Darstellung zur Abgrenzung der vitalen Zellen im Vor-wärts/Seitwärts-Scatter und Darstellung der Häufig-keitsverteilung der Fluoreszenz im FL2-Histogramm |
| Abb. 10: | Log Fluoreszenz Dot Plot von Annexin V und PI gefärbten CEM- Zellen, Trennung von vitalen (R1), apoptotischen (R2), und nekrotischen (R3) Zellen bei unbehandelten CEM-Zellen |
| Abb. 11: | Schematische Darstellung des optischen Systems eines Lasermikroskops |
| Abb. 12: | Zunahme der Fluoreszenzintensitäten der Zelle in Abhängigkeit von der Zeit |
| Abb. 13: | Beispiel zur Bestimmung von V30 und Vmax anhand der Kurven der Invasionskinetik von Daunorubicin und Daunoxome in drei unterschiedlichen Konzentrationen anhand der Formeln aus 3.2. |
| Abb. 14: | Darstellung der apoptotischen (schwarz markiert) und vitalen (rot markiert) Zellen im Vorwärts/Seitwärts-Scatter bei Inkubation mit 10 µg/ml Daunorubicin im Verlauf von 0 min, 180 min und 540 min |
| Abb. 15: | Kurvenverlauf der Fluoreszenzintensitäten von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1 µg/ml, 5 µg/ml und 10 µg/ml in Abhängigkeit von der Zeit |
| Abb. 16: | Vergleich der Apoptoseraten von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1, 5 und 10 µg/ml nach 120 min Inkubation |
| Abb. 17: | Vergleich der Apoptoseraten von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1, 5 und 10 µg/ml nach 240 min Inkubation |
| Abb. 18: | Vergleich der Apoptoseraten von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1, 5 und 10 µg/ml nach 360 min Inkubation |
| Abb. 19: | Vergleich der Apoptoseraten von Daunorubicin und Daunoxome in den Konzentrationen 1, 5 und 10 µg/ml nach 480 min Inkubation |
| Abb. 20: | Darstellung des Verlaufs aller Apoptosewerte von Daunorubicin und Daunoxome10 µg/ml, 5 µg/ml und 1 µg/ml in einem Liniendiagramm |
| Abb. 21: | Darstellung einer Übersicht von vitalen CEM-Zellen, es zeigen sich keine Anzeichen von typisch morphologischen Veränderungen während der Apoptose |
| Abb. 22: | Darstellung einer vitalen und zweier apoptotischer Zellen mit charakteristischen Veränderungen der Morphologie wie Zellschrumpfung, Formveränderung Kondensation des Kernchromatins, hyperchromatischer DNA und veränderter Anfärbung der Zellen |
| Abb. 23: | Darstellung von drei vitalen Zellen und einer apoptotischen Zelle mit morphologischen Veränderungen, wie Kernfragmentation und Kernauflösung |
| Abb. 24: | Darstellung von vier apoptotischen Zellen mit charakteristischen Veränderungen, wie stark angefärbten Kernfragmenten im Zytoplasma verteilt und Ablösung eines apoptotischen Körpers an der linken Zelle |
| Abb. 25: | Darstellung von zwei apoptotischen Zellen mit charakteristischen Veränderungen, wie der Ablösung von „apoptotischen Körpern“ bei der unteren Zelle |
| Abb. 26: | Darstellung der intrazellulären Verteilung von Daunorubicin 5 µg/ml nach 1,5 h Inkubation, die Fluoreszenz befindet sich im Zytoplasma, der Kern ist frei |
| Abb. 27: | Darstellung der intrazellulären Verteilung von liposomal verkapseltem Daunorubicin (Daunoxome) 5 µg/ml nach 1,5 h Inkubation anhand multipler Zellen,bei denen sich die Fluoreszenz im Zytoplasma befindet, die Kerne sind frei |
| Abb. 28: | Darstellung der intrazellulären Verteilung von freiem Daunorubicin 5 µg/ml nach 3 h Inkubation, die Fluoreszenz verteilt sich unregelmäßig im Kern mit stärkeren und schwächeren Arealen, das Zytoplasma ist fast frei |
| Abb. 29: | Darstellung der intrazellulären Verteilung von Daunoxome 5 µg/ml nach 3 h Inkubation, das Zytoplasma ist fast frei, im Kern verteilt sich die Fluoreszenz unregelmäßig |
| Abb. 30: | Darstellung der intrazellulären Verteilung von Daunorubicin nach 6 h Inkubation, das Zytoplasma weist keine Fluoreszenz auf, im Kern verteilt sie sich unregelmäßig |
| Abb. 31: | Darstellung der intrazellulären Verteilung von Daunorubicin nach 24 h Inkubation mit sehr starker Fluoreszenz im Kern und keiner im Zytoplasma |
| Abb. 32: | Schematische Darstellung zweier Kompartimente mit der Verteilung von gebundenen und freien Substanzkonzentrationen [aus Forth, [3]], dieses Modell stellt die Verteilung von freiem Daunorubicin dar |
| Abb. 33: | Kurvenverlauf der maximalen Einstromgeschwindigkeit von Daunorubicin und Daunoxome in drei Konzentrationen (1 µg/ml, 5 µg/ml und 10 µg/ml) |
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HTML - Version erstellt am: Tue Nov 19 12:41:05 2002 |