III  NEP und Alkoholkonsum

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III - 1.  Einleitung

In fast allen Industrieländern stellen Missbrauch und Abhängigkeit von Ethanol ein großes gesundheitliches, soziales und ökonomisches Problem dar. Schätzungen zufolge sind in diesen Staaten bis zu 8% der Männer und etwa 3% der Frauen durch die Alkoholkrankheit gefährdet. In Deutschland sind etwa 1,7 Mio. Menschen alkoholabhängig, mindestens weitere 2,4 Mio. sind durch Missbrauch gefährdet, und geschätzte 6 bis 9 Mio. Bundesbürger zeigen einen so genannten „riskanten Konsum“. Die Dunkelziffer wird jedoch in diesen Fällen auf ein Vielfaches geschätzt. Jährlich sind in Deutschland ca. 800.000 Todesfälle zu beklagen, die direkt oder indirekt mit der Wirkung von Alkohol in Zusammenhang stehen. Die volkswirtschaftlichen Kosten werden hierzulande auf etwa 20 bis 50 Mrd. € geschätzt [Bundesministerium für Gesundheit und Soziale Sicherung, 00].

In den USA sind mehr als 20% der stationären Aufenthalte direkt oder indirekt durch Alkoholkonsum bedingt. Die jährlichen Kosten des Alkoholismus, sowohl durch medizinische als auch durch sozioökonomische Probleme verursacht, werden in den Vereinigten Staaten auf mehr als 100 Mrd. $ geschätzt [Messing, 01].

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Damit ist aber nur ein Teil der Problematik umrissen, denn die meisten Betroffenen werden über einen langen Zeitraum hinweg – im Durchschnitt sind es fünfzehn Jahre – nicht behandelt. Für Angehörige und Hausärzte stellt es ein großes Problem dar, erst die Anzeichen der Sucht zu erkennen, dann den Betroffenen darauf anzusprechen und ihn schließlich so weit zu motivieren, dass er eine geeignete Therapie beginnt. Für einen Alkoholabhängigen selbst ist dieser erste Schritt noch wesentlich schwieriger. So ist es zu erklären, dass sich nur 7% der Alkoholkranken an spezielle Einrichtungen der Suchthilfe wenden; nur rund 5% unterziehen sich einer Entzugsbehandlung.

Um diesen therapiewilligen Patienten adäquat helfen zu können, bedarf es nicht nur eines Entzugs, sondern vor allem psychotherapeutischer Behandlung oder der Mitarbeit in einer Selbsthilfegruppe sowie der Unterstützung durch sein soziales Umfeld. Ohne diese zusätzlichen Maßnahmen werden mehr als 90% der Alkoholkranken nach einer bloßen Entzugsbehandlung rückfällig. Da aber die jahre-, oft jahrzehntelange Intoxikation mit Ethanol zu extremen Veränderungen im Gehirn führt (Verschiebungen im Neurotransmitter-Gleichgewicht; Veränderungen in der Gentranskription, RNA- und Protein-Prozessierung sowie der synaptischen Struktur) [Nestler, 01], ist es in den meisten Fällen notwendig, die Entwöhnung medikamentös zu unterstützen.

Über die neurobiologischen, neuroanatomischen und molekularen Grundlagen der Abhängigkeit wurden besonders in den 1990er Jahren, dem „Jahrzehnt des Gehirns“, umfangreiche neue Erkenntnisse gewonnen. Auf deren Basis erfolgte die Entwicklung von Wirkstoffen, die gegen das für die meisten Rückfälle verantwortliche „Craving“ wirken. Craving ist das anfallsartig auftretende, heftige und unkontrollierbare Verlangen nach Alkohol, das einen abstinenten („trockenen“) Alkoholiker noch viele Jahre nach einem erfolgreichen Entzug in einen Rückfall treiben kann. Die heute gebräuchlichsten Anti-Cravingmittel Naltrexon und Acamprosat sprechen jedoch nur bei etwa 1/5 bis maximal 1/3 der Patienten an. Warum es einen so hohen Prozentsatz an Non-Respondern gibt, ist bisher unklar.

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Die molekularen Zusammenhänge der Abhängigkeit von Substanzen im Allgemeinen und der Alkoholsucht im Besonderen werfen allerdings noch immer ungelöste Fragen auf. Die Ursache dafür ist im komplizierten Ineinandergreifen der verschiedenen physiologischen Regelkreise des ZNS zu sehen. Im Fall der Alkoholkrankheit kommt allerdings hinzu, dass für Ethanol per se kein Rezeptor bekannt ist, auch wenn in letzter Zeit Rezeptoren nachgewiesen wurden, die in die Vermittlung der Ethanolwirkungen einbezogen sind. So wurde eine Mutation in der α1-Untereinheit des Glyzin-Rezeptors gefunden, der bei transgenen Mäusen mit dieser Mutation die Sensitivität gegenüber Alkohol stark herabsetzte, aber die Sensitivität gegenüber anderen Narkotika unbeeinflusst ließ [Findlay, 02; Wick, 98].

Viele Teile des Puzzles der Alkoholabhängigkeit oder allgemein von Suchterscheinungen/-erkrankungen sind heute bereits bekannt. Die meisten der daraus abgeleiteten potentiellen pharmakologischen Targets stellen Neurotransmitter im weiteren Sinne dar (z. B. Opioide, Dopamin, Serotonin, Glutamat, GABA, NPY, CRH) bzw. deren jeweilige Rezeptoren. Bisher nur wenig Aufmerksamkeit galt hingegen den Enzymen, welche am Anabolismus/Katabolismus dieser Neurotransmitter beteiligt sind. Dabei spielten die Tyrosin-Hydroxylase und die Alkohol-Dehydrogenase eine hervorgehobene Rolle. In den letzten Jahren wurden allerdings auch zunehmend Arbeiten veröffentlicht, die die Funktion von peptidabbauenden Enzymen in der Pathogenese der Sucht bzw. der Alkohol-Abhängigkeit untersuchen. Das ist umso bedeutender, als inzwischen eine zunehmend größere Zahl peptidischer Neurotransmitter sowie deren Bedeutung für die Drogenabhängigkeit bekannt geworden sind. Die Zahl der Neuropeptide übersteigt die der Neuropeptidasen deutlich, da die meisten Peptidasen in der Regel ein größeres Spektrum von Neuropeptiden abbauen. Es ergeben sich daher durch die Hemmung oder Induktion von Neuropeptidasen zwar weniger selektive, dafür in ihrer Wirkungsweise aber umso effektivere Therapieansätze.

Solche Zusammenhänge zwischen Peptidase-Aktivität und Alkoholkonsum wurden bisher u. a. für das ACE, die APN und die NEP beschrieben. Die Hemmung des ACE führte in den meisten Experimenten zu einer Reduktion des Alkoholkonsums [Robertson, 94; Grupp, 92; Grupp, 92], was durch die Publikation von Maul et al. (incl. der Klärung der den Alkoholkonsum fördernden Rolle von Angiotensin I) eindeutig bestätigt werden konnte [Maul, 01]. Die Hemmung der APN durch Bestatin führte ebenfalls zu einer Reduktion des Alkoholkonsums [Szczepanska, 96; Szczepanska, 93].

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Die bisher publizierten Daten zur Bedeutung der NEP bei der Alkoholsucht waren dagegen widersprüchlich. Einerseits wurde nach Gabe von so genannten „NEP-Inhibitoren“ eine Reduktion des Alkoholkonsums berichtet. Diese Befunde sind aber anzuzweifeln, weil es sich bei diesen Substanzen entweder mit Kelatorphan um einen kombinierten NEP- und APN-Inhibitor handelte [George, 91] oder mit „SAAVE“ um eine Mischung aus Aminosäuren und Vitaminen, für die zwar eine Wirkung auf den Alkoholkonsum beschrieben wurde [Blum, 88], die aber kaum auf eine selektive Hemmung der NEP zurückgeführt werden kann. Aus diesem Grund wurden in unserer Arbeitsgruppe Untersuchungen zum Zusammenhang zwischen Alkoholkonsum und NEP-Aktivität durchgeführt. So konnten in verschiedenen Hirnregionen (besonders Tegmentum/Colliculi) von Alkohol-präferierenden Ratten (AA) im Vergleich zu Alkohol-meidenden Ratten (ANA) signifikant erhöhte NEP-mRNA-Spiegel und NEP-Aktivitäten detektiert werden [Winkler, 98b]. Diese Befunde werden durch andere Publikationen [Panchenko, 84a; Beliaev, 83a; Frette, 98c] sowie durch weitere Untersuchungen in unserer Arbeitsgruppe bestätigt.

Mit NEP-defizienten Mäusen stand unserer Arbeitsgruppe ab Mitte der 1990er Jahre erstmals ein Modell zur Verfügung, in dem die NEP im gesamten Körper spezifisch ausgeschaltet ist, ohne dass invasive Techniken erforderlich sind. Durch Verwendung dieser Tiere schien es grundlegend geklärt, dass das Fehlen der NEP zu einem erhöhten Alkohol-Konsum führt [Siems, 00g]. In diesen Versuchen von Siems et al. wurden jeweils fünf männliche Mäuse in einem Makrolonkäfig Typ III gehalten. Die Tiere hatten freien Zugang zu zwei gleich aussehenden Flaschen mit Wasser bzw. alkoholischer Lösung, deren Position regelmäßig gewechselt wurde. Durch dieses Versuchsdesign konnten sowohl invasive Techniken als auch Platzpräferenzen oder ein limitierter Zugang zu Alkohol vermieden werden. Vor allem aber wurden hier erstmals die Untersuchungen zur Funktion der NEP bei vollständigem Verlust der Enzymaktivität durchgeführt, was zuvor nicht ohne schwere invasive Eingriffe (besonders im ZNS) möglich war.

III - 1.1.  Aufgabenstellung

Für die eigenen weitergehenden Untersuchungen zum molekularen Mechanismus des Zusammenhangs NEP – Alkoholkonsum sollte zunächst das bei Siems et al. beschriebene Versuchsmodell reetabliert werden. Geringfügige Modifikationen waren darauf ausgerichtet, den störenden Einfluss diverser Stressoren zu minimieren. Dazu wurden die Tiere ausschließlich in Gruppen von zwei Mäusen gehalten, jedoch getrennt durch eine mit Löchern versehene Plexiglaswand. Durch diese Versuchsanordnung wurden einerseits soziale Kontakte ermöglicht, andererseits wurde das Austragen von Rangkämpfen verhindert. Die Versuche wurden zudem in einer möglichst stressarmen Umgebung durchgeführt, d. h. in einem Tierlabor mit geringer Gesamttierzahl und daraus resultierendem seltenen Betreten durch das Pflegepersonal sowie unter Zugabe von Zellstoff für den Nestbautrieb.

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In ersten orientierenden Versuchen während der Etablierungsphase konnten nach diesem Schema nicht die bei Siems et al. beobachteten Unterschiede im Alkoholkonsum (NEP(–/–) > NEP(+/+)) reproduziert werden. Lediglich bei Versuchsbeginn und bei nachweisbaren störenden Einflüssen von außen wurde ein kurzzeitiger Anstieg beim Alkoholverbrauch der Knockout-Tiere beobachtet, der jedoch nie über mehrere Sessions anhielt. Dies ließ uns vermuten, dass diese widersprüchlichen Ergebnisse nicht allein durch den Genotoyp beeinflusst werden, sondern dass die von Siems et al. ermittelten Differenzen zwischen den Genotypen erst durch einen nicht mehr genau zu definierenden Stressor ausgelöst wurden. Diese unerwarteten Beobachtungen veranlassten uns, die Suche nach den möglichen Ursachen eines erhöhten Alkoholkonsums bei den NEP-Knockout-Tieren mit Hilfe eines definierten Stress-Paradigmas fortzusetzen. Zur Klärung des Einflusses von stressenden Faktoren wurde folgende Strategie gewählt:

Die Mäuse wurden zunächst in einer stressarmen Eingewöhnungsphase an den freien Zugang zu einer Alkohollösung und Wasser gewöhnt. In der nächsten Phase wurden alle Tiere einem kurzzeitigen definierten Stress ausgesetzt und anschließend wurde unter erneut stressarmen Bedingungen die Auswirkung auf den Alkoholkonsum verfolgt. Um auszuschließen, dass die gemessenen Differenzen im Alkoholkonsum durch Unterschiede in der Alkoholabbau-Kinetik oder durch unterschiedliche Präferenzen (z. B. Platzpräferenzen, kalorische Präferenzen, Präferenzen bezüglich süßen oder bitteren Geschmacks) verursacht waren, wurden zuvor diese Parameter überprüft. Die Untersuchungen wurden durch Experimente zum Enkephalinabbau und zur pharmakologischen Inhibierung der NEP bei wildtypischen Mäusen ergänzt.

III - 2. Methoden

III - 2.1.  Tierhaltung

NEP-defiziente Tiere wurden – wie bei Lu et al. beschrieben [Lu, 95] – auf dem Hintergrund C57Bl/6J gezüchtet. 24 männliche NEP-Knockout-Mäuse (homozygot, im Folgenden auch mit NEP (–/–) bezeichnet) und 16 wildtypische C57Bl/6J-Mäuse (im Folgenden auch mit NEP (+/+) bezeichnet) wurden in Barrierehaltung in einem 12h-Licht-Dunkel-Zyklus bei 22 ± 2°C in Makrolonkäfigen Typ III (43 x 27 x 16 cm) gehalten, welche Weichholzfaser und Zellstoff als Einstreu enthielten. Alle zwei Wochen wurden die Tiere gewogen. In jedem Käfig befanden sich, getrennt durch eine Plexiglaswand, zwei Tiere des jeweils gleichen Genotyps. Diese Wand enthielt 9 Bohrungen mit einem Durchmesser von je 12 mm und trennte den Käfig der Länge nach.

III - 2.2. Trinkversuche

III - 2.2.1. Allgemein

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Jedes Tier hatte freien Zugang zu zwei Trinkflaschen, die entweder Leitungswasser oder ein Ethanol–Wasser-Gemisch mit den im Text angegebenen Konzentrationen (V/V) enthielten. Als Trinkflaschen wurden Kunststoffflaschen mit Doppelkugelventilen (Cascade 5, HAGEN Deutschland GmbH & Co. KG, Ragun/Deutschland) verwendet. Diese Flaschen wurden in Vorversuchen als besonders geeignet hinsichtlich der Tropfeigenschaften und Dichtigkeit befunden. Die Flüssigkeiten (Alkohollösung bzw. Wasser) konnten zusätzlich chemisch definierte Substanzen – wie unter den Ergebnissen beschrieben – enthalten. Zunächst waren die Mäuse Alkohol-naiv, dann wurden ihnen steigende Ethanol-Konzentrationen angeboten, um die für den anschließenden Test am besten geeignete Konzentration zu bestimmen. Um eventuelle Seitenpräferenzen der Tiere (zur linken oder rechten Flasche) auszugleichen, wurden die Positionen der Flaschen regelmäßig vertauscht. Die Ergebnisse werden entweder als konsumierte Alkoholmenge [g reines Ethanol/ kg Körpergewicht/Tag] oder als Alkoholpräferenzratio (Anteil der konsumierten Alkohollösung an der Gesamttrinkmenge, als Bruchteil von 1) angegeben. Das Vorgehen bei den diversen Präferenztests wird unter „Ergebnisse“ detailliert beschrieben.

III - 2.2.2. Trinkverhalten unter NEP-Inhibierung durch Candoxatril

Der NEP-Inhibitor Candoxatril (Pfizer, Karlsruhe/Deutschland) wurde mit dem täglichen Futter gegeben. Der durchschnittliche tägliche Futterverbrauch der Mäuse wurde vorher mit ca. 80 g/kg Körpergewicht/Tag bestimmt. Die Substanz wurde wie folgt in das Futter eingearbeitet: Pelletiertes Standardfutter (Altromin Standard-Diät Ratten – Mäuse 1324) wurde zu Partikeln < 1,4 mm zerkleinert und Candoxatril in der entsprechenden Dosierung gleichmäßig darin eingearbeitet. Die Mischung wurde mit einer Gelatinealkohol-Lösung (1,0 g Gelatine, 9,2 g Ethanol 90%, 0,6 g HCl 1M, 9,2 g Wasser) befeuchtet und anschließend granuliert. Das Granulat wurde durch ein Röhrchen gepresst, so dass Pellets mit ca. 1 cm Durchmesser und 2,5 cm Länge entstanden. Die Pellets wurden über Nacht in einem Trockenschrank bei 45°C getrocknet.

III - 2.2.3. Trinkverhalten unter Einwirkung von sozialem Stress

In einem ersten Versuch wurden jeweils zwei männliche Wurfgeschwister für mehrere Wochen durch eine Plexiglaswand separiert in einem Käfig gehalten. Nach einer Zeit der Gewöhnung an den Zugang zu Alkohol, sichtbar an stabilem Alkoholverbrauch, wurden die Trennwände entfernt, woraufhin es zu Rangkämpfen zwischen den beiden Tieren kam. Bei der statistischen Auswertung halbiert sich nach Entfernen der Trennwände die Anzahl der erfassten Werte, weil dadurch für jeweils zwei Tiere eine Wasser- und eine Alkoholflasche zur Verfügung standen.

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In einem weiteren Versuch wurde sozialer Stress als modifizierter Intruder-Test nach Sillaber [Sillaber, 02a] ausgeübt. Dafür wurde jede der NEP-Knockout- oder Wildtyp-Mäuse einzeln in einen Ihnen fremden Käfig (Abmessungen s. oben) zu drei ihnen unbekannten männlichen Mäusen (Residente) gesetzt. Die gleichaltrigen Residenten (C57Bl/6J) wurden in diesem Käfig bereits 7 Tage vor dem Test gehalten. Die Residenten griffen den Intruder innerhalb einer Minute an. Sofort nach der ersten Attacke wurden die Residenten und der Intruder durch eine Plexiglaswand (siehe oben) getrennt, sodass sich der Intruder für 15 min im kleineren Teil des Käfigs (Verhältnis der Grundflächen ca. 5:1) befand. Danach wurde er zurück in seinen Heimkäfig gesetzt, wo er freien Zugang zu Wasser und Alkohol hatte.

III - 2.3. Enzym- und Blut-Analytik

Für die Enzym- und Blut-Analytik wurden die Mäuse durch CO2 betäubt, dann sofort dekapitiert und das Blut aufgefangen. Nach ca. 20 min Koagulation wurde das Serum durch Zentrifugation (5 min bei 2000 g) separiert, abgetrennnt und bei –80°C eingefroren. Ausgewählte Hirnregionen wurden nach Popov [Popov, 73] präpariert und daraus Membran-Präparationen wie bei Hulme beschrieben [Hulme, 92] hergestellt. Für die folgenden Analysen wurden die Proben nach dem Auftauen durch Ultraschallbehandlung mit einem Ultraschallgerät (Sonotrode UW 60 mit Generator HD 60, Fa. Bandelin, Berlin/Deutschland) bei 4°C resuspendiert und homogenisiert.

Der Proteingehalt der Präparationen wurde mit Hilfe einer nach Bradford [Bradford, 76] modifizierten Methode bestimmt. Kurz gefasst wurden 20 µl proteinhaltige Lösung mit 1 ml Roti-Quant-Lösung (Roth, Karlsruhe/Deutschland) (1:5 mit Wasser verdünnt) in Halbmikroküvetten Plastibrand 1,5 ml (Brand GmbH & Co KG, Wertheim/Deutschland) vermischt und die Absorption der Lösung im linearen Bereich bei 595 nm in einem UV-Vis-Spektrophotometer UV mini 1240 (Shimadzu, Kyoto/Japan) vermessen.

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Die NEP-Aktivität wurde mit einer von Winkler et al. entwickelten Methode gemessen [Winkler, 98c]: 100 µl einer 200 µM [DAla2,Leu5]enkephalin-Lösung (DALEK) wurden in Gegenwart von 50 µl einer Lösung von Bestatin und Lisinopril (100 µM bzw. 1 µM Endkonzentration) mit 50 µl der oben beschriebenen Membran-Präparation oder Serum inkubiert, die Reaktion mit 100 µl HClO4 0,35 M gestoppt und das resultierende Abbauprodukt Tyr-D-Ala-Gly mittels high performance liquid chromatography (HPLC) über eine RP-C18-Säule mit 6% Acetonitril in saurem Phosphat-/Perchloratpuffer getrennt und bei 216 nm detektiert. Die Spezifität der Reaktion wurde durch den NEP-Inhibitor Candoxatrilat in der Endkonzentration 10 µM (Pfizer, Karlsruhe/Deutschland) bestätigt. Die Substrate und übrigen Inhibitoren wurden von der Sigma Aldrich Chemie GmbH, Taufenkirchen/ Deutschland, bezogen.

Die ACE-Aktivität wurde mit einer fluorimetrischen Methode, modifiziert nach Friedland und Silverstein, gemessen [Friedland, 76]. Dazu wurden 10 µl biologisches Material mit 20 µl Hip-His-Leu 25 mM als Substrat in Gegenwart von 10 µl Bestatin 2,5 µM und 210 µl phosphathaltigem Puffer (0,5 M K2HPO4, 1,5 M NaCl, pH-Wert 8,3; diese Lösung vor Gebrauch 1:4,6 mit H2O verdünnt) inkubiert. Das dabei entstehende His-Leu wurde mit 1 ml NaOH 0,506 M und 100 µl o-Phthalaldehyd (20 mg/ml Methanol) versetzt und der entstehende Komplex nach 10minütigem Stehen im Dunkeln mit 300 µl HCl 2 M versetzt. Dieser Komplex wurde im Fluorimeter Luminescence Spectrometer LS 50 B (Perkin-Elmer Ltd., Beaconsfield/England) bei 365 nm Anregungs- und 500 nm Emissionswellenlänge detektiert. Die Spezifität der Reaktion wurde durch den ACE-Inhibitor Lisinopril in der Endkonzentration 1 µM bestätigt. Substrate und Inhibitoren wurden von der Sigma Aldrich Chemie GmbH, Taufenkirchen/Deutschland, bezogen.

III - 2.4. Enkephalinabbau

Die Hydrolyse von Leu-Enkephalin durch Membranpräparationen verschiedener Hirnregionen von NEP-Knockout-Mäusen wurde mit derjenigen von wildtypischen Mäusen verglichen. Für jede Region wurden je drei Ansätze mit bzw. ohne den Inhibitor der Aminopeptidase N (APN), Bestatin, inkubiert. Die ungehemmten Ansätze wurden nach 30, 60 und 90 min analysiert, die Bestatin-gehemmten nach 60, 90 und 120 min.

III - 2.5. Alkoholabbau-Kinetik nach intraperitonealer Verabreichung

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2 bzw. 3 h nach intraperitonealer Verabreichung eines Alkoholbolus (3,5 g Ethanol/kg Körpergewicht) wurden je 10 µl Blut aus der Schwanzvene entnommen. Die Alkoholkonzentration im Blut wurde nach der Methode von Roach und Creaven [Roach, 68] in einem transportablen Gaschromatographen (Perkin Elmer 8600) analysiert.

III - 2.6. Statistik

Statistische Auswertungen wurden mit Hilfe der Programme GraphPad InStat 3.00 für Windows 95, GraphPad Prism 3.00 für Windows 95 (beide von GraphPad Software, San Diego, USA) und SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago/USA) berechnet. Der verwendete Test und die statistischen Parameter werden in den Ergebnissen beschrieben. Sofern nichts anderes angegeben ist, wird die Abweichung vom Mittelwert in Text und Abbildungen als SEM (standard error of mean = Standardfehler des Mittelwerts) angegeben und wurden die t-Tests zweiseitig und ungepaart durchgeführt. Bei nichtparametrischen Tests wird nur der Median als Lageparameter angegeben. In Abbildungen wird bei Mono-, Zwei- und Dreifaktorieller Varianzanalyse auch der Ausdruck „Ein-“, „Zwei-“ bzw. „Drei-Wege-ANOVA“ benutzt.

In Tabellen und Abbildungen entsprechen folgende Bezeichnungen diesen P-Werten:

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III - 3. Ergebnisse

In Vorversuchen wurde zunächst geklärt, ob die auftretenden Unterschiede zwischen den Genotypen durch verschiedene Präferenzen (Präferenzen für kaloriereiche Flüssigkeiten, Präferenzen für oder Aversionen gegen verschiedene Geschmacksrichtungen, Platzpräferenzen etc.), durch Bevorzugen oder Vermeiden bestimmter Alkoholkonzentrationen oder durch unterschiedliche Kinetiken im Alkoholabbau bedingt sein könnten. Des Weiteren wurden die Gesamttrinkmengen beider Genotypen verglichen, mögliche Unterschiede des Enkephalinabbaus in Hirnpräparationen analysiert sowie der Einfluss der pharmakologischen Inhibierung der NEP bei wildtypischen Mäusen untersucht. Im Hauptteil der experimentellen Arbeiten wurde anhand zweier unterschiedlicher Paradigmen (an zwei unterschiedlichen Tiersets) der Einfluss von Stress auf den Alkoholkonsum der beiden Genotypen verglichen.

III - 3.1.  Präferenztests

Zunächst musste ausgeschlossen werden, dass die hier und bei Siems et al. [Siems, 00f] beschriebenen NEP-abhängigen Effekte auf den Alkoholkonsum kalorische oder geschmackliche Ursachen hatten. Dazu wurden sowohl wildtypischen als auch NEP-Knockout-Mäusen vom 1.-9. Tag zwei Flaschen mit Wasser zur freien Auswahl angeboten; von Tag 10 an enthielt eine der beiden Flaschen zusätzlich die in Tab. 3 angegebenen Substanzen. In dieser Tabelle sind die Ergebnisse der Präferenztests (Angabe als Verhältnis [Präferenzratio] des Verbrauchs der behandelten Trinkflüssigkeit zur Gesamttrinkmenge) sowie die statistische Auswertung mittels Zweifaktorieller Varianzanalyse eingetragen.

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Tab. 3: Präferenztests für verschiedene Substanzen

Tag

Substanz
(Konz.
[mM] )

Ratio ± SEM
(
+/+)

Ratio ± SEM
(–/–)

Signifik.

1-9

0,481 ±0,054

0,563 ±0,052

n.s.

10-15

Saccharose 1,70% (m/V)

0,612 ±0,067

0,548 ±0,075

n.s.

16-22

Saccharose 4,25% (m/V)

0,725 ±0,051

0,642 ±0,069

n.s.

23-29

NaCl 0,9% (m/V)

0,174 ±0,041

0,301 ±0,074

n.s.

30-36

Chinin 0,03 mM

0,437 ±0,062

0,592 ±0,076

n.s.

37-47

Chinin 0,10 mM

0,504 ±0,060

0,526 ±0,061

n.s.

48-56

Chinin 0,25 mM

0,311 ±0,051

0,375 ±0,061

n.s.

57-71

Saccharin 0,033% (m/V)

0,612 ±0,039

0,593 ±0,047

n.s.

72-81

Saccharin 0,066% (m/V)

0,605 ±0,059

0,610 ±0,063

n.s.

82-86

0,530 ±0,087

0,536 ±0,087

n.s.

87-93

NaCl 0,9% (m/V)

0,147 ±0,009

0,172 ±0,037

n.s.

Die Ergebnisse der Präferenztests für verschiedene Substanzen bei je 8 Männchen NEP (–/–) und NEP (+/+) sind ausgedrückt als Präferenzratio („Ratio“). Der zeitliche Verlauf der Präferenzratio innerhalb eines Behandlungszeitraums wurde zwischen den Genotypen mittels Zweifaktorieller Varianzanalyse verglichen.
n.s.: P > 0,05 (nicht signifikant)

Aus dieser Tabelle wird ersichtlich, dass etwaige Veränderungen im Trinkverhalten bei allen Testbedingungen jeweils beide Genotypen betreffen und dass zwischen den beiden Genotypen bei keiner der Testbedingungen ein statistisch signifikanter Unterschied auftrat. Die beiden Genotypen unterscheiden sich also weder durch Ihr Bestreben, kalorienreiche oder süß schmeckende Trinkflüssigkeit zu sich zu nehmen noch durch eine Aversion gegen salzigen oder bitteren Geschmack. Die in den folgenden Tests auftretenden Unterschiede beim Alkoholverbrauch der beiden Genotypen können demnach nicht auf derartige Unterschiede im Geschmacksempfinden oder in der Motivation zur Kalorienaufnahme zurückgeführt werden.

Die NEP-Knockout- und Wildtyptiere wurden zusätzlich in einem konditionierten Platzpräferenztest untersucht. Daraus ging kein Anhaltspunkt für eine veränderte Platzpräferenz der Knockout- gegenüber den Wildtyptieren hervor (persönliche Mitteilung von B. Maul/FMP).

III - 3.2. Ermittlung einer geeigneten Alkoholkonzentration und der Gesamttrinkmenge

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Um ein generelles Meiden oder Bevorzugen bestimmter Alkoholkonzentrationen auszuschließen, wurde für die anschließenden Versuche eine geeignete Alkoholkonzentration ermittelt. Zu diesem Zweck wurden Alkohol-naiven Mäusen zusätzlich zum Wasser Alkohollösungen in unterschiedlichen Konzentrationen
(5, 7,5, 10 und 15% [V/V]) angeboten. Bei den ersten drei Konzentrationen wurde bei steigender Konzentration der Lösung innerhalb eines Genotyps keine Veränderung der Präferenzratio beobachtet – lediglich die absolut konsumierte Alkoholmenge (in g/kg Körpergewicht/Tag) stieg. Zwischen den Genotypen ergaben sich weder in der Präferenzratio noch in der aufgenommenen Alkoholmenge Unterschiede. Bei einer Alkoholkonzentration von 15% (V/V) wurde allerdings ein starker Anstieg von Alkoholverbrauch und Gesamttrinkmenge beobachtet. Dies wurde durch die geringere Grenzflächenspannung dieser Lösung und das dadurch bedingte leichtere Auslaufen aus den Ventilen verursacht. Um dieses Phänomen einerseits zu vermeiden und andererseits den Versuchstieren eine ausreichend hohe Alkoholmenge anbieten zu können, wurden die folgenden Experimente mit 10%igen Alkohollösungen durchgeführt.

Das Trinkverhalten bezüglich der Gesamttrinkmenge wurde in drei von einander unabhängigen Versuchen jeweils über den gesamten Zeitraum ermittelt. Die Versuche waren hinsichtlich der eingesetzten Alkoholkonzentrationen sowie der stressfreien oder stressarmen Bedingungen verschieden gestaltet. Die dabei beobachteten Gesamttrinkmengen können deshalb innerhalb eines Genotyps von Versuch zu Versuch differieren. Trotz dieser unterschiedlichen Versuchsbedingungen wurde jedoch in allen drei Versuchen ein erhöhter Gesamtverbrauch der Knockout-Tiere gegenüber den Wildtypen beobachtet. Die Ergebnisse wurden durch Zweifaktorielle Varianzanalyse des zeitlichen Kurvenverlaufs (Genotyp x Zeit) statistisch verglichen. Die Ergebnisse sind in Tab. 4 aufgeführt.

Der Einfluss des Genotyps auf die Gesamttrinkmenge unterstreicht die Bedeutung der Alkoholpräferenzratio bei der Beurteilung des NEP-abhängigen Alkoholkonsums. Die im Folgenden beschriebenen Versuche zum Alkoholverbrauch werden daher überwiegend durch die Präferenzratio ausgedrückt.

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Tab. 4: Gesamttrinkmenge

(+/+): Gesamttrinkmenge [g/kg/d] ± SEM

(–/–): Gesamttrinkmenge [g/kg/d] ± SEM

Sitzungen

Signifikanz

Versuch 1

119,1 ± 2,6 (N=10)

146,3 ± 2,6 (N=10)

39

✭✭✭

Versuch 2

142,8 ± 2,4 (N=12)

155,5 ± 2,5 (N=12)

21

✭✭✭

Versuch 3

120,7 ± 1,7 (N=16)

139,6 ± 1,7 (N=24)

47

✭✭✭

Statistische Auswertung der Gesamttrinkmenge von NEP-Knockout- (–/–) und Wildtyp-Mäusen (+/+) aus drei von einander unabhängigen Versuchen nach Zweifaktorieller Varianzanalyse (Genotyp x Zeit, N = Anzahl der Tiere).
✭✭✭: P ≤ 0,001

III - 3.3. Alkoholabbau-Kinetik nach intraperitonealer Verabreichung

Differenzen zwischen den beiden Genotypen in der Verstoffwechselung des aufgenommenen Alkohols könnten das Alkohol-Trinkverhalten der Tiere nachhaltig beeinflussen. Um derartige Unterschiede im Alkohol-Metabolismus auszuschließen, wurden die Blutalkohol-Spiegel von 6 NEP (–/–) und 6 NEP (+/+) 2 bzw. 3 h nach intraperitonealer Gabe von Ethanol gemessen. Zu beiden Zeitpunkten unterschied sich der Blutalkohol-Spiegel der Knockout-Mäuse nach Zweifaktorieller Varianzanalyse (Genotyp x Zeit) nicht signifikant von dem der Wildtypen (2 h: 1,51 ±0,071 mg/ml [–/–] vs. 1,37 ±0,108 mg/ml [+/+] ; 3 h: 1,18 ±0,085 mg/ml [–/–] vs. 0,99 ±0,090 mg/ml [+/+]; P = 0,0825). Die in den folgenden Tests auftretenden Unterschiede zwischen den Genotypen in ihrem Alkohol-Trinkverhalten lassen sich also nicht auf einen verzögerten Abbau bei NEP-Defizienz zurückgeführen

III - 3.4. Enkephalinabbau und Einfluss der Opioidrezeptoren

Physiologisch bedeutsame Substrate der NEP sind die Enkephaline Leu- bzw. Met-Enkephalin, weshalb das Enzym zeitweilig auch als „Enkephalinase“ bezeichnet wurde. Wegen des wichtigen Einflusses dieser Opioide auf suchtrelevante Vorgänge, wie z. B. die freiwillige Alkoholaufnahme [Gianoulakis, 04], könnte ein veränderter Abbau der Enkephaline in NEP-Knockout-Mäusen deren verändertes Alkohol-Trinkverhalten erklären. Deshalb wurde die Hydrolyse von Leu-Enkephalin durch Membranpräparationen verschiedener Hirnregionen aus NEP-Knockout-Mäusen mit denen wildtypischer Mäuse verglichen (n = jeweils 3, Zweifaktorielle Varianzanalyse). Wegen des ebenfalls bedeutenden Einflusses der APN auf den Enkephalin-Abbau wurde dieses Enzym zusätzlich durch Bestatin (Aminopeptidase-Hemmer, insbesondere der APN) inhibiert. Abhängig von der untersuchten Hirnregion und vom Zusatz von Bestatin resultierte dabei folgendes differenziertes Muster: In Striatum (P ≤ 0,001), Bulbus olfactorius (P ≤ 0,01), Thalamus (P ≤ 0,05) und Tegmentum/Colliculi (P ≤ 0,05) von NEP-Knockout-Mäusen wurde Leu-Enkephalin unter Bestatin-Hemmung signifikant langsamer abgebaut als in den entsprechenden Regionen der Wildtypen (Abb. 11). Ohne Bestatin waren in diesen Regionen keine signifikanten Unterschiede feststellbar. Im Cortex dagegen lief unter Bestatin-Hemmung bei beiden Genotypen die Peptid-Hydrolyse gleich schnell ab, ohne Bestatin wiederum bei den Knockout-Tieren signifikant langsamer (P ≤ 0,001). Im Hippocampus und Auditorischen Cortex waren weder mit noch ohne Zusatz von Bestatin signifikant unterschiedliche Abbauraten zu beobachten.

↓61

Abb. 11: Leu-Enkephalin-Abbau in ausgewählten Hirnregionen von NEP (–/–)- und NEP (+/+)-Mäusen.

Der Abbau durch Aminopeptidasen wurde durch Bestatin gehemmt. Die Kurven wurden mittels Zweifaktorieller Varianzanalyse (Genotyp x Zeit) verglichen (n = jeweils 3; errechnete Signifikanzen siehe Text). Der atypische Kurvenverlauf der NEP (–/–) im Tegmentum ist vermutlich auf einen Ausreißer bei den 120-min-Werten zurückzuführen.

Falls das unterschiedliche Trinkverhalten durch regionale Differenzen im Enkephalin-Metabolismus oder durch unterschiedliche Enkephalin-Konzentrationen verursacht sein sollte, müsste der Einsatz eines Opioid-Rezeptorantagonisten diesen Unterschied beseitigen oder zumindest deutlich beeinflussen. Die orale Applikation von Naltrexon in Dosen von 0,2 mg/kg/d über 2 mg/kg/d bis 5 mg/kg/d (jeweils über mindestens eine Woche, gelöst in beiden Trinkflüssigkeiten) erbrachte jedoch weder bei den Knockout- noch bei den Wildtyp-Mäusen eine Reduktion des Alkoholkonsums.

III - 3.5. Trinkverhalten unter NEP-Inhibierung durch Candoxatril

Um zu überprüfen, ob sich die von Siems et al. im Jahr 2000 [Siems, 00e] beschriebenen Unterschiede zwischen NEP-defizienten und wildtypischen Tieren auch bei pharmakologischer Inhibierung der NEP bestätigen, wurde einem Teil von wildtypischen C57Bl/6-Mäusen im Futter der spezifische NEP-Inhibitor Candoxatril verabreicht und gleichzeitig allen Tieren freier Zugang zu Wasser und 10%igem Alkohol gewährt. In Analogie zu den bei Siems et al. beschriebenen Effekten an NEP-Knockout-Mäusen wurde in diesem Paradigma durch die Inhibition der NEP-Aktivität ein erhöhter Verbrauch an Alkohol beobachtet (Abb. 12A).

↓62

Abb. 12: Effekte von Candoxatril nach oraler Verabreichung auf (A) den Alkoholkonsum, ausgedrückt als Präferenzratio, (B) die Gesamttrinkmenge, (C) die renale NEP-Aktivität und (D) die NEP-Aktivität im ZNS.

Die Versuche in (A) und (B) wurden mittels Zweifaktorieller Varianzanalyse ausgewertet, die Versuche in (C) und (D) mittels t-Test. Anzahl der Tiere: 8 pro Gruppe.

Die mit 200 mg Candoxatril/kg/d peroral behandelten Mäuse tranken im Durchschnitt mehr Alkohol als die unbehandelten und zeigten eine durchschnittlich erhöhte Präferenzratio (Abb. 12A). Die Auswertung des zeitlichen Verlaufs der Trinkmengen zeigte mittels Zweifaktorieller Varianzanalyse (Behandlung x Zeit) eine signifikante Differenz (P = 0,0137 für den Alkoholverbrauch und 0,0012 für die Präferenzratio). Die Behandlung mit Candoxatril hatte keinen Einfluss auf die insgesamt getrunkene Flüssigkeitsmenge (P = 0,2257 nach Zweifaktorieller Varianzanalyse, Abb. 12B).

Die Applikation von Candoxatril führt nach unseren Experimenten zu keiner Reduktion der zentralen NEP-Aktivität. Dies steht im Gegensatz zum bisherigen Erkenntnisstand, dass diese Substanz – nach Metabolisierung des Prodrugs zur Wirkform Candoxatrilat – in ausreichendem Maße die Blut-Hirn-Schranke überwindet und dadurch auch im ZNS aktiv ist. Selbst in der für Mäuse relativ hohen Dosis von 200 mg/kg Körpergewicht wurde in unseren Versuchen keine Reduktion der NEP-Aktivität in Gehirnmembran-Präparationen beobachtet (Abb. 12D). Dagegen ergab sich auch schon in geringeren Candoxatril-Konzentrationen eine signifikante Reduktion der peripheren NEP-Aktivität (Abb. 12C). Der spezifische NEP-Inhibitor Candoxatril übt also trotz einer ausschließlich peripheren NEP-Hemmung einen Einfluss auf das Trinkverhalten aus. Die molekularen Ursachen für diesen unerwarteten Effekt sind noch unklar.

III - 3.6. Trinkverhalten unter Stress

↓63

Wie in der Einleitung erwähnt, wurden sämtliche zuvor beschriebenen Trinkversuche nach einem Paradigma durchgeführt, das sich von dem bei Siems et al. [Siems, 00d] beschriebenen Versuchsaufbau unterschied (siehe auch Methoden und Diskussion). In diesem Versuchsschema tranken die NEP-Knockout-Mäuse signifikant mehr Alkohol als ihre wildtypischen Kontrollen. Die wesentlichen Unterschiede im Versuchsaufbau bestanden in der Käfigbelegung, in der Gestaltung des Käfiginnenraums sowie in den äußeren Bedingungen des Tierlabors. In den hier beschriebenen Versuchen wurden die Tiere (I) in Gruppen von zwei statt fünf Tieren gehalten, (II) waren diese zwei Tiere zusätzlich durch eine durchsichtige, mit Löchern versehene Plexiglaswand getrennt, und (III) wurde hier gezielt versucht, die stressenden Einflüsse aus der Umgebung (Tierlabor) zu minimieren.

Bei dem Versuch, die Ergebnisse aus Siems et al. zu reproduzieren, konnten in den oben beschriebenen Vorversuchen keine Unterschiede im Alkohol-Trinkverhalten beider Genotypen festgestellt werden. In den bereits beschriebenen Vorversuchen wurden lediglich nach stressenden Situationen (Versuchsbeginn, Umsetzen der Tiere, Entfernen der Trennwände) kurzzeitige Abweichungen von diesem einheitlichen Trinkverhalten registriert. Daher wurde postuliert, dass diese sporadisch auftretenden Differenzen und das bei Siems et al. beschriebene unterschiedliche Trinkverhalten die Folge einer stressinduzierten und Genotyp-abhängigen Situation waren. Folglich sollte nun unter den neuen, stressärmeren Versuchsbedingungen zunächst ein Basisniveau des Alkoholkonsums gefunden werden, das danach durch einen definierten Stress verändert werden sollte.

III - 3.6.1. „1. Stressversuch“

Anschließend an die stressarme Eingewöhnungsphase wurden die Tiere nun dem nach Koolhaas et al. [Koolhaas, 97] stärksten Stressor ausgesetzt – sozialem Stress. Dieser Stress erfolgte zunächst durch das Herausnehmen der Plexiglaswand, worauf sich die beiden jeweils in einem Käfig befindlichen Tiere als „Eindringlinge“ angriffen. Da zuvor für jeden Käfig jeweils zwei Brüder ausgewählt wurden, die auch bereits vor Versuchsbeginn in einem gemeinsamen Käfig saßen, und diese Brüderpaare anschließend nur durch die durchsichtige und mit Löchern versehene Plexiglaswand von einander getrennt waren, fielen diese sozialen Rangkämpfe nicht so heftig aus, wie sie von einander völlig fremden Männchen zu erwarten wären.

↓64

Nach einer Übergangsphase, in der die aufgenommene Alkoholmenge abnahm und die getrunkene Wassermenge stark anstieg (Tag 2937), stellte sich der erwartete Zustand ein (Abb. 13): Während sich die Alkoholpräferenzratio der Wildtypen kaum veränderte, nahm die Ratio der NEP-Knockout-Mäuse im Vergleich zur Prae-stress-Phase deutlich zu. Auch im direkten Vergleich zu den Wildtypen während desselben Zeitraums lag die Alkoholpräferenzratio der Knockout-Mäuse signifikant höher (Tag 3857). Dieser Zustand hielt mindestens 18 Tage an; danach glichen sich die Ratios beider Genotypen wieder auf ein Niveau an, das mit dem Zustand vor Herausnehmen der Trennwände vergleichbar war (Tag 5874).

Abb. 13: „1. Stressversuch“: Präferenzratio vor (Tag 1-28) und nach Herausnehmen der Trennwand (Tag 39-57), sowie nach erneutem Angleichen der Ratios (ca. 3 Wochen nach Herausnehmen der Trennwand).

Mit blau sind die wildtypischen und mit rot die Knockouttiere gekennzeichnet. Die Werte der Übergangsphase (Tag 29-37) wurden in der Abbildung nicht dargestellt. Die Werte von je 12 männlichen NEP (–/–) und NEP (+/+) wurden in jeder der drei Phasen durch t-Test analysiert. Eine Zweifaktorielle Varianzanalyse konnte nicht durchgeführt werden, da nach Herausnehmen der Trennwände die Anzahl der Messwerte halbiert wurde (nach dem Herausnehmen resultierte für die jeweils zwei Tiere eines Käfigs nur eine Präferenzratio).
✭✭✭: P ≤ 0,001

III - 3.6.2. „2. Stressversuch“

Da bei derartigen Versuchen auch zufällige und unkontrollierbare Einflüsse vorübergehend zu ähnlichen Resultaten führen können, sollten diese Ergebnisse noch nach einem etablierten und stärkeren Stressparadigma bestätigt werden. Dazu wurde das oben beschriebene Versuchsschema mit neuen NEP-Knockout- und Wildtyp-Tieren zu einem Resident-Intruder-Paradigma modifiziert. In einer Gewöhnungsphase wurde den Tieren zunächst Wasser und danach sowohl Wasser als auch Alkohol-Lösungen in steigenden Konzentrationen angeboten. Die daraus resultierenden Ergebnisse wurden zur Ermittlung einer geeigneten Alkoholkonzentration verwendet (siehe oben). Anschließend begann der in der folgenden Grafik und Tabelle dargestellte Hauptversuch. Beginnend mit „Tag 1“ wurde jeweils ein Tier aus dem Versuch an drei auf einander folgenden Tagen für jeweils maximal 1 min in einen ihm fremden Käfig zu fünf männlichen Mäusen gesetzt, dann innerhalb dieses Käfigs von diesen Tieren wie oben beschrieben für 15 min durch eine Plexiglaswand getrennt und anschließend in seinen „Heimkäfig“ zurückgesetzt.

↓65

Nach einer als „akut“ zu bezeichnenden Phase des Übergangs (Tag 22 bis 25), in der der Alkoholverbrauch und die Präferenzratio beider Genotypen absanken, blieb die Alkoholpräferenzratio der Wildtypen auf diesem niedrigeren Niveau (Abb. 14, Beobachtungsabschnitt Nr.2). Dies war aber auf eine leicht gestiegene Gesamttrinkmenge zurückzuführen – die berechnete Menge des aufgenommenen reinen Alkohols blieb gleich. Die Knockouttiere dagegen zeigten – wie schon im ersten Stressparadigma – eine deutliche Response auf den Stressor: Nachdem es während der akuten Stressphase ebenfalls zu einem kurzzeitigen Abfall des Alkoholverbrauchs kam, nahm die Präferenz der Knockouttiere anschließend für drei Wochen deutlich zu Diese Zunahme zeigte sich sowohl im Vergleich zu den wildtypischen Tieren im gleichen Zeitraum als auch im Vergleich zu den Werten der Knockouttiere in der Phase vor dem Stress . Ca. drei Wochen nach dem Stress hatten sich die Alkoholpräferenz-Ratios von Knockout- und Wildtyp-Tieren wieder angeglichen und zeigten keinen signifikanten Unterschied mehr.

Abb. 14: Präferenzratio vor, während und nach zweier Phasen sozialen Stresses.

Mit blau sind die wildtypischen und mit rot die Knockouttiere gekennzeichnet. Die Beobachtungsabschnitte um die beiden Stressphasen herum sind mit „Nr.1“ bzw. „Nr.2“ gekennzeichnet, die einzelnen Phasen mit lateinischen Zahlen. Angaben zur Statistik siehe Tab. 5. ✭✭✭: P ≤ 0,001

In Analogie zu dem Vorgehen bei Sillaber et al. [Sillaber, 02b] ist abschließend die Reproduzierbarkeit dieses Stresseffektes untersucht worden. Dazu wurden dieselben Tiere erneut dem oben beschriebenen Stress-Schema unterworfen (Abb. 14, Beobachtungsabschnitt Nr.2). Zunächst zeigte sich ein vergleichbares Bild wie im zuvor beschriebenen Abschnitt. Während jedoch nach dem ersten Stress die Unterschiede zwischen den Genotypen maximal drei Wochen anhielten, blieben Alkoholverbrauch und Präferenzratio der NEP-defizienten Mäuse bis zum Versuchsende (ca. 10 Wochen nach dem 2. Stress) signifikant erhöht.

↓66

In Tab. 5 (oberer Teil) wurden die Kurvenverläufe (Präferenzratio) beider Genotypen innerhalb einer Phase durch Zweifaktorielle Varianzanalyse miteinander verglichen. Dabei ergaben sich in den Post-stress-Phasen hoch signifikante Unterschiede zwischen Wildtyp- und Knockout-Mäusen, wogegen während der Prae-stress- und akuten Phasen keine statistisch signifikanten Differenzen nachweisbar waren.

Zusätzlich wurden innerhalb eines Genotyps die Mittelwerte jeweils zweier ausgewählter Zeiträume durch Monofaktorielle Varianzanalyse verglichen (unterer Teil von Tab. 5). Dabei stellte sich folgendes Bild heraus: Bei den Wildtypen waren lediglich geringe Unterschiede zwischen Phase I und III, I und IV sowie V und VI nachweisbar. Bei den NEP-Knockout-Mäusen gab es dagegen wesentlich stärkere Veränderungen im Zeitverlauf: Neben den bereits beschriebenen starken Anstiegen der Alkoholpräferenzratio nach dem Stress und dem Abfallen der Ratio nach Phase III wurden – wie erwartet – keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Prae-stress-Phasen I und IV beobachtet; auch die beiden Post-stress-Phasen III und VI waren auf gleich hohem Niveau. Lediglich die akute Phase V zeigte eine unerwartete Erhöhung, was mit einer unklaren und daher willkürlichen festgelegten Trennung von Phase VI erklärbar ist.

Tab. 5: Alkoholpräferenzratio aus dem 2. Stressversuch.

Vergleich der Alkoholpräferenzratio innerhalb der einzelnen Phasen (durch Zweifaktorielle Varianzanalyse)

Verglichene Gruppen

Mittelwerte ± SEM
(gesamter Zeitraum)

Diffe renz

Sign.

(+/+)

(–/–)

 

IPhase vor Stress Nr.1
(Tag 1-21)

0,355 ±0,022 g

0,354 ±0,021 g

-0,001

n.s.

IIIPhase nach Stress Nr.1
(Tag 26-48)

0,302 ±0,023 g

0,418 ±0,023 g

0,166

✭✭✭

IVPhase vor Stress Nr.2
(Tag 49-70)

0,327 ±0,025 g

0,356 ±0,020 g

0,054

n.s.

VIPhase nach Stress Nr.2
(Tag 86-158)

0,291 ±0,014 g

0,448 ±0,013 g

0,157

✭✭✭

Vergleich der Alkoholpräferenzratio innerhalb der (+/+)-Tiere

Phase I vs. Phase III

Phase I vs. Phase IV

Phase III vs. Phase IV

n.s.

Phase III vs. Phase VI

n.s.

Phase IV vs. Phase VI

n.s.

Vergleich der Alkoholpräferenzratio innerhalb der (–/–)-Tiere

Phase I vs. Phase III

✭✭✭

Phase I vs. Phase IV

n.s.

Phase III vs. Phase IV

✭✭

Phase III vs. Phase VI

n.s.

Phase IV vs. Phase VI

✭✭✭

Statistische Auswertung von 24 NEP-Knockout- (–/–) und 16 Wildtyp-Mäusen (+/+) in den im Text und in Abb. 14 beschriebenen Phasen. Im oberen Teil der Tabelle und in Abb. 14 wurden innerhalb der einzelnen Phasen beide Genotypen mit einander verglichen (Multivariate Varianzanalyse nach Pillai-Spur mit anschließendem t-Test). Die akuten Phasen II und V wurden zur Illustration in Abb. 14 eingezeichnet – auf deren statistische Auswertung wurde allerdings (wegen der dadurch zunehmenden Komplexität des statistischen Verfahrens) verzichtet.
In den beiden unteren Teilen der Tabelle wurde die Veränderung innerhalb eines Genotyps während verschiedener Phasen analysiert (Auswertung durch multivariate Varianzanalyse).
n.s.: P > 0,05; ✭: P ≤ 0,05; ✭✭: P ≤ 0,01; ✭✭✭: P ≤ 0,001

III - 4.  Diskussion

↓67

Neben im Laufe des Lebens erworbenen Faktoren (Erziehung, soziales Umfeld, negative Erlebnisse/„Schicksalsschläge“, religiöse Vorschriften etc.) spielen vererbbare Komponenten, also Gene und ihre Genprodukte, eine wichtige Rolle für das Verlangen nach Alkohol. Dies ließ sich experimentell an genetisch modifizierten Tieren – besonders mit Knockout-Tiermodellen – sowie beim Menschen anhand von Zwillingsstudien zweifelsfrei belegen [Crabbe, 02; National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIAAA), 92].

Zu den Genprodukten, die mitverantwortlich für den individuellen Alkoholkonsum bzw. für die erhöhte Motivation zur Aufnahme alkoholischer Getränke sind, gehören vor allem [nach Cowen, 04; Enoch, 03]

↓68

Neuere Erkenntnisse belegen jedoch auch auf molekularer Ebene, dass Differenzen im Trinkverhalten, die durch genetischen Komponenten bewirkt werden, durch Verhaltensfaktoren wie Angst und Stress deutlich beeinflusst oder gar erst durch diese induziert werden [Brady, 99; Gordon, 02]. Von besonderem Interesse sind die bereits erwähnten Ergebnisse von Sillaber et al. [Sillaber, 02c], nach denen der Einfluss des CRH1-Rezeptors auf den Alkoholkonsum erst durch einen wiederholten kurzzeitigen Stress ausgelöst wird.

Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit kann geschlossen werden, dass auch die NEP einen modulierenden (genauer: einen nivellierenden) Einfluss auf das Stressgeschehen ausübt. Dass das Enzym selbst ebenfalls durch Stressmediatoren reguliert werden kann, ist u. a aus Zellmodellen bekannt, jedoch handelte es sich in diesen Fällen meist um die Regulierung durch Mediatoren von z. B. oxidativem Stress [dazu u. a. Toyoda, 02]. Dieser Weg – die Regulierung der NEP durch Stressmediatoren nach einer Stressexposition – kann jedoch in unseren Versuchen keine entscheidende Rolle spielen, da hier nur die Tiere, denen das Enzym fehlt, eine starke Stressantwort zeigen. Bei den wildtypischen Kontrollen wurde dagegen keine deutliche Stressantwort beobachtet, obwohl nur sie das Signal in der Reihenfolge Stress ♢ NEP weiterleiten könnten. Es ist daher vorstellbar, dass die Wildtypen dank eines modulierenden Einflusses der NEP besser mit dem Stressgeschehen umgehen als die NEP-defizienten Tiere. Ein möglicher Einfluss des Alkohols auf die NEP-Aktivität wird unten besprochen.

III - 4.1.  Die Rolle von CRH und anderen peptidischen Mediatoren

Die NEP katalysiert mit hohen Turnover-Raten die Hydrolyse einer Reihe von Peptiden, die Einfluss auf die freiwillige Alkoholaufnahme oder allgemein auf die Selbstverabreichung von Sucht auslösenden Substanzen haben (u. a. NPY, Met- bzw. Leu-Enkephalin, Ang II). NEP-defiziente Mäuse sind folglich ein interessantes Modell zur Analyse einer veränderten Selbstverabreichung von Alkohol und anderen Substanzen mit Abhängigkeitspotential. Theoretisch sollten NEP-defiziente Tiere veränderte Abbauraten, daraus resultierend höhere Konzentrationen der genannten Peptide und dadurch eine veränderte Motivation zur Selbstverabreichung Sucht auslösender Substanzen haben. Dies war unter den stressarmen Anfangsbedingungen unseres Versuchsaufbaus allerdings nicht der Fall. Da die oben genannten Substrate jedoch weniger im Zusammenhang mit Stress stehen, kommen sie kaum als Mediatoren für den erhöhten Alkoholkonsum unter Stressbedingungen in Frage.

↓69

Zu den Substraten der NEP, die außer bei Suchtvorgängen auch beim Stressgeschehen eine wesentliche Rolle spielen, gehört vor allem das oben erwähnte Corticotropin-Releasing Hormon (CRH, bzw. Corticotropin-Releasing Faktor, CRF). Dass CRH ein gutes Substrat der NEP ist, wurde im Jahr 2003 durch Ritchie et al. publiziert [Ritchie, 03b], was in eigenen Untersuchungen anhand unterschiedlicher Enzymquellen bestätigt werden konnte. In der genannten Publikation wird der Umsatz des CRH durch die NEP als sehr effektiv beschrieben. Der K m-Wert der Reaktion liegt mit 42 µM nur wenig über dem der Substanz P (siehe Einleitung).

Die Bedeutung von CRH im Stressgeschehen ist ausführlich beschrieben worden [u. a. in Timpl, 98]. Obwohl der CRH-Einfluss auch auf die Alkoholaufnahme mehrfach untersucht wurde [Sarnyai, 01], konnte jedoch noch nicht ausreichend belegt werden, ob CRH eher fördernd oder hemmend auf die Selbstverabreichung von Alkohol wirkt. Die meisten Versuche gehen von der externen, invasiven Verabreichung des Peptids aus, was in der Regel zu einer Reduktion der Alkoholaufnahme führte. Dabei ist jedoch zu berücksichtigen, dass eine invasive (meist periphere) Verabreichung von Substanzen lediglich allgemeine Konzentrationsänderungen ohne distinkten Bezug zu relevanten Hirnregionen bewirkt. Außerdem können invasive Applikationstechniken durch den dadurch ausgeübten Stress die Motivation zur freiwilligen Alkoholaufnahme massiv beeinflussen [O'Callaghan, 02]. Der letztere Punkt ist natürlich besonders für die Verabreichung von CRH zu beachten, die eigentlich unter völlig stressfreien Bedingungen geschehen sollte.

Der Einfluss von CRH wurde jedoch auch bereits mit Hilfe nicht-invasiver Methoden untersucht, z. B. in CRH-Knockout-Mäusen [Olive, 03]. Durch das Fehlen des CRH-Gens konsumierten die Tiere doppelt so viel Alkohol wie die Wildtypen, zeigten aber auch eine reduzierte Sensitivität auf die lokomotorischen Reize und belohnenden Effekte von Ethanol. Die Verknüpfung des Einflusses von CRH auf den Alkoholkonsum in Kombination mit Stressfaktoren wurde kürzlich am Beispiel des CRH-Rezeptors untersucht. Die Arbeitsgruppe um Spanagel nutzte für ihre Untersuchungen CRH1-Rezeptor-Knockout-Mäuse und konnte so auf invasive Applikationstechniken verzichten [Sillaber, 02d]. Im Anschluss an wiederholte Stressperioden kam es bei den CRH-Rezeptor-Knockout-Mäusen zu einem starken, lang anhaltenden Anstieg des Alkoholkonsums, nicht jedoch bei den wildtypischen Kontrollen. Mit diesen Untersuchungen wurde ein neuer Ansatzpunkt für das genetisch bedingte, stressinduzierte Trinken gefunden.

↓70

Die eigenen Ergebnisse zur Stressabhängigkeit der freiwilligen Alkoholaufnahme in „Two-bottle-free-choice-Experimenten“ entsprechen den Ergebnissen aus der Spanagel-Gruppe insofern, als auch in unseren Versuchen eine Stressexposition die Alkoholkonsumption bei den (NEP-)Knockout-Mäusen ansteigen ließ und mehrfache Stressexposition zu einem verstärkenden, dann aber über Wochen und Monate anhaltenden Effekt führte, wobei die Tiere dem Stressor nur für jeweils kurze Zeiträume (wenige Minuten ) ausgesetzt waren. Die wildtypischen Kontrolltiere in unseren und den zitierten Versuchen reagierten auf die Stressexposition nach identischem Behandlungsschema nicht mit einem Anstieg der Alkoholkonsumption. Das deutet darauf hin, dass auch die NEP auf Prozesse der Stressverarbeitung wesentlichen Einfluss nimmt.

Die molekularen Ursachen für das unterschiedliche Trinkverhalten von NEP-Knockout-Mäusen und ihren wildtypischen Wurfgeschwistern sind unklar. Betrachtet man die auffällige Parallelität der eigenen Untersuchungen mit den Ergebnissen von Sillaber et al., so wäre ein Einfluss des NEP-Substrates CRH nahe liegend. Ein Widerspruch zu den Ergebnissen der Spanagel-Gruppe besteht jedoch darin, dass bei deren Tieren das CRH wegen der Rezeptor-Defizienz nicht zur Wirkung kommt, während bei den NEP-Knockout-Tieren primär von einem erhöhten CRH-Spiegel (als Folge der Ausschaltung eines CRH-abbauenden Enzyms) auszugehen ist. Als mögliche Erklärungen dafür kommen in Frage:

↓71

Solche Überlegungen lassen sich auch zu anderen NEP-Substraten, die im Zusammenhang mit Stress stehen, anstellen, z. B. zur Substanz P. Auch hier ist der Abbau durch die NEP gut belegt und mit einem K m-Wert von 31,9 µM sehr effektiv [Matsas, 84c]. Der größte Teil der Publikationen zur Substanz P beschäftigt sich mit ihrer großen Bedeutung im Stress- und Entzündungsgeschehen. Inzwischen gibt es aber auch Untersuchungen zum Zusammenhang zwischen Substanz P und dem Verlangen nach Alkohol [Slawecki, 01]. In dieser Arbeit wurden u. a. erniedrigte Substanz P-Spiegel in Hirnregionen von Alkohol-präferierenden Ratten gemessen. In NEP-Knockout-Mäusen ist dagegen der Substanz P-Spiegel (z. B. im Colon) wie zu erwarten erhöht [Sturiale, 99]. Interessant ist in diesem Zusammenhang auch der Befund, dass Substanz P ihrerseits scheinbar auch die NEP regulieren kann: Die Stimulation von Zellen mit Substanz P führte zu einem Anstieg der NEP-Expression [Bae, 02]. Auch eine Hemmung der CRH-induzierten Stressantwort durch Substanz P wurde in Hypophysen-Zellen gefunden [Melzig, 98]. Weitere Kandidaten für einen Zusammenhang NEP-Substrat – Stressachse – erhöhter Alkohlkonsum sind u. a. Cholecystokinin (CCK) und Glucagon-Like Peptid 1 (GLP-1) [Moller, 02; Gulpinar, 04].

Die Erörterung eines für die Stress-Response unserer Versuche verantwortlichen Mediators – vermutlich eines Substrates der NEP – ist z. Z. spekulativ und kann nur durch weiterführende, ausgedehnte Untersuchungen der in Frage kommenden Peptide (u. a. zu Peptidkonzentrationen in ausgewählten Hirnregionen der Knockout- und Wildtyp-Mäuse nach dem Trinkversuch) beantwortet werden. Die Auffindung eines solchen peptidischen Mediators kann zur Erforschung der Stressabhängigkeit der Alkoholkrankheit beitragen. Der Alkoholkonsum wird, wie bereits erwähnt, in vielen Fällen wesentlich durch Stress beeinflusst, z. B. beim so genannten „Stresstrinker“ oder bei dem Rückfälligwerden eines abstinenten Alkoholkranken (auch noch Jahre nach einem erfolgreichen Entzug) beim Auftreten stark stressender Situationen. Das hier beschriebene Modell der NEP-Knockout-Maus könnte wegen seiner deutlichen Stressabhängigkeit ein geeignetes Versuchsobjekt zur Identifizierung der genannten Mediatoren darstellen.

III - 4.2. Wechselseitige Beziehungen zwischen NEP, Alkoholaufnahme und Stressgeschehen

Obwohl hier dargelegt wurde, dass eine direkte, stressunabhängige Beeinflussung des Alkoholkonsums durch die NEP eher unwahrscheinlich ist, sollen zwei Arbeiten erwähnt werden, die auf eine kausale Rolle der NEP hinweisen. Nachdem Soleilhac et al. berichteten, dass die lösliche NEP im Serum von Untertage-Kohlearbeitern vermutlich aufgrund der Staubeinwirkung erhöht ist [Soleilhac, 96b], konnten Frette et al. zeigen, dass die Aktivität der Serum-NEP mit dem Alkoholkonsum signifikant korreliert, nicht aber mit dem Nicotinkonsum [Frette, 98b]. Die errechneten Korrelationskoeffizienten waren allerdings nicht sehr hoch. Unklar ist auch, ob möglicherweise auch andere externe Faktoren wie Stress, Ernährung etc. zwischen den Personengruppen differierten.

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In unserem Versuchsansatz ist dagegen der basale Alkoholverbrauch unter stressarmen Bedingungen in den NEP-defizienten Tieren nicht verändert. Erst nach Applikation eines starken sozialen Stressreizes reagieren die NEP-defizienten Tiere mit einem über Wochen erhöhten Alkoholverbrauch. Die wesentlichen Faktoren, die zu diesem gegenüber den Ergebnissen von Siems et al. differenzierteren Verhalten führten, wurden unter „Ergebnisse“ bereits erwähnt: Erstens wurden diese Tiere in Gruppen von je fünfMännchen gehalten. Dadurch kam es innerhalb der Gruppen zu Rangkämpfen und der Ausprägung einer sozialen Rangordnung, welche nachgewiesener Maßen die freiwillige Aufnahme von psychotropen Substanzen beeinflusst [Morgan, 02]. Aus diesem Grund wurden in unseren neuen Versuchen die Tiere in Gruppen von nur zwei Männchen pro Käfig gehalten und – als zweite Änderung – durch eine teilweise mit Löchern versehene, durchsichtige Trennwand separiert.

Ein weiterer störender Faktor der älteren Experimente bestand in dem erhöhten Stress durch äußere Faktoren in dem Tierlabor. Die Anzahl der in diesem Laboratorium gehaltenen Tiere war beträchtlich größer als in dem hier beschriebenen Experiment. Dadurch war die Frequenz der Tierpflege (Füttern, Tränken, Umsetzen) wesentlich erhöht, außerdem wurden in dem Raum auch andere Tierarten gehalten, darunter Ratten und Hähne. Dass unterschiedliche Umgebungen (trotz standardisierter Grundbedingungen) einen empfindlichen Einfluss auf verschiedene Verhaltenstests und auf das Trinkverhalten darstellen können, wurde vor allem in den letzten Jahren häufiger diskutiert und auch eindrucksvoll in einer Arbeit von John Crabbe bestätigt [Crabbe, 99]. In unseren hier beschriebenen Versuchen wurde daher – als dritte Änderung – die Gesamttierzahl (nur Mäuse und Ratten) in dem Tierlabor gering gehalten und auf eine möglichst niedrige Begehungsfrequenz geachtet. Auch die Haltungsbedingungen innerhalb des Käfigs sind von Bedeutung; deshalb wurde zur Minimierung des basalen Stresses in den neuen Versuchen Zellstoff für den natürlichen Nestbautrieb hinzugefügt („enriched environment“).

Ein solches Versuchsschema mit basal möglichst stressarmen Bedingungen – von der Käfighaltung bis hin zu den räumlichen und tierpflegerischen Gegebenheiten – sollte für zukünftige weiterführende Experimente strikt eingehalten werden. Aus der erwähnten Publikation von Crabbe et al. geht auch hervor, dass schon geringfügige Veränderungen der Rahmenbedingungen, wie der Wechsel des Tierlabors, zu völlig unterschiedlichen Trinkergebnissen führen können. Dies gilt umso mehr für derartig stresssensitive Experimente.

↓73

Wie eingangs bereits erwähnt, muss bei der Bewertung des Einflusses der NEP auf den Alkoholkonsum auch noch der umgekehrte Weg diskutiert werden: die Wirkung des Alkoholkonsums auf die NEP. Ein solcher Einfluss wurde in weiteren Experimenten unserer Arbeitsgruppe beobachtet. In den Versuchen von B. Maul, A. Winkler und W.-E. Siems am FMP (bisher unveröffentlicht) wurden vier Gruppen von Wistarratten unterschiedlichen Trinkparadigmen unterworfen: Die erste Gruppe bekam nur Wasser und fungierte als Kontrollgruppe. Die zweite bekam zunächst für mehrere Wochen nur Wasser und gegen Ende der Versuchsreihe für zwei gesonderte Perioden nur 10%igen Alkohol („forcierte Trinker“), die dritte Gruppe bekam zunächst nur Wasser und in den zwei gesonderten Perioden Wasser und 10%igen Alkohol zur freien Auswahl („kontrollierte Trinker“). Die vierte Gruppe schließlich bekam zunächst für mehrere Wochen Wasser und Alkohol zur freien Auswahl, was in den zwei gesonderten Perioden durch alleiniges Angebot von Wasser unterbrochen wurde („abhängige Trinker“).

Folgende Beobachtungen hinsichtlich bestimmter Enzyme wurden gemacht: Die NEP-Aktivität war in 4 von 8 Hirnregionen der abhängigen Trinker (Cortex, Thalamus, Auditor. Cortex Tegmentum/Colliculi) gegenüber der Kontrollgruppe erhöht und zeigte darüber hinaus eine auffallende Tendenz zum Grad der Alkoholabhängigkeit. Bei den kontrollierten Trinkern und in geringerem Ausmaß bei den forcierten Trinkern wurden z. T. ebenfalls erhöhte NEP-Aktivitäten registriert. Dagegen zeigt sich lediglich bei den forcierten Trinkern eine Erhöhung der ACE-Aktivität. Für die APN war keine klare Beziehung zum Alkoholkonsum feststellbar. In NEP-Knockout-Mäusen wurde dagegen keine signifikante Veränderung von ACE oder APN beschrieben [Siems, 00c], d. h. dass zwei andere wichtige Enkephalin-abbauende Enzyme nicht gegenreguliert sind und daher nicht die Funktion der fehlenden NEP übernehmen. In diesem Zusammenhang muss jedoch darauf hingewiesen werden, dass bei NEP-defizienten Tieren enzymatische Gegenregulationen prinzipiell bekannt sind. So wurden z. B. bei NEP-Knockout-Mäusen erhöhte Abbauraten natriuretischer Peptide beschrieben [Walther, 04].

Unsere Beobachtung eines direkten Zusammenhanges zwischen NEP-Aktivität und Alkoholkonsum wird durch andere Publikationen gestützt [Panchenko, 84b; Beliaev, 83b], in denen bei Mäusen bzw. Ratten, die an Alkohol gewöhnt waren, die Serum- bzw. Hirn-Aktivitäten der NEP meist erhöht waren. Die Bestimmung von Ursache und Wirkung in der Beziehung zwischen Alkoholkonsum und NEP kann aus den vorliegenden Daten nicht erbracht werden. Für eine kausale Rolle des Alkoholkonsums sprechen die letztgenannten Untersuchungen. Aus den Daten von Soleilhac bzw. Frette et al. lässt sich dagegen eher eine ursächliche Rolle der NEP ableiten, da die Untertagearbeiter mit der höheren NEP-Aktivität signifikant mehr Alkohol tranken als vergleichbare Arbeiter im Tagebau [Frette, 98a; Soleilhac, 96c]. Die hier vorgelegten Untersuchungen an NEP-Knockout-Mäusen sprechen ebenfalls mehr für die ursächliche Rolle der NEP, bringen allerdings zusätzlich den Einfluss des Stresses ins Spiel. Der Zusammenhang zwischen NEP und Alkoholkonsum ist wahrscheinlich komplexer und ist vermutlich von gegenseitiger Beeinflussung gekennzeichnet.

III - 4.3. Einfluss von NEP-Inhibitoren auf den Alkoholkonsum

↓74

Aus pharmakologischer Sicht ist der Einfluss von NEP-Inhibitoren auf den Alkoholkonsum von besonderem Interesse, da sich einerseits mehrere internationale Pharmakonzerne (z. B, Pfizer, Schering, Solvay) mit der Entwicklung von NEP-Inhibitoren befassen und andererseits in der Literatur ein direkter Zusammenhang zwischen der NEP-Aktivität und der Alkoholaufnahme beschrieben wird (s. Einleitung). Um den Einfluss spezifischer NEP-Inhibitoren auf den Alkoholkonsum zu überprüfen wurden 8 Wildtyp-Mäuse mit dem Pfizer-Inhibitor Candoxatril behandelt, von dem zunächst angenommen wurde, dass er in der eingesetzten Konzentration die Blut-Hirn-Schranke überwindet. Die Auswertung mit Zweifaktorieller Varianzanalyse über einen Zeitraum von mehreren Wochen ergab einen signifikant erhöhten Alkoholkonsum in der Candoxatril-Gruppe verglichen mit den unbehandelten Tieren. Die Ergebnisse sind schwierig zu interpretieren, da nach Abschluss des Trinkversuches keine Überwindung der Blut-Hirnschranke nachgewiesen werden konnte. Die NEP-Aktivität in der Niere wurde dagegen eindeutig gehemmt. Eine Beeinflussung des Alkoholkonsums, vermittelt durch periphere, z. B. diuretische Effekte, ist jedoch wegen der gleich bleibenden Gesamttrinkmenge wenig wahrscheinlich. Über einen molekularen Mechanismus kann bei der derzeitigen Datenlage nur spekuliert werden: So könnte sich der durch die NEP-Hemmung veränderte Katabolismus von Peptiden in Niere, Darm und/oder anderen peripheren Organen auf das ZNS auswirken, falls es sich dabei um Neuropeptide handelt, die die Blut-Hirn-Schranke überwinden können.

Um sicher ausschließen zu können, dass sich der Alkoholverbrauch von Bluthochdruck-Patienten bei Behandlung mit diesem Wirkstoff erhöht oder dass sogar aktive oder abstinente Alkoholiker davon betroffen werden, müssen noch weitere, breiter angelegte Tierversuche mit dieser Substanz erfolgen.


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24.11.2006