II  NEP und Alzheimersche Erkrankung

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Alois Alzheimer (1864 – 1915) und Patientin: „Wie heißen Sie?“ „Auguste.“ „ Ihr Mann?“ „Ich glaube Auguste.“ „Ihr Mann?“ „Ach so, mein Mann....“ „Sind Sie verheiratet?“ „Zu Auguste.“ (Krankenakte Auguste D., Archiv der Psychiatrischen Universitätsklinik Frankfurt/Main) [Alzheimer, 06]

II - 1.  Einleitung

II - 1.1.  Prävalenz und Pathologie der Alzheimerschen Erkrankung

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In den westlichen Industrienationen ist mit der allgemein längeren Lebenserwartung die am häufigsten gestellte neurologisch-psychiatrische Diagnose die Alzheimersche Krankheit. Ihre Prävalenz liegt in diesen Ländern bei etwa einem Prozent der Gesamtbevölkerung, d.h. in Deutschland sind daran mindestens ca. 800.000 Menschen erkrankt; weltweit wird ihre Zahl auf 12 bis 18 Millionen, nach anderen Angaben sogar 30 Millionen geschätzt. Die Zahl der Neuerkrankungen liegt in den Industrieländern bei etwa 0,12% der Gesamtbevölkerung – in der Bundesrepublik bedeutet dies jährlich mehr als 80.000 Menschen. Die Alzheimersche Erkrankung ist auch eine der häufigsten natürlichen Todesursachen – inzwischen steht sie an vierter Stelle. Der größte Teil der Patienten, etwa 80%, werden von ihren Angehörigen bis zu ihrem Tod gepflegt. Nach neuesten Untersuchungen sind mehr als 800.000 Alzheimer-Patienten in Pflegeheimen untergebracht. Bei einem Pflegesatz von 2.250€/Monat ergibt das jährliche Kosten von 2,7 Milliarden € allein für die Pflege in Heimen [Bundesregierung, 96; Beyreuther, 99; Jansen, 04].

Die klinisch stumme Phase der Krankheit – der Zeitraum, in dem histopathologische Merkmale ohne Vorliegen der charakteristischen Demenz-Symptomatik nachweisbar sind – kann Schätzungen zufolge bis zu 30 Jahre dauern, während die anschließende klinische Phase ein bis 20 Jahre dauert. Diese kann jedoch ebenfalls nur geschätzt werden, da der Beginn schleichend ist und ihr Einsetzen meist relativ spät erkannt wird. Charakteristisch für die Erkrankung ist die starke Neurodegeneration, bei der es zu einem 50%igen Verlust von Nervenzellen kommen kann. Die damit verbundene Schrumpfung des Gehirns ist erst in einem fortgeschrittenen Stadium der Krankheit zu beobachten. Anfänglich ist nur die Anzahl der Synapsen reduziert. Parallel zeichnet sich ein deutlicher Rückgang an Neurotransmittern ab.

Die auffälligsten histopathologischen Kennzeichen sind extrazelluläre herdförmige Substanzeinlagerungen – die so genannten Plaques (Abb. 3A), welche größtenteils aus Fibrillen des β-Amyloid-Peptids (Aβ, s. unten) bestehen – sowie intrazelluläre Fibrillenbündel (neurofibrillary tangles, Abb. 3B) aus hyperphosphorylierten Neurofilament-Proteinen (Tau-Proteine).

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Abb. 3: A: Plaque-Herd, zum großen Teil aus β-Amyloid-Peptid bestehend. B: neurofibrilläre Tau-Bündel

(die Aufnahmen stammen aus der AG von Dr. R. Prior, Universitätsklinik Düsseldorf, und wurden freundlicherweise von Frau Dr. B. Urmoneit zur Verfügung gestellt).

Das Aβ-Peptid und die zu einem großen Teil daraus bestehenden Plaques spielen eine wichtige Rolle in der Alzheimerschen Erkrankung. Die Plaque-Ablagerungen, die vorwiegend im Cortex und im Hippocampus, aber auch in Kapillargefäßwänden von Hirnrinde und Hirnhaut zu finden sind, verursachen ab einem gewissen Grad Hirnblutungen, die zu dem schweren neurologischen Erscheinungsbild gegen Ende der Erkrankung beitragen. Das komplexe Geschehen im Gehirn von Alzheimer-Patienten, speziell im Umkreis der Plaques, wird von entzündlichen und oxidativ-zellschädigenden Vorgängen begleitet. Die Plaques werden von Mikroglia- und Astrogliazellen angegriffen – Entzündungen und ein verringerter Energiestoffwechsel im Hirn sind die Folge. Dieses Energiedefizit ist letztendlich eine der Ursachen, die zum Untergang der Nervenzellen führen. Besonders cholinerge Neuronen (vor allem im Nucleus basalis Meynert, von dem etwa 90% der cholinergen Bahnen zum Neocortex ausgehen) sind davon betroffen. Deren Ausfall bestimmt maßgeblich die Lern- und Gedächtnisstörungen zu Beginn der Erkrankung mit.

Aβ wird von den meisten Forschern für die Entstehung der Krankheit verantwortlich gemacht bzw. als Ursache für deren pathologische Symptomatik betrachtet. Es gibt jedoch auch ernst zu nehmende Hinweise, die gegen eine hauptverantwortliche Wirkung der Aβ-Peptide bei der Entstehung der Alzheimerschen Erkrankung sprechen. Zum Für und Wider der „Amyloid-Hypothese“ seien hier stellvertretend zwei Übersichtsarbeiten genannt [Hardy, 02; Rottkamp, 02]. Da dem Peptid also zumindest eine sehr wichtige, wenn nicht sogar ursächliche Funktion bei der Alzheimerschen Erkrankung zukommt, und weil es eine unbestrittene Beziehung des Peptids zur NEP gibt, sollen diese beiden Aspekte im Folgenden näher betrachtet werden.

II - 1.2. Entstehung und Biochemie des Aβ-Peptids

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Schon 1906 stellte Alois Alzheimer auf der Tagung „Südwestdeutscher Irrenärzte“ das Krankheitsbild als „einen eigenartigen, schweren Erkrankungsprozess der Hirnrinde“ vor und erkannte die extrazellulären Plaques – neben den intrazellulären Neurofibrillenbündeln – in neurohistopathologischen Präparaten als bis heute gültiges diagnostisches Kriterium. 1984 konnte gezeigt werden, dass die Plaques zu einem großen Teil aus dem maximal 43 Aminosäuren langen Aβ-Peptid (β-Amyloid-Peptid, Abeta, βA4) bestehen [Glenner, 84]. Der kausale Zusammenhang zwischen den amyloiden Ablagerungen und dem Entstehen der Krankheit ist im Detail zwar noch nicht geklärt, wird aber von den meisten Forschern vertreten. Erst in den letzten Jahren wurden Verfahren entwickelt, mit Hilfe derer Aβ-Ablagerungen bzw. -Konzentrationen und damit letztlich die Krankheit selbst am lebenden Patienten mit höherer Sicherheit diagnostiziert werden kann, z. B. mit der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie [Pitschke, 98], PET-Scanning [Shoghi-Jadid, 02], Aβ-Labelling-Methoden [Wengenack, 00] oder Messung von Aβ bzw. dessen Vorläuferprotein (s. unten) im Plasma [Padovani, 01; DeMattos, 02]. Diese Verfahren sind jedoch noch in der Entwicklung und zum Teil sehr kostenintensiv.

Aβ wird während des ganzen Lebens produziert, ist in verschiedenen Körperregionen (besonders im Gehirn) zu finden und liegt normalerweise als korrekt gefaltetes Monomer vor. Wie eine Reihe anderer Proteine auch neigt es jedoch sehr leicht zu Fehlfaltungen, die die Monomeren über verschiedene Übergangszustände zu Fibrillen aggregieren lassen (Abb. 4A-C). Die Bezeichnung Amyloid („stärkeartiges“ Molekül) wird für eine Vielzahl sehr unterschiedlicher Proteine benutzt und rührt von den Anfärbungsreaktionen mit Kongorot und Lugol-Lösung sowie der Lichtdoppelbrechung im Polarisationsmikroskop her, die von Rudolf Virchow 1854 für eine Reihe niedermolekularer Proteine beschrieben wurden und auch heute noch als Nachweis verwendet werden. Ein wesentliches gemeinsames Strukturmerkmal aller Amyloide ist der hohe Anteil an β-Faltblattstrukturen innerhalb des Aggregates. Charakteristisch ist auch die typische Fibrillenstruktur – die Tau-artige Verschlingung von makromolekularen Einzelsträngen – unter dem Elektronenmikroskop (Abb. 4A).

Abb. 4: Amyloidfibrillen.

A: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines künstlichen, Glutamin- und Asparagin-reichen Peptids.
B: Modell einer Amyloid-Fibrille aus 2 bzw. 3 Einzelsträngen. Beide Abbildungen aus [Perutz, 02]
C: vereinfachtes Modell der Amyloid-Fibrillenbildung: Monomere oligomerisieren sehr schnell zu Paranuclei (in anderen Arbeiten auch als Mizellen bezeichnet).
Die Paranuclei können sich dann weiter zu großen Oligomeren („large oligomers“) zusammenlagern. Diese drei Formen sind noch größtenteils unstrukturiert (U), es können aber auch β-Faltblatt-/β-Turn- und α-helikale Elemente enthalten sein. Aus den großen Oligomeren, vermutlich aber teilweise auch aus Monomeren und Paranuclei, können durch substantielle Konformationsänderungen Protofibrillen entstehen, in denen β-Faltblatt-/β-Turn-Elemente dominieren. Schließlich können die Protofibrillen zu Fibrillen reifen, ein Vorgang der kinetisch nahezu irreversibel ist. Die Durchmesser der Protofibrillen und Fibrillen sind angegeben, die einzelnen Strukturen sind jedoch nicht maßstabsgetreu gezeichnet. Modifiziert nach [Bitan, 03]

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Von einer Reihe weiterer Erkrankungen ist bekannt, dass sie ebenfalls durch teilweise massive Anhäufungen von Amyloid-Proteinen im ZNS, aber auch in Organen der Peripherie oder im Kreislauf, gekennzeichnet sind. Bei etlichen dieser Krankheiten ist bekannt, dass Amyloide ursächlich dafür verantwortlich sind. Bei anderen wurden Amyloid-Proteine bisher lediglich als Begleiterscheinungen beobachtet, werden nun aber aufgrund vieler Übereinstimmungen der Erkrankungen auch als gemeinsame Ursache diskutiert. Tab. 2 zeigt eine Zusammenstellung dieser so genannten Amyloidosen und der mit ihnen in Verbindung stehenden Amyloid-Proteine. Darunter befinden sich seit Längerem als Amyloidosen bekannte Erkrankungen wie die Creutzfeldt-Jacob-Krankheit, aber auch solche wie Diabetes Typ II oder Morbus Parkinson, bei denen erst in den letzten Jahren zumindest eine Beteiligung der Amyloide an der Krankheitsentstehung diskutiert wurde. Viele Erkrankungen des ZNS aber auch der Peripherie könnten demnach einem gemeinsamen ursächlichen Mechanismus unterliegen.

Tab. 2: Amyloidosen

Klinisches Syndrom

Fibrilläres Protein

Sekundäre systemische Amyloidose

Serum Amyloid-A-Protein

Senile systemische Amyloidose

Transthyretin

Insulin-assoziierte Amyloidose

Insulin

Typ-II Diabetes

Amylin (Insel-Amyloid-Polypeptid)

Atriale Amyloidose

Atriales Natriuretisches Peptid

Morbus Alzheimer

Aβ-Peptid, Tau-Protein

Morbus Parkinson

α-Synuclein

Creutzfeldt-Jacob-Krankheit
Bovine Spongiforme Enzephalopathie

Prion-Protein (PrPSC)

Morbus Huntington

Huntingtin

Amyotrophe Lateralsclerose

Superoxiddismutase

Bekannte und vermutete Amyloidosen sowie die damit verbundenen Amyloid-Proteine [nach Selkoe, 03].

Aβ entsteht aus dem Amyloid-Vorläufer-Protein (amyloid precursor protein, APP) durch proteolytische Spaltung. Normalerweise wird das membranständige APP auf dem „nicht-amyloidogenen Weg“ durch α-Sekretasen gespalten, wodurch lösliches APPs-α entsteht. Der „amyloidogene Weg“ dagegen ist im gesunden Organismus zwar auch aktiv, hat aber eine untergeordnete Bedeutung. Bei diesem Weg wird das APP zunächst durch die β-Sekretase – die inzwischen als das beta-site APP-cleaving enzyme 1 (BACE1, Überblick in [Vassar, 00]) identifiziert wurde – gespalten, anschließend löst die so genannte γ-Sekretase durch innermembranäre Spaltung das restliche, 39 bis 43 Aminosäuren lange Peptid von der Zellmembran oder intrazellulären Membranen ab (Abb. 5). Normalerweise wird bei dieser Spaltung das unter physiologischen Umständen lösliche Aβ (1-40) gebildet, neben geringen Mengen Aβ (1-39), (1-42) und (1-43). Obwohl das APP und die Amyloid-Peptide während des ganzen Lebens produziert werden ist ihre physiologische Bedeutung immer noch unklar und wurde erst in den letzten Jahren diskutiert [Selkoe, 02; Opazo, 02a; Esteban, 04].

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Abb. 5: Schematische Darstellung des humanen APP und des Aβ-Peptids.

Der obere Teil stellt die größte bekannte Splice-Variante des APP mit 770 Aminosäuren (AS) dar. Am N-Terminus befindet sich eine 17 AS lange Signalsequenz. Die transmembranäre Domäne (TM) befindet sich zwischen den AS 700-723. Das APP kann von verschiedenen Sekretasen spezifisch hydrolysiert werden. Bei initialer Spaltung durch die β-Sekretase (an Position 671/672) und nachfolgender Spaltung durch die γ-Sekretase (hinter AS 711 bzw. 713, auch andere Positionen sind möglich) entstehen die schwer- bzw. unlöslichen Aβ-Peptide 1–40 bzw. 1–42 (rotes Rechteck, „amyloidogener Weg“), sowie ein lösliches APPs-β (AS 1–671) und die intrazellulare Domäne AICD (APP intracellular domain, AS 712/714–770). Bei Hydrolyse durch die α-Sekretase und anschließend durch die γ-Sekretase („nicht-amyloidogener Weg“) entstehen nur lösliche Varianten: APPs
(AS 1–687) und AICD (AS 712/714–770). Die Aminosäuresequenz im Bereich um Aβ ist im unteren Teil der Abb. näher aufgelöst (die Sequenz von Aβ ist unterstrichen). Unter der wildtypischen Aminosäuresequenz sind diejenigen bekannten Mutationen gelb aufgezeigt, die bei Patienten mit familiären Alzheimer-Formen oder vererbbaren Amyloidosen gefunden wurden. Orange sind die Angriffsstellen der Sekretasen markiert. (modifiziert nach [Selkoe, 02])

Bei beginnender Alzheimererkrankung tritt der „amyloidogene Weg“ in den Vordergrund, und die im physiologischen Milieu unlöslichen Peptide Aβ (1-42) und (1-43) werden – besonders bei den familiären (autosomal-dominant vererbbaren) Formen – vermehrt gebildet und lagern sich mit anderen Molekülen aus bis heute nicht vollständig bekannten Ursachen zu den typischen Plaques zusammen. Die Gründe für diese Verschiebung der APP-Spaltung hin zum Anabolismus der Aβ-Peptide sind Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Zum einen könnten dafür Mutationen im APP-Gen verantwortlich sein, die bei einem Teil der familiären (vererbbaren) Alzheimer-Erkrankungen auftreten. Diese Formen unterscheiden sich allerdings von der spontanen („normalen“) Alzheimer-Demenz: Die ersten Symptome treten bei den familiären Formen wesentlich früher auf – sie machen jedoch nur ca. 5% aller Alzheimer-Fälle aus. Biochemisch gesehen führen die APP-Mutationen zu einer Zunahme des APP selbst und damit auch zur vermehrten Bildung der Aβ-Peptide. Die Mutationen liegen zum großen Teil im Bereich der Spaltstellen der α-, β- und γ-Sekretasen und könnten damit eine Abnahme der Hydrolyserate durch die α-Sekretase bewirken oder eine Spaltung durch die β- und γ-Sekretasen begünstigen. Die Produktion des zellschädigenden Aβ (1-42) oder das Verhältnis von Aβ (1-42) zu (1-40) jedenfalls ist in allen diesen Fällen stark erhöht [Selkoe, 02]. Das Gen für APP liegt zudem auf dem Chromosom 21, was das vermehrte und frühere Auftreten von Alzheimer-artigen Demenzerscheinungen bei Patienten mit Down-Syndrom (Trisomie 21) als Gen-Dosiseffekt erklärt [Mann, 88].

Eine weitere Ursache für die Zunahme an Aβ könnten Aktivierungen der an der APP-Hydrolyse beteiligten Enzyme sein. Unter anderem wurde in Gehirnen von Alzheimer-Patienten – besonderes in Regionen mit erhöhtem Plaque-Anteil – vermehrt γ-Sekretase-mRNA gefunden [Yasojima, 01]. Die γ-Sekretase wurde nach intensiver Forschung als Multiproteinkomplex charakterisiert, der aus Nicastrin, APH-1, Presenilin-1 und PEN-2 besteht [Yu, 00; Francis, 02]. Mutationen im Presenilin-Gen, die einen großen Teil der vererbbaren Alzheimer-Formen ausmachen, führen zu einer stark erhöhten Produktion der Aβ-Peptide und zu einem erhöhten Aβ-(1-42)/(1-40)-Quotienten [Selkoe, 03].

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Da die bevorzugten Labortiere – Mäuse und Ratten – aufgrund eines anders strukturierten Aβ-Peptids keine ausgeprägte Alzheimersymptomatik zeigen (siehe unten) wird häufig das Modell hAPP-transgener Mäuse verwendet. Diese überexprimieren humanes APP, bilden folglich humanes Aβ und zeigen eine früh einsetzende, starke Plaquesymptomatik.

II - 1.3. Abbau des Aβ-Peptids

Bei der Ergründung der erhöhten Aβ-Belastung von Alzheimer-Patienten hat sich die Forschung in den letzten Jahren von der alleinigen Untersuchung der anabolen Seite des Aβ-Peptids gelöst. Mit dem rasch auf einander folgenden Bekanntwerden von Aβ-katabolisierenden Enzymen in hochrangigen Publikationen wurde zunehmend untersucht, wie sowohl das Aβ-Peptid als auch die Plaques abgebaut bzw. aufgelöst werden können und wie sich diese Erkenntnisse zu therapeutischen Ansätze nutzen lassen. Mit Kenntnis dieser Enzyme konnten nun auch ihre Aktivitäten in Gehirnen von Alzheimer-Patienten und bei Tiermodellen der Alzheimerschen Erkrankung untersucht werden. Dabei wurde im Gegensatz zu der erhöhten Aktivität (bzw. erhöhten mRNA- oder Protein-Spiegeln) der Aβ-generierenden γ-Sekretase eine Erniedrigung von mRNA, Protein oder der Aktivität von Aβ-abbauenden Enzymen gefunden. So wurde zum Beispiel in den Gehirnregionen von Alzheimer-Patienten, die verstärkte Plaquebildung zeigten, eine stark verringerte NEP-Aktivität festgestellt, während andere Gehirnregionen, in denen pathologische Veränderungen nicht oder erst in sehr späten Stadien der Krankheit auftreten, keine Veränderung der NEP-Aktivität aufwiesen [Yasojima, 01; Iwata, 02; Carpentier, 02]. Auch für das Insulin-abbauende Enzym (insulin-degrading enzyme, IDE, Insulysin) wurde solch eine inverse Korrelation von Aβ und Enzymaktivität gefunden [Miller, 03]. Zusammengenommen zeugen diese Befunde von der „Schieflage“, in die die Homöostase von Anabolismus und Katabolismus der Peptide bei familiärer Veranlagung oder beim spät einsetzenden („late-onset“) Typ der Alzheimerschen Erkrankung gerät. Dies führt letztlich zur Akkumulation der Peptide.

Dass die NEP tatsächlich Aβ hydrolysieren kann, wurde bereits 1995 von Howell gefunden [Howell, 95]. Dieser Zusammenhang erregte allerdings erst im Jahr 2000 nach einer eingehenden In vivo-Untersuchung der Arbeitsgruppe um T. Saido am japanischen RIKEN Brain Science Institute Aufsehen [Iwata, 00c]. Iwata et al. konnten nachweisen, dass die NEP unter den Phosphoramidon-sensitiven Peptidasen am effektivsten Aβ hydrolysiert [Shirotani, 01a], mit einem K m-Wert von 2 µM [Takaki, 00a]. Vermutlich ist das Enzym generell für den Aβ-Abbau mit hauptverantwortlich [Iwata, 01d]. Seit diesen Veröffentlichungen ist der Zusammenhang zwischen der NEP und dem Aβ-Peptid Gegenstand verschiedener Forschungsansätze.

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Neben den geschilderten Versuchen wurde u. a. erfolgreich versucht, NEP-Protein im Zellmodell [Hama, 01] und im ZNS von wildtypischen oder hAPP-transgenen Mäusen durch viralen Gentransfer zu induzieren bzw. in Hirnregionen von NEP-Knockout-Mäusen zu exprimieren [Iwata, 04; Leissring, 03c]. Diese Versuche resultierten durchgängig in erniedrigten Aβ-Spiegeln. In hAPP-transgenen Tieren mit bereits vorhandenen Amyloid-Plaques führte der NEP-Gentransfer sogar zu einer 50%igen Reduktion der Plaques [Marr, 04]. Umgekehrt führte die Injektion von fibrillärem Aβ in Gehirne von jungen transgenen Mäusen mit der Alzheimer-verursachenden „schwedischen“ APP-Mutation (swAPP) zu einem Anstieg von NEP-mRNA und -Protein, woraus erniedrigte Aβ-Spiegel resultierten [Mohajeri, 02]. Dies wird damit erklärt, dass die NEP bei erhöhten Aβ-Spiegeln verstärkt exprimiert wird, wodurch sich der Abbau verstärkt. Das ist ein Beispiel für eine intakte Homöostase. Bei der Alzheimerschen Erkrankung ist diese Homöostase gestört; trotz erhöhter Aβ-Konzentration sinkt die NEP-Aktivität.

Ein weiterer Hinweis auf die Rolle der NEP in der Alzheimerschen Erkrankung in vivo kommt aus Untersuchungen zu Polymorphismen der NEP und deren Einfluss auf die Krankheit. Bisher waren genetische Beziehungen zu der Erkrankung vor allem von den Presenilinen, dem APP sowie dem Apolipoprotein E (Vererbung des ε4-Allels) bekannt. Versuche, solche Beziehungen auch für die NEP nachzuweisen, waren zunächst erfolglos bis zur Veröffentlichung zweier Arbeiten von 2003 und 2004 [Clarimon, 03; Sakai, 04], in denen eine Beziehung von Polymorphismen des NEP-Gens zur Alzheimerschen Erkrankung festgestellt wurden.

Die NEP ist im Hinblick auf den Aβ-Abbau das am besten charakterisierte Enzym. Inzwischen wurden jedoch auch andere Aβ-metabolisierende Enzyme gefunden – ein Großteil dieser Versuche wurde allerdings nur in vitro oder am Zellmodell durchgeführt. Für das erwähnte IDE wurde hingegen die Hydrolyse des Aβ-Peptids nicht nur am Zellmodell bestätigt [Vekrellis, 00], sondern auch beim Aβ-Abbau in vivo (am Mausmodell) scheint sie eine ähnliche Potenz wie die NEP zu besitzen [Leissring, 03b]. Eine Übersicht der Aβ-spaltenden Enzyme und ihrer Angriffsstellen im Aβ-Molekül ist in Abb. 6 veranschaulicht.

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Abb. 6: Spaltstellen innerhalb der Aβ-Sequenz.

In der Literatur beschriebene Spaltstellen sind mit „/“ innerhalb der Sequenz und das betreffende Enzym über- bzw. unterhalb der Sequenz mit einem Buchstaben und der Literatur-Fundstelle markiert. A = ACE [Hu, 01]; E = ECE-1 [Eckman, 01]; I = IDE [Mukherjee, 00]; M = MMP-9, Matrix-Metallopeptidase 9 [Backstrom, 96]; N = NEP [Howell, 95]. Eine Wichtung nach Bedeutung der jeweiligen Spaltstelle wurde nicht vorgenommen. (aus [Carson, 02])

II - 1.4. Problemstellung der Arbeit

Die Beschreibung der NEP als essentieller Aβ-katabolisierender Peptidase einerseits und die Verfügbarkeit von NEP-Knockout-Mäusen sowie des reinen Enzyms andererseits bewegten uns dazu, einige bisher ungeklärte Fragen hinsichtlich des Zusammenhangs zwischen der NEP und der Alzheimerschen Erkrankung zu untersuchen.

Wie beschrieben gibt es klare Post-mortem-Unterscheidungskriterien zwischen der Alzheimerschen Krankheit und anderen Demenzerkrankungen. Diese pathologischen Merkmale konnten bereits bei verschiedenen Säugetieren festgestellt werden [Johnstone, 91a], nicht jedoch bei Mäusen und Ratten [Vaughan, 81] (die manchmal gebrauchte Bezeichnung „bei Nagern“/“rodents“ sollte nicht verwendet werden, da zumindest Meerschweinchen Alzheimer-Merkmale ausprägen können). Auch wenn Mäuse und Ratten Demenzerkrankungen bekommen können, so fehlen Ihnen doch die charakteristischen Plaques. Es könnte dafür verschiedene Gründe geben – unsere Annahme war daher, dass die NEP das murine Peptid schneller spaltet als das menschliche und die resultierende geringere Aβ-Konzentration dazu beiträgt, dass sich eine der menschlichen vergleichbare Alzheimersche Erkrankung bei Ratten und Mäusen nicht ausbildet.

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Murines Aβ unterscheidet sich in drei Aminosäuren vom humanen Peptid [Johnstone, 91b] (Abb. 7). In Position 5 ist Arg gegen Gly ausgetauscht, Tyr gegen Phe in Position 10 und His gegen Arg in Position 13. Die Peptidbindung zwischen Gly 9 und Tyr 10 ist – wie oben beschrieben – für den Katabolismus des humanen Aβ durch die NEP die initiale Spaltstelle. So war es nahe liegend zu untersuchen, ob die murine Gly 9Phe 10-Bindung von der NEP besser gespalten werden kann als die im humanen Aβ enthaltene Gly 9Tyr 10-Bindung. Die Gly–Phe-Bindung ist eine bevorzugte Spaltstelle der NEP, wie sie z. B. in der schnellen Spaltung der Enkephaline zum Ausdruck kommt. Die hydrolytische Spaltung aminoterminal von Tyr ist jedoch ebenfalls möglich, da auch sie eine große und hydrophobe Aminosäure darstellt.

Abb. 7: Vergleichende Gegenüberstellung des humanen und murinen Aβ (1-42).

Die drei unterschiedlichen Aminosäuren sind fett/kursiv gedruckt, die für die Spaltung durch die NEP relevante ist zusätzlich rot gedruckt. Die Spaltstellen durch die NEP wurden aus der Arbeit von Howell et al. übernommen [Howell, 95]. Weitere, von uns detektierte Spaltstellen werden im Ergebnisteil beschrieben.

Ziel der Untersuchungen war folglich, die Abbaugeschwindigkeiten der beiden Peptide durch die NEP zu vergleichen. Da sich die drei unterschiedlichen Aminosäuren im Aβ relativ nah bei einander befinden und die quantitativ genaue Handhabung des Aβ-(1-42)-Peptids mit praktischen Schwierigkeiten verbunden ist, wurden diese Untersuchungen zusätzlich mit der Teilsequenz (4-15) durchgeführt. Um ein evtl. verändertes Hydrolysemuster zu untersuchen, wurden die Spaltprodukte mithilfe der HPLC getrennt und durch Massenspektrometrie identifiziert.

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Ein weiterer Grund für das Fehlen von Plaques in Mäusen und Ratten könnte überdies in einer Unfähigkeit des murinen Peptids zur Amyloid-Fibrillenbildung liegen. Um dies zu überprüfen, wurde die Fibrillenbildung sowohl des murinen als auch des humanen Peptids (als Kontrolle) unter dem Elektronenmikroskop verglichen. Auf die Bedeutung dieser Beobachtungen für das Ausbleiben von Plaques und anderen Symptomen der Alzheimerschen Erkrankung bei Mäusen und Ratten wird in der Diskussion ausführlich eingegangen.

II - 2. Methoden

II - 2.1.  Peptide

Die murine bzw. die humane Variante des Aβ-Peptids (1-42) (mAβ (1-42) bzw. hAβ (1-42)) sowie die entsprechenden Teilsequenzen mAβ (4-15) und hAβ (4-15) wurden freundlicherweise von der AG Peptidsynthese (bei M. Beyermann) am FMP mittels Festphasen-Synthese an einem automatisierten MilliGen 9050 Peptid-Synthesizer (MilliGen/Biosearch, Burlington, MA, USA) hergestellt. Sie wurden mittels präparativer RP-HPLC (C18) und einem Acetonitril-/ Trifluoressigsäure(0,1%)-Gradienten bei 70°C Säulentemperatur gereinigt. Nach Lyophilisation wurde ihre Identität über MALDI-Massenspektrometrie (Voyager-DE STR, Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA) bestätigt. Genauere Angaben zum Verfahren finden sich in [Janek, 01]. Bis zur Benutzung wurden die Peptide bei –20°C gelagert. Zur Vereinheitlichung der Nomenklatur werden die (4-15)-Peptide hier ebenfalls mit dem Präfix „Aβ“ versehen, obwohl sie keine amyloidartigen oder β-Faltblatt-Strukturen ausbilden.

II - 2.2. Amyloid-Inkubation

II - 2.2.1. Vorbereitung der Peptide

Eine 2 mM Lösung sowohl des murinen als auch des humanen Peptids Aβ (1-42) wurde frisch in wasserfreiem DMSO hergestellt. Für die Inkubationen wurden die Lösungen auf 25 µM mit 50 mM Tris-Lösung pH 9,5 verdünnt (der Anteil an DMSO betrug dann 1,25%), gevortext und anschließend ultraschallbehandelt (Vortex VF2, Jahnke & Kunkel GmbH & Co KG, Staufen i. Br./Deutschland; Ultraschallbad: Transsonic T310, 35 kHz, Elma, Singen/Deutschland). Auch nach jedem Auftauen wurden diese Lösungen zuerst gevortext und für 3 min ultraschallbehandelt; ein Stern (*) im Inkubationsansatz bedeutet ebenfalls nachfolgende Behandlung im Ultraschallbad. Die Lösung im Basischen wurde gewählt, weil die Eigenschaften zur Oligomerisierung, Fibrillenbildung, Neurotoxizität und andere Parameter laut einer Veröffentlichung [Fezoui, 00b] besser reproduzierbar sind, wenn die alkalischen Lösungen erst kurz vor der Analyse neutralisiert werden. Die Reaktionen wurden direkt in HPLC-Röhrchen (06-PPCV, Chromacol Ltd., UK/Abimed, Deutschland) mit Bördelkappen R11-oA 1.0mm (Chromatographie Handel Müller, Fridolfing/Deutschland) durchgeführt, die sich in ausführlichen Vorversuchen als am wenigsten Aβ-adsorbierend erwiesen. Wegen deren Abmessungen war eine Inkubation im Schüttelwasserbad (GFL 1086, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel/Deutschland) nötig. Währenddessen wurden die Röhrchen mit Kappen (incl. Septen) verschlossen. Die Handhabung der (4-15)-Teilsequenzen war wesentlich einfacher: Stammlösungen mit 2 mM wurden in Tris-Lösung pH 7,4 hergestellt und vor der Inkubation 1:10 verdünnt.

II - 2.2.2. Enzyme

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Rekombinante humane NEP (rhNEP, Charge GXW01) wurde von R&D Systems (Wiesbaden/Deutschland) bezogen. Die Lösung enthielt 0,368 mg Protein/ml und hatte bei ihrem Eingang eine Aktivität von >250 pmol/min/µg, bezogen auf den Umsatz von Mca-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys(Dnp)-OH. Mit „Glycerol-Lösungsmittel“ („Glycerol-LM“) wurde das Lösungsmittel bezeichnet, in dem die rekombinante NEP vorlag. Es bestand aus 50% Glycerol, 50 mM NaCl und 25 mM Tris-HCl pH 7,5. Mit diesem Lösungsmittel wurde die rhNEP für den Inkubationsansatz im Verhälnis 1:30 verdünnt (rhNEP „1:30“).

Aufgereinigte lösliche NEP wurde aus bovinem Seminalplasma wie folgt hergestellt: Seminalplasma vom Eber wurde bei 80.000 g für 7 min zentrifugiert. Ein Teil des Überstandes wurde mit vier Teilen Tris-HCl-Puffer 50 mM pH 7,6 verdünnt und bei 80.000 g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde danach auf ein HPLC-System von Perkin Elmer Applied Biosystems (Workstation Vision) mit einer 20 HQ Anionenaustauscher-Säule bei einer Flussrate von 10 ml/min aufgetragen. Die Trennung wurde mit einem Stufengradienten von 0, 50, 100, 150 und 600 mM NaCl in Tris-HCl-Puffer 50 mM pH 7,6 ausgeführt. Es wurden vier Fraktionen nach 11,5; 12,4; 13,3 und 14,2 min erhalten, die bei den längeren Retentionszeiten steigenden Proteingehalt und erhöhte NEP-Aktivität aufwiesen. Die letzten zwei Fraktionen wurden vereinigt und durch SDS-PAGE und Western-Blotting auf Begleitprodukte und Identität analysiert. Der Proteingehalt und die NEP-Aktivität (Beschreibung s. Kap. 3.2.3) der so entstandenen Lösung wurden mit 0,0835 mg Protein/ml bzw. 982 nmol TAG/mg Protein/min ermittelt.

II - 2.2.3. Inkubation

Die Inkubationen der Aβ-(1-42)-Peptide bzw. der Aβ-(4-15)-Teilsequenzen wurden nach folgendem Schema vorgenommen:

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Lösung

ungehemmt

ohne Enzym

A (1-42) 25 µM

20 µl

20 µl

Tris 50 mM pH7,4 (*)

50 µl

50 µl

HClO4 0,35 M (*)

3,33 µl

3,33 µl

rhNEP „1:30“ (*)

20 µl

„Glycerol-LM“ (*)

20 µl

Inkubation (37°C) über die
im Text angegebene Zeit

Stopp : HClO4 0,35 M

20 µl

20 µl

MeCN (*)

20 µl

20 µ

Lösung

ungehemmt

gehemmt

A (4-15) 0,2 mM

7 µl

7 µl

Lisinopril 0,01 mM

10 µl

10 µl

Bestatin 1 mM

10 µl

10 µl

Candoxatrilat 0,1 mM

10 µl

Tris 50 mM, pH 7,4

63 µl

53 µl

Aufgereinigte NEP
(s. unten)

10 µl

10 µl

Inkubation (37°C) über 0 h, 2 h und 5 h

Stopp : HClO4 0,35 M

50 µl

50 µl

Bei der Inkubation der (1-42)-Peptide wurden die peptidhaltigen Lösungen nach dem Auftauen möglichst schnell in die Ansätze pipettiert und die Inkubation gestartet. Vor dem Einpipettieren wurde jede Peptidlösung 20x aufgesaugt, um die Pipettenspitze mit der Lösung abzusättigen. Nach der angegebenen Inkubationszeit wurden die Kappen abgenommen, die Ansätze mit HClO4 und Acetonitril (MeCN) versetzt, neue Kappen aufgesetzt, gevortext und sofort eingefroren. Vor der Analyse per HPLC wurde jede Probe einzeln kurz vorher aufgetaut, gevortext, 3 min ultraschallbehandelt und sofort analysiert. Da bei Reaktionsansätzen mit gehemmtem Enzym (und auch ganz ohne Enzym) die Konzentration der (1-42)-Sequenzen deutlich abnahm wurde statt des Bezugs auf einen t0-Wert der Mittelwert der Inkubationen ohne Enzym (zum jeweiligen Zeitpunkt) mit 100% gleichgesetzt (= 100%-Wert). Die Mittelwerte der ungehemmten Ansätze (zum gleichen Zeitpunkt) wurden darauf bezogen und sind demnach ebenfalls prozentual angegeben.

↓29

Bei der Inkubation der (4-15)-Peptide wurden zeitgleich getrennte Inkubationen für jeden Zeitpunkt angesetzt, die Reaktion zum jeweiligen Zeitpunkt gestoppt und zwei Zeitpunkte im Bereich linearer Kinetik zur Auswertung herangezogen. Da die Konzentration auch der (4-15)-Teilsequenzen bei gehemmter Inkubation und langen Reaktionszeiten abnahm (allerdings in wesentlich geringerem Ausmaß als bei den (1-42)-Peptiden), wurden zu jedem Zeitpunkt auch Proben mit Candoxatrilat (freundlicherweise zu Verfügung gestellt von Pfizer, Karlsruhe/Deutschland) in der Endkonzentration 10 µM inkubiert. Candoxatrilat ist der aktive Metabolit des NEP-Inhibitor-Prodrugs Candoxatril. Der Mittelwert der gehemmten Ansätze zum jeweiligen Zeitpunkt wurde (wie oben) mit 100% gleichgesetzt und die ungehemmten Ansätze zum gleichen Zeitpunkt darauf bezogen.

II - 2.3. HPLC-Analytik

Die hochauflösende Flüssigkeits-Chromatographie (high performance liquid chrom a tography, HPLC) wurde mit einem LC 10-System der Shimadzu Deutschland GmbH/Duisburg durchgeführt. Zur Auswertung wurde die Shimadzu-Software CLASS-LC 10 herangezogen.

Zur Trennung wurde eine Reversed-Phase-Säule verwendet: Nucleosil 100 C18, Länge X Innendurchmesser 250 x 4,6 mm, Partikelgröße 5 µm, Porengröße 100 Å (VDS Opilab Chromatographie Technik GmbH, Berlin/Deutschland).

↓30

Die Signale wurden mit einem UV-Vis-Detektor bei 216 nm detektiert. Als Eluent diente ein Zweikomponenten-Gemisch mit einer 0,1%igen TFA-Lösung als Laufmittel A (LM A) und MeCN als Laufmittel B (LM B). Die Angaben zu den Chromatographie-Bedingungen werden hier für das jeweilige Peptid – sowohl für die quantitative Bestimmung des Peptidabbaus als auch für die Erfassung der resultierenden Abbauprodukte – kurz aufgeführt (Anteil LM B am Gesamtgemisch, Temperatur der Säule, ungefähre Retentionszeit des Peptid-Peaks bei isokratischem Lauf bzw. gesamte Laufzeit des Gradienten):

A β -Peptid

Methode für Peptidabbau (quant.)

Methode für Spaltprodukte (für MS)

murine Aβ 4-15

17%, 40°C, ca. 8,9 min

12%, 40°C, Lauf über 30 min

human Aβ 4-15

12%, 40°C, ca. 12,7 min

10%, 40°C, Lauf über 30 min

murine Aβ 1-42

35%, 40°C, ca. 12,9 min

15-50%, 40°C, Lauf über 45 min

human Aβ 1-42

33,7%, 40°C, ca. 15,8 min

5-45%, 40°C, Lauf über 45 min

Die Peaks wurden durch Integration (Software: CLASS LC-10, Shimadzu) ausgewertet.

II - 2.4. Massenspektrometrie (MS)

↓31

Die bei der Inkubation entstandenen Abbauprodukte wurden manuell nach HPLC-Separation und UV-Vis-Detektion in Glas-Röhrchen aufgefangen. Die Lösungen wurden bis zur Trockne mittels Speedvac (Integrated Speedvac System ISS 100-240, Savant/Life Sciences International GmbH, Frankfurt am Main/Deutschland) eingeengt, in 40 µl eines Gemisches aus MeCN und TFA (0,3%) (1:1) aufgenommen und gevortext. Die Messungen wurden freundlicherweise von H. Lerch und M. Schümann aus der Arbeitsgruppe von E.  Krause (Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie Berlin [FMP]) vorgenommen. Alle Messungen der Bruchstücke der Aβ-(1-42)-Peptide wurden mittels MALDI-TOF-MS (matrix-assisted laser desorption/ionization – time-of-flight-Analysator) analysiert. Dafür wurde α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Taufenkirchen/Deutschland) als Matrix benutzt und jeweils 1,0 µl Matrix und 1,0 µl Probe auf die Probenplatte aufgetragen und co-kristallisiert. Die Matrixmoleküle ermöglichen durch gepulsten Laserbeschuss (Ionisation) niedriger Energie eine schonende Ionisierung der Peptide. Durch die Laserenergie werden dabei zunächst die Matrixmoleküle angeregt und in die Gasphase freigesetzt, dabei gehen auch die Peptidmoleküle als Ionen in die Gasphase über. Anschließend werden die Ionen unter Vakuum in einem elektrischen Feld beschleunigt und nach ihrem Masse-Ladungsverhältnis getrennt. Mit dem Time-of-flight-Analysator wurde die Flugzeit der Ionen im linearen Modus, teilweise auch im Reflektron-Modus mit dem Massenspektrometer (Voyager – De STR, Applied Biosystems) gemessen.

II - 2.5. Elektronenmikroskopie

Die Vorbereitung der Proben und die Messungen wurden freundlicherweise in Zusammenarbeit mit M. Ringling (FMP) durchgeführt. Eine 0,2 mM Lösung des humanen bzw. murinen Aβ (1-42) wurde in hochaufgereinigtem Wasser mit 5% DMSO hergestellt, für 24 h bei Raumtemperatur inkubiert. 5 µl der jeweiligen Probe wurden auf ein 300-mesh Kupfernetzchen mit Kohlefilm aufgetragen, und nach 60 s wurde der Überstand mit Filterpapier abgesaugt. Die noch feuchte Probe wurde auf dem Netzchen mit 5 µl einer frisch zubereiteten 2%igen (M/V) Uranylacetat-Lösung negativ kontrastiert. Nach 60 s wurde überschüssige Flüssigkeit entfernt, die Probe luftgetrocknet und anschließend mit einem 902 A-Elektronenmikroskop (Zeiss, Oberkochen/Deutschland) bei 80 kV untersucht.

II - 2.6. Statistik

Die Abbauversuche wurden mittels t-Test ausgewertet. Die Abweichungen vom Mittelwert sind als SEM (standard error of mean) angegeben.

II - 3. Ergebnisse

II - 3.1.  Abbauversuche

↓32

Abb. 8 zeigt, dass die murinen Aβ–Sequenzen schneller als die humanen Varianten durch die NEP abgebaut werden. In einer ersten Reihe von Experimenten wurde Aβ (1-42) mit rekombinanter humaner NEP inkubiert. In der ersten Messreihe wurden nach 6,5 h noch 9,97% ±0,59% (n=5) des murinen bzw. 17,32% ±1,53% (n=5) des humanen Peptids detektiert (Abbildung nicht gezeigt). Da in diesem Fall wahrscheinlich schon Substratmangel vorlag, wurde das Experiment mit kürzeren Inkubationszeiten und für die NEP optimalem pH-Wert (6,0) wiederholt. In dieser zweiten Messreihe wurden nach 2,75 h Inkubation vom murinen Peptid noch 28,25% ±0,94% des 100%-Wertes und vom humanen Peptid 50,68% ±0,97% des 100%-Wertes gefunden. Der Unterschied zwischen diesen beiden Abbauwerten ist hoch signifikant (P<0,0001).

Abb. 8: Abbau der murinen bzw. humanen Aβ-Peptidsequenzen.

A: Inkubation von Aβ (1-42) mit rhNEP („ungehemmte Inkubation“) bzw. ohne Enzym über 2,75 h (murines Aβ: n = 6; humanes Aβ: n = 5).
B: Inkubation von Aβ (4-15) mit aufgereinigter löslicher (boviner) NEP über 2 bzw. 5 h (n = 4).
✮: P ≤ 0,05; ✭✭✭: P ≤ 0,001

Da die Handhabung der Aβ (1-42)-Peptide mit beträchtlichen praktischen Schwierigkeiten wie z. B. Adsorption an die Gefäßwand oder spontaner Agglomerat- bzw. Fibrillenbildung verbunden ist, wurden die Ergebnisse noch durch Abbaustudien mit der Teilsequenz Aβ (4-15) bestätigt, die gut löslich ist und keine Agglomerate bildet. Diese Sequenz enthält alle drei zwischen murinem und humanem Aβ verschiedenen Aminosäuren in Position 2, 7 und 10 (entspricht Position 5, 10 und 13 der Gesamtsequenz, siehe Abb. 7). Außerdem wurde statt mit rekombinanter NEP mit löslicher boviner NEP (aufgereinigt aus Seminalplasma vom Eber) inkubiert, um die Ergebnisse auch mit Enzym aus einer natürlichen Quelle und anderer Herkunft als Maus oder Mensch zu belegen. Nach 2 bzw. 5 h wurden Proben entnommen. Auch hierbei (Abb. 8B) zeigte sich ein vergleichbares Ergebnis. Aus Vorversuchen war bekannt, dass sich der 2 h-Wert noch im linearen Bereich der Abbaukurve befindet. Nach 2 h wurden noch 60,46% ±0,02% des murinen bzw. 67,34% ±0,02% des humanen Peptids detektiert (P = 0,0376), nach 5 h noch 31,38% ±0,03% des murinen bzw. 40,75% ±0,02% des humanen Peptids (P = 0,0301).

II - 3.2. Massenspektrometrie (MS)

↓33

Zur Kontrolle wurden die frisch hergestellten Aβ (1-42)-Lösungen vor der Inkubation mit Hilfe der HPLC aufgetrennt. Dabei wurden auch einige kleinere Peaks aufgefangen und durch MS analysiert. Außer einem kaum detektierbaren Peak, der dem Bruchstück (1-21) entsprechen könnte, wurden keine Signale gefunden, die als Abbauprodukte aus dem Gesamtpeptid hervorgegangen sein könnten. In der HPLC-Fraktion, die dem Gesamtpeptid entspricht, wurde ein MS-Signal mit ungefähr der halben Signalstärke des Gesamtpeptids detektiert und als das am Methionin35 oxidierte Aβ (1-42) identifiziert.

Anschließend wurden in zwei getrennten Experimenten (Inkubationen wie oben beschrieben) sowohl murines als auch humanes Aβ (1-42) mit löslicher rekombinanter NEP inkubiert, über HPLC aufgetrennt, deutliche Peaks manuell aufgefangen und per MS analysiert. Neben einer Reihe von Peaks mit geringer Konzentration oder schwer zuzuordnenden MS-Signalen konnten nachstehend aufgeführte MS-Signale einem HPLC-Peak mit mittlerer bis großer Peakfläche zugeordnet werden. Die Berechnung erfolgte mithilfe des online verfügbaren Auswertungs-Tools „FindPept“ auf dem Server von www.expasy.org. Die Bruchstücke sind nach absteigender Größe der korrespondierenden HPLC-Peaks aufgeführt; die Anzahl der Sternchen spiegelt in etwa die Größe des HPLC-Peaks wider. Einige Bruchstücke haben gleiche theoretische Massen. Die aus theoretischer Sicht wahrscheinlicheren Bruchstücke sind in fetter Schriftart hervorgehoben. Die jeweilige Aminosäuresequenz ist dahinter mit Unterstreichung aufgeführt. Bei alternativen Möglichkeiten ist nur die wahrscheinlichere abgebildet. Die drei zwischen zwischen humenem und murinem Peptid verschiedenen Aminosäuren sind fett gedruckt. Die jeweils folgende Aminosäure N- und C-terminal von der Spaltstelle ist ohne Unterstreichung in Klammern angegeben.

II - 3.2.1. Inkubation von humanem Aβ (1-42):

↓34

Sequenz 1-42:

Asp 1 -Ala 2 -Glu 3 -Phe 4 - Arg 5 -His 6 -Asp 7 -Ser 8 -Gly 9 - Tyr 10 -Glu 11 -Val 12 - His 13 -His 14 -Gln 15 -Lys 16 -Leu 17 -Val 18 -Phe 19 -Phe 20 -Ala 21 -Glu 22 -Asp 23 -Val 24 -Gly 25 -Ser 26 -Asn 27 -Lys 28 -Gly 29 -Ala 30 -Ile 31 -Ile 32 -Gly 33 -Leu 34 -Met 35 -Val 36 -Gly 37 -Gly 38 -Val 39 -Val 40 -Ile 41 -Ala 42

Sehr große HPLC-Peaks und MS-Signale:

↓35

Mittelgroße HPLC-Peaks und MS-Signale:

↓36

Folgende Fragmente konnten nur in einer von zwei Inkubationen detektiert werden, hatten darin jedoch ein sicheres MS-Signal:

II - 3.2.2. Inkubation von murinem Aβ (1-42):

Sequenz 1-42:

Asp 1 -Ala 2 -Glu 3 -Phe 4 - Gly 5 -His 6 -Asp 7 -Ser 8 -Gly 9 - Phe 10 -Glu 11 -Val 12 - Arg 13 -His 14 -Gln 15 -Lys 16 -Leu 17 -Val 18 -Phe 19 -Phe 20 -Ala 21 -Glu 22 -Asp 23 -Val 24 -Gly 25 -Ser 26 -Asn 27 -Lys 28 -Gly 29 -Ala 30 -Ile 31 -Ile 32 -Gly 33 -Leu 34 -Met 35 -Val 36 -Gly 37 -Gly 38 -Val 39 -Val 40 -Ile 41 -Ala 42

↓37

Sehr große HPLC-Peaks und MS-Signale:

↓38

Mittelgroße HPLC-Peaks und MS-Signale:

II - 3.2.3. Inkubation von humanem und murinem Aβ (4-15):

Auch Inkubationen von h- und mAβ (4-15) mit aufgereinigter löslicher NEP wurden per HPLC aufgetrennt, die detektierten Peaks manuell aufgefangen und mittels MS analysiert. Die entstandenen Bruchstücke waren z. T. jedoch so klein, dass sie nicht vom Signalrauschen unterhalb von 500 Dalton zu unterscheiden waren. Dagegen konnten die erwarteten Fragmente (4-9) und (10-15) eindeutig detektiert werden (Nomenklatur entsprechend der vollständigen (1-42)-Sequenz).

II - 3.3. Elektronenmikroskopie

Elektronenmikroskopisch lassen das humane und das murine Aβ (1-42) ebenfalls ein unterschiedliches Verhalten erkennen: Abb. 9C und D zeigen das murine Aβ (1-42), bei dem in zwei unabhängigen Experimenten in keinem der betrachteten Quadranten eine Fibrillenbildung beobachtet werden konnte. Dagegen sind deutlich sphärische Partikel von fast einheitlicher Größe (ca. 25-40 nm) zu sehen. Beim humanen Aβ (1-42) dagegen konnte eine deutliche Fibrillenbildung gezeigt werden. In Abb. 9A und B sind Fibrillen und Fibrillenbündel von mehr als 100 nm Dicke und mehreren Mikrometer Länge zu sehen. Auch dieses Experiment wurde wiederholt; Abb. 9stellt eine repräsentative Auswahl dar.

↓39

Abb. 9: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von humanem (A und B) bzw. murinem Aβ (1-42) (C und D).

Es wurden repräsentative Ausschnitte ausgewählt. Die Aufnahmen B und D stellen vergrößerte Ausschnitte aus A und C dar.

II - 4.  Diskussion

Mutationen innerhalb der Sequenz des menschlichen Aβ-Peptids, z. B. die so genannten „Dutch“-, „Flemish“-, „Italian“- und „Arctic“-Mutationen, verursachen schwerwiegende „familiäre“ Formen der Alzheimerschen Erkrankung mit erhöhtem Aβ-Spiegel, erhöhter Fibrillen-, Protofibrillen- oder Plaquebildung und/oder erhöhter Neurotoxizität der Aβ-Peptide [Selkoe, 02]. Ein wichtiger Schritt zur Beschreibung der Ursachen für das Krankheitsrisiko, das mit derartigen Mutationen verbunden ist, wurde mit einer Veröffentlichung von Tsubuki et al. gemacht [Tsubuki, 03]. Darin werden die unterschiedlichen Abbauraten der genannten Peptide und der Aβ-(1-40)-Wildform durch die NEP beschrieben. Die mutierten Varianten zeigten im Gegensatz zur Wildform eine höhere Resistenz gegenüber der hydrolytischen Aktivität der NEP, wurden jedoch durch Trypsin in einem vergleichbaren Maß gespalten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die mutierten Formen schlechter in die Bindungstasche der NEP passen und dass durch die resultierenden geringeren Abbauraten die Konzentration dieser besonders pathogenen Formen im Gehirn erhöht ist. Damit war ein enzymatischer Erklärungsansatz für die Pathogenität bestimmter Aβ-Formen gefunden. Mögliche „protektive“ Eigenschaften der bisher nur bei Mäusen und Ratten gefundenen murinen bzw. „rodent“ Form des Aβ-Peptids blieben weiterhin ungeklärt.

In den hier beschriebenen Abbauversuchen konnte in verschiedenen experimentellen Ansätzen erstmals gezeigt werden, dass murines Aβ (1-42) von der NEP signifikant schneller abgebaut wird als das analoge humane Peptid. Diese Ergebnisse wurden zusätzlich durch die besser analysierbare Teilsequenz des murinen Aβ (4-15) bestätigt. Ob der beschriebene Unterschied entscheidend zum Fehlen von amyloidhaltigen Plaques in Gehirnen von Mäusen bzw. Ratten beiträgt, kann aus diesen Versuchen nicht endgültig abgeleitet werden. Der Befund stellt jedoch einen wichtigen Hinweis zur Beantwortung dieser Frage dar und unterstreicht die Bedeutung der bisher oft vernachlässigten katabolischen Seite des Aβ-Stoffwechsels. Es ist jedoch davon auszugehen, dass noch weitere Faktoren ursächlich an der fehlenden Alzheimer-Symptomatik bei Mäusen und Ratten beteiligt sind, wie z. B. die Löslichkeit der Peptide, ihre Tendenz zur Aggregation, ihre zellschädigende Wirkung, oder die peptidolytische Wirkung anderer Aβ-abbauender Enzyme. Diese Diskrepanz zwischen Mensch und Maus/Ratte wird im Folgenden unter Berücksichtigung der hier vorgestellten Ergebnisse sowie der genannten weiteren Faktoren diskutiert (zur Untersuchung des Spaltmusters innerhalb der Peptide durch MS siehe weiter unten).

II - 4.1.  Erklärungsansätze für die fehlende Alzheimer-Symptomatik bei Mäusen und Ratten

↓40

Falls die hier beschriebenen Differenzen in den NEP-Abbaukinetiken von humanem bzw. murinem Aβ ausschlaggebend für die Unterschiede bei der Alzheimersymptomatik von Mensch bzw. Maus/Ratte sind, müssten NEP-Knockout-Tiere, da sie den Vorteil des schnelleren Aβ-Abbaus eingebüßt haben, in höherem Alter amyloidhaltige Plaques entwickeln. Derartige histologische Studien mit Hirnschnitten von NEP-Knockout-Mäusen wurden in Kooperation mit Partnern der Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg (Dr. Schreff) und der Humboldt-Universität zu Berlin (Prof. Luneburg) mit monoklonalen Antikörpern gegen mAβ (Prof. Multhaup, Freie Universität Berlin) durchgeführt. Es konnten jedoch auch bei sehr alten Tieren (>2 Jahre) keinerlei Unterschiede zwischen Wildtyp- und Knockout-Mäusen gefunden werden (zu diesen Versuchen siehe auch weiter unten). Zu ähnlichen Ergebnissen kamen inzwischen auch Iwata et al. [Iwata, 01c]. Wenn diese Funde nun ausschließlich im Hinblick auf den katalytischen Einfluss der NEP betrachtet werden, ergibt sich zwangsläufig ein Widerspruch. Dieser Widerspruch könnte durch folgende Postulate oder Annahmen gelöst werden:

1. Die NEP ist nicht das geschwindigkeitsbestimmende Enzym beim A β - Abbau.

Die seit der Veröffentlichung von Iwata et al. im Jahr 2000 erschienenen Arbeiten sprechen in ihrer Gesamtheit jedoch eher für einen maßgeblichen Anteil der NEP am Gesamtabbau: Die Arbeitsgruppe um T. Saido am japanischen RIKEN Brain Science Institute konnte zeigen, dass im ZNS fast der gesamte Abbau des Aβ-Peptids Thiorphan- bzw. Phosphoramidon-sensitiv ist [Iwata, 00b; Iwata, 01b]. Außerdem wurde gefunden, dass die NEP unter den Thiorphan- bzw. Phosphoramidon-sensitiven Enzymen nahezu alleinverantwortlich für den Aβ-Katabolismus ist [Shirotani, 01b]. Der Einfluss weiterer Peptidasen darauf sollte aber auch nicht vernachlässigt werden. Aβ-katabolisierende Effekte wurden auch für ACE, IDE, ECE, Plasmin oder MMP-9 beschrieben, die zusammen genommen möglicherweise den Verlust der NEP teilweise kompensieren könnten. Es liegen bisher allerdings keine quantitativen Studien vor, die einen Vergleich der Bedeutungen von NEP, ECE und IDE für den Aβ-Abbau im ZNS gestatten würden. Die verfügbaren Daten sind jedoch für NEP und IDE besonders sicher und erstrecken sich auch auf überzeugende In vivo-Untersuchungen. So gibt es bereits erste erfolgreiche Versuche, in hAPP-transgenen Mäusen (siehe Einleitung) die Plaque-Bildung durch Kreuzung mit anderen transgenen, NEP- oder IDE-überexprimierenden Mäusen hinauszuschieben oder sogar vollständig zu verhindern. Die Überlebenswahrscheinlichkeit dieser Tiere ist gegenüber dem hAPP-Stamm stark erhöht [Leissring, 03a]. In weiteren Versuchen wurde mittels Gentransfer die NEP-Aktivität im ZNS von hAPP-transgenen Tieren stark erhöht, wodurch sogar bereits bestehende Plaques wieder aufgelöst werden konnten [Marr, 03a]. Es lässt sich zusammenfassen, dass die NEP für den Aβ-Abbau von wesentlicher Bedeutung ist. Die fehlenden Plaques in den NEP-Knockout-Mäusen lassen sich demzufolge nicht erklären. Eine Begründung dafür könnte das zweite Postulat darstellen:

↓41

2. In den NEP-defizienten Mäusen ist lediglich der Spiegel an löslichem A β erhöht.

Diese Vermutung wird durch die Arbeit von Iwata [Iwata, 01a] sowie durch persönliche Korrespondenz mit einem der Autoren [Saido, 04] bestätigt, in der die Aβ-Konzentration (sowohl (1-40) als auch (1-42)) im ZNS der NEP-Knockout-Mäuse doppelt so hoch wie die der Kontrollen war. Dies führte uns zu der Überlegung, dass

3. murines A β  (1 42) Eigenschaften besitzt, die eine Zusammenlagerung zu Plaques verhindern.

↓42

Dass das murine Peptid im Vergleich zu humanem Aβ unter den oben beschriebenen In vitro-Bedingungen tatsächlich keine Fibrillen ausbildet, war in unseren Versuchen eindeutig nachweisbar, auch wenn frühere Publikationen dazu widersprüchlich waren: Hilbich et al. zeigten sowohl von humanem als auch vom entsprechenden „rodent“ (=Nager) Aβ (1-43) Fibrillenbildung unter dem Elektronenmikroskop, Kongorot-Anfärbung, Doppellichtbrechung unter polarisiertem Licht sowie ein ähnliches Verhalten in Löslichkeitstests [Hilbich, 91]. Allerdings gibt es Anlass, die Übertragbarkeit dieser Ergebnisse auf Nager anzuzweifeln, denn in der Sequenz des dort benutzten „rodent“-Peptids fehlt der Austausch des Arg 5 gegen Gly 5. Die Unterschiede dieser beiden Aminosäuren hinsichtlich Ladung, Basizität, Hydrophilie/Lipophilie und Größe sind jedoch so bedeutend, dass die Ergebnisse dieser Arbeit als nicht repräsentativ für die Fibrillenbildung von murinem Aβ angesehen werden können. Weitere Aspekte der Methodik (Reinheit der Peptide, Bearbeitung der Peptide in 70%-iger Ameisensäure) bekräftigen diese Zweifel. Die extrem saure Behandlung kann eine Fibrillenbildung auch bei Peptiden induzieren, die im Neutralen diese Tendenz nicht zeigen [Fezoui, 00a].

In einer Veröffentlichung von Fraser et al. wurden ebenfalls Aβ-Modifikationen des humanen und murinen Peptids untersucht, allerdings wurde hier nur mit den (1-40)-Sequenzen gearbeitet [Fraser, 92]. Diese sind zwar auch in der Lage, Fibrillen auszubilden, jedoch erst bei deutlich höheren Konzentrationen und – wie inzwischen bekannt ist – über einen anderen Mechanismus als die (1-42)-Peptide [Bitan, 03]. In der Arbeit von Fraser werden die Peptide z. T. auch unter extremen Bedingungen untersucht, z. B. in D2O bei einem pD-Wert von 2,5. Im einzigen Teilversuch dieser Arbeit, bei dem beide Peptide unter gleichen Bedingungen untersucht wurden, konnte erst nach vorheriger Fixierung mit Glutaraldehyd-Dampf eine Fibrillenbildung beobachtet werden. Mit den (1-42)-Sequenzen konnten wir hingegen auch ohne diese Fixierung und ohne einen unphysiologisch niedrigen pH-Wert Fibrillen bei humanem Aβ beobachten.

Andere Experimente hingegen stützen unser Ergebnis zur Aggregation und Fibrillenbildung. So konnte gezeigt werden, dass die zwischen humanem und murinem Aβ unterschiedlichen Aminosäuren wesentliche Elemente der Fähigkeit zur Bindung von Zink- bzw. Kupferionen darstellen. His 13 ist neben His 14 für die Zinkbindung verantwortlich [Liu, 99; Yang, 00]. Für die Kupferbindung sind Tyr 10 und His 13 essentiell; His 6 und wahrscheinlich auch die anderen Histidine können über die Komplexierung eines Kupferions die Dimerisierung und Oligomerisierung von Aβ bewirken [Curtain, 01]. Weil Kupfer und Zink die Aggregation von Aβ wesentlich beschleunigen (bzw. dadurch die Aggregationskonzentration stark herab sinkt) und weil die für deren Bindung essentiellen Aminosäuren Tyr 10 und His 13 im murinen Aβ gegen Phe bzw. Arg ausgetauscht sind, aggregiert humanes Aβ (1-40) in Gegenwart von Zink bzw. Kupfer folgerichtig schon bei wesentlich geringeren Konzentrationen als die murine Variante [Atwood, 98; Bush, 94]. Von Otvos et al. wurde die Fähigkeit beider Peptide zur Fibrillenbildung ebenfalls untersucht. Sie fanden, dass humanes Aβ (1-42) bei neutralem pH-Wert sowie Peptidkonzentrationen und Versuchsbedingungen, die besser als die Arbeiten von Hilbich und Fraser die physiologischen Bedingungen widerspiegeln, reicher an β-Faltblattstrukturen ist als das murine Peptid [Otvos, Jr., 93]. Da die extrazellulären Plaques im menschlichen Alzheimer-Gehirn zum großen Teil aus β-Faltblatt-reichen Amyloidfibrillen gebildet werden, ist wahrscheinlich in dem geringeren Anteil an β-Faltblattstrukturen, in der dadurch beeinträchtigten Fibrillenbildung sowie in der stark veränderten Metallionenbindung die Ursache für die fehlende Plaquebildung bei Mäusen und Ratten zu sehen. Das würde erklären, warum trotz der erhöhten AβKonzentration in den NEP-defizienten Mäusen keine Plaques zu beobachten sind.

↓43

Allerdings sind die Plaque-Herde wahrscheinlich nur eine von mehreren für die Alzheimer-Pathogenese bedeutsamen Formen des Aβ-Peptids. Seit ihrer Entdeckung durch Alois Alzheimer und vor allem seit ihrer eingehenden biochemischen und molekularbiologischen Erforschung in den 1980er und –90er Jahren wurden zwar die Plaque-Ablagerungen im Allgemeinen und die Amyloidfibrillen im Besonderen für die Entstehung der Alzheimerschen Erkrankung verantwortlich gemacht. In den letzten Jahren wurden allerdings zunehmend Hinweise dafür gefunden, dass auch die niedermolekulareren Aggregationsformen des Aβ-Peptids, wie z.B. die so genannten Oligomere oder Protofibrillen, neurotoxische/zellschädigende Eigenschaften besitzen [Walsh, 02; Bucciantini, 02]. Zudem zeigen lösliche Oligomere im Gegensatz zu Plaques eine signifikante Korrelation zu synaptischen Fehlfunktionen oder sogar zu frühen kognitiven Störungen (cognitive impairment). Es gibt inzwischen eine Anzahl von Arbeiten, die eine Korrelation von löslichen oder oligomeren Formen von Aβ mit der Schwere von Alzheimer-Symptomen beschreiben [Kuo, 96; Lue, 99; McLean, 99; Roher, 96]. Derartig eindeutige Beziehungen zwischen Plaque-Ablagerungen und Nervenschädigungen sind bisher nicht bekannt.

Wenn aber oligomeres Aβ in Hirnen von NEP-Knockout-Mäusen im Vergleich zu wildtypischen Tieren – wie oben beschrieben – erhöht ist und diese niedermolekularen Aβ-Aggregate zumindest für einen Teil der neurotoxischen Eigenschaften verantwortlich sind,

4. müssten die NEP-defizienten Tiere im Alter erhebliche Lernbeeinträchti gungen und andere Demenzsymptome zeigen.

↓44

Dazu wurden in Kooperation mit T. Walther (Erasmus Medical Center Rotterdam/NL) sowie G. Grecksch und A. Becker (Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg) Experimente zum Lernverhalten junger und sehr alter NEP (–/–)- und NEP (+/+)-Mäuse (9 bzw. 21 Monate) durchgeführt. Alle diese Versuche zeigten die gleiche, unerwartete Tendenz: Sowohl in der sogenannten „Shuttlebox“ als auch im „Morris-Watermaze-Test“ (zwei Tests zur Bestimmung der Lern- und Gedächtnisleistung) erwiesen sich die 21 Monate alten NEP-Knockout-Mäuse als lernfähiger als die gleichaltrigen Wildtypen. Diese Resultate wurden durch elektrophysiologische Experimente (long-term potentiaton, LTP) an relevanten Hirnschnitten (Amygdala und Hippocampus) von 9 bzw. 24 Monate alten
NEP (–/–)- und NEP (+/+)-Tieren bestätigt [Walther, 05]. Diese Resultate stehen in einem völligen Widerspruch zu den Erwartungen, wonach das Fehlen der NEP zu einem verlangsamten Abbau der Aβ-Peptide und somit zur Akkumulation der Alzheimer-Peptide im ZNS (mit all ihren neurotoxischen Folgen) beitragen sollte. Viel versprechende Versuche an NEP-Knockout-Mäusen mit einem anderen Peptid, welches durch die NEP hydrolysiert wird – dem neuroprotektiven und die Lern- und Gedächtnisleistung fördernden Glucagon-Like Peptid 1 (GLP-1 [Perry, 04; During, 03b]), werden zur Zeit in unserer Arbeitsgruppe am FMP durchgeführt.

Auch wenn diese Experimente eine völlig neue Perspektive in der Erforschung von Gedächtnis und Lernfähigkeit eröffnen, kann damit noch weniger erklärt werden, warum Mäuse mit deutlich erhöhtem Aβ-Spiegel (die NEP-Knockout-Mäuse) keine Alzheimer-Symptomatik zeigen. Wenn die Amyloid-Hypothese nicht in Frage gestellt werden soll, muss es eine andere Lösung dafür geben. Eine weitere Überlegung geht deshalb von einer

5. Speziesabhängigkeit der zellschädigenden Eigenschaften der Amyloid-Peptide aus.

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Es ist denkbar, dass murines Aβ eine geringere Neurotoxizität als das humane Analogon hat. Diese Vermutung wird durch mehrere Publikationen unterstützt. So besitzt murines Aβ (140) im Unterschied zur humanen Variante stark herabgesetzte hydrolytische und oxidative Eigenschaften [Brzyska, 01]. Die Generierung von zellschädigendem H2O2 in Gegenwart von Kupfer ist bei humanem Aβ (142) im Gegensatz zum murinen Peptid stark erhöht [Opazo, 02b]. Folgerichtig fanden Huang et al. in Gegenwart von Kupfer eine starke Erhöhung der Neurotoxizität in der Reihenfolge mAβ (140) << hAβ (140) < hAβ (142) [Huang, 99], was die oben aufgestellte Hypothese bestätigt.

Vermutlich tragen also mehrere Faktoren dazu bei, dass Mäuse und Ratten keine voll ausgeprägte Alzheimer-Symptomatik entwickeln:

Erstens zeigen diese Tiere – wie hier erstmals beschrieben – im Vergleich mit dem Menschen eine beschleunigte Clearance des AβPeptids durch die NEP. Ähnliches könnte auch für das IDE gelten, denn die Unterschiede in den Aminosäuresequenzen von humanem und murinem Aβ betreffen auch eine für dieses Enzym typische Spaltsstelle (His 13His 14 im humanen Peptid bzw. Arg 13His 14 im murinen Peptid).

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Zweitens besitzt murines Aβ im Vergleich zum AβPeptid des Menschen eine stark herabgesetzte Neurotoxizität, und auch biochemische und chemisch-physikalische Eigenschaften wie die Metallionen-Komplexierung sind im murinen Peptid deutlich verändert.

Drittens konnte hier eine verminderte oder gar nicht vorhandene Fähigkeit des murinen Aβ-Peptids zur Fibrillen- und damit Plaquebildung demonstriert werden.

Diese Erkenntnisse können zusammen genommen als ein weiterer Hinweis auf die Richtigkeit der Amyloid-Hypothese gewertet werden. Da sich die von uns und anderen Arbeitsgruppen gefundenen biochemischen und zellphysiologischen Eigenschaften des humanen bzw. murinen Aβ mit der Schwere der Alzheimer-Symptomatik von Mensch bzw. Maus/Ratte decken, scheint das humane Aβ tatsächlich einen pathogenen Einfluss auf die Erkrankung zu haben. Zusätzlich können aus den hier beschriebenen Ergebnissen wichtige Hinweise auf bestimmte Aminosäuren abgeleitet werden, die zur Pathogenität des humanen Aβ-Peptids beitragen bzw. diese in der murinen Form verhindern. Die verantwortliche Sequenz für die Fibrillenbildung und für die Neurotoxizität des humanen Aβ wird allgemein Cterminal von His 14 gesehen. Dieser Abschnitt ist jedoch bei humanem und murinem Aβ identisch. Es kann also vermutet werden, dass murines Aβ in den ersten 14 Aminosäuren Eigenschaften aufweist, die die Pathogenität der gemeinsamen Sequenz abschwächen. Das für die Metallkomplexierung wichtige His 13 ist wahrscheinlich der entscheidende Faktor für die Fähigkeit des humanen Peptids zur Bildung von Amyloidfibrillen. Die für die Neurotoxizität wichtigste der drei ausgetauschten Aminosäuren kann dagegen nur anhand von Aβ-Analogen untersucht werden, bei denen die drei Aminosäuren einzeln ausgetauscht werden. Für den schnelleren Abbau des murinen Peptids ist nach unserer Studie Phe 10 verantwortlich.

II - 4.2. Hydrolytische Angriffsstellen der NEP innerhalb von Aβ

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Neben den Abbauversuchen und den elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurde in dieser Arbeit auch die Lage der enzymatischen Angriffsstellen für die NEP innerhalb der Aβ-Moleküle untersucht und mit Angaben aus älteren Publikationen verglichen. Diese Kenntnisse gehen – trotz zahlreicher Zitate in der Literatur – sämtlich auf eine Publikation aus dem Jahr 1995 zurück [Howell, 95]. Die dort beschrieben Abbauversuche wurden mit aufgereinigter löslicher NEP an humanem Aβ (1-40) durchgeführt. Unsere Untersuchungen hatten zum Ziel, diese Ergebnisse unter Verwendung von rekombinanter NEP und Aβ (1-42) zu überprüfen, aber auch eventuelle Unterschiede im Spaltungsmuster zwischen humanem und murinem Aβ aufzuzeigen. Zuvor wurde auch das Spaltmuster der (4-15)-Teilsequenzen untersucht, um die Eignung dieses Modells für den Abbau durch die NEP anhand eines Vergleichs der Spaltstellen zu belegen. Der massenspektroskopische Nachweis der erwarteten Fragmente (1-6) und (7-12) (entsprechend den Bruchstücken (4-9) und (10-15) in der Nomenklatur der vollständigen (1-42)-Sequenz) bestätigte diese Hypothese. Weitere Informationen konnten aus den MS-Signalen der (4-15)-Inkubation nicht gezogen werden, da die entstanden Bruchstücke zu klein waren, um mit der MALDI-TOF-Technologie detektiert zu werden.

Anschließend konnten in unseren Untersuchungen mit der vollständigen Sequenz Aβ (1-42) die drei in der Arbeit von Howell et al. gefundenen Bruchstücke (4-9), (20-30) und wahrscheinlich auch (31-33) bestätigt werden. Die Fragmente (20-30) und (31-33) waren jedoch nicht so dominierend wie bei den Studien von Howell. Die größten Peaks konnten bei uns dagegen bei beiden Spezies den Bruchstücken (10-17) sowie einem Signal zugeordnet werden, das wahrscheinlich dem Fragment (12-17) entspricht. Neben dem Fragment (4-9) sind wahrscheinlich auch die Di- bzw. Tetrapeptide (18-19) bzw. (39-42) in höherer Ausbeute entstanden. Bei den genannten Hauptpeaks gab es keine nennenswerten Speziesunterschiede – lediglich das Bruchstück (10-16) (begleitet von dessen C-terminalen Abbauprodukten) wurde nur beim murinen Aβ in hoher Ausbeute gefunden. Dieses könnte aus der Vorstufe (10-17), aber auch durch direkte Spaltung der Lys-Leu-Bindung entstanden sein. Die Bruchstücke (31-33) und (31-32) waren dagegen aus der Inkubation des murinen Peptids in deutlich geringerer Ausbeute hervorgegangen als beim humanen Aβ. Bei beiden Aβ-Peptiden kann aus unseren Ergebnissen und denen von Howell et al. keine alleinige initiale Spaltstelle abgeleitet werden. Die hauptsächlichen katalytischen Angriffspunkte können allerdings mit großer Sicherheit in den Peptidbindungen von Glu 3 -Phe 4, Gly 9 -Tyr 10 (bzw. Gly 9 -Phe 10 beim murinen Peptid) Glu 11 -Val 12, Lys 16 -Leu 17 (nur beim murinen Peptid), Leu 17 -Val 18, Phe 19 -Phe 20, Ala 30 -Ile 31, Gly 33 -Leu 34 (die beiden letzten Bindungen vorwiegend beim humanen Peptid) sowie Gly 38 -Val 39 gesehen werden.

Abb. 10: Ergebnisse aus [Howell, 95] im Vergleich mit den hier beschriebenen Resultaten (in Analogie zur Abb. 7).

Die Größe der Pfeile/Kästchen spiegelt grob die Signalgröße der in unseren Experimenten gefundenen Bruchstücke wider. Rote Pfeile markieren Spaltstellen aus der Arbeit von Howell, welche sämtlich auch bei uns auftraten. Spaltstellen mit blauen Pfeilen wurden von uns erstmals beschrieben. Weiße Kästchen kennzeichnen Spaltstellen aus MS-Signalen, deren Echtheit nicht völlig gesichert war (siehe auch Kommentare in den Ergebnissen).

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Aus den hier vorgestellten Ergebnissen zu den unterschiedlichen Abbauraten von murinem und humanem Aβ durch die NEP, zur fehlenden Fibrillenbildung des murinen Peptids sowie zum Spaltmuster beider Peptide durch die NEP lässt sich zwar noch keine unmittelbare therapeutische oder diagnostische Verwertbarkeit ableiten. Die neuen Erkenntnisse – besonders zum Einfluss der Aβ-Aminosäuresequenz auf dessen Katabolismus und die Fibrillenbildung – haben jedoch generelle Bedeutung für das Verständnis der Pathogenität von Aβ und der Entwicklung der Alzheimerschen Erkrankung.


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24.11.2006