Aus der Medizinischen Klinik mit
Schwerpunkt Rheumatologie und Klinische Immunologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

DISSERTATION

Untersuchungen zu Wirksamkeit, Verträglichkeit und Wirkmechanismen der Glucocorticoide bei Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Burkhard Bartholome
aus Frankfurt am Main

Dekan: Prof. Dr. med. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. Frank Buttgereit
2. Prof. Dr. Rainer H. Straub
3. Prof. Dr. Andreas Krause

Datum der Promotion: 19.4.2004

Abstract

Ziel:

Gewinnung neuer Erkenntnisse auf dem Gebiet der Glucocorticoidforschung. Die Arbeit gliedert sich in zwei Teile:

1. Klinische Studie zu Wirkungen und Nebenwirkungen einer niedrig bis mittelhoch dosierten Methylprednisolon(MP)-Therapie bei Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen.
2. Durchflusszytometrische Untersuchungen mit humanen PBMC mit dem Ziel, membranständige Glucocorticoidrezeptoren (mGCR) nachzuweisen.

Methodik:

1. In einer klinischen Studie wurden zwei Patientengruppen mit jeweils 20 Patienten miteinander verglichen. Alle Patienten hatten entzündlich-rheumatische Erkrankungen und bekamen eine MP-Therapie über mindestens ein Jahr. Die Dosierungen in der ersten Gruppen entsprachen einer low-dose GC-Therapie, die Patienten in der zweiten Gruppe bekamen eine medium-dose GC-Therapie.
   Erwünschte, unerwünschte Wirkungen sowie die Lebensqualität der Patienten wurden erhoben.
2. Humane PBMC wurden durchflusszytometrisch untersucht. Es wurden konventionelle Färbemethoden sowie eine hoch-sensitive Liposomenfärbung zur Detektion spezifischer membranständiger Antigene angewandt.

Ergebnisse:

1. In den meisten Fällen waren die relativ niedrigen Dosierungen von MP geeignet, die Krankheitsaktivität der entzündlich-rheumatischen Erkrankung wirksam zu kontrollieren. Einzelne Exazerbationen waren allerdings zu verzeichnen.
   Bei den meisten unerwünschten Wirkungen zeigten sich keine Unterschiede zwischen den Dosisgruppen. Osteoporosetypische Rückenschmerzen traten signifikant höher in [Seite 7↓]der oberen Dosisgruppe auf (p=0,04), bei dem erhöhten Augeninnendruck zeigte sich eine Tendenz (p=0,1).
   Häufige Nebenwirkungen auch bei niedrigen Dosierungen waren: Unterblutungen der Haut und Pergamenthaut (76,2 % bzw. 73,8 % aller Patienten) bzw. eine Cushing-Symptomatik (61,9 % aller Patienten).
2. Mit der Liposomen-Färbetechnik ließen sich erstmals mGCR auf humanen PBMC systematisch nachweisen. Bis zu 5 % der B-Lymphozyten und bis zu 7 % der Monozyten exprimierten mGCR bei Gesunden.
   Stimulationen des Immunsystems durch Impfungen oder eine aktive rheumatoide Arthritis führten zu einer deutlichen Erhöhung des Anteils mGCR-positiver Monozyten auf über 20 %.

Schlussfolgerungen:

1. Niedrig bis mittelhoch dosierte Therapien mit MP können effektiv die Aktivität von entzündlich-rheumatischen Erkrankungen kontrollieren. Die unerwünschten Effekte sind vermutlich dosisabhängig, für die meisten ist jedoch nicht relevant, ob mit einer low-dose oder einer medium-dose Therapie behandelt wird.
2. mGCR werden auf humanen PBMC unter physiologischen Bedingungen exprimiert. Unter bestimmten immunologischen Bedingungen werden sie hochreguliert. Herkunft und Funktion der Rezeptoren müssen noch genauer geklärt werden.

Eigene Schlagworte: low-dose Glucocorticoidtherapie, entzündlich-rheumatische Erkrankungen, membranständige Glucocorticoidrezeptoren, nicht-genomische Glucocorticoideffekte, hoch-sensitive Immunfluoreszenzfärbung

Abstract

Purpose:

Gaining new knowledge in glucocorticoid research. The dissertation consists of two parts:

1. Clinical study on effects and side-effects of a low-dose / medium-dose therapy with methylprednisolone (MP) in patients with inflammatory rheumatic diseases.
2. Flowcytometric investigation of human PBMC in order to detect membrane-bound glucocorticoid-receptors (mGCR).

Methods:

1. In a clinical study two groups of patients - 20 patients each - were compared. All patients had inflammatory rheumatic diseases and recieved MP-therapy for at least one year. The first group recieved a low-dose GC-therapy, the second group a medium-dose GC-therapy.
2. Human PBMC were examined. We used conventional and high-sensitive liposome staining technique for the detection of specific membrane-bound antigens.

Results:

1. In most cases rather low dosages of MP were able to control the disease activitiy of inflammatory rheumatic diseaeses. However, we observed disease exacerbation in some cases.
   Most side-effects showed the same characteristics in both groups. There was a significant higher appearance of typical osteoporotic back pain in the higher dosage group (p=0,04) and a tendency to higher intraophtalmic pressure in this group (p=0,1).
   Common side effects with even low dosages were: skin hematoma and thin skin (76,2 % and 73,8 % respective) and a Cushing-Syndrome (61,9 % of all patients).
2. With the liposome staining technique we showed for the first time systematically mGCR on human PBMC. Up to 5 % of B-lymphocytes and 7 % of monocytes presented mGCR in healthy blood donors.
   Stimulation of the immunological system by vaccination or in case of an active rheumatoid arthritis led to a marked increase of mGCR-positive monocytes to more than 20 %.

Conclusions:

1. Low-dose and medium-dose methylprednisolone therapy can effectivly control the activity of inflammatory rheumatic diseases. The side effects are probably dose-dependent. However, for most side effects it doesn't matter if patients are treated with a low-dose or a medium-dose therapy.
2. mGCR are expressed on human PBMC under physiological conditions and are up-regulated under certain immunological conditions. The function of these receptors has to be examined more profoundly.

Keywords: low-dose glucocorticoid-therapy, inflammatory rheumatic diseases, membrane-bound glucocorticoid receptors, non-genomic glucocorticoid effects, high-sensitive immunofluorecent labelling

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Wirkmechanismen der Glucocorticoide
  • 1.2 Glucocorticoidwirkungen und Osteoporose
  • 1.3 Zielsetzung
• 2  Material und Methoden
  • 2.1 Untersuchungen zu Wirkungen, Nebenwirkungen und Lebensqualität bei Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen unter low-dose Glucocorticoidtherapie am Beispiel von Methylprednisolon
    • 2.1.1 Patienten
    • 2.1.2 Erfassung der Patientendaten
    • 2.1.3  Fragebogen zum Gesundheitszustand
    • 2.1.4 Bestimmung der Knochendichte
    • 2.1.5 Blut- und Urinuntersuchungen
  • 2.2  Experimentelle Untersuchungen zum Nachweis von membranständigen Glucocorticoidrezeptoren
    • 2.2.1 CCRF-CEM- (CCL 119-) Zelllinie
      • 2.2.1.1 Morphologie
      • 2.2.1.2 Wachstumskinetik
    • 2.2.2  Präparation humaner mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC)
    • 2.2.3 Durchflusszytometrie
      • 2.2.3.1 Prinzip der Durchflusszytometrie
      • 2.2.3.2 Testsystem zur Detektion von zytosolischen und membranständigen Glucocorticoidrezeptoren
      • 2.2.3.3 Herstellung des antiGCR-Digoxigenin-Konjugats (antiGCR-Dig-Konjugat)
      • 2.2.3.4 Hochsensitive Immunfluoreszenz mit magnetofluoreszenten Liposomen
      • 2.2.3.5 Prinzipielles methodisches Vorgehen
      • 2.2.3.6 Färbung mit antiGCR-Dig-Antikörpern
      • 2.2.3.7 Optimierung der Färbung durch Sekundärreagenzien
      • 2.2.3.8 Detektion der Cluster of Differentiation (CD) 3, 14 und 19
  • 2.3 Bestimmung der Krankheitsaktivität bei Patienten mit rheumatoider Arthritis
  • 2.4  Statistische Methoden
    • 2.4.1 Klinische Studie
    • 2.4.2 Durchflusszytometrische Experimente
• 3  Ergebnisse
  • 3.1 Klinische Studie
    • 3.1.1 Charakterisierung der Patienten und der Vergleichsgruppen
    • 3.1.2 Ergebnisse der einzelnen Parameter
      • 3.1.2.1 Knochendichte
      • 3.1.2.2  Knochenumsatzparameter
      • 3.1.2.3 Schmerzen der Wirbelsäule (Osteoporoseschmerzen)
      • 3.1.2.4 Cushing-Symptomatik
      • 3.1.2.5 Typische Hautveränderungen bei Glucocorticoidtherapie
      • 3.1.2.6  Veränderung des Augeninnendrucks
      • 3.1.2.7 Krankheitsaktivitätsparameter
      • 3.1.2.8 Blutfette
      • 3.1.2.9 Lebensqualität
  • 3.2  Durchflusszytometrische Experimente
    • 3.2.1 Ableitung der Standardisierungsbedingungen
      • 3.2.1.1 Messung der mGCR-Expression auf CCRF-CEM-Zellen in Abhängigkeit von der Wachstumszeit nach Auftauen
      • 3.2.1.2 Optimierung des Antikörper-Färbesystems
      • 3.2.1.3  Antikörper-Konjugation, Färbe- und Block-AK-Konzentrationen
      • 3.2.1.4 Blockade durch Vorinkubation der antiGCR-AK mit dem Antigen APTEK26
    • 3.2.2 Intrazelluläre Färbung der CCRF-CEM-Zellen
    • 3.2.3  Vergleich der konventionellen Oberflächenfärbung mit der Liposomenfärbung
    • 3.2.4  Untersuchungsergebnisse gesunder Probanden
    • 3.2.5 Systematische Untersuchung von Probanden mit Hepatitis B-Impfung
    • 3.2.6 Messung der mGCR auf PBMC einer unbehandelten SLE-Patientin
    • 3.2.7 Messung der mGCR auf PBMC von Patienten mit rheumatoider Arthritis
    • 3.2.8 Messung auf Granulozyten
• 4  Diskussion
  • 4.1 Untersuchungen zu Wirkungen, Nebenwirkungen und Lebensqualität bei Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen unter low-dose Glucocorticoidtherapie am Beispiel von Methylprednisolon
    • 4.1.1 Unerwünschte Wirkungen
    • 4.1.2 Kontrolle der Krankheitsaktivität
    • 4.1.3 Befragung zur Lebensqualität
    • 4.1.4 Zusammenfassung
  • 4.2  Durchflusszytometrische Untersuchungen zum Nachweis von membranständigen Glucocorticoidrezeptoren
    • 4.2.1 Nachweis von mGCR auf humanen PBMC
    • 4.2.2 Zusammenfassung
• 5  Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Erklärung an Eides Statt
• Publikationen

Tabellen

• Tabelle 1: Exzitations- und Emissionsmaxima unterschiedlicher Fluorochrome
• Tabelle 2: Reihenfolge der Zugabe der Antikörper in den drei Ansätzen.
• Tabelle 3: Antikörper-Fluorochrom-Konjugat und Zielzellen, die damit detektiert werden sollen.
• Tabelle 4: Überblick über die Patienten in den beiden Dosisvergleichsgruppen
• Tabelle 5: Zahl der Patienten mit DMARD- bzw. Anti-Osteoporose-Therapie
• Tabelle 6: Anzahl der Patienten mit normalen und pathologischen Werten für Knochendichte und zwei biochemische Knochenabbauparameter (Pyridinolin und Desoxypyridinolin)
• Tabelle 7: Unterschied zwischen den zwei Dosisgruppen im Hinblick auf die einzelnen Parameter des SF-36 Fragebogens
• Tabelle 8: mGCR-Expression bei gesunden Spendern (n = 11)
• Tabelle 9: mGCR-Expression bei Spendern, die aufgrund vorausgegangener Infekte aus der Gruppe der „Gesunden“ ausgeschlossen wurden
• Tabelle 10: mGCR-Expression bei Patienten mit rheumatoider Arthritis (n =19)
• Tabelle 11: Statistischer Zusammenhang zwischen mGCR-Expression auf Monozyten und verschiedenen Krankheitsaktivitätsparametern

Bilder

• Abb. 1: Genomische (I), spezifische nicht-genomische (II) und unspezifische nicht-genomische Wirkmechanismen (III) der Glucocorticoide; aus: Buttgereit et al., Arthritis Rheum (1998). HSP = heat-shock protein; IP3 = Inositoltrisphosphat; PKC = Proteinkinase C; NF-κB = nuclear factor κB; IL = Interleukin; TNF = Tumornekrosefaktor; COX = Cyclooxigenase
• Abb. 2: Schematische Darstellung des Glucocorticoidrezeptors. Der von uns zur Detektion benutzte monoklonale Antikörper ist gegen eine konservierte Sequenz (150 – 176 Aminosäuren) vom Regulationsteil des Rezeptors gerichtet. Berki et al. (1998), J Immunol Methods
• Abb. 3: CCRF-CEM-Zelllinie unter dem Elektronenmikroskop betrachtet
• Abb. 4: Eine der zahlreichen Mitosen der CCRF-CEM-Zellen.Die elektronenmikroskopischen Bilder wurden uns freundlicherweise von Dr. Axel-M. Ladhoff aus dem Institut für Pathologie der Charité zur Verfügung gestellt.
• Abb. 5: Wachstumsverhalten der CCRF-CEM-Zellen mit und ohne Austausch des Wachstumsmediums
• Abb. 6: Oben: Schematische Darstellung eines Durchflusszytometers. Unten: Prinzip der Streulicht- und Fluoreszenzmessung
• Abb. 7: Konventionelles Immunfluoreszenz-Färbesystem
• Abb. 8: Primär verwendetes Färbesystem zur Detektion der mGCR: Der antiGCR-FITC-Antikörper ist gegen den mGCR gerichtet. Als Sekundärreagenzien zur Steigerung der Signalintensität wurden antiFITC-Dig und antiDig-Liposomen verwendet. Die Liposomen enthalten eine Vielzahl von FITC-Molekülen.
• Abb. 9: Optimiertes Färbesystem zur Detektion der mGCR: Der antiGCR-Antikörper wurde direkt mit Digoxigenin gekoppelt. Der Zwischenschritt mit Färbung durch antiFITC-Dig-Antikörpern entfällt. Die unspezifische Färbung reduzierte sich dadurch.
• Abb. 11: Zahl der Patienten (keine Unterscheidung nach Dosisgruppen) mit unterschiedlich ausgeprägter Cushing-Symptomatik. n=42
• Abb. 12: Zahl der Patienten (keine Unterscheidung nach Dosisgruppen) mit typischen GC-induzierten Hautveränderungen. n=42
• Abb. 13: Vergleich der Scores in den einzelnen Kategorien des SF-36-Fragebogens zwischen dem Studienkollektiv und einer bundesdeutschen Normpopulation. Daten aus: SF-36 Fragebogen zum Gesundheitszustand – Handanweisungen, a.a.O.[87]
• Abb. 14: Vergleich der Scores in den einzelnen Kategorien des SF-36-Fragebogens zwischen dem Studienkollektiv und einer bundesdeutschen Normpopulation, differenziert nach dem Geschlecht. Daten aus: SF-36 Fragebogen zum Gesundheitszustand – Handanweisungen, a.a.O.[87]
• Abb. 15: Vergleich des Studienkollektivs mit bundesdeutschen Normpopulationen hinsichtlich der körperlichen und psychischen Summenskalen. Die Standardisierung erfolgt im Vergleich zu einer US-amerikanischen Normpopulation (Mittelwert = 50)
• Abb. 16: Nachweis der Spezifität der Färbung durch Blockade des Signals nach Vorinkubation des antiGCR-Antikörpers mit dem Epitop-Peptid APTEK26
• Abb. 17: Intrazelluläre Färbung der CCRF-CEM-Zellen.
• Abb. 18: Oberflächenfärbung auf CCRF-CEM-Zellen. A: konventionelle Färbung, B: Liposomenfärbung
• Abb. 19: mGCR-Expression auf Monozyten und B-Lymphozyten nach Impfung im Verlauf (Nettofärbung). Der Pfeil markiert jeweils den Zeitpunkt, an dem Proband 1 an einem grippalen Infekt erkrankte.
• Abb. 20: Verlauf der Messung von mGCR auf Monozyten im Zusammenhang mit einer Hepatitis-B-Impfung. Die Buchstaben markieren die Zeitpunkte. Zeitpunkt A ist unmittelbar vor der Impfung, B am sechsten Tag, C einen Monat und D sieben Wochen nach der Impfung. Es werden jeweils die Kontrolle, die Absolutfärbung sowie die Färbung nach Blockierung dargestellt. Die Nettowerte (spezifische Färbung) ergeben sich jeweils aus der Differenz zwischen Absolutfärbung und Färbung nach Block.
• Abb. 21: Histogrammdarstellung der Verteilungen der mGCR-Expression auf Monozyten bei gesunden Spendern und Patienten mit rheumatoider Arthritis
• Abb. 22: Korrelationen der mGCR-positiven Monozyten mit unterschiedlichen Krankheitsaktivitätsparametern. p=p-Wert, k=Korrelationskoeffizient
• Abb. 23: Korrelationen der mGCR-positiven Monozyten mit unterschiedlichen Krankheitsaktivitätsparametern. p=p-Wert, k=Korrelationskoeffizient