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2  Material und Methoden

2.1 Untersuchungen zu Wirkungen, Nebenwirkungen und Lebensqualität bei Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen unter low-dose Glucocorticoidtherapie am Beispiel von Methylprednisolon

2.1.1 Patienten

Für diese Untersuchungen wurden die Patienten aus der Osteoporosesprechstunde der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Rheumatologie und Klinische Immunologie der Charité rekrutiert. Es wurden Patienten mit entzündlich-rheumatischen Krankheiten eingeschlossen, die eine niedrig-dosierte Methylprednisolontherapie über mindestens ein Jahr bekamen. Wir beschränkten uns auf die Untersuchung nur eines Glucocorticoidpräparats, um sehr exakt Dosierungen vergleichen zu können. Grund dafür ist die Tatsache, dass unterschiedliche Glucocorticoidpräparate eine unterschiedliche Wirkpotenz haben und durch die nur unscharf definierten „Äquivalenzdosen“ ein exakter Vergleich nicht möglich ist (s. Kap. 1.1.).[51, 61]

2.1.2 Erfassung der Patientendaten

In der Osteoporosesprechstunde werden routinemäßig folgende Parameter erhoben:

Bei jedem der eingeschlossenen Patienten wurden in der Sprechstunde folgende Daten dokumentiert:

Zusätzlich zu diesen Routineparametern wurden für die Studie folgende Daten erfasst:

Bei den visuellen Analogskalen muss der Arzt oder Patient auf einer 10 cm langen Linie mit entgegengesetzten Endpunkten (z.B. starke Schmerzen – keine Schmerzen) einen Punkt auf der Linie markieren, der ihrer subjektiven Einschätzung am ehesten entspricht. Die markierte Stelle wird ausgemessen, der Wert in Millimetern angegeben.
In der Regel konnten alle Parameter problemlos erhoben werden, die Patienten waren durchweg interessiert und sehr kooperativ. Die primäre Erfassung der Daten erfolgte in Papierform. Nachfolgend wurden sie computerunterstützt verwaltet und statistisch ausgewertet (MS Excel, SPSS). Die Daten zu Diagnose, Therapieschema sowie Dauer und Art der Therapie wurden aus den Krankenakten sowie aus der Eigenanamnese ermittelt. Zu der Bewertung der Nebenwirkungen zählten neben der Messung der Knochendichte die Patientenbefragung sowie die klinische Untersuchung. Von Belang waren hierbei osteoporosebedingte Schmerzzustände, Cushing-Symptomatik, Hautveränderungen in Form von Unterblutungen, Verdünnung der Haut sowie Ausbildung von Striae. Außerdem wurden die Patienten nach bekannten Erhöhungen des Augen-innendrucks befragt, die vom Ophtalmologen diagnostiziert worden waren.


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2.1.3  Fragebogen zum Gesundheitszustand

Zur Beurteilung des allgemeinen Gesundheitszustandes verwendeten wir einen Standardfragebogen, den Short Form-36 (SF-36). Diesen bekamen die Patienten am Ende der Untersuchung ausgehändigt mit der Bitte, ihn möglichst vollständig und exakt auszufüllen.

2.1.4 Bestimmung der Knochendichte

Die Knochendichte wurde mit einem DEXA-Gerät gemessen. DEXA bedeutet Dual Energy X-Ray Absorptiometry. Dieses Verfahren ermöglicht eine quantitative Messung des Knochenmineralgehaltes von einzelnen Regionen des Körpers. Der menschliche Körper kann in guter Näherung in zwei verschiedene Komponenten unterteilt werden, das Knochengewebe und das Weichteilgewebe. Setzt man dieses Zwei-Komponenten-System voraus, sind Photonenstrahlen mit zwei unterschiedlichen Energien notwendig, um aus den jeweiligen Schwächungen der Ausgangsintensitäten die Massen der zwei unterschiedlichen Materialien zu berechnen. Diese Materialien – und damit deren Dichte – werden als bekannt vorausgesetzt, während die Masse den berechneten Wert darstellt. Dadurch werden Messfehler minimiert, die auf der ungleichmäßigen Verteilung des Weichteilgewebes und den nicht konstanten Körperkonturen (Konstitution, Gewicht) beruhen. Theoretisch wird für die Dichteanalyse einer gegebenen Anzahl von Substanzen die gleiche Zahl an Absorptionsmessungen mit unterschiedlichen Photonenenergien benötigt. Klinisch ist die Einteilung in zwei Komponenten ausreichend. Die Photonenenergien der verwendeten Photonenstrahlen betragen 38 und 70 kev.
Gemessen wird der Knochenmineralgehalt an verschiedenen Regions of interest (ROI), in unserem Fall an der Lendenwirbelsäule (L2-L4) im anterior-posterioren Strahlengang, sowie am Schenkelhals des Femurs. Die Knochenmineraldichte (bone mineral density, BMD) gibt die Dichte in Bezug auf die Flächenprojektion der ausgewählten Region an und hat somit die Einheit g/cm2. Der BMD-Wert wird bis dato als klinisch am besten mit dem Zustand des Skelettsystems eines Patienten korrelierend angesehen.[62] Dieser Wert wird verglichen mit einem existierenden Durchschnittswert junger, gesunder Erwachsener zwischen 20 und 40 Jahren, die von gleichem Geschlecht und gleicher ethnischer Herkunft sind. Unabhängig vom Alter steigt bei sinkendem BMD-Wert das Risiko für Frakturen. Mit etwa jeder Standardabweichung (SD) zu niedrigeren Werten verdoppelt sich dieses Risiko.[63, 64] Nach der WHO-Übereinkunft wird ab einer Abweichung von 1,0 SD nach unten von Osteopenie, ab 2,5 SD von Osteoporose gesprochen.[65, 66] Ab diesem Wert steigt das Risiko für Spontanfrakturen rapide an.[63] Diese Richtwerte übernahmen wir auch zur Interpretation unserer Ergebnisse. Allerdings spielen auch andere Risikofaktoren wie Alter, Geschlecht, Familienanamnese, vorausgegangene Frakturen [Seite 23↓]und erhöhte biochemische Knochenumsatzparameter eine wichtige Rolle.[67] Für die individuelle Beurteilung des Risikos für eine Fraktur wird daher neuerdings die Beurteilung des absoluten Risikos unter Einbeziehung der o.g. Parameter statt des relativen Risikos propagiert.[68, 69] Die Abweichung vom Durchschnittswert junger Erwachsener in x-facher Standardabweichung bezeichnet den T-Score.

2.1.5 Blut- und Urinuntersuchungen

Standardmäßig wurden Blutkörperchensenkungsgeschwindigkeit, C-reaktives Protein, kleines Blutbild, Elektrolyte (Natrium, Kalium, Calcium, Phosphat) sowie einige Leber- und Nierenwerte (Bilirubin, ASAT, ALAT, gammaGT, Kreatinin, Harnstoff) gemessen. Außerdem wurden die Parameter zum Knochenstoffwechsel erhoben. Diese Parameter werden routinemäßig in der Osteoporosesprechstunde unserer Klink angesetzt. Zu den Parametern für den Knochenstoffwechsel gehören die Ostase, das Osteocalcin, die knochenspezifische alkalische Phosphatase (Kn-AP) sowie die Cross-links im Urin Pyridinolin, Desoxypyridinolin und N-Telopeptid. Osteocalcin und Kn-AP dienen dabei als Parameter für den Knochenaufbau, während die Pyridinum-Crosslinks und die „crosslinked“ Telopeptide Aussagen über den Knochenabbau erlauben.[70] Man erhofft sich, anhand dieser Parameter Veränderungen im Knochenstoffwechsel frühzeitig erkennen zu können. Der BMD-Wert steht zur Beurteilung eines Knochenabbaus erst am Ende eines Prozesses, der bereits begonnen hat. Erst nach zwei bis drei Jahren unterscheiden sich wiederholte Messwerte der BMD signifikant von Vorwerten aufgrund großer individueller Variabilität und langsamen Ansprechens der Messwerte.[71] Nur in manchen Fällen, wie dem Beginn einer GC-Therapie, findet eine schnellere Änderung der Messwerte statt. Darüber hinaus variiert der BMD-Wert sehr stark, z.B. abhängig vom Alter.[72] Dagegen sind die biochemischen Knochenmarker sensitiv für frühe Änderungen des Knochenumsatzes.[71, 73] Es gibt gegenteilige Meinungen darüber, inwiefern sie eine Veränderung der Knochendichte vorhersagen können.[74, 75] Allerdings sprechen viele Publikationen dafür, dass diese Parameter ebenso wie der BMD-Wert eine Vorhersage über zukünftige Frakturen erlauben.[69, 74, 76, 77, 78, 79, 80] Daher wird die Erhebung der biochemischen Knochenmarker als unabhängiger Vorhersagewert, der komplementär zur Messung der BMD verwendet werden kann, als sinnvoll erachtet.


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2.2  Experimentelle Untersuchungen zum Nachweis von membranständigen Glucocorticoidrezeptoren

2.2.1 CCRF-CEM- (CCL 119-) Zelllinie

Bei der CCRF-CEM-Zelllinie handelt es sich um periphere T-Lymphoblasten. Sie stammen ursprünglich von einem an akuter lymphoblastischer Leukämie erkrankten 4-jährigen Kind. Diese Tumorzellen wurden in RPMI-1640 Puffermedium mit 5 % BSA bei 5,5 % CO2 Atmosphäre und einer Temperatur von 37°C kultiviert. Das Medium wurde alle 2-3 Tage gewechselt. Zur späteren Verwendung sowie zur Standardisierung der Versuchsbedingungen wurden die Zellen kryokonserviert. Dazu wurde die Zellsuspension bei 300 g für 10 min zentrifugiert, mit einer Zelldichte von 2 x 106/ ml resuspendiert, in Aliquots à 5 x 106 Zellen abgefüllt und mit DMSO als Gefrierschutzmittel versetzt. Anschließend wurden die Zellen zunächst für einige Wochen bei –80°C zwischengelagert, bevor sie in flüssigem Stickstoff bei –156°C endgelagert wurden.

2.2.1.1 Morphologie

Unter dem Elektronenmikroskop betrachtet, zeigen sich bei der CCRF-CEM-Zellkultur polymorphe Zellen mit großem Kern : Plasma-Verhältnis, gelappten Zellkernen sowie Ausbildung von Mikrovilli (Abb. 3). Mitosen waren sehr häufig zu beobachten (Abb. 4). Die Bilder entsprechen einem aufgetauten Zell-Aliquot nach 40 Stunden Wachstumszeit. Sie sprechen für ein gutes Befinden der Zellkultur.

Abb. 3: CCRF-CEM-Zelllinie unter dem Elektronenmikroskop betrachtet


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Abb. 4: Eine der zahlreichen Mitosen der CCRF-CEM-Zellen.
Die elektronenmikroskopischen Bilder wurden uns freundlicherweise von Dr. Axel-M. Ladhoff aus dem Institut für Pathologie der Charité zur Verfügung gestellt.

2.2.1.2 Wachstumskinetik

In Kultur zeigten die CCRF-CEM-Zellen ein exponentielles Wachstum. Ohne Mediumwechsel nahm die Zellzahl nach sieben Tagen wieder ab (Abb. 5).

Abb. 5: Wachstumsverhalten der CCRF-CEM-Zellen mit und ohne Austausch des Wachstumsmediums


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2.2.2  Präparation humaner mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC)

Für die Präparation der PBMC wurden heparinisierte Blutproben verwendet. Das Blut wurde von gesunden Spendern sowie Patienten der Rheumaklinik der Charité nach deren Zustimmung abgenommen. Die Ethikkommission der Charité hatte ebenfalls ihre Zustimmung erklärt. Das Blut wurde im Verhältnis 1:3 mit PBS (phosphatgepufferte Salzlösung mit Standardzusammensetzung) gemischt und anschließend vorsichtig in einem 50 ml Falcon®-Röhrchen auf 15 ml Ficoll geschichtet. Nun erfolgte die Zentrifugation bei 1500 g (2000 U/min) und Zimmertemperatur für 20 Minuten in einer BECKMAN® GS-5-Zentrifuge. Die Bremse war dabei ausgeschaltet.
Der Leukozytenring wurde vorsichtig abpipettiert und in PBS/BSA/NaN3 (PBA) bei 1200 U/min zwei Mal gewaschen. Dafür wurde die Zentrifuge auf 4°C vorgekühlt. Die Zellsuspension wurde von nun an konstant auf Eis gehalten.
Für die Zellzählung wurde ein Aliquot der Zellsuspension zunächst im Verhältnis 1:10 mit PBS, anschließend nochmals 1:5 mit PBS und 3mM Trypanblau verdünnt. Von dieser letzten Verdünnung wurden 10 µl in die mit einem Deckglas versehene Neubauer®-Zählkammer gegeben. Es wurden alle vier Quadranten mit ihren je 16 Feldern ausgezählt. Das Trypanblau diente zur Markierung der toten Zellen, die sich aufgrund der erhöhten Membranpermeabilität blau färben. Ihr Anteil betrug i.d.R. unter 1 %.

2.2.3 Durchflusszytometrie

2.2.3.1 Prinzip der Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie ist eine Methode zur Analyse von Einzelzellen in Suspension auf der Grundlage von Fluoreszenz- und Streulichteigenschaften. Verschiedene physikalische und chemische Zelleigenschaften werden simultan auf der Einzelzellebene gemessen. Relative Zellgröße, Granularität sowie bis zu zwölf verschiedene Fluoreszenzfarben können für viele tausend Zellen in kurzer Zeit ermittelt werden. Der Zellsuspension werden Antikörper-Fluorochrom-Konjugate zugesetzt. Die Antikörper sind gegen spezifische Antigene der Zellen gerichtet. Dadurch können beispielsweise Subpopulationen von Zellen (z.B. T-Helferzellen, zytotoxische T-Zellen und B-Lymphozyten) unterschieden werden. Monoklonale, fluoreszenzmarkierten Antikörper sind mittlerweile in großer Auswahl kommerziell erhältlich, so dass breite Anwendungsmöglichkeiten sowohl in der Klinik als auch in der Grundlagenforschung bestehen.
Zur Analyse wird die Zellsuspension über eine Stahlkapillare durch Überdruck in die Messküvette eingeführt. Beim Eintreten in die Messkammer werden die Zellen stark beschleunigt, wodurch sich Aggregate auftrennen. Die Zellen erreichen so den Analysepunkt, einen Argonlaser [Seite 27↓]mit 488 nm Wellenlänge, aufgereiht wie an einer Perlenschnur, was als „hydrodynamische Fokussierung“ bezeichnet wird (Abb. 6).
Das Licht des Lasers wird durch die Zellen gestreut. Die Streuung des Lichtes wird durch die Zellgröße, die Struktur der Zellmembran sowie die intrazellulären Bestandteile beeinflusst. An Streulicht unterscheidet man den sogenannten „forward scatter“, das Streulicht längs zum Anregungslichtstrahl, und den sogenannten „side scatter“, das Streulicht im rechten Winkel zu dieser Achse. Der forward scatter ist dabei in erster Linie ein Maß für die Zellgröße (kleine Zellen streuen weniger), während der side scatter vor allem intrazelluläre Granularität misst (Granulozyten streuen mehr als Lymphozyten) (Abb. 6).

Abb. 6: Oben: Schematische Darstellung eines Durchflusszytometers. Unten: Prinzip der Streulicht- und Fluoreszenzmessung


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Die Messung der Fluoreszenz (d.h. das Leuchten eines Stoffes durch anregende Strahlung) erfolgt entlang der Laserachse im 90°-Winkel. Die fluoreszierenden Stoffe absorbieren Licht in einem mehr oder weniger breiten Wellenlängenbereich. Dadurch werden Elektronen der äußeren Schalen auf ein höheres Energieniveau gehoben. Mit dem Rücksprung auf das ursprüngliche Niveau wird ein Photon abgegeben, es geht Schwingungs-Rotations-Energie verloren. Daher hat das emittierte Licht eine größere Wellenlänge (energieärmer) als das anregende. Unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe haben unterschiedliche Absorptions- und Emissionsspektren. Die Emissionsspektren der Farbstoffe bestimmen nachfolgend die Kombinierbarkeit der Fluorochrome. Sie sollten sich in ihren Wellenlängenbereichen möglichst wenig überschneiden, um sie trennscharf auswerten zu können. Durch Mehrfarbenfluoreszenz wird die Korrelation mehrerer Zelleigenschaften ermöglicht. In Tabelle 1 sind verschiedene Farbstoffe zusammen mit ihren Exzitationsmaxima (der Wellenlänge, bei der sie am besten angeregt werden) und Emissionsmaxima (der Wellenlänge, bei der das meiste Licht emittiert wird) aufgeführt.

Tabelle 1: Exzitations- und Emissionsmaxima unterschiedlicher Fluorochrome

Farbstoff

Ex max (nm)

Emmax(nm)

Fluorescein Isothiocyanat (FITC)

490

530

Cy5

650

666

Phycoerythrin (PE)

480, 545, 565

575

Peridininchlorophyll-a (PerCP)

470

680

Allophycocyanin (APC)

650

660

Exmax: Exzitationsmaximum, Emmax: Emissionsmaximum

Das verwendete Durchflusszytometer war ein fluoreszenzaktivierter Zellsortierer (FACS CaliburTM, Becton Dickinson; San Jose, USA).
In der vorliegenden Arbeit wurde die Durchflusszytometrie zur Detektion von membranständigen und zytosolischen Glucocorticoidrezeptoren verwendet, sowie zur Unterscheidung der einzelnen Subpopulation der PBMC.

2.2.3.2 Testsystem zur Detektion von zytosolischen und membranständigen Glucocorticoidrezeptoren

Zum Nachweis der Glucocorticoidrezeptoren wurden monoklonale Anti-Glucocorticoidrezeptor-Antikörper (antiGCR-AK) verwendet, die freundlicherweise von Frau Dr. Berki vom Institut für Immunologie und Biotechnologie der Medizinischen Hochschule von Pécs, Ungarn, zur Verfügung gestellt wurden. Diese Antikörper wurden gegen die zytosolischen Rezeptoren generiert (Abb. 2).[81] Voruntersuchungen zeigten jedoch, dass auch membranständige GCR durch sie [Seite 29↓]detektiert werden.[45]
Wir verwendeten zunächst Fluoresceinisothycianat(FITC)-markierte antiGCR-AK. Diese Antikörper werden für die konventionelle Immunfluoreszenzfärbung eingesetzt (Abb. 7).

Abb. 7: Konventionelles Immunfluoreszenz-Färbesystem

Zur Verstärkung des Signals setzten wir Sekundärreagenzien ein. Das Besondere an der Detektion der mGCR war die Verwendung einer hochsensitiven Immunfluoreszenz-Färbung mit magnetofluoreszenten Liposomen (siehe Kapitel 2.2.3.4.). Abb. 8 zeigt das bereits in Vorarbeiten angewandte primäre Färbesystem.[45]

Abb. 8: Primär verwendetes Färbesystem zur Detektion der mGCR: Der antiGCR-FITC-Antikörper ist gegen den mGCR gerichtet. Als Sekundärreagenzien zur Steigerung der Signalintensität wurden antiFITC-Dig und antiDig-Liposomen verwendet. Die Liposomen enthalten eine Vielzahl von FITC-Molekülen.


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Nach Färbung mit den Antikörpern wurden die Zellen durchflusszytometrisch gemessen. Da sich in den ersten Experimenten herausstellte, dass die FITC-konjugierten antiGCR-AK eine zu hohe unspezifische Färbung zeigten, stellten wir eine eigene Kopplung der Antikörper mit einem Digoxigenin-succinimidylester her. Dementsprechend stellt sich das optimierte Färbesystem wie in Abb. 9 dar (siehe auch Ergebnisteil, Kapitel 3.2.1.2.).

Abb. 9: Optimiertes Färbesystem zur Detektion der mGCR: Der antiGCR-Antikörper wurde direkt mit Digoxigenin gekoppelt. Der Zwischenschritt mit Färbung durch antiFITC-Dig-Antikörpern entfällt. Die unspezifische Färbung reduzierte sich dadurch.

2.2.3.3 Herstellung des antiGCR-Digoxigenin-Konjugats (antiGCR-Dig-Konjugat)

Zur Herstellung des antiGCR-Dig-Konjugats verwendeten wir die antiGCR-AK zusammen mit Digoxigenin-succinimidylester (Dig-SE). Das Antikörperprotein wurde über eine Gelfiltration in den Konjugationspuffer (PBS) überführt, wobei eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml eingestellt wurde. Dies wurde durch Verdünnung nach Extinktionsmessung bei 280 nm erreicht. Der Dig-SE wurde dann in einer Konzentration von 5 mg/ml in DMSO gelöst. Anschließend wurden die gelösten Ester sofort in die Proteinlösung gegeben. Um das geeignete Molverhältnis zu ermitteln, wurden unterschiedliche Mengen der Esterlösung verwendet. Grundsätzlich birgt ein zu geringes Verhältnis (1-2:1) Hapten : Protein die Gefahr, dass das Signal sehr schwach ausfällt. Umgekehrt ist bei hohem Verhältnis (> 10:1) das Problem, dass es unspezifische hydrophobe Interaktionen mit den Zellen geben kann bzw. dass das Bindungsreagenz inaktiviert wird oder präzipitiert. Präzipitate lassen sich durch Zentrifugieren bei 12000 g für 10 Minuten entfernen.
Für Immunglobuline G geben erfahrungsgemäß Molverhältnisse von 10:1 – 50:1 die besten Resultate. Aus diesem Grund stellten wir drei Ansätze her mit den Molverhältnissen Dig-SE : an [Seite 31↓] tiGCR-AK von 10:1, 30:1 und 50:1. Dafür wurden pro Milliliter Antikörperlösung (Konzentration von 1 mg/ml, Molekulargewicht ca. 150 KD) 44, 132 bzw. 220 µg Dig-SE gelöst in DMSO benötigt.
Nach der Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur wurden die freien Haptene per Gelfiltration entfernt. Anschließend wurde die Proteinkonzentration mittels Extinktionsmessung bei 280 nm ermittelt. Danach hatte der Ansatz 10:1 eine Proteinkonzentration von 0,356 mg/ml, der Ansatz 30:1 von 0,351 mg/ml und der Ansatz 50:1 von 0,591 mg/ml.

2.2.3.4 Hochsensitive Immunfluoreszenz mit magnetofluoreszenten Liposomen

Für die Detektion eines Antigens auf der Zelloberfläche mit konventioneller Färbetechnik sind circa 2000 Moleküle/Zelle notwendig.[82, 83, 84] Mit der hochsensitiven Immunfluoreszenzfärbung lässt sich die Signalintensität 100- bis 1000-fach erhöhen, so dass schon bei nur 50 bis 100 Moleküle eine Zelle als positiv im Durchflusszytometer detektiert werden kann.[85] Die magnetofluoreszenten Liposomen (kurz im folgenden: Liposomen) haben eine Größe von 200-300 nm und enthalten mehrere tausend Fluoreszenzmoleküle sowie kolloidale magnetische Partikel, die auch eine magnetische Zellsortierung (MACS) erlauben. In unserem Fall waren die Liposomen mit Fluoresceinisothycianat (FITC) gefüllt. Die Liposomen wurden von der Arbeitsgruppe Dr. Scheffold im Deutschen Rheumaforschungszentrum zur Verfügung gestellt.

2.2.3.5 Prinzipielles methodisches Vorgehen

Das übliche Vorgehen bestand darin, für jede Probe Messungen mit drei unterschiedlichen Ansätzen vorzunehmen. Der erste Ansatz diente zur Kontrolle der Hintergrundfluoreszenz – und damit als Referenzwert für die Einteilung in „positive“ und „negative“ Zellen. Hier wurden nur die Sekundärantikörper (antiDig-Liposomen) zugegeben, nicht jedoch die antiGCR-Dig-Antikörper. Die Versuchsbedingungen wurden so eingestellt, dass dieser Ansatz eine möglichst geringe Anzahl unspezifisch „positiver“ Zellen aufwies. Dies wurde durch Titrierung der AK erreicht (s. Kap. 3.2.1.3.). Der zweite Ansatz diente der Bestimmung der absoluten Färbung; hier wurden ausschließlich die Färbeantikörper zugesetzt. Mit dem dritten Ansatz wurde die unspezifische Färbung bestimmt, die auch noch nach der Inkubation mit unmarkiertem (d.h. nicht Fluoreszein- bzw. Digoxigenin-gekoppeltem) Antikörper (Blockantikörper) im Überschuss vorhanden war. Ausgewertet wurde die „Nettofärbung“, also die Färbung, die sich aus der Differenz von Ansatz zwei und drei ergab. Bei der konventionellen Färbung wurde zu dem Anteil der positiven Zellen die durchschnittliche Fluoreszenzintensität angegeben. Sie gibt die mittlere Helligkeit aller positiven Zellen an und erlaubt u.a. Rückschlüsse auf die Qualität der Blockade. Bei [Seite 32↓]der Liposomenfärbung ist sie allerdings nicht aussagekräftig. Sie wurde daher nicht angegeben (siehe dafür: Diskussion, Kap. 4.2.).
Tabelle 2 zeigt die Ansätze in der Übersicht. Die in Zeile 1 aufgeführten polyklonalen IgG dienten der Absättigung unspezifischer Epitope auf der Zelloberfläche, um die unspezifische Färbung nochmals zu reduzieren. Als Inkubationsmedium wurde PBS/BSA/NaN3 (PBA) verwendet.

Tabelle 2: Reihenfolge der Zugabe der Antikörper in den drei Ansätzen.

Kontrollansatz

Färbeansatz

Blockansatz

1. polyklonale IgG

1. polyklonale IgG

1. polyklonale IgG

  

2. unmarkierter antiGCR-AK im Überschuss

 

2. antiGCR-Dig-AK

3. antiGCR-Dig-AK

2. antiDig-Liposomen (FITC) / antiDig-Cy5

3. antiDig-Liposomen (FITC) / antiDig-Cy5

4. antiDig-Liposomen (FITC) / antiDig-Cy5

2.2.3.6 Färbung mit antiGCR-Dig-Antikörpern

Oberflächenfärbung

Während der gesamten Färbeprozedur wurde die Zellsuspension auf Eis belassen, um unspezifische Färbeprozesse zu minimieren. Es wurden pro Ansatz zwischen 106 und 5 x 106 Zellen gewaschen und resuspendiert. Zur Absättigung unspezifischer Antikörperbindungsstellen wurden die Zellen mit humanem polyklonalen Immunglobulin G (Färbekonzentration: 5 mg/ml) für 10 Minuten vorinkubiert. Die Konzentrationen des Färbe- und des Blockantikörpers entsprachen denen des optimalen Färbeergebnisses bei Austitrierung (siehe Ergebnisteil, Kap. 3.2.1.3.). Die Inkubationszeit betrug jeweils 10 Minuten. Nach der Färbung wurden die Zellen zweimal in PBA gewaschen. Anschließend erfolgte die Inkubation mit antiDig-Liposomen.

Intrazelluläre Färbung

Zur Detektion zytosolischer Glucocorticoidrezeptoren müssen die Färbeantikörper in das Zellinnere gelangen. Hierfür muss die Zellmembran permeabilisiert werden. Die Zellen wurden zunächst in 2%iger Formaldehyd-Lösung fixiert (20 Minuten bei Raumtemperatur) und anschließend in PBA gewaschen. Die Permeabilisierung der Zellmembran erfolgte mit 0,5%igem Saponin-Puffer für 20 Minuten. Alle weiteren Inkubations- und Waschschritte wurden ebenfalls in Saponin-Puffer und bei Raumtemperatur durchgeführt. Die weiteren Färbeschritte entsprachen [Seite 33↓]bis auf den letzten denen der Oberflächenfärbung. Statt der antiDig-Liposomen wurden antiDig-Cy5-Antikörper verwendet.
Die Liposomenfärbung ist zur intrazellulären Färbung ungeeignet, weil die Liposomen nicht in die Zelle gelangen und durch Saponin zerstört werden. Zur Detektion der iGCR war außerdem die konventionelle Färbung wegen der hohen Rezeptorenzahl ausreichend (siehe Diskussion, Kap. 4.2.).

2.2.3.7 Optimierung der Färbung durch Sekundärreagenzien

Es wurden Fluoreszenz- und Liposomen-gekoppelte Antikörper gegen Digoxigenin als Sekundärreagenzien verwendet. Diese waren gegen die Digoxigenin-markierten Primär-Antikörper gerichtet.

Liposomenfärbung

Die Verdünnung der antiDig-Liposomen betrug 1:200 entsprechend der zuvor erfolgten Austitrierung der Liposomen auf Mauszellen. Vor der Färbung wurden die Liposomen in PBA bei 12000 g zentrifugiert, um nicht gebundene Antikörper abzutrennen. Die Inkubation erfolgte in einem Färbevolumen von 200 µl in einem FACS-Röhrchen für 30 Minuten auf dem Schüttler.

Cy5-Färbung

Der antiDig-Cy5-Antikörper wurde in einer Verdünnung entsprechend des besten Ergebnisses bei Austitrierung auf Mauszellen verwendet. Die Inkubationszeit betrug zehn Minuten auf Eis.

2.2.3.8 Detektion der Cluster of Differentiation (CD) 3, 14 und 19

Hierfür verwendeten wir kommerziell erhältliche Antikörper der Firmen Becton Dickinson. Wir verwendeten monoklonale Antikörper gegen CD3, CD14 und CD19. Tabelle 3 zeigt die jeweilige Antikörper-Fluorochrom-Kombination sowie die PBMC-Subpopulationen, die spezifisch die Cluster of Differentiation ausprägen. Nach Austitrierung verwendeten wir ein Verdünnungsverhältnis von 1:50. Die Färbung erfolgte vor der Färbung mit antiGCR-Antikörpern. Die Inkubationszeit betrug 10 Minuten.


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Tabelle 3: Antikörper-Fluorochrom-Konjugat und Zielzellen, die damit detektiert werden sollen.

Antikörper

Konjugiertes Fluorochrom

Detektion von

antiCD3

PerCP

T-Lymphozyten

antiCD14

PE

Monozyten

antiCD19

APC

B-Lymphozyten

2.3 Bestimmung der Krankheitsaktivität bei Patienten mit rheumatoider Arthritis

Um die Expression der mGCR auf PBMC mit der Krankheitsaktivität zu korrelieren, bestimmten wir diese anhand der folgenden Parameter:


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2.4  Statistische Methoden

2.4.1 Klinische Studie

Die Patienten wurden in Abhängigkeit von der durchschnittlichen Methylprednisolondosis innerhalb der letzten zwölf Monate in zwei Gruppen eingeteilt. Die beiden Gruppen wurden hinsichtlich der abgefragten Parameter zu Nebenwirkungen und Lebensqualität untereinander sowie mit den Referenzwerten gesunder Probanden verglichen. Die Grenze zogen wir bei einer durchschnittlichen Dosis von 6 mg. Patienten mit einer Dosis von < 6 mg gehörten zu Gruppe 1, solche mit ≥ 6 mg zu Gruppe 2. Dieser Wert entspricht nach den herkömmlichen relativen Wirkpotenzen einer Äquivalenzdosis von 7,5 mg Prednisolon. Die Grenze wurde hier aus folgenden Gründen gezogen:

Zur Auswertung des Vergleichs zwischen den beiden Gruppen wurden eine Vierfeldertafel mit Chi-Quadrat-Test nach Pearson für die bipolaren Parameter (ja/nein-Fragen), sowie der Mann-Whitney-U-Test als nichtparametrischer Test für die (nicht normal verteilten) übrigen Werte verwendet. P-Werte < 0,05 zeigten einen signifikanten Unterschied zwischen den Vergleichsgruppen an. Bei Werten < 0,1 sprechen wir von einer Tendenz. Für die Parameter „Knochendichte“ und „durchschnittliche Methylprednisolon-Dosis in den vergangenen 12 Monaten“ wurde zudem der Korrelationskoeffizient nach Spearman berechnet.

2.4.2 Durchflusszytometrische Experimente

Wir korrelierten die Ausprägung der mGCR auf PBMC mit unterschiedlichen Krankheitsaktivitätsparametern. Zu Anschauungszwecken wurden in den Diagrammen jeweils eine Regressions[Seite 36↓]gerade ermittelt. Schließlich wurde der Korrelationskoeffizient nach Spearman sowie die p-Werte für das Kriterium eines statistisch signifikanten Zusammenhangs berechnet.
Ein p-Wert von < 0,05 bedeutetet einen signifikanten Zusammenhang.


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14.05.2004