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4  Diskussion

Glucocorticoide sind aus der Behandlung vieler verschiedener Krankheiten nicht mehr weg zu denken. Bereits seit über einem halben Jahrhundert sind sie im klinischen Einsatz, und dennoch sind noch einige Fragen zu Mechanismen und klinischem Einsatz offen. Die dosisabhängigen Wirkungen und Nebenwirkungen im low-dose Bereich gehören ebenso dazu wie die weitere Aufklärung der molekularen Wirkmechanismen. Auf diesen beiden Gebieten soll die vorliegende Arbeit neue Erkenntnisse beitragen.

4.1 Untersuchungen zu Wirkungen, Nebenwirkungen und Lebensqualität bei Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen unter low-dose Glucocorticoidtherapie am Beispiel von Methylprednisolon

In den letzten Jahren hat sich die niedrig und niedrigst dosierte Glucocorticoidtherapie mehr und mehr durchgesetzt. Der Hintergrund dafür ist, dass die vielfältigen unerwünschten Wirkungen der Glucocorticoide bei erhaltener Wirksamkeit möglichst gering ausgeprägt sein sollen. Harris bezeichnete schon Anfang der 80er Jahre die low-dose Glucocorticoidtherapie als Brückentherapie für den Gebrauch mit anderen Antirheumatika.[88] Bis zu 15 mg Prednisolonäquivalent pro Tag kann man in der Literatur unter dem Begriff low-dose GC-Therapie finden. In letzter Zeit wird die Grenze allerdings häufig niedriger gezogen.[61] Es besteht weitgehende Einigkeit darüber, dass die unerwünschten Wirkungen mit steigender Dosis zu-, mit geringer werdender Dosis abnehmen.[11, 13] Ab welcher Dosierung von einem sicheren Gebrauch der GC gesprochen werden kann, bleibt jedoch kontrovers. Die Untersuchungen werden dadurch erschwert, dass bestimmte Wirkungen der GC manchmal nur unscharf von solchen der behandelten Grundkrankheit unterschieden werden können. Eine aktive rheumatoide Arthritis kann z.B. – wie die Behandlung mit GC – eine Osteoporose verursachen. Die Behandlung einer RA mit GC kann also einem Knochenabbau durch die Verminderung Krankheitsaktivität entgegenwirken; gleichzeitig erhöht sich durch die unerwünschte Wirkung des Medikaments das Risiko auf Entstehung einer Osteoporose.[89] Allerdings wird in einer großen Metaanalyse von Espallargues et al. die Einnahme von Corticosteroiden als hoher Risikofaktor für zukünftige Frakturen eingestuft, wogegen eine RA einen mittleren Risikofaktor darstellt.[90] Hatz geht davon aus, dass bei Langzeittherapien mit Dosierungen ≤ 5 mg Prednisolon-Äquivalent/die „eine klinische Wirkung ohne das übliche Nebenwirkungsprofil erreicht“ wird.[7] Wie bereits eingangs erwähnt, deuten neuere Studien jedoch darauf hin, dass bereits geringere tägliche Dosen Osteoporose verursachen können.[13, 14] Die Existenz einer „sicheren Dosierung“ ist daher zweifelhaft. Der erste Teil der [Seite 63↓]vorliegenden Arbeit sollte die Prävalenz einiger typischer Nebenwirkungen der Glucocorticoidbehandlung bei niedriger Dosierung untersuchen und sie ins Verhältnis zur Effektivität der Kontrolle der Krankheitsaktivität setzen. Außerdem sollte geprüft werden, inwiefern eine möglichst niedrige Dosiseinstellung (mit dem Risiko einer Reaktivierung der Grundkrankheit) sinnvoll ist im Hinblick auf die auftretenden unerwünschten Wirkungen. Hierzu existieren in der Literatur – im Kontrast zu der umfangreichen Anwendung der GC – nur wenige Angaben.
Ein wichtiges Kriterium unserer Studie war, dass gezielt nur Patienten mit Methylprednisolontherapie eingeschlossen wurden. Die Umrechnung der Glucocorticoiddosen auf Prednisolon-Äquivalenzdosen wurde in letzter Zeit häufiger als Vergleichsmaß problematisiert.[9, 48, 52] Hinsichtlich der relativen Wirkpotenz scheint es einen Unterschied für die genomischen und nicht-genomischen Wirkungen zu geben. Dieser Fakt könnte den Vergleich unterschiedlicher GC-Präparate auf Basis der herkömmlichen (genomischen) relativen Wirkpotenzen verfälschen. Da die von uns untersuchten Patienten nur ein Präparat erhielten, ließen sich die Dosierungen tatsächlich exakt vergleichen. Ein weiterer Vorteil der Studie ist, dass es sich bei den untersuchten Personen ausschließlich um Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen und damit um ein sehr homogenes Untersuchungskollektiv handelt.
Als Vergleichsmaßeinheit wählten wir die durchschnittliche tägliche Methylprednisolondosis in den vorausgegangenen zwölf Monaten. Die kumulative Gesamtdosis an Glucocorticoiden ließ sich nicht vollständig erheben, da die Daten hierfür vor dem Beobachtungszeitraum meist inkomplett waren. In der großen Studie von van Staa et al. wurde aber gezeigt, dass die tägliche Dosis relevanter für das Frakturrisiko war als die kumulative Dosis. Es gibt demnach einen monotonen Zusammenhang zwischen täglicher Dosis und Frakturrisiko scheinbar ohne Grenzwert, d.h. linear dosisabhängig. Dieser Zusammenhang war weniger stark ausgeprägt für die kumulative Dosis.[12]
Nach der bereits oben erwähnten standardisierten Nomenklatur für Glucocorticoid-Dosierungen vom August 2002 ist die Grenze für die low-dose GC-Therapie bei 7,5 mg PÄ/die zu ziehen. Alle Patienten in der Dosisgruppe 2 bekamen demnach eine „medium-dose“ GC-Therapie.[61]
Schließlich sollte die Untersuchung zur Lebensqualität zeigen, ob Wirkungen und Nebenwirkungen der Therapie in einem angemessenen Verhältnis zueinander stehen.

4.1.1 Unerwünschte Wirkungen

Verminderung der Knochendichte

Folgt man Caldwell et al., ist die GC-induzierte Osteoporose nach Diabetes mellitus und Hautveränderungen eine der häufigsten Nebenwirkungen der low-dose GC-Therapie.[10] Hinsichtlich [Seite 64↓]der Auswirkungen auf die Lebensqualität des behandelten Patienten ist ihre Bedeutung noch größer. Bei 30 bis 50 % der Patienten, die über längere Zeit mit GC behandelt werden, kommt es zu spontanen oder durch minimale Traumata (sog. „Bagatelltraumata“ oder „Niedrigenergietraumata“) ausgelöste Frakturen.[91] Nach van Staa sind 47 % aller Hüftfrakturen und 72 % aller Wirbelfrakturen auf den Gebrauch von Glucocorticoiden zurückzuführen.[92] Wie bereits dargestellt, fällt es schwer, eine feste Dosisschwelle für das Auftreten dieser Nebenwirkung auszumachen. Der Übergang ist wahrscheinlich fließend. Bei unseren Untersuchungen zeigte sich für Methylprednisolon-Dosierungen zwischen 1,58 und 15 mg/die, dass jeweils ca. 1/3 der Patienten normale Werte, eine Osteopenie beziehungsweise eine Osteoporose aufwiesen. Insgesamt über 2/3 der Patienten hatten damit eine signifikante Verringerung der Knochendichte. Diese hohe Zahl relativiert sich etwas, da sich in der untersuchten Gruppe viele postmenopausale Patientinnen befanden. Solche Patientinnen haben per se ein erhöhtes Risiko für eine Osteoporose.[93]
Die zwei miteinander verglichenen Dosisgruppen wiesen hinsichtlich der Grundkrankheiten und der weiteren Medikation mit Einfluss auf den Knochenstoffwechsel (z.B. Methotrexat, Bisphosphonate) eine ähnliche Verteilung auf. Auch die Alters- sowie die Geschlechtsverteilung, die ebenfalls Einfluss auf die Knochendichte haben,[68] unterschieden sich nur unwesentlich. In der graphischen Darstellung zeigt sich tendenziell, dass die Gruppe 2 mit der höheren Dosierung eine geringere Knochendichte hat. Die Regressionsgerade fällt sowohl bei der Messung der Lendenwirbelsäule als auch des Schenkelhalses zu höheren durchschnittlichen Dosierungen hin ab. Im Ergebnis zeigte sich allerdings kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den beiden gewählten Dosisgruppen, d.h. nach neuester Nomenklatur zwischen der low-dose und der medium-dose GC-Therapie.
Unsere Ergebnisse können analog der zitierten Autoren interpretiert werden: Der Verlust von Knochendichte mit dem erhöhten Risiko von Frakturen tritt dosisabhängig auch bei niedrigen und niedrigsten Dosierungen von Methylprednisolon auf. Zwischen einer Dosis von im Median 4 mg MP/die und 8,2 mg MP/die lässt sich kein signifikanter Unterschied feststellen. Eine Erklärung hierfür wäre, dass ein Grenzwert nicht eindeutig bestimmbar ist, ab dem ein Knochendichteverlust auftritt, da viele individuelle Faktoren einfließen. Es ist allerdings vorstellbar, dass sich bei höheren Patientenzahlen ein eindeutiger statistisch messbarer Unterschied zeigt.

Knochenumsatzparameter

Der Einfluss der Glucocorticoide auf die biochemischen Knochenmarker ist nicht eindeutig. Bei Patienten mit rheumatoider Arthritis führte eine kombinierte Therapie mit Prednisolon, Methotrexat und Sulfasalazin zu einer deutlichen Abnahme sämtlicher Knochenumsatzparameter. [Seite 65↓]Diese war stärker als bei alleiniger Behandlung mit Sulfasalazin.[89] Die Marker nahmen parallel zur durchschnittlichen BSG ab, was für einen Zusammenhang mit der Grunderkrankung spricht. Die Marker für den Knochenaufbau fielen schneller ab als die für den Knochenabbau, was nach den Autoren eine Erklärung für BMD-Verluste in der Frühphase der Therapie einer rheumatoiden Arthritis mit Glucocorticoiden sein könnte. In dieser Studie von Verhoeven et al. fiel der spinale BMD-Wert nach Therapiebeginn mit Prednisolon ab, während der femorale gleich blieb. Hier vermuteten die Autoren, dass sich GC-induzierte Knochendichteverluste und knochenschützende Effekte durch Reduktion der Krankheitsaktivität die Waage halten.
In unserer Untersuchung zeigte sich zunächst, dass nicht alle Patienten mit verminderter Knochendichte erhöhte Knochenabbauparameter aufwiesen. In diesem Zusammenhang ist zu diskutieren, dass der größte Knochendichteverlust innerhalb des ersten halben Jahres nach Beginn der GC-Therapie zu verzeichnen ist.[54, 58] Danach verläuft der Knochenabbau langsamer oder hält sogar inne. Die Patienten befinden sich also in einem steady state, in dem der Knochenaufbau ungefähr dem Knochenabbau entspricht. Somit treten nur unwesentliche Nettoeffekte auf. Da alle in unserer Studie eingeschlossenen Patienten bereits für mindestens ein Jahr die GC-Therapie bekamen, befanden sich vermutlich viele Patienten in diesem Stadium, was die niedrigen Abbauparameter bei einem Teil der Probanden erklären würde. Allerdings zeigten noch 18 Patienten (42,9 %) erhöhte Werte für Pyridinolin und Desoxypyridinolin.
Unter diesen Patienten mit erhöhten Werten wiesen in der Osteodensitometrie fast die Hälfte eine noch normale Knochendichte auf. Nimmt man die gängige Meinung vieler Autoren[69, 74, 76, 77, 78, 79, 80], besteht auch für diese Patienten ein erhöhtes Risiko für Frakturen. Neben dem Risikofaktor „niedrige Knochendichte“ steht der Risikofaktor „erhöhter Knochenumsatz“ als komplementärer Vorhersagewert. Dies würde bedeuten, dass auch bei diesen Patienten der Knochenabbauprozess im Gange ist. Demnach würden fünf Sechstel der Patienten (35 von 42) einen dieser beiden Risikofaktoren für eine Knochenfraktur aufweisen.
Zwischen den beiden Dosisgruppen zeigte sich kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Knochenumsatzparameter. Man kann also auch für diesen Wert nicht die Aussage treffen, dass die niedrigere durchschnittliche Dosis (4,11 mg Methylprednisolon/die) sicherer anzuwenden wäre als die höhere (9,04 mg MP/die). Umgekehrt sind demnach 9,04 mg MP/die nicht signifikant schädlicher als 4,11 mg MP/die. Allerdings muss auch hier darauf hingewiesen werden, dass der Vergleich dadurch erschwert wird, dass sich viele Patienten in beiden Gruppen vermutlich im steady state ihres Knochenumbaus befinden.


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Weitere unerwünschte Wirkungen

Es gibt sehr wenige Studien, die – jenseits der Osteoporose – die unerwünschten Wirkungen der GC im low-dose Bereich systematisch untersuchen. Häufige unerwünschte Wirkungen waren in unserer Studie: Schmerzen der Wirbelsäule, eine Cushing-Symptomatik, Pergamenthaut und Hautunterblutungen. Seltener traten Striae distensae und ein erhöhter Augeninnendruck auf.
Ein Drittel der Patienten gab Schmerzen in der Wirbelsäule bei Bewegung an. Es ist darauf hinzuweisen, dass die Aussage dieser Studie aufgrund der relativ geringen Patientenzahl limitiert ist. Weiterhin muss kritisch angemerkt werden, dass Rückenschmerzen auch durch andere, v.a. degenerative Erkrankungen hervorgerufen werden können. Der Unterschied von neun Patienten (Dosisgruppe 2) versus fünf Patienten (Dosisgruppe 1) mit Bewegungsschmerzen in der Wirbelsäule ist nicht signifikant (p-Wert 0,328). Allerdings zeigten andere Parameter, die auf osteoporosebedingte Schmerzen hindeuten, jeweils die gleiche Tendenz bis hin zu signifikanten Unterschieden. Zusammengefasst sagen sie aus, dass die Schmerzen in der Dosisgruppe 2 größer bzw. weiter verbreitet sind. So gab fast ein Viertel der Patienten in Dosisgruppe 2 osteoporosetypische Schmerzen in Ruhe an, während es in Dosisgruppe 1 mit einem Patienten knapp 5 % waren (p-Wert 0,067). Bei den osteoporosetypischen Schmerzen unter Belastung glichen sich dann die Werte der Gruppen wieder an. Sechs (28,6 %) gegenüber zwei (9,5 %) Patienten hatten eine klopfschmerzhafte Wirbelsäule. Schließlich zeigte sich bei der Erhebung der Schmerzstärke durch Osteoporose mittels visueller Analogskala ein signifikanter Unterschied zwischen den Dosisgruppen mit geringerer Schmerzintensität in der Dosisgruppe 1. Ob sich bei höherer Fallzahl noch deutlichere Unterschiede darstellen, werden die anschließenden Studien zeigen müssen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Schmerzen bedingt durch steroidinduzierte Osteoporose innerhalb des niedrig dosierten Bereichs unterhalb von 6 mg MP/die seltener auftreten.
Mehr als die Hälfte der Patienten hatte eine Cushing-Symptomatik, wobei sich kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Dosisgruppen zeigte. Auch Patienten unterhalb der sog. „Schwellendosis“ (s.o.) für diese Nebenwirkung von 7,5 mg PÄ/die wiesen demnach in hohem Maße eine derartige Fettumverteilung auf. Dies bestätigt die Aussage von Hatz, dass die Dosis für die Entstehung des Cushing-Syndroms individuell unterschiedlich ist.[7] Daher führt der Begriff „Cushing-Schwellendosis“ eher zu Verwirrungen und sollte vermieden werden. Die Fettstoffwechselstörungen waren jedoch meist nicht so stark ausgeprägt, dass sich Striae distensae bildeten. Insgesamt zeigten drei Patienten (7,1%) diese unerwünschte Wirkung von MP.
Etwa ¾ der Patienten wiesen Hautunterblutungen und Pergamenthaut auf. Auch hier zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Dosisgruppen. Die Verdünnung der Haut [Seite 67↓]sowie die Neigung zu Hautunterblutungen treten bei Methylprednisolongabe also bereits bei niedrigsten Dosierungen in großem Umfang auf. Dies bestätigt die Ergebnisse von Caldwell et al., nach denen Hautnebenwirkungen wie Atrophie und Einblutungen unterhalb von 10 mg PÄ/die häufig sind.[10]
Tripathi et al. untersuchten den Einfluss von Glucocorticoiden auf das Glaukomrisiko.[94] Sie bezeichneten danach 18 bis 36 % der allgemeinen Bevölkerung als sogenannte GC-Responder, die auf GC-Gabe mit einer Erhöhung des Augeninnendrucks reagieren. Diese Größenordnung wurde in unserer Untersuchung in der oberen Dosisgruppe erreicht. Bei einer durchschnittlichen Dosierung von 9,04 mg MP/die berichteten 5von 42 Patienten (23,8 %) von einer ophtalmologisch festgestellten Erhöhung des Augeninnendrucks. In der unteren Dosisgruppe (4,11 mg MP/die im Mittel) befand sich nur ein Patient (2,4 %) mit einer solchen Anamnese (p-Wert 0,101). Diese Ergebnisse sind angesichts der relativ kleinen Patientenzahl noch mit Vorsicht zu betrachten. Sie weisen jedoch erstmalig darauf hin, dass es bezüglich des Glaukomrisikos durchaus relevant sein könnte, ob weniger oder mehr als 6 mg MP/die verabreicht werden. Unterhalb von dieser Dosis wäre nach diesen Daten der Gebrauch von MP als relativ sicher im Hinblick auf das Glaukomrisiko anzusehen. Um eine größere Sicherheit für diese Feststellung zu erzielen, müssen jedoch größere Fallzahlen betrachtet werden.
Bei der Konzentration der Blutfette zeigte sich, dass die Triglyceride durchschnittlich nicht erhöht waren, während die Gesamtcholesterinwerte im Mittel oberhalb des Empfehlungsbereichs lagen. Statistisch relevante Unterschiede zwischen den Dosisgruppen waren nicht feststellbar. Insgesamt scheinen also die untersuchten Dosierungen keinen relevanten bzw. einen gleichartigen (4,11 mg MP/die wirkt wie 9,04 mg MP/die) Einfluss auf die Blutfette zu haben.

4.1.2 Kontrolle der Krankheitsaktivität

Es existieren bereits einige Studien, die belegen, dass niedrig dosierte GC die Krankheitsaktivität entzündlich-rheumatischer Erkrankungen wirksam kontrollieren können.[1, 8, 10, 89, 95, 96, 97, 98] In unserer Untersuchung bewegten sich die Aktivitätsparameter der Grundkrankheiten überwiegend im gut kontrollierten Bereich. Unter der niedrig dosierten Methylprednisolontherapie und ggf. mit Sekundärmedikation zeigte sich meist keine Exazerbation des entzündlich-rheumatischen Leidens. Es ließen sich allerdings Ausnahmen beobachten.
Die Aktivitätseinschätzung mittels VAS fiel durch den behandelnden Arzt meist geringer aus als durch die Patienten (jeweils ca. 20 mm in beiden Dosisgruppen bei Einschätzung durch den Arzt; 48 mm [Dosisgruppe 1] und 37 mm [Dosisgruppe 2] bei Einschätzung durch die Patienten). Diese Diskrepanz lässt sich durch die unterschiedlichen Bewertungsgrundlagen von Arzt und Patient [Seite 68↓]erklären. Der Arzt stützt sich auf die klinische Untersuchung sowie die Laborparameter. Der Patient / die Patientin bewertet vermutlich mehr seinen / ihren allgemeinen Gesundheitsstatus oder die Einschränkung durch die Erkrankung, die nicht notwendigerweise durch eine aktuell hohe entzündliche Aktivität verursacht wird (z.B. irreversible Gelenkschäden etc.). Diese Hypothese müsste in weiteren Untersuchungen überprüft werden. Nimmt man die Aktivitätseinschätzung durch den behandelnden Arzt (jeweils ca. 20 mm von 100 mm), so bewegte sich die Aktivität der entzündlich-rheumatischen Erkrankungen in beiden Dosisgruppen im unteren Bereich.
Die Entzündungsparameter BSG und CRP waren mit im Mittel 25,4 mm/1. Stunde bzw. 1,02 mg/dl nicht stark erhöht (Normwerte für BSG: Frauen: bis 50 Jahre < 20 mm/1. h, ab 50 Jahre < 30 mm/1. h; Männer: bis 50 Jahre < 15 mm/1. h, ab 50 Jahre < 20 mm/1. h – Normwert für CRP: < 0,50 mg/dl). Allerdings zeigten neun Patienten (21,4 %) eine BSG > 30, ein Patient hatte einen Wert größer 50 mm/1. Stunde. Auch für die CRP-Konzentrationen gab es in fünf Fällen Werte, die mit > 2 mg/dl klar erhöht waren. Hier fand sich ein Spitzenwert von 6,49 mg/dl. Bei diesem Patienten zeigte sich gleichzeitig eine moderate Erhöhung der BSG von 25 mm/1. Stunde.
Für keinen Krankheitsaktivitätsparameter konnte ein statistisch relevanter Unterschied zwischen den Dosisgruppen errechnet werden. Dies lässt sich so interpretieren, dass die Patienten im Wesentlichen die jeweils adäquate Dosierung ihrer antientzündlichen Therapie bekamen.
Insgesamt lassen sich die Ergebnisse so interpretieren, dass die low-dose GC-Therapie mit Methylprednisolon in der Lage ist, entzündlich-rheumatische Erkrankungen im Sinne einer Co-Medikation wirksam zu kontrollieren; es besteht jedoch ein labiles Gleichgewicht zwischen antientzündlicher Therapie und entzündlicher Aktivität des Körpers, das einer regelmäßigen Kontrolle bedarf, da in Einzelfällen Exazerbationen vorkommen können.

4.1.3 Befragung zur Lebensqualität

Der Short-Form 36 Fragebogen

Wir verwendeten den Short Form-36 Fragebogen zur Evaluierung der gesundheitsbezogenen Lebensqualität. Nach Bullinger et al. bezeichnet dieser Begriff ein psychologisches Konstrukt aus mindestens vier Komponenten: psychisches Befinden, körperliche Verfassung, soziale Beziehungen und funktionale Kompetenz der Befragten.[87] In der Ermittlung der Lebensqualität sollen neben klassischer Zielkriterien wie Verbesserung der Symptomatik und erhöhte Lebenserwartung auch die psychischen und sozialen Komponenten des Gesundheitsbegriffs (nach WHO-Definition)[99] einbezogen werden. Zudem sollen die Auswirkungen von Krankheit und Therapie auf die Patienten erfasst werden. Hieraus werden dann auch Rückschlüsse auf den Behandlungsbedarf erwartet.
[Seite 69↓]Die Auswertung der Fragebögen erfolgte gemäß der Handanweisung für den SF-36 von Bullinger und Kirchberger.[87] Es gibt unterschiedliche Möglichkeiten der Interpretation des SF-36. Eine ist der Vergleich der Patienten zu Referenzgruppen innerhalb derselben Erkrankung oder in Bezug auf eine gesunde Vergleichsgruppe. Die deutsche Normstichprobe, zu der wir unsere Ergebnisse ins Verhältnis setzten, ist charakterisiert durch ein Durchschnittsalter von 47,7 Jahren und einen Frauenanteil von 55,6 %. Das durchschnittliche Alter war in unserem Patientenkollektiv mit 52 Jahren nur geringfügig höher. Da in unserer Untersuchung der Anteil der Frauen mit 83,3 % deutlich größer war, setzten wir diese Ergebnisse auch getrennt ins Verhältnis zur weiblichen und männlichen deutschen Normstichprobe. Die Auswertung des SF-36 ermöglicht die standardisierte Ermittlung sogenannter Summenskalen für körperliche und psychische Kategorien. Mit diesen Summenskalen ist eine Differenzierung der Aussagen zu der gesundheitsbezogenen Lebensqualität in die psychischen und physischen Komponenten möglich.
Anhand unserer Ergebnisse konnten wir keinen signifikanten Unterschied der Lebensqualität zwischen der unteren und der oberen Dosisgruppe feststellen. Innerhalb der low-dose und der medium-dose Glucocorticoidtherapie ist die Dosishöhe also offensichtlich kein ausschlaggebender Faktor für die Lebensqualität.
Im Vergleich des gesamten Patientenkollektivs mit der Normalstichprobe fällt auf, dass sich Differenzen vor allem bei den physischen Kategorien wie Schmerzen oder der physischen Funktion zeigen. Bei den sozio-emotionalen Kategorien wie dem psychischen Wohlbefinden oder der sozialen Funktionsfähigkeit stellen sich die Testwerte näher an denen des gesunden Kontrollkollektivs dar. Dies verdeutlicht der Vergleich der körperlichen und psychischen Summenskalen. Hier fällt der Unterschied bei der körperlichen Summenskala wesentlich deutlicher aus. Trotz einer deutlichen körperlichen Beeinträchtigung scheint also das psychische und soziale Befinden i.d.R. nur wenig alteriert zu sein. Dies deckt sich größtenteils mit Ergebnissen bei Populationen von Patienten mit rheumatoider Arthritis. Auch bei diesen ist das körperliche Befinden deutlich stärker eingeschränkt als das psychosoziale.[100]

4.1.4 Zusammenfassung

Wir verglichen in der durchgeführten Studie zwei Patientengruppen mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen mit zwei unterschiedlichen mittleren Dosierungen von Methylprednisolon. Nach neuester Nomenklatur[61] beinhaltete die Dosisgruppe 1 Patienten mit einer low-dose GC-Therapie, während die Dosierungen der Dosisgruppe 2 einer niedrigen medium-dose Therapie entsprachen. Die Patienten erhielten diese Dosen über mindestens ein Jahr, befanden sich also im steady state bzgl. der Wirkungen / Nebenwirkungen. Dies bestätigt die [Seite 70↓]insgesamt gut kontrollierte Krankheitsaktivität. Hinsichtlich der unerwünschten Wirkungen ließen sich kaum statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen bestimmen. Bei folgenden Symptomen ließ sich allerdings eine Tendenz bzw. eine statistische Signifikanz hinsichtlich einer verstärkten Ausprägung in der Dosisgruppe 2 erkennen: Verringerung der Knochendichte, osteoporosetypische Rückenschmerzen und erhöhter Augeninnendruck. Es ist bei diesen Symptomen vorstellbar, dass bei einer größeren Patientenzahl statistisch relevante Unterschiede erkennbar werden. Für diese unerwünschten Wirkungen wäre es dann besonders sinnvoll und notwendig, die mittlere tägliche Dosis von Methylprednisolon innerhalb des untersuchten Bereichs so weit wie möglich zu reduzieren. Unabhängig von der Dosierung traten als sehr häufige Nebenwirkungen Verdünnungen und Unterblutungen der Haut sowie eine Cushing-Symptomatik auf.
Die Therapie war in den meisten Fällen offenbar geeignet für die Kontrolle der Krankheitsaktivität. In Einzelfällen waren jedoch hohe Entzündungswerte nachweisbar. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass eine niedrig dosierte GC-Therapie regelmäßig überwacht und die Dosierung ggf. angepasst werden muss.
Die gesundheitsbezogene Lebensqualität zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den Dosisgruppen. Es ist auffallend, dass die physische Lebensqualität deutlich stärker eingeschränkt ist als die psychosoziale im Vergleich zu einer gesunden Kontrollpopulation.


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4.2  Durchflusszytometrische Untersuchungen zum Nachweis von membranständigen Glucocorticoidrezeptoren

Der Nachweis von mGCR gelang bis dato bei neuronalen Membranen von Amphibienhirnen,[39, 40, 46, 101] auf Lymphomzellen von Ratten und Menschen[43, 44] sowie kürzlich auf humanen PBMC.[45] Auch bei Rattenleberzellen wurden spezifische Membranbindungsstellen für Glucocorticoide nachgewiesen.[102] Ihre Funktion ist noch weitgehend unbekannt. Unsere Experimente sollten dazu dienen, die Expression der mGCR auf PBMC genauer zu untersuchen, um weitere Erkenntnisse zu diesen Rezeptoren zu gewinnen.
Verschiedene Signalsysteme (Ca2+, IP3, PKC, cAMP, DAG, MAPK, G-Proteine) wurden mit der spezifischen Membranbindung anderer Steroidmoleküle in Verbindung gebracht. Aldosteron und Fludrocortison bewirkten einen IP3-Anstieg binnen 30 s in menschlichen PBMC.[103] In glatten Muskelzellen bewirkte Aldosteron den Anstieg von PKC und DAG.[30] Aldosteron verursachte ebenso wie an Rinderserumalbumin gekoppeltes Testosteron einen schnellen Ca2+-Anstieg in glatten Muskelzellen bzw. Mauslymphozyten.[35, 104] Dies schien jeweils auf eine IP3- und DAG-Bildung zurückführbar zu sein. In glatten Muskelzellen von Schweinen führte Aldosteron innerhalb von einer Minute zu einem cAMP-Anstieg.[105] Nach Borski gibt es mittlerweile gute Hinweise dafür, dass auch GC cAMP und Ca2+als Signalübertragungswege benutzen.[106] Sie führten im Gegensatz zu anderen Steroidhormonen zu verringerten intrazellulären cAMP- und Ca2+-Konzentrationen.[107] Buttgereit et al. zeigten die Hemmung eines schnellen Ca2+-Einstroms in Rattenthymozyten durch Methylprednisolon.[50] Borski stellte ein hypothetisches Modell auf, wonach mGCR einerseits über G-Proteine die Adenylatzyklase hemmen und damit die intrazelluläre cAMP-Konzentration senken. Andererseits stimulierten die G-Proteine die PKC sowie Einwärts-Gleichrichter-K+-Kanäle. Dadurch werde der transzelluläre Ca2+-Einstrom gehemmt. Wie die mGCR die G-Proteine aktivieren sollen, bleibt dabei noch unklar. Der Autor stellte die Vermutung auf, dass intrazelluläre GCR an G-Proteine koppeln könnten. Hafezi-Moghadam et al. berichteten kürzlich über die kardiovaskulär protektiven Effekte von Dexamethason, u.a. vermittelt über die endotheliale NO-Synthase (eNOS). Diese Effekte konnten nicht durch genomische (da sie zu schnell eintraten und nicht durch Actinomycin D hemmbar waren) und unspezifische nicht-genomische Wirkungen (da sie bereits ab Konzentrationen von 100 nM auftraten) erklärt werden.[53] Ebenfalls kürzlich fanden Solito et al., dass die Translokation von Annexin 1 zur Zellmembran durch Dexamethason in humanen Follikelzellen unter anderem durch nicht-genomische Wirkungen verursacht wurde. Diese konnten durch Blockade der PKC sowie des MAPK-Pfades inhibiert werden.[108] Cato et al. beschrieben schnelle GC-[Seite 72↓]Wirkungen, die durch transmembranöse Rezeptoren vermittelt und insensitiv gegenüber klassischen Steroidantagonisten waren. Sie postulierten, dass es zwei verschiedene Arten von membranständigen Rezeptoren für Steroide gebe: membrangebundene Steroidrezeptoren und membran-assoziierte Rezeptoren, die keine klassischen Steroidrezeptoren sind. Nach den Autoren unterschieden sich die ersten von den zweiten u.a. dadurch, dass sie sich mit monoklonalen Antikörpern gegen klassische Steroidrezeptoren identifizieren ließen.[109]
Wir nutzten zum Nachweis von membranständigen und zytosolischen GCR einen murinen monoklonalen Antikörper, der gegen einen 26 Aminosäuren langen konservierten Bereich des zytosolischen Glucocorticoidrezeptors (Abb. 2) gerichtet ist. Berki et al. gelangen damit der spezifische Nachweis zytosolischer GCR in humanen PBMC.[81] Gametchu et al. nutzten ebenfalls monoklonale Antikörper gegen den zytosolischen Rezeptor, um membranständige Rezeptoren nachzuweisen.[43, 44] Die Tatsache, dass sich mGCR durch Antikörper gegen iGCR spezifisch detektieren lassen, weist auf die Ähnlichkeit dieser Proteine hin. Es gibt eine Kontroverse darüber, ob es sich bei dem mGCR um eine Variante des iGCR handelt, oder ob es ein vollkommen anderes Protein ist (siehe Kapitel 1.1.). Diese Diskussion wird auch bei anderen membranständigen Steroidrezeptoren geführt.[47] In mit Genen für Östrogenrezeptoren (ERα und ERβ) transfizierten Ovarialzellen von chinesischen Hamstern wurde gezeigt, dass ER sowohl im Zytoplasma als auch an der Zellmembran nachweisbar waren. Der Anteil der membranständigen ER an der Gesamtzahl der ER war mit 2 % (ERβ) bzw. 3 % (ERα) sehr gering.[110] Unklar bleibt, wie die Rezeptoren an die Membran gebunden werden, da der zytosolische ER keine typische transmembranöse Domäne aufweist.[47]
Für die Aufklärung der Funktion wird letztlich die Klonierung des mGCR nötig sein, die bisher noch nicht gelang.
Die durchflusszytometrische Detektion von Zelleigenschaften wie Größe und Granularität sowie von immunfluoreszenten monoklonalen Antikörpermarkierungen stellt eine wichtige Methode zur Charakterisierung und Erkennung von Zellen dar. Wir koppelten die antiGCR-Antikörper mit unterschiedlichen Molekülen, die antigene oder fluoreszierende Eigenschaften haben. Die Fluoreszenz dieser Moleküle kann im Durchflusszytometer detektiert werden; darüber hinaus können sie Epitope für weitere Färbeantikörper (Sekundärreagenzien) darstellen. Die Verwendung von Sekundärreagenzien dient vor allem der Verstärkung des Färbesignals. Lässt sich das Färbesignal durch Vorinkubation mit nicht fluoreszenzgekoppeltem (unmarkiertem) Antikörper deutlich reduzieren, spricht dies für eine spezifische Färbung. Die spezifischen Bindungsstellen sind dann durch die unmarkierten Antikörper besetzt, die markierten binden nicht unspezifisch an anderen Bindungsstellen. Ein weiterer Test für die Spezifität der Färbung ist die Vorinkubati[Seite 73↓]on des Antikörpers mit dem Peptid, das für deren Herstellung verwendet wurde. Dadurch soll die Bindungsstelle am Antikörper besetzt und gezeigt werden, dass nicht andere (unspezifische) Teile des Molekülkomplexes an Zellstrukturen binden (epitopspezifischer Block).
Zur Etablierung des Färbesystems sollte gewährleistet werden, dass die unspezifische Färbung möglichst gering gehalten wird. Bei dem zunächst verwendeten Färbesystem für die Oberflächenfärbung antiGCR-FITC àantiFITC-Dig àantiDig-Liposomen war die unspezifische Färbung noch zu hoch. Daher koppelten wir die antiGCR-AK direkt mit Digoxigenin. Das nun verwendete Färbesystem antiGCR-Dig àantiDig-Liposomen zeichnete sich durch eine deutlich geringere unspezifische Färbung und sehr gute Reproduzierbarkeit aus.
Der spezifische Nachweis von zytosolischen GCR wurde, wie bereits erwähnt, mehrfach beschrieben.[43, 45, 81] Da diese in hoher Anzahl in den Zellen vorliegen, sind sie auch mit konventioneller Fluoreszenzfärbung detektierbar. Man geht heute von 3000 – 6000 GCR-Molekülen pro weißer Blutzelle aus.[111, 112, 113] Die Sensitivitätsminimum liegt für die konventionelle Färbung bei ca. 2000 Molekülen pro Zelle.[83]
Zum Nachweis der iGCR verwendeten wir die CCRF-CEM-Zelllinie. Als Sekundärreagenz diente ein antiDig-Cy5-AK, der gegen den Digoxigenin-Rest des antiGCR-Dig-AK gerichtet war. Durch den Nachweis der iGCR wurde die Sensitivität und Spezifität des Färbesystems gezeigt. Die Färbung der Zellen durch Markierung der Rezeptoren war spezifisch, da sich das Signal durch Vorinkubation mit unmarkierten Antikörpern bzw. mit dem Rezeptor-Epitop APTEK26 deutlich reduzieren ließ. Den eindeutigen Block bestätigte die Differenz in der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität (MFI), die nach Blockade wieder dem Ausgangswert entsprach (Abb. 17).
Für den Nachweis der mGCR verwendeten wir ebenfalls zunächst die CCRF-CEM-Zelllinie. Auf diesen T-Lymphoblasten wies Gametchu erstmals mGCR auf humanen Zellen nach. Dies gelang ihm allerdings erst nach vorheriger immunabsorptiver Rezeptoranreicherung.[43, 44] Mit dem konventionellen Färbesystem antiGCR-DigàantiDig-Cy5 ließen sich in unseren Experimenten keine mGCR-positiven Zellen detektieren. Auch Berki et al. erhielten mit den gleichen antiGCR-AK keine Färbung, wenn sie der Inkubationslösung kein Saponin zusetzten und damit eine Oberflächenfärbung vornahmen.[81] Als Grund hierfür diskutierten wir zwei Möglichkeiten: 1. Der mGCR wird von einem anderen Gen kodiert als der iGCR. Es resultiert daraus ein anderes Protein, das nicht von dem verwendeten Antikörper erkannt wird. 2. Die Expressionsdichte der Rezeptoren an der Zelloberfläche ist sehr gering und liegt unter dem Detektionslimit der konventionellen Färbemethode. Bei der konventionellen Färbung werden in der Regel zwischen 10 und 50 Fluoreszenzmoleküle an den monoklonalen Antikörper gekoppelt. Eine hohe [Seite 74↓]Anzahl an Fluoreszenzmolekülen führt dabei auch zu einer verstärkten unspezifischen Färbung durch hydrophobe Interaktionen mit der Zelle.[82] Bei weniger als 2000 Antigenmolekülen pro Zelle wird das Signal dann zu gering, um im Durchflusszytometer detektiert zu werden.[83] Dabei ist bekannt, dass zum Beispiel Zytokin- und prä-T-Zellrezeptoren bereits in einer Anzahl von ca. 100 Molekülen pro Zelle physiologische Wirkungen erzielen.[114, 115]
Um die 2. Hypothese zu überprüfen, wendeten wir eine hochsensitive Immunfluoreszenzfärbung mit magnetofluoreszenten Liposomen zur Detektion der mGCR an. Diese Färbemethode erlaubt durch an Antikörper gekoppelte, mit Fluoreszenzmolekülen gefüllte Liposomen eine 100 – 1000fache Verstärkung des Signals gegenüber der konventionellen Färbung. Damit wird der Nachweis von Oberflächenantigenen ab einer Zahl von wenigen hundert Molekülen pro Zelle ermöglicht.[83, 85] Bei sehr geringer Expressionsdichte der Oberflächenmoleküle ist die Färbung nicht mehr quantitativ. Es kann also detektiert werden, ob eine Zelle das jeweilige Molekül an ihrer Oberfläche exprimiert, nicht aber in welcher Zahl. Ab dem Detektionslimit wird die Zelle positiv für die Rezeptoren erkannt, darunter negativ. Daher ist die Angabe der MFI bei der Liposomenfärbung von in geringer Zahl exprimierten Oberflächenmolekülen nicht sinnvoll. Die Färbehelligkeit wird nicht gleichmäßig geblockt, da schon durch die Färbung einer Zelle mit nur wenigen Liposomen diese sehr hell detektiert wird. Daraus ergibt sich allerdings auch die folgende offene Frage: Handelt es sich bei den mGCR-positiven Zellen um eine distinkte Subpopulation, die ausschließlich die Rezeptoren exprimiert; oder findet eine Expressionssteigerung unter bestimmten Umständen bei allen Zellen statt, und wird nur die „Spitze des Eisberges“ (die Zellen, die am meisten mGCR exprimieren) erkannt? Diese Frage wird später noch einmal aufgegriffen werden.
Mit den FITC-gefüllten, antiDigoxigenin-AK-gekoppelten Liposomen ließen sich mGCR auf den CCRF-CEM-Zellen detektieren. Durchschnittlich fast 11 % der Zellen waren positiv für mGCR. Da stets mehr als 8 % der CCRF-CEM-Zellen positiv für mGCR waren, nutzten wir diese Zelllinie als Positivkontrolle in den weiteren Experimenten.

4.2.1 Nachweis von mGCR auf humanen PBMC

Gesunde Probanden

Kürzlich konnten erstmals mGCR auf Monozyten und Lymphozyten von phänotypisch gesunden humanen Spendern nachgewiesen werden.[45] Wir führten nun mit optimierter Technik zum ersten Mal eine systematische Untersuchung gesunder Individuen durch und differenzierten die Lymphozyten nach B- und T-Lymphozyten. Letzteres erreichten wir durch Detektion spezifischer Antigene mit monoklonalen Antikörpern (antiCD3 für T-Lymphozyten, antiCD19 für B-[Seite 75↓]Lymphozyten, antiCD14 für Monozyten) in der Durchflusszytometrie. Es konnte gezeigt werden, dass jeweils ein Prozentsatz von 0,2 – 5 % bei den B-Lymphozyten und 3 bis 7,2 % bei den Monozyten mGCR exprimieren. Dagegen gelang kein Nachweis auf T-Lymphozyten. Interessanterweise veränderte sich die Expression der Rezeptoren mit bestimmten Krankheitssymptomen. So wiesen Personen mit vorangegangenem grippalen Infekt ebenso eine erhöhte Anzahl mGCR-positiver Zellen auf wie solche mit akuter Arthritis und Tonsillitis. Dies war sowohl bei den B-Lymphozyten als auch bei den Monozyten der Fall. Dieser auffällige Befund ließ uns die Frage stellen, womit diese vermehrte Expression zusammen hängt. Wir hatten die Vermutung, dass eine Aktivierung des Immunsystems eine erhöhte Anzahl mGCR-positiver Zellen bewirkt.

Probanden nach Hepatitis B-Impfung

Wir untersuchten nun zwei Probanden systematisch auf die Ausprägung von mGCR vor und nach einer Hepatitis B-Impfung. Die Impfung ist ein standardisierter Immunstimulus, der unter anderem zur Bildung von spezifischen Antikörpern und Gedächtniszellen führt. Es sollte untersucht werden, inwiefern ein solcher Immunstimulus die Expression von mGCR auf PBMC beeinflusst.
Während sich die Werte vor und drei Tage nach der Impfung in dem Bereich bewegten, den wir bei anderen gesunden Probanden gefunden hatten, zeigte sich nach einer Woche ein deutlicher Anstieg auf das drei- bis vierfache des Ausgangswertes.
Bei den Monozyten waren bis zu einem Fünftel der Zellen positiv für die Rezeptoren, zuvor waren es ca. 5 %. Der Verlauf der Expression war bei beiden Probanden sehr ähnlich, mit dem Unterschied, dass der Abfall auf die Ausgangswerte verschieden lange dauerte. Die Beobachtung erhöhter mGCR-Expression auf Monozyten nach Infekten könnte eine Erklärung für den langsameren Abfall der Werte eines Probanden darstellen. Dieser hatte nach eigenen Angaben eine „heftige Grippe“ zwölf Tage nach der Impfung.
Bei den B-Lymphozyten war der initiale steile Anstieg ebenfalls zu beobachten. Der Abfall der Werte erfolgte jedoch rascher, um nachfolgend wieder anzusteigen. Dieser Anstieg war bei beiden Probanden zu verzeichnen, wenn auch in stärkerem Ausmaß bei jenem mit grippalem Infekt. Allerdings war hier kein direkter zeitlicher Zusammenhang zu erkennen.
Bei den T-Lymphozyten zeigte sich zu keinem Zeitpunkt eine mGCR-Expression.
Bemerkenswert ist der synchrone Anstieg der Messwerte bei beiden Probanden circa eine Woche nach dem „Stimulus“ und der über Wochen andauernde langsame Abfall zu den Ausgangswerten. Auch wenn für diese Arbeit nur zwei Probanden untersucht wurden und eine systematische Untersuchung an einer größeren Anzahl noch aussteht, legen diese Ergebnisse nahe, dass mit der [Seite 76↓]Impfung die Expression der mGCR auf Monozyten und B-Lymphozyten stimuliert wurde. Die Diskussion zu der möglichen Funktion dieser erhöhten Expression der mGCR wird auf Seite 79ff geführt.

Patienten mit rheumatoider Arthritis

Die vorausgegangenen Ergebnisse legten die Vermutung nahe, dass eine Aktivierung des Immunsystems zu einer erhöhten Expression der mGCR führt. Mit der Untersuchung von Patienten mit rheumatoider Arthritis wollten wir feststellen, ob sich die Expression von mGCR auf PBMC mit der Krankheitsaktivität verändert. Es sollte für die rheumatoide Arthritis der Zusammenhang zwischen dem Grad der immunologischen Aktivität und der mGCR-Expression untersucht werden. Die Expression von mGCR könnte dabei Hinweise auf mögliche nicht-genomische Wirkmechanismen bei der Behandlung der RA mit Glucocorticoiden geben.
Die RA ist eine entzündlich-rheumatische Erkrankung, die sehr häufig mit GC behandelt wird. Dabei werden je nach Krankheitsaktivität sehr hohe bis hin zu sehr niedrigen Dosen erfolgreich angewandt.[1, 2, 3, 4, 97] Wir wählten die RA aus, weil sie sich sehr gut hinsichtlich der Krankheitsaktivität charakterisieren lässt. Um ein einheitliches Kollektiv an untersuchten Personen zu erhalten, sollte nur eine entzündlich-rheumatische Grundkrankheit betrachtet werden. Sämtliche Patienten hatten eine gesicherte RA nach ARA-Kriterien.[116] Für die Bestimmung der Krankheitsaktivität dienten diverse objektive (Blutkörperchensenkungsgeschwindigkeit, C-reaktives Protein, Anzahl druckschmerzhafter und geschwollener Gelenke) und subjektive (Krankheits- und Schmerzcharakterisierung mittels visueller Analogskala) Einzelparameter, außerdem der berechnete Disease Activity Score (DAS), der einige dieser Parameter standardisiert zusammennimmt. Grundsätzlich fanden wir bei den meisten Patienten mit rheumatoider Arthritis erhöhte Werte mGCR-positiver Monozyten, teilweise auch der B-Lymphozyten. Einige Patienten wiesen aber auch „Normalwerte“ auf (verglichen mit denen gesunder Spender).
Die Maximalwerte der Monozyten waren mit fast 20 % deutlich erhöht, auch der durchschnittliche Wert war mit gut 10 % mehr als doppelt so hoch wie bei Gesunden. Die Korrelation der Krankheitsaktivitätsparameter mit der Anzahl mGCR-positiver Monozyten im Blut der Patienten zeigte in der überwiegenden Zahl der Fälle einen signifikanten Zusammenhang, der auf die folgende Formel gebracht werden kann: je höher die Aktivität der rheumatoiden Arthritis, umso höher die Zahl mGCR-positiver Monozyten. Dieser Zusammenhang war bei den einzelnen Parametern mehr oder weniger stark ausgeprägt. Bei der Anzahl der geschwollenen Gelenke sowie der Selbsteinschätzung des allgemeinen Gesundheitszustandes durch den Patienten zeigte sich keine signifikante Korrelation. Die höchsten Werte für die Korrelationskoeffizienten wurden bei [Seite 77↓]den Parametern erreicht, die wahrscheinlich am besten ein Gesamtbild der Krankheitsaktivität wiedergeben. Es sind dies der DAS und die Einschätzung der Krankheitsaktivität durch den Arzt. Der DAS wird von einigen Autoren auch als Goldstandard für diesen Zweck bezeichnet.[86] Die Einschätzung der Krankheitsaktivität durch den behandelnden Arzt bekommt zwar durch die visuelle Analogskala eine gewisse Unschärfe und Subjektivität, beinhaltet aber den klinischen Gesamteindruck des Arztes nach der Untersuchung. In beiden Fällen ist der Korrelationskoeffizient mit 0,808 bzw. 0,891 sehr hoch (p-Wert für den Zusammenhang 0,001 bzw. 0,0002).
Für die B-Lymphozyten lässt sich dieser Zusammenhang nicht erkennen. Hier schwankten die Werte unabhängig von der Krankheitsaktivität. Auch bei Patienten mit hohem Anteil mGCR-positiver Monozyten fanden sich geringe Anteile mGCR-positiver B-Lymphozyten und umgekehrt. Der durchschnittliche Wert sowie der Median waren erhöht gegenüber den gesunden Probanden (Mittelwert: 4,15 % gegenüber 2,79 %; Median 3,77 gegenüber 2,64 %). Der Maximalwert von 9,89 % war ebenfalls deutlich über dem der Gesunden (5,04 %). Auch bei den zwei gesunden Probanden mit kürzlich zurückliegender Krankheit waren die Werte mit 8,09 bzw. 7,54 % erhöht. Bei der dritten Person waren sie mit 0,98 % dagegen sehr niedrig. Es wäre denkbar, dass die Expression der mGCR auf B-Lymphozyten einer anderen Kinetik folgt als die auf den Monozyten. Bei den Hepatitis-B geimpften Probanden zeigte sich, dass nach einem Anstieg parallel zu dem der Monozyten die Werte der mGCR-positiven B-Lymphozyten schnell wieder abfielen. Sie stiegen erneut an, als die Werte der Monozyten am Abfallen waren. Es wäre möglich, dass diesem Phänomen eine „Phasenverschiebung“ in der mGCR-Expression auf B-Lymphozyten und Monozyten zugrunde liegt. In unterschiedlichen Phasen der Immunreaktion würden demnach unterschiedliche immunkompetente Zellen mGCR exprimieren.

Bei der Patientin mit akutem Schub eines systemischen Lupus erythematodes befand sich die mGCR-Expression auf den B-Lymphozyten mit 2,77 % ebenfalls im Bereich der gesunden Spender. Hier differierte der Anteil der positiven Monozyten sehr stark von dem der B-Lymphozyten. Mit 36,76 % war es der am höchsten gemessene Wert in allen Experimenten. Wir untersuchten die Patientin spontan, da sie mit hoher Krankheitsaktivität in unsere Klinik aufgenommen wurde. Sie hatte zum Zeitpunkt der Blutentnahme bereits einige Stunden zuvor einen Prednisolon-Stoß (100mg) erhalten. Der hohe Anteil mGCR-positiver Monozyten lässt sich gut mit der hohen entzündlichen Aktivität der Grundkrankheit im Rahmen der vorausgegangenen Beobachtungen hohe immunologische Aktivität à hohe mGCR-Expression auf Monozyten interpretieren.

Diese Experimente zeigen erstmals systematisch die physiologische Expression von mGCR so[Seite 78↓]wie deren Kinetik auf humanen Immunzellen. Neu ist auch, dass die Expression der mGCR auf Monozyten offensichtlich abhängig von grippalen Infekten, Booster-Impfungen oder der Krankheitsaktivität einer rheumatoiden Arthritis ist. Exprimiert werden diese Rezeptoren auf B-Lymphozyten und Monozyten, nicht jedoch auf T-Lymphozyten und Granulozyten.
Bei anderen membranständigen Steroidrezeptoren scheint es ebenfalls so zu sein, dass nicht alle Zellen diese exprimieren, wie das beim fast ubiquitär vorkommenden zytosolischen GCR der Fall ist. Benten et al. fanden interessanterweise kürzlich, dass T-Lymphozyten und Makrophagen, nicht aber B-Lymphozyten membranständige Östrogen- und Testosteronrezeptoren exprimieren.[34]
Die CCRF-CEM-Zelllinie ist allerdings ein T-Zellklon und exprimiert mGCR. Ein relevanter Unterschied könnte sein, dass es sich um T-Lymphoblasten handelt. Bei unseren Experimenten waren die T-Lymphozyten auch bei hohem mGCR-positiven Anteil in den anderen Zellpopulationen stets negativ. Es stellt sich die Frage, ob T-Lymphozyten unter bestimmten Stimuli mGCR exprimieren können, oder ob es eine Eigenart der konkreten Tumorzelle ist. Ebenfalls gilt es zu klären, wodurch die Kinetik der Expression zustande kommt und warum diese bei B-Lymphozyten anders ist als bei Monozyten. An dieser Stelle kann an die weiter oben gestellte Frage angeschlossen werden, ob ausschließlich eine Subpopulation der B-Lymphozyten oder Monozyten mGCR exprimieren, oder ob dies alle Zellen in geringer Zahl tun oder zumindest potentiell dazu in der Lage sind. Die mER-positiven Zellen können diese Eigenschaft offensichtlich im Zuge einer weiteren Zellkultivierung wieder verlieren.[117] Gametchu et al. fanden eine Abhängigkeit der mGCR-Expression auf CCRF-CEM-Zellen von dem Zellzyklus.[44] Deshalb untersuchten wir die Kinetik der mGCR-Expression auf diesen Zellen nach Auftauen und fanden, dass die Expression nach ca. 40 h am höchsten war und nachfolgend wieder abfiel. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die membranständigen Rezeptoren abhängig vom jeweiligen Zellstadium exprimiert werden, was wiederum gegen die Existenz einer distinkten mGCR-positiven Subpopulation spricht. Entsprechend könnte sich der Aktivierungsgrad einer Zellpopulation (z.B. der Monozyten durch einen Immunstimulus) auf die Expression der mGCR auswirken. Mit der Aktivierung würde dann die mGCR-Expression auf einigen Zellen über die Detektionsschwelle von ca. 200 Rezeptoren pro Zelle ansteigen, wodurch diese Zellen positiv für mGCR erkannt würden. Nach dieser Überlegung wäre es möglich, dass auch die T-Lymphozyten mGCR in geringer Anzahl exprimierten. Es wäre denkbar, dass ein adäquater Stimulus auch bei diesen Zellen die Ausprägung der mGCR über das Detektionslimit der Liposomenfärbung anheben könnte.
Nachfolgende Untersuchungen sollen nun prüfen, ob eine in vitro-Stimulation von Monozyten [Seite 79↓]mit Lipopolysaccharid eine ähnliche Expressionssteigerung der mGCR bedingen kann.
Hinsichtlich der Funktion der mGCR bedarf es noch weiterer Forschung.
Denkbar wäre eine Funktion im Sinne eines negativen Feed-back-Mechanismus (z.B. durch Apoptoseinduktion), der eine überschießende Immunantwort verhindern soll. Ein Beispiel für einen vermuteten derartigen negativen Feed-back-Mechanismus ist der bereits erwähnte Zusammenhang zwischen Plasma-Cortisol und ACTH-Ausschüttung.[22] Gametchu et al. beobachteten eine Zerstörung von Lymphomzellen (CCRF-CEM) nach Glucocorticoidapplikation.[43, 44] Nach Verringerung der Zellsubpopulation, auf der zuvor die mGCR nachgewiesen worden waren, zeigten die Lymphomzellen eine erhöhte Resistenz gegenüber der Glucocorticoid-induzierten Zelllyse. Die mGCR-angereicherten Zellen waren sensitiver für GC-induzierten Zelltod. Die absolute Zahl an GC-Bindungsstellen war dabei nicht relevant für eine klinische Antwort im Sinne eines Absterbens der Zellen. Die Autoren schlossen aus diesen Ergebnissen, dass die mGCR eine Schlüsselrolle bei der GC-induzierten Apoptose spielen. Sowohl Ca2+ und cAMP als auch die PKC wurden in lymphoiden Mauszellen mit der GC-induzierten Apoptose in Verbindung gebracht.[118, 119] Dies lässt sich nach den oben genannten Ergebnissen und Hypothesen mit einer schnellen GC-Wirkung über mGCR vereinbaren. In diesem Zusammenhang wäre vorstellbar, dass die Immunantwort durch eine verstärkte Apoptoseneigung der immunkompetenten Zellen limitiert wird. Allerdings wäre dies nach unseren Ergebnissen nicht für die T-Lymphozyten der Fall. Die Induktion von Apoptose könnte allerdings auch über genomische Mechanismen verursacht sein.[120, 121] Schließlich könnten auch unspezifische nicht-genomische Wirkungen dafür verantwortlich sein, indem sie die mitochondriale Funktion beeinträchtigen.[122] Dagegen demonstrierten Kousteni et al. schnelle antiapoptotische Effekte durch Androgene und Östrogene u.a. bei Osteoblasten, Osteozyten und embryonalen Fibroblasten.[123]
Eine andere Hypothese zu der Funktion der mGCR ist, dass sie eine Rolle in der Pathogenese von entzündlich-rheumatischen Erkrankungen spielen. Diese Hypothese begründet sich auf unseren Untersuchungsergebnissen bei Patienten mit RA. Hier zeigte sich bei den Monozyten, dass die Aktivität der Erkrankung mit dem Anteil mGCR-positiver Zellen korrelierte.
Nach Cato et al. ist eine Funktion der schnellen Steroidwirkungen, die klassischen Wirkungen zu potenzieren. Demnach wären diese nicht-genomischen Wirkungen ein integraler Bestandteil der genomischen Wirkungen, die an physiologischen wie pathophysiologischen Prozessen beteiligt sein könnten.[109]
Sollten die mGCR zentrale Wirkungen auf die GC-vermittelte Zelllyse haben, wäre dies von großer klinischer Bedeutung. Unter Umständen könnte damit auch erklärt werden, warum einige [Seite 80↓]Patienten nicht auf die Behandlung von z.B. Lymphomen ansprechen (non-responder) bzw. diese Ansprechbarkeit im Laufe der Therapie nachlässt. Aber auch für andere Effekte der GC könnten die mGCR mit verantwortlich sein im Sinne der eingangs erwähnten nicht-genomischen Wirkmechanismen.[15] Die Auswahl des richtigen Glucocorticoids ist nach Lipworth wichtig für die richtige Mischung aus genomischer und nicht-genomischer Aktivität.[124] Hier können die unterschiedlichen relativen Wirkpotenzen für genomische und nicht-genomische Wirkmechanismen[48, 51] relevant werden. Die weitere Erforschung der nicht-genomischen Glucocorticoidwirkungen wird daher in naher Zukunft von großer Bedeutung sein, nicht zuletzt im Hinblick auf die Entwicklung einer spezifischen pharmakologischen Therapie.

4.2.2 Zusammenfassung

Wir untersuchten in diesem zweiten Teil der Arbeit mononukleäre Zellen des peripheren Blutes auf die Expression von membranständigen Glucocorticoidrezeptoren. Die Umstände für die Expression dieser Rezeptoren, ihre Struktur sowie ihre Funktion sind noch weitgehend unbekannt. Zur Detektion der vermutlich nur in geringer Zahl exprimierten Rezeptoren verwendeten wir die Durchflusszytometrie unter Zuhilfenahme einer hochsensitiven Immunfluoreszenzfärbung mit magnetofluoreszenten Liposomen. Erstmalig wurde eine systematische Untersuchung gesunder Spender durchgeführt. Ebenfalls erstmalig waren die Untersuchungen von Impfprobanden sowie Patienten mit rheumatoider Arthritis.
Die Ergebnisse lassen sich folgendermaßen zusammenfassen: Membranständige Glucocorticoidrezeptoren existieren physiologischerweise auf B-Lymphozyten und Monozyten. Auf T-Lymphozyten und Granulozyten konnten sie nicht nachgewiesen werden. Ihre Expression wird offensichtlich stimuliert durch Infekte, Impfungen und entzündlich-rheumatische Erkrankungen. Letzteres zeigten wir für die rheumatoide Arthritis. Bei Monozyten zeigte sich darüber hinaus eine starke Korrelation zwischen der Aktivität der rheumatoiden Arthritis und dem Anteil mGCR-positiver Zellen. Auch bei einer Patientin mit einem Schub eines Lupus erythematodes waren die Werte für mGCR-positive Monozyten stark erhöht. Man könnte daher vermuten, dass das Ausmaß der Expression mit der immunologischen Aktivität des Körpers zusammen hänge.
Die Färbetechnik erlaubt es nicht, eindeutig zwischen mGCR-negativen Zellen und mGCR-positiven unterhalb des Detektionsminimums zu unterscheiden. Es kann also einerseits sein, dass eine Zellsubpopulation mGCR exprimieren und diese Subpopulation bei Stimulation anwächst. Dadurch erhöht sich auch der Anteil mGCR-positiver Zellen. Andererseits ist vorstellbar, dass alle Zellen in geringer Zahl mGCR exprimieren. Ein Teil dieser Zellen, der sich bei Stimulation erhöht, erreicht das Detektionslimit bzw. übertrifft es. Aufgrund der gemessenen Kinetik der [Seite 81↓]mGCR-Expression auf CCRF-CEM-Zellen favorisieren wir die zweite Hypothese. Dies würde bedeuten, dass auch T-Lymphozyten mGCR in sehr geringer Zahl exprimieren könnten. Möglicherweise würden diese Zellen dann auf andere Stimuli mit der Expression von mGCR reagieren.
Bezüglich der Funktion der mGCR gibt es Hinweise auf einen Zusammenhang mit der Induktion von Apoptose. Außerdem könnte die Expression der Rezeptoren mit der Pathogenese von entzündlich-rheumatischen Erkrankungen, im speziellen der RA, zusammenhängen. Darüber hinaus potenzieren die nicht-genomischen Wirkmechanismen über mGCR möglicherweise die genomischen Wirkungen.


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14.05.2004