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3  Ergebnisse

3.1 Klinische Studie

3.1.1 Charakterisierung der Patienten und der Vergleichsgruppen

Es wurden 42 Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung und Methylprednisolontherapie für mindestens ein Jahr in die Studie aufgenommen. Diese wurden entsprechend ihrer durchschnittlichen Dosis an Methylprednisolon innerhalb der vergangenen 12 Monate in zwei Gruppen unterteilt. Die maximale Dosierung innerhalb des vergangenen Jahres betrug in keinem Fall mehr als 16 mg/die (zu den Kriterien für die Einteilung in die beiden Dosisgruppen siehe Kapitel 2.4.1.). Aus Tabelle 4 ergibt sich die Verteilung des Alters, des Geschlechts, der Diagnosen sowie der Therapiedauer in den beiden Vergleichsgruppen:

Tabelle 4: Überblick über die Patienten in den beiden Dosisvergleichsgruppen

 

Gruppe 1
untere Dosishöhe (< 6 mg)

Gruppe 2
obere Dosishöhe (≥ 6 mg)

Anzahl (n)

21

21

weiblich

19

16

männlich

2

5

Alter

20-80

24-79

Durchschnitt

53,81

50,24

Diagnosen

1) Kollagenosen: 7

2) Vaskulitiden: 4

3) Rheumatoide Arthritis: 7

4) Spondylarthropathien: 1

5) Andere: 2

1) Kollagenosen: 10

2) Vaskulitiden: 6

3) Rheumatoide Arthritis: 3

4) Spondylarthropathien: 1

5) Andere: 1

Methylprednisolondosis in den vorausgegangenen 12 Monaten

Mittelwert: 4,11 mg

Median: 4 mg

Minimum: 1,58

Maximum: 5,83 mg

Mittelwert: 9,04 mg

Median: 8,2 mg

Minimum: 6 mg

Maximum: 15 mg

Therapiedauer

Mittelwert: 6,89 Jahre

Median: 4 Jahre

Minimal: 2 Jahre

Maximal: 20 Jahre

Mittelwert: 7,06 Jahre

Median: 6 Jahre

Minimal: 1 Jahre

Maximal: 22 Jahre

1) Systemischer und kutaner Lupus erythematodes, Polymyositis, CREST-Syndrom, Sjögren-Syndrom, Sklerodermie
2) M. Wegener, Polymyalgia rheumatica, Churg-Strauss-Vaskulitis, sonstige Vaskulitiden
3) Diagnose nach ARA-Kriterien
4) Spondylitis ankylosans und seronegative Spondylarthropathie
5) Polychondritis, Cogan-Syndrom, Still-Syndrom


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Tabelle 5 zeigt die Anzahl der Patienten mit DMARD (disease modifying antirheumatic drug)- bzw. Anti-Osteoporose-Therapie, welche die Knochendichte negativ bzw. positiv beeinflussen können. Die Verteilung auf die Gruppen zeigt dabei keine relevanten Unterschiede.

Tabelle 5: Zahl der Patienten mit DMARD- bzw. Anti-Osteoporose-Therapie

 

Gruppe 1

Gruppe 2

Gesamt

Methotrexat

5

4

9

Vitamin D / Kalzium

12

15

27

Bisphosphonate

6

7

13

Östrogene

2

0

2

3.1.2 Ergebnisse der einzelnen Parameter

3.1.2.1 Knochendichte

13 (31 %) Patienten zeigten in der Osteodensitometrie noch normale Werte, 16 (38,1%) eine Osteopenie (T-Score -1 bis -2,5) und 13 (31 %) eine Osteoporose (T-Score < -2,5). Zwischen den beiden Dosisgruppen bestand kein signifikanter Unterschied. Der Median für den T-Score der Lendenwirbelsäule betrug für Gruppe 1 -1,24, für Gruppe 2 -1,19. Der p-Wert für den Unterschied zwischen beiden Gruppen war 0,218. Bei der Schenkelhalsmessung betrugen die Medianwerte für die T-Scores -1,92 (Gruppe 1) bzw. -2,05 (Gruppe 2). Der p-Wert war hier 0,781.
Der Korrelationskoeffizient für nichtparametrische Korrelationen nach Spearman betrug für den Zusammenhang T-Score der Lendenwirbelsäule und Methylprednisolondosis -0,142. Damit war auch diese negative Korrelation bei einem p-Wert von 0,369 nicht signifikant. Ebenso verhielt es sich bei der Korrelation zwischen dem T-Score des linken Schenkelhalses und der durchschnittlichen Methylprednisolondosis in den vorangegangenen 12 Monaten. Hier betrug der Korrelationskoeffizient -0,098, der p-Wert 0,559.
Abb. 10 zeigt die graphische Darstellung der Knochendichte im Verhältnis zur Methylprednisolondosis. Man sieht eine in der Tendenz fallende Regressionsgerade, was bedeutet, dass bei höherer Methylprednisolondosis die durchschnittliche Knochendichte geringer ist.


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Abb. 10: Ergebnisse der Knochendichtemessungen (A: LWS, B: Schenkelhals) in Abhängigkeit von der durchschnittlichen Methylprednisolondosis in den vorausgegangenen 12 Monaten. Die senkrechten Linien teilen die Dosisgruppe 1 von der Dosisgruppe 2, die waagerechten geben die Richtwerte bei der Osteodensitometrie an. Eingezeichnet ist auch die jeweilige Regressionsgerade. Für die Werte der Korrelationskoeffizienten siehe o.a. Text.


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3.1.2.2  Knochenumsatzparameter

Knochenaufbauparameter: Bei keinem Patienten war die alkalische Phosphatase (AP) oder die knochenspezifische AP erhöht. 14 Patienten (33,3 %) wiesen einen erhöhten Osteocalcin-Wert auf. Von diesen bekamen vier eine Bisphosphonat-Behandlung, eine Patientin erhielt ein Östrogenpräparat.
Knochenabbauparameter: Bei 17 Patienten (40,5 %) war das Pyridinolin erhöht, bei elf (26,2 %) von diesen 17 auch das Desoxypyridinolin. Ein Patient hatte erhöhtes Desoxypyridinolin ohne erhöhtes Pyridinolin. Vier Patienten (9,5 %) wiesen einen erhöhten Wert für N-Telopeptid auf.
Vitamin D: Vier (9,5 %) Patienten hatten erniedrigte Werte für Calcidiol, zwölf (28,6 %) für Calcitriol.
Bei keinem Parameter gab es einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Dosisgruppen.
Seibel bezeichnet die Knochenmasse als statische, die biochemischen Marker als dynamische Größe. Sie seien somit zwei komplementäre diagnostische Verfahren, die sich ergänzten.[70] Wie in Kapitel 2.1.5. dargelegt, eignen sie sich neben der Knochendichte als weitere Werte zur Vorhersage zukünftiger Frakturen. Aus diesem Grund sind in Tabelle 6 den Ergebnissen der Knochendichtemessung zwei biochemische Knochenabbauparameter gegenübergestellt.

Tabelle 6: Anzahl der Patienten mit normalen und pathologischen Werten für Knochendichte und zwei biochemische Knochenabbauparameter (Pyridinolin und Desoxypyridinolin)

 

Pyridinolin /

Desoxypyridinolin

erhöht

Pyridinolin /

Desoxypyridinolin

normal

Gesamt

normale Knochendichte

6

7

13

Osteopenie / Osteoporose

12

17

29

Gesamt

18

24

42

41,4 % der Patienten mit verminderter Knochendichte wiesen demnach erhöhte Knochenabbauparameter auf. Demgegenüber zeigten 46,2 % der Patienten mit normaler Knochendichte erhöhte biochemische Marker.

3.1.2.3 Schmerzen der Wirbelsäule (Osteoporoseschmerzen)

Bewegungsschmerz (Anamnese)


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Insgesamt 14 Patienten (33,3 %) gaben anamnestisch einen Bewegungsschmerz an (fünf [23,8 %] in Gruppe 1 und neun [42,9 %] in Gruppe 2). Auch hier zeigte der p-Wert mit 0,328 keinen signifikanten Unterschied.

Osteoporoseschmerzen (Anamnese)

Die Patienten wurden in der Anamnese nach Rückenschmerzen gefragt, die im Laufe des Tages und bei Belastung stärker werden bzw. beim Liegen und nachts nachlassen. Diese Art der Schmerzen wurde nochmals unterteilt in Schmerzen in Ruhe und bei Belastung. In Ruhe gaben ein Patient (4,8 %) der Gruppe 1 und fünf Patienten (23,8 %) der Gruppe 2 derartige Schmerzen an. Hier lässt sich eine Tendenz erkennen, wonach eine erhöhte Glucocorticoiddosis mehr osteoporosetypische Schmerzen hervorruft (p-Wert aus Chi-Quadrat nach Pearson: 0,067). Unter Belastung zeigten beide Dosisgruppen dagegen fast den gleichen Anteil an Patienten mit ostoporoseartigen Schmerzen (42,9 % in Gruppe 1, 38,1 % in Gruppe 2).

Osteoporoseschmerzen (Visuelle Analogskala)

Bei der Einschätzung der Schmerzen durch die Patienten auf einer visuellen Analogskala zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Dosisgruppen. Die durchschnittlichen Werte betrugen 9,64 mm (Gruppe 1) und 28,76 mm (Gruppe 2), die Mediane betrugen 1 mm bzw. 15 mm. Der p-Wert, ermittelt durch nichtparametrischen Test nach Mann-Whitney-U, betrug 0,042.

Klopfschmerz (Klinik)

Bei zwei Patienten (9,5 %) in der unteren und sechs (28,6 %) in der oberen Dosisgruppe zeigte sich klinisch eine klopfschmerzhafte Wirbelsäule. Es war jedoch mit einem p-Wert von 0,178 kein signifikanter Unterschied festzustellen.

3.1.2.4 Cushing-Symptomatik

Über die Hälfte der Patienten (52,4 % nach Angaben der Patienten, 61,9 % nach Angaben des Arztes) wies eine mehr oder weniger starke Cushing-Symptomatik (Fettumverteilung à „Mondgesicht“, „Büffelnacken“, allgemeine Gewichtszunahme; Akne; Gesichtsrötung) auf (Abb.11). Die Zahl ist in der oberen Dosisgruppe etwas höher. Es besteht jedoch kein signifikanter Unterschied (p-Wert aus Chi-Quadrat nach Pearson 0,217 bei Patientenangaben, 0,204 bei Arztangaben).


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Abb. 11: Zahl der Patienten (keine Unterscheidung nach Dosisgruppen) mit unterschiedlich ausgeprägter Cushing-Symptomatik. n=42

3.1.2.5 Typische Hautveränderungen bei Glucocorticoidtherapie

Pergamenthaut und Unterblutungen sind typische durch Glucocorticoide verursachte Hautveränderungen. Wir fanden, dass in den zwei Vergleichsgruppen jeweils ca. ¾ der Patienten diese Veränderungen aufwiesen. Dagegen verzeichneten nur drei von 42 Patienten Striae distensae (Abb. 12). Auch bei diesen Veränderungen fand sich kein signifikanter Unterschied zwischen den zwei Dosisgruppen.

Abb. 12: Zahl der Patienten (keine Unterscheidung nach Dosisgruppen) mit typischen GC-induzierten Hautveränderungen. n=42


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3.1.2.6  Veränderung des Augeninnendrucks

In der unteren Dosisgruppe gab eine Person (4,8 %) einen erhöhten Augeninnendruck an. Dies war deutlich weniger als in der oberen Dosisgruppe. Dort berichteten fünf Personen (23,8 %) von diesem Symptom. Es zeigte sich eine Tendenz, aber mit einem p-Wert von 0,101 kein signifikanter Unterschied.

3.1.2.7 Krankheitsaktivitätsparameter

Die Werte Blutkörperchensenkungsgeschwindigkeit (BSG) sowie das C-reaktive Protein (CRP) bewegten sich allgemein in einem gut kontrollierten Bereich. Median und Durchschnittswert betrugen für die BSG jeweils etwa 25 mm/1. Stunde. Insgesamt neun Patienten wiesen eine BSG von mehr als 30 mm/1. Stunde auf. Ein Patient zeigte einen Spitzenwert von 67 mm/1. Stunde. Das CRP war in Gruppe 2 mit durchschnittlich 1,3 mg/dl (Median: 0,73 mg/dl) etwas höher als in Gruppe 1 (Durchschnitt: 0,73 mg/ml, Median 0,59 mg/dl), ein signifikanter oder tendenzieller Unterschied zeigte sich jedoch nicht (p-Werte jeweils größer 0,1). Fünf Patienten (11,9 %) hatten ein CRP > 2 mg/dl, ein Patient einen Spitzenwert von 6,49 mg/dl. (Dieser zeigte eine BSG von 25 mm/h.)
Auch bei der Einschätzung der Krankheitsaktivität durch Arzt und Patient mittels visueller Analogskala zeigte sich kein statistisch relevanter Unterschied zwischen den Dosisgruppen (p-Wert nach Mann-Whitney-U 0,927 bzw. 0,426). Hier waren die Werte der Selbsteinschätzung der Patienten in der unteren Dosisgruppe leicht höher als in der oberen (Median Gruppe 1: 48 mm, Gruppe 2: 37 mm), während die ärztliche Einschätzung jeweils ca. 20 mm im Median betrug.

3.1.2.8 Blutfette

Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen den Dosisgruppen bei den Blutkonzentrationen für Triglyceride und Gesamtcholesterin. Der Durchschnittswert aller untersuchten Patienten für Triglyceride betrug 170 mg/dl bei einem Median von 135,5 mg/dl. Bei dem Gesamtcholesterin betrug der Durchschnittswert 246,2 mg/dl, der Median ist 242 mg/dl.

3.1.2.9 Lebensqualität

In keinem der vom Short Form 36 abgefragten Kategorien unterschieden sich die beiden Dosisgruppen signifikant voneinander. Es waren auch keine Tendenzen auszumachen (Tabelle 7).


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Tabelle 7: Unterschied zwischen den zwei Dosisgruppen im Hinblick auf die einzelnen Parameter des SF-36 Fragebogens

SF-36-Kategorie

p-Wert für den Unterschied zwischen Dosisgruppe 1 und 2

Körperliche Funktionsfähigkeit

0,588

Körperliche Rollenfunktion

0,883

Körperliche Schmerzen

0,869

Allgemeine Gesundheitswahrnehmung

0,944

Vitalität

0,235

Soziale Funktionsfähigkeit

0,790

Emotionale Rollenfunktion

0,575

Psychisches Wohlbefinden

0,592

Körperliche Funktionsfähigkeit: Ausmaß, in dem der Gesundheitszustand körperliche Aktivitäten wie Selbstversorgung, Gehen, Treppen steigen, Bücken, Heben und mittelschwere oder anstrengende Tätigkeiten beeinträchtigt.
Körperliche Rollenfunktion: Ausmaß, in dem der körperliche Gesundheitszustand die Arbeit oder andere tägliche Aktivitäten beeinträchtigt, z.B. weniger schaffen als gewöhnlich, Einschränkungen in der Art der Aktivitäten oder Schwierigkeiten, bestimmte Aktivitäten auszuführen.
Körperliche Schmerzen: Ausmaß der Schmerzen und Einfluss der Schmerzen auf die normale Arbeit, sowohl im als auch außerhalb des Hauses.
Allgemeine Gesundheitswahrnehmung: Persönliche Beurteilung der Gesundheit, einschließlich aktueller Gesundheitszustand, zukünftige Erwartungen und Widerstandsfähigkeit gegenüber Erkrankungen.
Vitalität: Sich energiegeladen und voller Schwung fühlen versus müde und erschöpft.
Soziale Funktionsfähigkeit: Ausmaß, in dem die körperliche Gesundheit oder emotionale Probleme normale soziale Aktivität beeinträchtigen.
Emotionale Rollenfunktion: Ausmaß, in dem emotionale Probleme die Arbeit oder andere tägliche Aktivitäten beeinträchtigen; u.a. weniger Zeit aufbringen, weniger schaffen und nicht so sorgfältig wie üblich arbeiten.
Psychisches Wohlbefinden: Allgemeine psychische Gesundheit, einschließlich Depression, Angst, emotionale und verhaltensbezogene Kontrolle, allgemeine positive Gestimmtheit.
(aus: SF-36 Fragebogen zum Gesundheitszustand – Handanweisungen, Monika Bullinger und Inge Kirchberger, Hogrefe-Verlag, Göttingen, Bern, Toronto, Seattle, 1998)[87]

Im Vergleich zu einer deutschen Normpopulation sind die Werte des Studienkollektivs deutlich niedriger, was einem insgesamt schlechteren Gesundheitszustand entspricht. Abb. 13 zeigt die graphische Darstellung der beiden verglichenen Kollektive. Da das Normkollektiv eine nahezu paritätische Verteilung von männlichem und weiblichen Geschlecht aufweist, bei den untersuchten Patienten aber der weibliche Anteil stark überwog, werden in Abb. 14 die Geschlechter ge[Seite 45↓]trennt dargestellt. Da die Werte der weiblichen Normalbevölkerung durchweg etwas niedriger sind, vermindert sich auch der Unterschied zum untersuchten Kollektiv geringfügig.

Abb. 13: Vergleich der Scores in den einzelnen Kategorien des SF-36-Fragebogens zwischen dem Studienkollektiv und einer bundesdeutschen Normpopulation. Daten aus: SF-36 Fragebogen zum Gesundheitszustand – Handanweisungen, a.a.O.[87]


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Abb. 14: Vergleich der Scores in den einzelnen Kategorien des SF-36-Fragebogens zwischen dem Studienkollektiv und einer bundesdeutschen Normpopulation, differenziert nach dem Geschlecht. Daten aus: SF-36 Fragebogen zum Gesundheitszustand – Handanweisungen, a.a.O.[87]

Die Auswertung des SF-36 erlaubt die Differenzierung in sog. körperliche und psychische Summenskalen.[87] Hierbei werden die einzelnen Kategorien gemäß ihrer Aussagekraft für den psychischen bzw. körperlichen Gesundheitszustand gewichtet. Die Auswertung erfolgt durch Berechnung von z-Werten für jede Subskala des SF-36. Hierfür wird der Mittelwert einer amerikanischen Normpopulation vom Mittelwert der untersuchten Population subtrahiert und das Ergebnis durch die Standardabweichung der amerikanischen Normstichprobe dividiert. Durch Multiplikation der z-Werte mit Regressionskoeffizienten für die körperlichen und psychischen Faktoren der einzelnen SF-36-Subskalen erhält man die Rohwerte der Summenskalen. Höhere Werte entsprechen einem besseren Gesundheitszustand. Der Mittelwert der US-amerikanischen Normpopulation ist auf den Wert 50 normiert. Abb. 15 zeigt den Vergleich der psychischen und körperlichen Summenskalen.


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Abb. 15: Vergleich des Studienkollektivs mit bundesdeutschen Normpopulationen hinsichtlich der körperlichen und psychischen Summenskalen. Die Standardisierung erfolgt im Vergleich zu einer US-amerikanischen Normpopulation (Mittelwert = 50)

Man erkennt, dass die körperliche Summenskala deutlich stärker von den Vergleichswerten der Normpopulation nach unten abweicht als die psychische. Das Studienkollektiv zeigt mit ca. 30 einen deutlich niedrigeren Wert in der körperlichen Summenskala. Dies entspricht einem schlechteren physischen Gesundheitszustand.


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3.2  Durchflusszytometrische Experimente

3.2.1 Ableitung der Standardisierungsbedingungen

3.2.1.1 Messung der mGCR-Expression auf CCRF-CEM-Zellen in Abhängigkeit von der Wachstumszeit nach Auftauen

Die CCRF-CEM-Zelllinie diente als Färbekontrolle für unsere Experimente. Gametchu et al. wiesen die mGCR auf diesen Zellen zuerst nach und berichteten, dass die Zahl der pro Zelle exprimierten mGCR vom Zellzyklus abhängig ist.[44] Wir untersuchten daher zunächst, zu welchem Zeitpunkt die Expression verlässlich nachweisbar ist, um eine gut verwendbare Kontrolle zu erhalten.
Zu diesem Zweck wurden drei Aliquots zur gleichen Zeit aufgetaut und im Brutschrank inkubiert. Die mGCR-Expression wurde für das erste Aliquot 17 Stunden, für das zweite 41,5 Stunden und für das dritte 65 Stunden nach Aussetzung gemessen. Als Primärantikörper diente das antiGCR-FITC-Konjugat von Frau Dr. Berki. Ihm zugesetzt wurden das antiFITC-Dig-Konjugat sowie die antiDig-Liposomen (primär verwendetes Färbesystem, siehe Kap. 2.2.3.2.).
Zum ersten Zeitpunkt waren 4,98 % der Zellen positiv (Hintergrund: 0,62 % / Färbung: 8,56 % / Block: 3,58 %). Nach 41,5 Stunden waren 30,43 % der Zellen (0,17 % / 37,21 % / 6,78 %) und nach 65 Stunden noch 19,18 % der Zellen positiv (0,71 % / 30,51 % / 11,33 %).
Nach 41,5 Stunden war also die Expression am höchsten. Daher wurden im Weiteren CCRF-CEM-Zellen 39 – 42 h nach dem Auftauen als Kontrolle mitgeführt.

3.2.1.2 Optimierung des Antikörper-Färbesystems

Das Färbesystem antiGCR-FITC àantiFITC-Dig àantiDig-Liposomen zeigte zwar eindeutige Färbeergebnisse. Allerdings ließ sich auch nach der Inkubation mit höheren Konzentrationen des unmarkierten antiGCR-Antikörpers kaum ein Block-Ergebnis unter 5% erreichen; die unspezifische Färbung war zu hoch. Wir vermuteten eine Aggregatbildung der FITC-markierten Antikörper, wodurch möglicherweise auch einige unspezifische Epitope besetzt worden waren.
Wir versuchten daher zunächst, mögliche Aggregate durch Zentrifugieren bei 22000g für 10 Minuten zu separieren. Der Überstand wurde weiter verwendet. Außerdem inkubierten wir die Antikörpersuspension mit großen Mengen PBMC mit dem Ziel, eben diese Aggregate „herauszuwaschen“, indem sie an den Blutzellen hängen bleiben.
Da dies nicht den gewünschten Erfolg brachte, wechselten wir das Färbesystem, indem wir eine Direktkopplung der antiGCR-Antikörper mit Digoxigenin vornahmen. Daraus resultierte also folgendes Färbesystem: antiGCR-Dig àantiDig-Liposomen (siehe Abb. 8 und 9).


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3.2.1.3  Antikörper-Konjugation, Färbe- und Block-AK-Konzentrationen

Zunächst wurden Versuche durchgeführt, um das neue Färbesystem zu optimieren. Dazu gehörte die Identifizierung

  1. des optimalen Hapten : Antikörper-Verhältnisses,
  2. der optimalen Konzentration des Färbe-Antikörpers und
  3. der optimalen Konzentration des unmarkierten Antikörpers.

Zur Austitrierung des antiGCR-Dig-Konjugats wurde die CCRF-CEM-Zelllinie verwendet. Für die Färbekonzentration wurden fünf verschiedene Verdünnungen getestet (1:500, 1:200, 1:100, 1:50 und 1:25). Darüber hinaus wurden drei verschiedene Konjugations-Verhältnisse (das heißt die Zahl von Haptenen, die mit einem Antikörper-Protein konjugiert werden) getestet: 10:1, 30:1 sowie 50:1. Es zeigte sich, dass der Ansatz mit dem Molverhältnis von 10:1 (Hapten : AK) bei einer Verdünnung von 1:50 die besten Ergebnisse aufwies. Bei den Ansätzen 30:1 und 50:1 gab es jeweils eine sehr hohe unspezifische Färbung.
Die Verdünnung von 1:50 entspricht einer Färbekonzentration von ca. 7 µg/ml (Proteinkonz.: 0,356 mg/ml). Nach Blockade zeigte sich eine Anzahl positiver CCRF-CEM-Zellen von deutlich unter 5 %. Mit diesem Messsystem waren in der Nettofärbung durchschnittlich 10,7 % der Zellen positiv für mGCR.
Um den erwähnten Block zu erreichen, wurde der unmarkierte Antikörper in ca. 70fachem Überschuss eingesetzt (15 µl auf 40µl Gesamtfärbevolumen bei einer Proteinkonzentration zwischen 1,3 und 1,4 mg/ml).

3.2.1.4 Blockade durch Vorinkubation der antiGCR-AK mit dem Antigen APTEK26

Die Blockade der Färbung durch unmarkierte Antikörper im Überschuss zeigte bereits die Spezifität der Markierung in der Durchflusszytometrie. Dennoch sollte dieses Ergebnis noch untermauert werden, indem eine epitopspezifische Blockade mit APTEK26 durchgeführt wurde. Es handelt sich um das 26 Aminosäuren lange Peptidfragment aus der Regulationssequenz des Glucocorticoidrezeptors (von Position 150 bis 176), welches für die Produktion der Antikörper verwendet wurde. Es stellt das Epitop dar, gegen das diese Antikörper gerichtet sind (siehe Abb. 2). Zur Blockade wurde der Färbeantikörper mit dem Antigen vorinkubiert. Dafür wurden in 30 µl PBS/BSA/NaN3 2 µl des Färbeantikörpers mit 2 µl des Antigens (Konz. 1 mg/ml) für 30 Minuten auf Eis inkubiert.
Der Block fiel meist etwas schwächer aus als mit unmarkiertem Antikörper, war aber dennoch deutlich, was auf die Spezifität der Färbung hinweist. Abb. 16 zeigt eine typische Färbung.


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Abb. 16: Nachweis der Spezifität der Färbung durch Blockade des Signals nach Vorinkubation des antiGCR-Antikörpers mit dem Epitop-Peptid APTEK26

3.2.2 Intrazelluläre Färbung der CCRF-CEM-Zellen

Die intrazelluläre Färbung dient der Detektion der zytosolischen GCR. Sie erfolgte mit antiGCR-Dig als Primär- und antiDig-Cy5 als Sekundärantikörper. Es zeigte sich, dass alle CCRF-CEM-Zellen positiv für iGCR waren. Die Blockade war nahezu vollständig, was auf eine spezifische Färbung hinweist (Abb. 17).

Abb. 17: Intrazelluläre Färbung der CCRF-CEM-Zellen.

Es handelte sich um eine homogene Population, bei der alle Zellen gefärbt und blockiert wurden. Daher ist hier die durchschnittliche Fluoreszenzintensität (Mean Fluorescence Intensity, MFI) angegeben. Diese war nach Blockade so hoch wie bei der Kontrolle, was die Spezifität der Färbung bestätigt.


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3.2.3  Vergleich der konventionellen Oberflächenfärbung mit der Liposomenfärbung

Wir verglichen die Oberflächenfärbungen vitaler Zellen der CCRF-CEM-Zelllinie nach konventioneller Methode sowie nach der hochsensitiven Immunfluoreszenzmethode mittels Liposomen. Für die konventionelle Färbung kam das gleiche Färbesystem wie für die intrazelluläre Färbung zum Einsatz (antiGCR-Dig àantiDig-Cy5). Die Zellen wurden allerdings nicht permeabilisiert. Das Ergebnis ist in Abb. 18 dargestellt.

Abb. 18: Oberflächenfärbung auf CCRF-CEM-Zellen. A: konventionelle Färbung, B: Liposomenfärbung

Die Abbildungen zeigen, dass es nur mit der Liposomenfärbung gelingt, die durch Gametchu et al. identifizierten membranständige Rezeptoren in ihrer Existenz zu bestätigen. Die konventionelle Färbung ist dazu nicht in der Lage. Es gibt keinen signifikanten Unterschied der MFI zwischen Kontrolle, Färbung und Block. Das System, das zuvor alle Zellen positiv für zytosolische GCR testete, zeigt demnach kein spezifisches Signal für Oberflächenrezeptoren. Im gleichen Versuchsansatz wurden mit der Liposomenfärbung über 7,5 % der Zellen (Nettofärbung) positiv detektiert.


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3.2.4  Untersuchungsergebnisse gesunder Probanden

Nach erfolgreicher Etablierung und Optimierung des Liposomentestsystems wurde zunächst eine Messreihe mit den PBMC gesunder Probanden durchgeführt, um Normalwerte zu erhalten. Vorausgegangene Experimente wiesen darauf hin, dass sich auch bei Gesunden mGCR nachweisen lassen. Dieser Nachweis gelang vor allem auf den Monozyten deutlich. Wir untersuchten insgesamt 14 Probanden im Alter zwischen 21 und 44 Jahren. Von diesen waren vier weiblich und zehn männlich. Eine genaue Befragung ergab, dass drei Probanden in den vorausgegangenen vier Wochen einen Infekt (grippaler Infekt, Tonsillitis, fiebrige Erkältung) durchgemacht hatten. Diese wiesen im Vergleich zu den anderen z.T. deutlich höhere Werte an mGCR-positiven Monozyten auf. Sie wurden daher nicht für die Erfassung der Normalwerte herangezogen.
Die verbleibenden 11 Probanden (acht männlich, drei weiblich) wiesen durchweg keine Färbung auf T-Lymphozyten auf. Auf B-Lymphozyten und Monozyten ergab sich folgendes Bild:

Tabelle 8: mGCR-Expression bei gesunden Spendern (n = 11)

Zelltyp

durchschnittliche mGCR-Expression in %

Standardabweichung

Minimum / Maximum in %

Median in %

B-Lymphozyten

2,79

1,22

0,2 / 5,04

2,64

Monozyten

4,67

1,33

2,96 / 7,16

4,23

Dies bedeutet, dass bei gesunden Individuen durchschnittlich ca. 4,5 % der Monozyten und knapp 3 % der B-Lymphozyten mGCR exprimieren.
Bei den Probanden mit Zustand nach einem Infekt zeigte sich ebenfalls keine Expression auf T-Lymphozyten. Auf den anderen zwei Zellarten erzielten wir folgendes Ergebnis:


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Tabelle 9: mGCR-Expression bei Spendern, die aufgrund vorausgegangener Infekte aus der Gruppe der „Gesunden“ ausgeschlossen wurden

Proband

Zelltyp

mGCR-Expression in %

Ausschlussgrund

1 (männlich, 28 Jahre)

B-Lymphozyten

Monozyten

0,98

11,36

fiebrige Erkältung ca. 20 Tage zuvor

2 (männlich, 36 Jahre)

B-Lymphozyten

Monozyten

8,09

17,17

grippaler Infekt ca. 14 Tage zuvor

3 (weiblich,

28 Jahre)

B-Lymphozyten

Monozyten

7,54

28,51

Tonsillitis, unspezifische Arthritis

Proband 2 und 3 konnten nochmals im Verlauf gemessen werden. Nach einem Monat waren die Werte für Probandin 3 auf 12,52 % positive Monozyten und 5,58 % positive B-Lymphozyten gesunken – bei auskurierter Tonsillitis und deutlich verminderter Arthritissymptomatik. Proband 2 hatte sich einen Tag nach der Messung einer Tetanus-Diphtherie-Auffrischimpfung unterzogen. Bei ihm waren die Werte nach einem Monat sogar noch höher. Es stellte sich daher die Frage, inwiefern allgemein Immunstimuli wie Infektionen, Entzündungen oder Impfungen auch die Expression von mGCR – zumindest auf Monozyten – stimulieren.

3.2.5 Systematische Untersuchung von Probanden mit Hepatitis B-Impfung

Um diese Frage zu klären, untersuchten wir die mGCR-Expression auf PBMC von 2 Probanden, die sich zeitgleich einer 3. Hepatitis-B-Auffrischimpfung unterzogen. Es wurden jeweils 6 Messungen innerhalb eines Zeitraums von bis zu 3 Monaten durchgeführt.
Abbildung 19 zeigt die Resultate auf Monozyten und B-Lymphozyten. T-Lymphozyten wiesen keine Färbung auf. Abbildung 20 zeigt die Resultate von Proband 2 in der Plot-Darstellung des Durchflusszytometers.


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Abb. 19: mGCR-Expression auf Monozyten und B-Lymphozyten nach Impfung im Verlauf (Nettofärbung). Der Pfeil markiert jeweils den Zeitpunkt, an dem Proband 1 an einem grippalen Infekt erkrankte.


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Abb. 20: Verlauf der Messung von mGCR auf Monozyten im Zusammenhang mit einer Hepatitis-B-Impfung. Die Buchstaben markieren die Zeitpunkte. Zeitpunkt A ist unmittelbar vor der Impfung, B am sechsten Tag, C einen Monat und D sieben Wochen nach der Impfung. Es werden jeweils die Kontrolle, die Absolutfärbung sowie die Färbung nach Blockierung dargestellt. Die Nettowerte (spezifische Färbung) ergeben sich jeweils aus der Differenz zwischen Absolutfärbung und Färbung nach Block.


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Man erkennt, dass bei der 3. Messung sechs Tage nach der Impfung die Werte für mGCR-positive Monozyten deutlich angestiegen sind. Im weiteren Verlauf fielen die Werte langsam über Wochen ab. Die Messungen erfolgten jeweils so lange, bis sich die Werte wieder an die der Anfangsmessung angenähert hatten. Dies dauerte bei Proband 1 mehr als einen Monat länger als bei Proband 2. Als Ursache hierfür diskutieren wir einen grippalen Infekt, an dem Proband 1 circa 2 Wochen nach der Impfung erkrankt war. Der Zeitpunkt ist in der Abbildung 19 zu erkennen.
Bei den B-Lymphozyten ist der Verlauf zunächst ähnlich wie bei den Monozyten. Allerdings sieht man einen deutlich schnelleren Abfall der Werte bei geringeren Maximalwerten.

3.2.6 Messung der mGCR auf PBMC einer unbehandelten SLE-Patientin

Es wurde eine Patientin untersucht, die an einem Systemischen Lupus erythematodes leidet und im akuten Schub stationär eingewiesen wurde. Sie hatte zuvor ohne ärztliche Rücksprache alle verordneten Medikamente abgesetzt. Die Blutabnahme erfolgte, nachdem am Abend zuvor eine hochdosierte Glucocorticoidtherapie mit 100 mg Prednisolon begonnen worden war.
Auf T-Lymphozyten ließ sich keine Expression von mGCR nachweisen.
Die B-Lymphozyten zeigten mit einer spezifischen Färbung von 2,77 % keine erhöhten Werte im Vergleich zum gesunden Kontrollkollektiv.
Die Monozyten dagegen wiesen mit einer spezifischen Färbung (Nettofärbung) von 36,76 % den höchsten überhaupt gemessenen Wert auf.

3.2.7 Messung der mGCR auf PBMC von Patienten mit rheumatoider Arthritis

In einer weiteren Gruppe von Experimenten sollte die Expression von mGCR auf PBMC bei Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen untersucht werden. Die Messungen an den geimpften Probanden ließ einen Einfluss immunologischer Aktivität auf die Expression von mGCR vermuten. Im Hinblick auf die klinisch-therapeutische Relevanz sollten diese Experimente nun zeigen, ob ein Zusammenhang besteht zwischen (autoimmuner) Krankheitsaktivität und der Expression von mGCR. Um ein möglichst einheitliches Kollektiv zu erhalten, wurden nur Patienten mit einer rheumatoiden Arthritis eingeschlossen, da die Aktivität dieser Erkrankung gut zu erfassen und zu beschreiben ist. Sie wurden aus einer klinisch sehr gut charakterisierten Patientengruppe in unserer Klinik rekrutiert. Wir untersuchten 19 Patientinnen und Patienten im Alter von 31 bis 72 Jahren (im Durchschnitt 50,5 Jahre). Von diesen waren 4 männlich und 15 weiblich.
Es fiel auf, dass bei vielen dieser Patienten vor allem unter den Monozyten ein relativ großer [Seite 57↓]Prozentsatz der Zellen positiv für mGCR war. Die T-Lymphozyten zeigten in keinem Fall eine mGCR-Expression. Tabelle 10 zeigt die Werte für B-Lymphozyten und Monozyten.

Tabelle 10: mGCR-Expression bei Patienten mit rheumatoider Arthritis (n =19)

Zelltyp

durchschnittliche mGCR-Expression in %

Standardabweichung

Minimum / Maximum in %

Median in %

B-Lymphozyten

4,15

2,15

0,69 / 9,89

3,77

Monozyten

10,13

4,85

3,32 / 19,58

8,32

In Abbildung 21 sind die Verteilungen der mGCR-Expression bei gesunden Spendern und Patienten mit rheumatoider Arthritis einander gegenübergestellt.

Abb. 21: Histogrammdarstellung der Verteilungen der mGCR-Expression auf Monozyten bei gesunden Spendern und Patienten mit rheumatoider Arthritis

Mittelwert: 4,67

Standardabweichung: 1,33


[Seite 58↓]

Abb. 22: Korrelationen der mGCR-positiven Monozyten mit unterschiedlichen Krankheitsaktivitätsparametern. p=p-Wert, k=Korrelationskoeffizient


[Seite 59↓]

Abb. 23: Korrelationen der mGCR-positiven Monozyten mit unterschiedlichen Krankheitsaktivitätsparametern. p=p-Wert, k=Korrelationskoeffizient

Die jeweils eingezeichnete Regressionsgerade zeigt immer eine positive Korrelation. Dies bestätigt die Statistik. Da die Verteilungen der Werte der Variablen nicht einer Normalverteilung ent[Seite 60↓]sprachen, wurde der Spearman’sche Korrelationskoeffizient als Maß für einen monotonen Zusammenhang ermittelt.
In Tabelle 11 werden die Korrelationskoeffizienten sowie die p-Werte für die Signifikanz dargestellt:

Tabelle 11: Statistischer Zusammenhang zwischen mGCR-Expression auf Monozyten und verschiedenen Krankheitsaktivitätsparametern

Korrelation von mGCR-positiven Monozyten mit:

Korrelationskoeffizient (Spearman)

p-Wert

BSG

0,538

0,021

CRP

0,625

0,013

schmerzhafte Gelenke

0,663

0,005

geschwollene Gelenke

0,381

0,118 (nicht signifikant)

VAS 1

0,609

0,021

VAS 2

0,533

0,041

VAS 3

0,500

0,170 (nicht signifikant)

VAS 4

0,891

0,0002

DAS

0,808

0,001

VAS 1 = Einschätzung der Krankheitsaktivität durch Patient; VAS 2 = Einschätzung der Gelenkschmerzen durch Patient; VAS 3 = Einschätzung der allgemeinen Krankheitsaktivität durch Patient; VAS 4 = Einschätzung der Krankheitsaktivität durch Arzt; DAS = disease activity score. Die fett gedruckten Werte und Parameter markieren die statistisch signifikanten Korrelationen.

Die Einschätzungen der Aktivität der Krankheit (VAS 1) durch den Patienten, seiner Gelenkschmerzen (VAS 2) sowie des Gesundheitszustandes allgemein ohne die Symptome der Grunderkrankung (VAS 3) erfolgten jeweils zum Zeitpunkt der Untersuchung. Die Einschätzung des Arztes bezieht sich auf die globale Krankheitsaktivität (VAS 4) ebenfalls zum Zeitpunkt der Untersuchung.
Außer bei den geschwollenen Gelenken und bei dem VAS 3 (Einschätzung der allgemeinen Gesundheit durch den Patienten) zeigen alle Aktivitätsparameter eine signifikant positive Korrelation mit der Zahl mGCR-positiver Monozyten. Die höchste Korrelation weisen der VAS 4 (Aktivitätseinschätzung der Krankheit durch den Arzt) und der DAS (globaler Aktivitätsparameter) auf.
Für die B-Lymphozyten ließ sich weder graphisch noch rechnerisch ein Zusammenhang zwischen mGCR-Expression und Krankheitsaktivität erkennen. Es gab sowohl erhöhte Werte als auch solche, die sich im Bereich der Werte der gesunden Probanden bewegten. Auch Patienten mit [Seite 61↓]sehr hohen Werten auf den Monozyten wiesen zum Teil solch einen niedrigen Anteil mGCR-positiver B-Lymphozyten auf.
T-Lymphozyten zeigten bei keinem der Patienten eine signifikante Expression von mGCR.

3.2.8 Messung auf Granulozyten

Wir stellten bei humanen PBMC die Existenz von mGCR auf Monozyten und B-Lymphozyten, nicht aber auf T-Lymphozyten fest. In einem weiteren Versuchsansatz untersuchten wir Granulozyten auf mGCR-Expression. Hierzu wurde nach Abnahme der PBMC-reichen Interphase auch der Ficoll-Plasma-Rest im Falcon®-Röhrchen abpipettiert. Die aus Erythrozyten und Granulozyten bestehende unterste Schicht wurde 1:1 mit RPMI-Medium gemischt und sodann im Verhältnis 1:5 mit einem Lyse-Puffer versetzt. Nach 15 Minuten auf Eis waren die Erythrozyten lysiert, die verbleibenden Granulozyten wurden zweimal gewaschen. Die Färbeprozedur war die gleiche wie bei den PBMC.
Die Nettofärbung bei zwei Probanden betrug 0,16 bzw. 0,73 % (1,23 / 2,12 / 1,96; 0,93 / 2,83 / 2,1). Angesichts der Fehlerbreite der Methode ist dies nicht als positiver Nachweis zu werten. Diesen Experimenten zufolge werden also von Granulozyten keine mGCR exprimiert.


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14.05.2004