IV  NEP und Übergewicht

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IV - 1.  Einleitung

Übergewicht ist mittlerweile ein allgegenwärtiges Problem in der industrialisierten Welt, und Fettleibigkeit wird von der WHO unter den zehn größten globalen Gesundheitsproblemen eingestuft. In den Medien wird Übergewicht nicht mehr nur als kosmetisches Problem betrachtet, sondern immer häufiger auf dessen gesundheitliche Risiken und Folgekrankheiten hingewiesen. Inzwischen sind auch einzelne Länder auf höchster Ebene in die Offensive gegangen, wie z. B. das US-amerikanische Gesundheitsministerium, das unter Tommy Thompson „der Fettsucht-Epidemie den Kampf angesagt“ hat [Schoeller, 04b]. Wenig später stellte auch die damalige deutsche Ministerin für Verbraucherschutz, Ernährung und Landwirtschaft, Renate Künast, ihre Initiative „Plattform Ernährung und Bewegung“ vor [Künast, 04]. Angesichts alarmierender Statistiken kommen diese Programme keinesfalls zu früh, müssen ihre Effektivität aber erst noch unter Beweis stellen.

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In den Vereinigten Staaten stieg die Prävalenz der Fettleibigkeit (oder „Fettsucht“) mit einem Body-Mass-Index (BMI) ≥30 kg/m² von 12,0% der erwachsenen Bevölkerung im Jahr 1991 über 17,9% im Jahr 1998 auf 19,8% im Jahr 2000 [Mokdad, 01] (zur Definition des BMI und der Grade der Adipositas siehe unten). Fast 64% der Population, das entspricht etwa 130 Mio. US-Amerikanern, waren nach Stand von 2003 übergewichtig oder fettleibig, die direkten und indirekten Folgekosten belaufen sich auf geschätzte 117 Mrd. $ jährlich [Schoeller, 04a]. In Deutschland wiesen 1998 31,1 bis 48,7% einen BMI zwischen 25,0 und 29,9 auf und waren somit mäßig übergewichtig, 18,3 bis 24,5% der Bundesbürger im Alter von 18 bis 79 Jahren hatten einen BMI ≥30 [Bergmann, 99]. An extremer Fettsucht mit einem BMI >40 kg/m² leiden z. Z. allein in Deutschland 800.000 Menschen, das entspricht etwa 1% der Bevölkerung [Herpertz, 03]. Damit weisen nur noch etwa ein Drittel der Deutschen ein gesundheitlich wünschenswertes Gewicht auf. Schätzungen der direkten und indirekten Krankheitskosten der Adipositas und der Folge- bzw. Begleiterkrankungen für 1995 ergeben je nach Modellvariante zwischen 7,75 und 13,5 Mrd. € (das sind 3,1 bis 5,5% der Gesamtkosten) [Schneider, 96]; nach anderen Schätzungen sind es sogar bis zu 18 Mrd. € pro Jahr [Herpertz, 03].

Adipöse Patienten haben eine signifikant erhöhte Mortalität [Allison, 99], ebenso Komorbiditäten wie Dyslipidämien, Bluthochdruck, Diabetes mellitus Typ 2, Atherosklerose, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und andere Gesundheitsstörungen wie Gallenblasenerkrankungen, Schlafapnoe, osteoarthritische bzw. orthopädische Beeinträchtigungen sowie verschiedene Krebsarten [Kral, 01; Solomon, 97].

Der BMI ist definiert als das Körpergewicht in Kilogramm geteilt durch das Quadrat der Körperhöhe in Metern. Ein gesunder Body-Mass-Index scheint bei Erwachsenen zwischen 18,5 (nach anderen Angaben 20) und 24,9 kg/m² zu liegen. Ein BMI von 18,5 bis 24,9 kg/m² wird als Normalgewicht bezeichnet. Übergewicht oder Adipositas Grad I wird bei einem Body-Mass-Index von 25 bis 29,9 kg/m², Fettsucht oder Adipositas Grad II von 30 bis 39,9 kg/m² und eine extreme Fettsucht (Adipositas Grad III) bei einem Body-Mass-Index von >40 kg/m² angenommen. Der BMI berücksichtigt allerdings nicht die Fettverteilung am Körper, die z. B. in die gluteofemorale (hüftbetonte) oder gynoide Form und die wesentlich risikoreichere abdominale (stammbetonte) oder androide Form unterteilt werden kann. Ebenso wenig kann mit dem BMI der Knochenbau oder der Anteil von Fett- bzw. Muskelmasse am Gesamtgewicht einberechnet werden. Er wird heute jedoch wegen seiner leicht handhabbaren Formel und der guten Relation zu Morbidität und Mortalität (trotz der oben genannten Einwendungen) übereinstimmend zur Einteilung und Klassifikation der Adipositas heran gezogen.

IV - 1.1.  Mögliche Ursachen für Übergewicht

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Heute ist erwiesen, dass die Ursachen für die Entwicklung eines übermäßigen Körpergewichtes sehr vielfältig sind. Sie können physiologischer, psychischer, genetischer und umweltbedingter Natur sein [Barsh, 00b]. Am einfachsten ausgedrückt kann Übergewicht nur entstehen, wenn die Energieaufnahme den Energieverbrauch übersteigt.

Unser heutiger Alltag ist durch einen unbegrenzten Zugang zu wohlschmeckender, relativ preiswerter, energiereicher Nahrung gekennzeichnet, ebenso wie durch einen Lebensstil, der uns nur eine geringe physische Aktivität abverlangt. Unter diesen Umständen tritt Übergewicht zwangsläufig immer häufiger auf, denn das Energiegleichgewicht ist deutlich in Richtung der Aufnahme verschoben. Außerdem hat der Körper im Laufe der Evolution exzellente physiologische Mechanismen zur Abwehr eines Gewichtsverlustes entwickelt, während er nur schwache Strategien gegen die Akkumulation von Energiespeichern besitzt, solange genügend Nahrung vorhanden ist [Hill, 03].

Deshalb wird die überschüssige Energie in Form von Triglyceriden im Fettgewebe gespeichert. Die gesteigerte Masse an Fettgewebe kann sich als gesteigerte Zellgröße, Zellzahl oder beides manifestieren (hypertrophe bzw. hyperplastische Adipositas), wobei bei einer erhöhten Anzahl der Fettzellen die Vergrößerung des Fettgewebes theoretisch unbegrenzt ist [Kordik, 99].

IV - 1.2. Molekulare Regulation von Appetit und Nahrungsaufnahme

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Der Appetit, das Hungergefühl und die Intention zur Nahrungsaufnahme allgemein werden durch eine komplexe Interaktion hervorgerufen, die zwischen Signalen aus verschiedenen Körperorganen und diversen Hirnregionen besteht. Diese Regelmechanismen können demnach in periphere Bereiche und solche des ZNS unterteilt werden.

Der Hypothalamus, der sich am Boden des Zwischenhirns (Diencephalon) befindet, spielt bei der Integration der Signale aus Peripherie und ZNS eine bedeutsame Rolle; deshalb kommt ihm auch bei der Kontrolle der Nahrungsaufnahme – oder zumindest bedeutsamer Elemente dieses Kontrollsystems – eine zentrale Rolle zu [Hirsch, 92]. Aber auch die Hypophyse und in der Peripherie Magen, Darm, Nebennieren und Pankreas haben gewichtige Kontrollfunktionen auf das Körpergewicht. Erst in den letzten Jahren dagegen ist bekannt geworden, dass auch das Fettgewebe einen einflussreichen Regelkreis darstellt und sogar als eigenes endokrines Organ aufgefasst werden kann [Ahima, 00].

Die sehr komplexen Steuerkreise in den einzelnen Organen sowie ihre Vernetzung untereinander werden bis heute nur ansatzweise verstanden. Eine ständig wachsende Literatur unterstützt die Hypothese, dass die Nahrungsaufnahme innerhalb eines vielschichtigen und sehr empfindlichen Systems der Energiehomöostase gesteuert wird. Die Energiehomöostase wird durch ein höchst effektives, stark verknüpftes neurohumorales Netzwerk bewirkt, das den Einfluss kurzfristiger Fluktuationen der Energiebalance auf das Körpergewicht minimiert. Dies erklärt auch, warum bei den meisten Menschen das Körpergewicht über Jahre und sogar über ein ganzes Leben relativ stabil bleibt.

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Eine Beispielrechung soll das verdeutlichen: Eine Person, die über die letzten 5 Jahre 10 kg zusätzlich im Fettgewebe abgelagert hat, hat damit ca. 800.000 kcal (1 kcal ≅ 4,18 kJ) akkumuliert. Diese gespeicherte Energie ist nur ein Bruchteil der enormen Menge von ca. 4 bis 5 Mio. kcal, die in den 5 Jahren durch den Körper geflossen sind. Damit hat diese Person täglich nur 40 überschüssige kcal zu sich genommen, das entspricht nur etwa 1,5% der insgesamt pro Tag aufgenommenen Energie. Folglich reicht ein Bruchteil dessen, was man isst – akkumuliert über einen größeren Zeitraum – aus, um das Körpergewicht deutlich zu verändern. Dass dies trotz der täglich sich unterscheidenden Portionen in der Regel nicht so ist, spricht also für das regulierende System der Nahrungsaufnahme und Energiehomöostase, das über verschiedene periphere Organe und diverse Hirnareale verteilt ist.

Ein Großteil der daran beteiligten Transmitter ist peptidischer Natur. Die wichtigsten peptidischen und nichtpeptidischen sind in Tab. 6 dargestellt. Sie sind in komplizierte Regelkreise eingebunden, die sich gegenseitig beeinflussen und sowohl periphere als auch zentralnervöse Komponenten beinhalten. Diese Regelmechanismen sind sehr komplex und oft noch nicht vollständig verstanden. Am Beispiel des Leptins sollen hier die komplizierten Wechselwirkungen derartiger Hormone kurz veranschaulicht werden.

Das so genannte „Sättigungshormon“ Leptin wird nach einer aufgenommenen Mahlzeit im weißen Fettgewebe ausgeschüttet und gelangt über die Blutbahn und einen noch nicht genau bekannten Transportmechanismus (vermutlich über die Bindung an Leptin-Rezeptoren) in das ZNS. Dort bindet es unter anderem im Nucleus arcuatus (NArc) des Hypothalamus an die Leptin-Rezeptoren von so genannten NPY/AGRP-Neuronen und von POMC/CART-Neuronen (Erklärung der Peptid-Abkürzungen siehe Tab. 6). Diese Neurone 1. Ordnung projizieren auf weitere Regionen des Hypothalamus, vor allem auf den paraventrikulären Nucleus (PVN), den lateralen Hypothalamus (LHA) und die perifornikale Area (PFA). Nach Ausschüttung der Neuropeptide aus diesen Neuronen werden Neurone 2. Ordnung aktiviert, die ihrerseits im PFA und LHA über orexigene (die Nahrungsaufnahme stimulierende) Peptide wie die Orexine und MCH die Energieaufnahme steigern, bzw. im PVN über anorexigene (die Nahrungsaufnahme inhibierende) Peptide wie TRH, CRH und Oxytocin die Energieaufnahme hemmen.

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Tab. 6: Endogene Mediatoren (Neuropeptide, Neurotransmitter, Hormone) mit Effekt auf das Körpergewicht.

Nahrungs- bzw. Energieaufnahme oder Metabolismusrate

Nahrungs- bzw. Energieaufnahme oder Metabolismusrate

Peptidische Mediatoren

NPY (Neuropeptid Y)

MCH (Melanin-konzentr. Hormon)

Ghrelin

Galanin

GALP (Galanin-Like Peptid)

Orexin A und B

Opioide (β-Endorphin, Dynorphin)

AGRP (Agouti-Related Peptid)

NPW/NPB (Neuropeptide W/B)

Beacon

GHRF (Growth-Hormon-Releasing Faktor)

26RFa

Leptin

α-MSH (Melanozyten-stimulierendes Hormon, = Melanocortin)

CRH (CRF; Corticotropin-Releasing Faktor/Hormon)

PYY (Peptid YY 3-36)

Glucagon

GLP-1 (Glucagon-Like Peptid 1)

GRP-10 (Gastrin-Releasing Peptid 10)

TRH (Thyrotropin-Releasing Hormon)

IL-1β (Interleukin 1β)

IL-6 (Interleukin 6)

CCK (Cholecystokinin-8)

CART (Cocain- und Amphetamin-reguliertes Transkript)

Urocortin

Neurotensin

Enterostatin

Amylin

Oxytocin

Bombesin

Somatostatin

Nichtpeptidische Mediatoren

Noradrenalin (über α2-Rezeptor)

GABA (γ-Amino-Buttersäure)

Noradrenalin (über α1- und β1-Rezeptor)

Adrenalin

Serotonin

Dopamin

Histamin

Unterstrichen sind Peptide, von denen der Abbau durch die NEP belegt ist. Gestrichelt unterstrichen sind Peptide, bei denen – abgeleitet aus der Struktur der Verbindungen – ein Abbau durch die NEP von uns vermutet und untersucht wurde (siehe Ergebnisse).

Tab. 6 zeigt die oben genannten Transmitter und weitere wichtige Mediatoren der Nahrungsaufnahme bzw. Energiehomöostase und –utilisation, geordnet nach einem positiven bzw. negativen Effekt auf das Körpergewicht. Diese Einteilung ist z. T. willkürlich, weil einige Mediatoren entgegengesetzte Wirkungen ausüben können, z. B. Noradrenalin (je nach Rezeptorsubtyp). Die Tabelle erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit. Sie beinhaltet nicht nur orexigene bzw. anorexigene Mediatoren, sondern auch solche,

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und damit allgemein die Stoffwechselrate (Metabolismusrate) positiv bzw. negativ beeinflussen.

IV - 1.3. Bedeutung der NEP für peptidische Mediatoren

Begünstigt durch Fortschritte in der Molekularbiologie und Gentechnik wurden seit Anfang der Neunziger Jahre in verstärktem Maße spezifische Tier- (meist Maus-) Modelle zur Untersuchung der molekularen Zusammenhänge von Nahrungsaufnahme und Energiehomöostase und der damit zusammenhängenden Entwicklung von Übergewichtigkeit herangezogen. Dabei wurden verschiedene Ansätze verfolgt:

Einerseits wurden die Gene bestimmter Signalmoleküle (Peptide oder andere kleine Moleküle mit Hormon- oder Transmitter-Charakter) bzw. deren Rezeptoren in Mausstämmen durch gentechnische Methoden ausgeschaltet oder überexprimiert, bei denen aufgrund vorheriger Versuche ein Einfluss auf das Körpergewicht vermutet wurde. Solche Knockout-Stämme bzw. transgenen Linien wurden u. a. für das Neuropeptid Y (NPY), Proopiomelanocortin (POMC), den PPARγ-Rezeptor (peroxisome proliferator-activated receptor ), das Melanin-konzentrierende Hormon (melanin-concentrating hormone, MCH) oder Interleukin 6 (IL-6) entwickelt [Barsh, 00a; Leibowitz, 04]. Mit diesen Modellen konnten die empirischen Befunde bestätigt und die Zusammenhänge zur molekularen Steuerung des Körpergewichts eingehender charakterisiert werden.

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Ein anderer Ansatz geht davon aus, bei bereits etablierten und phänotypisch gut charakterisierten Zuchtstämmen mithilfe molekularbiologischer Methoden Mutationen in den Genen für Proteine festzustellen, die vorher nicht bekannt waren oder deren Funktion im Zusammenhang mit der Gewichtsregulation unbekannt war. Dabei wurden so bedeutende Entdeckungen gemacht wie die, dass der seit langem bekannte ob-Mausstamm eine Mutation im Gen für das Protein Leptin aufweist und dadurch eine extreme Fettleibigkeit entwickelt [Zhang, 94]. Weitere Adipositas-Tiermodelle, für die ebenfalls die molekulare Ursache aufgeklärt wurde sind die Yellow-(A y )-Maus (Agoutiprotein-Mutation) [Duhl, 94], die Diabetes-(db)-Maus (Leptinrezeptor-Mutationen) [Chen, 96] bzw. das homologe Modell der Fatty-(fa)-Zucker-Ratte [Phillips, 96], die Tubby-(tub)-Maus (Mutation im Tub-Protein) [Kleyn, 96] sowie die Obese-(fat)-Maus [Naggert, 95a]. Meist handelt es sich dabei um Mutationen in den Genen für Rezeptoren bzw. für Proteine (oder deren Präkursoren), welche Hormon- oder Neurotransmitter-Charakter haben.

Dass auch peptidolytische oder proteolytische Enzyme in diesem Zusammenhang eine Rolle spielen könnten, ist zwar durch biochemische Kenntnisse und daraus folgenden theoretische Überlegungen zum Abbau orexigener/anorexigener Peptide durch Enzyme weithin akzeptiert. Bisher gab es hierfür jedoch kaum praktische Bestätigungen aus Tiermodellen. Zwar wurden einerseits für einige direkt am Fettstoffwechsel beteiligte Enzyme wie die HMG-CoA-Reduktase, die Lipoproteinlipase (LPL) oder die Hormon-sensitive Lipase (HPL) ausführlich die Aktivitäten oder mRNA-Spiegel in übergewichtigen bzw. untergewichtigen Tieren untersucht und/oder anhand von Knockout-Tiermodellen bestätigt [Steinmetz, 01; Olivecrona, 85b; Haemmerle, 02a; Steinmetz, 01; Olivecrona, 85a; Haemmerle, 02b]. Andererseits findet sich – mit Ausnahme der Carboxypeptidase E (CPE) und der Prohormonconvertasen (PC 1 bis 3) (siehe unten) – in diesem Zusammenhang kaum Literatur mit Knockout-Modellen proteolytischer Enzyme. Auch sind nur wenige Versuche zur Beeinflussung des Fettgewichtes durch Inhibitoren proteolytischer Enzyme bekannt. Eine prominente Ausnahme bildet das ACE (siehe unten), bei dem jedoch das Studiendesign im Allgemeinen auf eine Aussage zu kardiovaskulären Parametern ausgerichtet war. Evtl. beobachtete Reduktionen des Körpergewichts sind nie Gegenstand gezielter Untersuchungen gewesen und solche Resultate wurden in der Regel als sekundäre Erscheinungen diskutiert. Zum Einfluss weiterer proteolytischer Enzyme auf das Körpergewicht bietet die Literatur dagegen kaum Daten.

Den klassischen Ansatzpunkt zur Therapie der Adipositas stellen in der Regel spezifische Agonisten oder Antagonisten der oben beschriebenen Mediatoren der Energiehomöostase dar. Peptidasen bieten dagegen einen neuartigen Ansatzpunkt für die Therapie von krankhaftem Übergewicht. Die Beeinflussung (in der Regel Hemmung) dieser peptidolytischen Enzyme moduliert fast immer die Konzentration mehrerer Peptidhormone, und das schließt die Auswirkungen auf mehrere Ligand-/Rezeptor-Systeme mit Einfluss auf die Fettleibigkeit ein. Ein pharmakologischer Eingriff an solch einem höher angesiedelten Target kann auf Grund der geringeren Spezifität der Einflussnahme ein Nachteil sein. Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass die Therapie einer typisch „multigenetischen Erkrankung“ wie die der Adipositas die Beeinflussung mehrerer Komponenten geradezu erfordert. Im Laufe der Evolution hat der Körper exzellente Mechanismen gefunden, bei Störung eines Regelkreises dessen Funktion durch mehrere andere Regelkreise zu kompensieren. Bei Beeinflussung eines höheren Steuermechanismus, wie der für den Mediator-Metabolismus verantwortlichen Enzyme, sind dagegen zugleich mehrere Regelkreise betroffen, die sich nun gegenseitig weniger kompensieren können. Es kann dadurch zu einer zwar weniger prononcierten, durch die schlechtere Kompensation aber umso wirksameren Beeinflussung des Körpergewichts kommen. Der Gesamteffekt einer solchen Enzymbeeinflussung sowie die Chancen und Risiken einer pharmakologischen Inhibierung müssen anhand von pharmakologischen Studien und von Knockout-Tiermodellen untersucht werden.

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Wie oben erwähnt, ist der Einfluss des ACE auf das Körpergewicht bzw. das Körperfett bereits bekannt [Engeli, 03b], und der Einfluss von ACE-Hemmern auf das Körpergewicht ist durch deren langjährige Anwendung relativ gut belegt. Durch die Wirkung von ACE-Inhibitoren wurde wiederholt eine Reduktion des Körpergewichts beobachtet [Sharma, 04]. Die molekularen Ursachen einer Gewichtsabnahme unter ACE-Hemmung sind bisher unklar. Es ist nicht auszuschließen, dass – auch angesichts der relativ kurzen Beobachtungszeiträume – diuretische Effekte und kardiovaskuläre Wirkungen zur Gewichtsabnahme geführt haben. Einige Arbeiten konnten allerdings eine Reduktion des Körpergewichtes durch Beeinflussung des Fettstoffwechsels belegen [Ortlepp, 02]. Untersuchungen an gentechnisch veränderten Mäusen, die eine, zwei oder drei Kopien des ACE-Gens trugen, weisen dagegen in eine andere Richtung: Mäuse mit drei Kopien wiesen bei fettreicher Diät ein geringeres Körpergewicht und weniger periepididymales Fettgewebe auf als Mäuse mit einer oder zwei Kopien [Heimann, 04].

Bei Anwendung von NEP-Inhibitoren wurden Veränderungen des Körpergewicht nur selten gezielt verfolgt, und wenn, dann meist bei relativ kurzfristiger Anwendung. Lediglich zwei Arbeiten beschreiben die stimulierende Wirkung der relativ selektiven NEP-Inhibitoren Thiorphan und Acetorphan auf die Futteraufnahme [Riviere, 87; Bado, 89] nach einmaliger oraler oder peripherer Applikation. Nach intracerebroventrikulärer Verabreichung von Thiorphan kam es dagegen zu einer Reduktion der Futteraufnahme.

Die Wirkungen des spezifischen NEP-Inhibitors Candoxatril bzw. seines aktiven Metaboliten Candoxatrilat wurden durch die Fa. Pfizer über mehrere Jahre intensiv untersucht. Die meisten dieser Experimente wurden nur über wenige Wochen geführt oder das Körpergewicht wurde nicht untersucht. Lediglich eine Arbeit von Arnal et al. gibt hinreichende Informationen: Bei oraler Gabe von täglich 50 mg Candoxatril/kg Körpergewicht über 4 Monate wurde keine Zunahme des Körpergewichts festgestellt. Interessanterweise konnte der gleichfalls getestete duale NEP-/ACE-Inhibitor Omapatrilat die Einlagerung von Fettpolstern bei Apolipoprotein E-defizienten Mäusen wirkungsvoll vermindern, wogegen sich Candoxatril in diesem Punkt nicht von den Kontrollen unterschied [Arnal, 01b].

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Zwei der wenigen publizierten Knockout-Tiermodelle, in denen der direkte Zusammenhang zwischen Peptidasen und erhöhtem Körpergewicht oder Körperfettanteil untersucht wurde, sind Mäuse, die entweder für verschiedene Prohormonconvertasen oder die CPE eine Defizienz aufweisen. Bei den Prohormonconvertasen wurde ein Zusammenhang zum Körpergewicht schon länger vermutet, da diese Enzyme viele Prohormone wie GHRH, Proopiomelanocortin (POMC), Proinsulin oder Proglucagon zu einer Reihe stoffwechselaktiver Hormone umsetzen. Knockout-Tiermodelle dieser Convertasen sind seit einiger Zeit verfügbar – neben deutlichen Veränderungen in Körpergewicht und Fettstoffwechsel weisen diese Tiere jedoch weitere schwerwiegende Schädigungen auf. Diese schränken den Nutzen des Tiermodells für die Erforschung der Regulierung des Körpergewichtes durch die Convertasen ein [Seidah, 99; Zhu, 02]. Bei der CPE war dieser Zusammenhang zum Körpergewicht weniger vorhersehbar. Seit längerer Zeit war allerdings das Modell der fat-Maus bekannt, welches durch Adipositas und Hyperglycämie gekennzeichnet ist. 1995 konnte die molekulare Ursache dafür in einer Mutation im CPE-Gen aufgeklärt werden, die die Aktivität des Enzyms nahezu vollständig unterdrückt [Naggert, 95b]. Für die Futteraufnahme und den Energiehaushalt wichtige Peptide wie z. B. Leu-Enkephalin liegen im Gehirn der fat-Mäuse stark erhöht vor [Fricker, 96]. Interessanterweise ist die Aktivität der Convertasen PC 1 und 2 in den fat-Mäusen ebenfalls reduziert [Berman, 01]

IV - 1.4. Aufgabenstellung

In diesem Zusammenhang war es eine interessante Bestätigung der oben beschrieben Theorie, als in unserer Arbeitsgruppe bei NEP-Knockout-Mäusen ein erhöhtes Körpergewicht und vermehrt abdominale Fettansammlungen beobachtet wurden. Die folgenden Versuche wurden durchgeführt, um zunächst das erhöhte Körpergewicht quantifizieren zu können, weiterhin wichtige metabolische und biochemische Parameter zu charakterisieren und schließlich erste Erklärungsansätze der molekularen Mechanismen dieser Ergebnisse zu liefern.

IV - 2. Methoden

IV - 2.1.  Allgemeine Bemerkung

Die physiologischen, metabolischen und biochemischen Untersuchungen wurden an Gruppen von NEP-Knockout-Mäusen und deren wildtypischen Kontrollen (C57BL/6) bzw. an Material, das von diesen entnommenem wurde, durchgeführt. Zunächst werden hier die einzelnen Versuchstiergruppen und Untersuchungen vorgestellt. Im Anschluss sind jedoch zur Verbesserung der Übersichtlichkeit die Methoden und Ergebnisse thematisch angeordnet.

IV - 2.2. Beschreibung der Tiergruppen

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Der größte Teil der Untersuchungen wurde an der Forschungseinrichtung Experimentelle Medizin in Berlin-Steglitz (FEM) durchgeführt. Dort wurden an einer Tiergruppe (im Folgenden „Gruppe 1“ genannt) erste umfangreiche Daten zum Körpergewicht und zum Einfluss unterschiedlicher Futtersorten (retrospektiv) gesammelt. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden die folgenden Experimente geplant. Diese Daten wurden an einer neuen Tiergruppe („Gruppe 2“) bestätigt. Deren Untergruppen wurden auf beide Genotypen, Männchen und Weibchen sowie pelletiertes und extrudiertes Futter (im nächsten Abschnitt beschrieben) aufgeteilt. Die Mäuse wurden zu zweit in Makrolonkäfigen Typ II (26 x 21 x 14 cm) unter Zugabe eines Papiertuchs gehalten. Im Alter von 6 und 12 Monaten erfolgte in regelmäßigen Abständen die Bestimmung des Futterverbrauchs. Nach Beendigung des Versuches (ungefähr in ihrem 15.-16. Lebensmonat) wurden die Tiere getötet, Glucose- und Ketonwerte im Blut gemessen, Organe entnommen (und deren Gewicht bestimmt) und Serum gewonnen sowie der Hypothalamus für spätere Enzymanalytik präpariert. An einer weiteren Tiergruppe am FEM wurden die Tiere auf ihre orale Glucosetoleranz getestet („Gruppe 3“).

Am Max-Rubner-Laboratorium des Deutschen Institutes für Ernährungsforschung in Bergholz-Rehbrücke (DIfE) erfolgte die Bestimmung der Körperzusammensetzung von weiblichen Knockout- und Wildtypmäusen („Gruppe 4“) über einen Zeitraum von 8 Monaten (Kooperation mit R. Kluge, Abteilung Pharmakologie, H. G. Joost). Diese Tiere erhielten entweder Standardfutter (vergleichbar mit dem nachfolgend beschrieben pelletierten Futter) oder fett- und energiereicheres Futter. Nach Beendigung dieses Teilversuches wurde der Energiestoffwechsel der Tiere (Respiratorischer Quotient und abgegebene Wärmemenge) kaloriemetrisch bestimmt. Zu Versuchsende wurden die Tiere getötet und Organe entnommen sowie Serum gewonnen und derBody-Mass-Index ermittelt.

Am Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere in Dummerstorf (FBN) wurden Organe von zwei dort gezüchteten Mausstämmen („Gruppe 5“, Beschreibung siehe Ergebnisse) entnommen und deren NEP-Aktivität bestimmt.

IV - 2.3. Versuchstiere und deren Haltung

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Zucht und allgemeine Haltungsbedingungen waren analog zu den Experimenten zum Alkoholkonsum (s. Kap. 3.2.1); Wasser und Futter erhielten die Tiere ad libitum. Die Mäuse wurden in Makrolonkäfigen Typ II bzw. Typ III (jedoch ohne Trennwand) in unterschiedlicher Anzahl pro Käfig gehalten (in der Regel 2 – 5 Tiere). Ausschließlich in Typ II-Käfigen wurden die Gruppen 2, 3 und 6 gehalten, die Gruppe 4 ausschließlich in Typ III-Käfigen. Je nach Anzahl der Tiere pro Käfig wurden die Gruppen 1 und 5 in Typ II- oder Typ III-Käfigen gehalten. Der Einstreu wurden Zellstofftücher zugesetzt. Einmal pro Woche wurden die Tiere umgesetzt und in regelmäßigen Abständen gewogen.

IV - 2.4. Futtersorten

Die Untersuchungen der Mäuse wurden in den verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Futtersorten durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse auch unter unterschiedlichen Haltungsbedingungen zu untersuchen. Im Folgenden sind die Tiergruppen den einzelnen Futtersorten zugeordnet (Mehrfachnennung bei Vergleich zweier Futtersorten innerhalb einer Tiergruppe):

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Die Futtersorten „ssniff M-Z, 10mm, autoklavierbar“ und „ssniff R/M-H, 10mm, autoklavierbar“ sind weitgehend miteinander vergleichbar (ersteres hat als Zuchtfutter einen etwas höheren Anteil an Rohprotein, Rohfett und einigen Aminosäuren sowie einen etwas erhöhten Brennwert). Besonders die Herstellung durch Pelletierung sowie die Autoklavierung vor Verfütterung führen zu einem ähnlichen Erscheinungsbild. Die „Altromin Standard-Diät Ratten – Mäuse 1324“ hat ebenfalls Ähnlichkeiten mit „ssniff R/M-H, 10mm, autoklavierbar“. Da das Altromin-Futter nicht autoklaviert wurde, ergibt sich ein etwas anderes Erscheinungsbild.

IV - 2.5. Bestimmung des Anteils von Körperfett, Muskelmasse und Extrazellularflüssigkeit am Gesamtkörpergewicht

Diese Untersuchungen wurden an den Mäusen der Gruppe 4 mittels Minispec MQ10 NMR Analyzer (Bruker, Billerica, Massachusetts/USA; www.minispec.com) sowie der Software von Echo Medical Systems (Houston, Texas/USA) vorgenommen. Dieses Gerät nutzt die Tatsache der verkürzten transversalen und longitudinalen Relaxationszeiten des Wasserstoffs in gebundenem Wasser. Die Relaxationszeiten unterscheiden sich zwischen den verschiedenen Geweben. Als Basis dient der Wasserstoff aus in Knochen gebundenem Wasser; Fett und andere weiche Gewebe haben eine doppelt so lange Relaxationszeit, Protein (Muskulatur) eine wesentlich kürzere. Aus den Relationen der ermittelten Zeiten werden die Gewebsmengen berechnet. Die Summe der aus den NMR-Werten berechneten Massen von Körperfett, Muskelmasse und Extrazellularflüssigkeit kann bei hohen Körperfettgehalten (>60%) vom direkt gemessenen Körpergewicht um 2–3% abweichen. Da der prozentuale Anteil der gemessenen Gewebsmengen auf das per Wägung bestimmte Gesamtkörpergewicht bezogen wurde, kann die Summe der prozentualen Gewebsmengen über 100% betragen.

IV - 2.6. Organgewichte, Blutparameter und Enzymaktivitäten

Von den Tieren der Gruppe 2 wurde zu Beginn des Versuches aus der Schwanzvene Vollblut für die Bestimmung der Glucose bzw. der freien Ketonkörper entnommen. Diese wurden mit einem Accu-Chek Comfort Blutglucosemessgerät (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim/Deutschland) bzw. einem Medisense Precision Xtra Messgerät (Abbott GmbH & Co. KG, Wiesbaden/Deutschland) analysiert. Bei Versuchsende wurden die Tiere nach CO2-Anästhesie durch Dekapitation getötet und aus dem anfallenden Blut wie oben beschrieben Glucose und Ketone bestimmt. Aus dem restlichen Blut wurde Serum gewonnen, bei –80°C gelagert und später mithilfe eines Cholestech LDX Lipidanalysators und der dazu gehörigen Testkassetten „Lipid-Profil + Glucose“ (Incomat Medizinische Geräte GmbH, Glashütten/Deutschland) Triglyceride, Gesamtcholesterol, High-density-Lipoproteine (HDL) und Very-low-density-Lipoproteine (VLDL) gemessen. Eine größere Anzahl der Gesamtcholesterol-Werte lag unterhalb des Messbereiches von min. 100 mg/dl; an dieser Stelle wurden Werte von 100 mg/dl eingesetzt. Ebenso lag eine größere Anzahl der HDL-Werte oberhalb des Messbereiches von max. 100 mg/dl; an dieser Stelle wurden ebenfalls Werte von 100 mg/dl eingesetzt. Da sich die Werte der Low-density-Lipoproteine (LDL) bei dem Cholestech-Gerät aus den Werten von HDL und Gesamtcholesterol berechnen, war eine sichere Berechnung aus den vorhandenen Werten nicht möglich.

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Zusätzlich wurden den Tieren Herz, linke Niere, Milz, abdominales Fettgewebe sowie der Hypothalamus entnommen und deren Gewicht bestimmt. NEP und ACE im Hypothalamus wurden wie in Kap. 3.2.3 beschrieben untersucht. Die Bestimmung des Leptinspiegels wird gesondert beschrieben.

Nach den oben beschriebenen Methoden wurden die Tiergruppen 3 und 4 ebenfalls auf ihren Blutglucosespiegel untersucht (Gruppe 3 im Rahmen des unten beschriebenen Glucosetoleranztests).

IV - 2.7.  Leptin-Spiegel

Die Serum-Leptinspiegel der am DIfE mit High-Fat- bzw. Low-Fat-Diät gefütterten Tiere (Gruppe 4) wurden mithilfe der ELISA-Technik (Quantikine Maus Leptin Immunoassay Kit MOB00 von R&D Systems Inc., Minneapolis/USA) analysiert. Die Proben wurden 1:10 verdünnt; Proben deren Werte über dem Messbereich lagen, wurden 1:50 verdünnt und anschließend incl. aller Kontrollen und Standards erneut gemessen.

IV - 2.8. Oraler Glucosetoleranz-Test (OGT)

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An zwei verschiedenen Tagen wurden 8 weibliche und 9 männliche Wildtypen bzw. 10 weibliche und 9 männliche Knockouttiere getestet (Gruppe 3). Die Tiere hatten 8 h vor dem Test keinen Zugang zum Futter. Zunächst wurden die basalen Blutglucose-Werte nach Punktion der Schwanzvene bestimmt. 30 min danach wurde den Tieren Glucose (1 mg/g Körpergewicht, gelöst in Wasser) oral appliziert und die Blutglucose-Werte 10 min, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 5 h und 6 h danach gemessen. Da an beiden Messtagen vergleichbare Kurvenverläufe resultierten, wurden die Werte der korrespondierenden Tiergruppen gemittelt. Die Kurven wurden durch Zweifaktorielle Varianzanalyse verglichen. Die Werte zu den jeweiligen Zeitpunkten wurden mittels ungepaarten t-Tests verglichen.

IV - 2.9. Futterverbrauch

Zu zwei Zeitpunkten während des Versuchs mit der Gruppe 2 am FEM (die Tiere waren durchschnittlich 6 bzw. 12 Monate alt) wurde das Futter auf den Raufen ein- und ausgewogen und die pro Tag konsumierten Mengen durch das Gesamtgewicht der im Käfig befindlichen Tiere geteilt. Daraus wurde ein mittlerer Futterverbrauch in g / kg Körpergewicht / d berechnet.

IV - 2.10. Energiehaushalt

Parameter des Energiestoffwechsels wurden an den Mäusen der Gruppe 4 mithilfe der indirekten Kalorimetrie ermittelt [Aust, 01]. Dabei geht man davon aus, dass zur Bildung von Kohlenhydraten, Fetten und Eiweißen spezifische Sauerstoffmengen benötigt werden. Aus dem Volumen von verbrauchtem Sauerstoff (V O2) und gebildetem Kohlendioxid (V CO2) kann über den Respiratorischen Quotienten (RQ, Respiratorische Austauschrate; bestimmt als Quotient aus V CO2 [ml/kg Körpergewicht/h] und V O2 [ml/kg Körpergewicht/h]) auf den Substanzumsatz geschlossen werden. Der RQ ist für Kohlenhydrate = 1, für Fette = 0,707 und für Proteine = 0,83 [Menke, 80]. Ein RQ > 1 kann dann auftreten, wenn der Kohlenhydratabbau von einer ausgeprägten Fettsynthese begleitet wird. Weiterhin wird bei der Energieumwandlung nach dem 2. Hauptsatz der Thermodynamik ein großer Teil der Energie in Wärme umgewandelt (Angaben in kJ oder kcal), deren Abgabe über einen definierten Zeitraum (in kcal/h) verfolgt wird.

IV - 2.11. Peptidabbau durch die NEP

↓89

Die Abbaustudien mit Peptiden wurden in Analogie zu den Aβ-Peptiden (Kap. 2.2.2) durchgeführt. Für orientierende Versuche wurde zunächst rhNEP verwendet, für weiter gehende Versuche mit durch rhNEP abbaubaren Peptiden wurden zusätzlich sowohl aus Seminalplasma aufgereinigte NEP als auch Hirnmembran-Präparationen von NEP (–/–)- und NEP (+/+)-Mäusen verwendet. Die Peptide wurden entweder von Bachem Distribution Services GmbH (Weil am Rhein/Deutschland) oder Phoenixpeptide (Phoenix Europe GmbH, Karlsruhe/Deutschland) bezogen. Die Methoden zur Mikrodialyse sind ausführlich bei Richter et al. beschrieben [Richter, 00a].

IV - 2.12. Statistik allgemein

Die statistische Auswertung wurde analog zu der Beschreibung in Kap. 3.2.6 vorgenommen. Der jeweils verwendete Test und die statistischen Parameter sind in den Ergebnissen aufgeführt.

IV - 3. Ergebnisse

IV - 3.1.  Beschreibung des Phänotyps

Im Zusammenhang mit anderen Versuchen an adulten NEP-defizienten Mäusen fiel bei diesen Tieren ein im Vergleich zu wildtypischen Kontrollen häufiges Auftreten von schweren fettleibigen Tieren auf. Abb. 15 zeigt ein typisches Bild zweier gleich alter weiblicher Wildtyp- (1A links) bzw. NEP-Knockout-Tiere (1A rechts sowie 1B). Im Bauchraum sind bei diesen übergewichtigen Tieren große Fettansammlungen zu beobachten (Abb. 15C).

↓90

Abb. 15: A: Repräsentativer Phänotyp zweier Mäuse auf C57Bl/6-Hintergrund im Alter von 15 Monaten.

Links wildtypische Maus mit 33,8 g, rechts NEP-Knockout-Maus mit 55,0 g. B und C: NEP-Knockout-Maus mit 55,0 g aus Abb. 15A auf Waage, geöffneter Bauchraum mit großen Fettansammlungen.

Um zu überprüfen, ob es sich hierbei um Einzelerscheinungen oder einen allgemeinen Phänotyp handelt, wurden über einen langen Zeitraum die Körpergewichte aller verfügbaren NEP-Knockout-Tiere und entsprechender wildtypischer Kontrollmäuse gemessen (Gruppe 1). Die Knockouttiere wiesen, verglichen mit den Kontrollen, ungefähr ab dem 2. Lebensdrittel ein höheres mittleres Körpergewicht auf (Tab. 7).

Tab. 7: Mittelwerte des Körpergewichts von NEP(+/+)- und (–/–)-Tieren (Gruppe 1).

Mittelwert ± SEM
(
+/+)

N

Mittelwert ± SEM
(–
/–)

N

Signifikanz

Männchen
5.-9. Monat

34,32 ±0,24 g

187

33,45 ±0,17 g

743

✭✭✭

Weibchen
4.-8. Monat

26,17 ±0,16 g

264

27,24 ±0,18 g

445

✭✭✭

Männchen
10. Monat bis Tod

36,31 ±0,24 g

330

39,65 ±0,23 g

999

✭✭✭

Weibchen
9. Monat bis Tod

29,72 ±0,29 g

329

37,13 ±0,32 g

726

✭✭✭

N = Zahl der einzelnen Messwerte; ✭✭✭: P<0,0001.

↓91

Zwar unterscheiden sich auch die Gewichte der jungen Tiergruppen statistisch signifikant, dies liegt aber an der sehr großen Zahl ausgewerteter Gewichtsdaten. Die Gewichtsdifferenzen der jüngeren Tiergruppen (Männchen: 0,87 g, Weibchen: 1,07 g) fallen wesentlich geringer aus als bei den älteren Tiergruppen (Männchen: 3,34 g, Weibchen: 7,41 g) und sind wahrscheinlich physiologisch nicht relevant.

Wenn nicht die Mittelwerte, sondern die einzelnen Messwerte in einer Graphik aufgetragen werden, wird auch ersichtlich, warum sich trotz des beträchtlichen Übergewichtes vieler Knockout-Mäuse die Mittelwerte erst relativ spät auseinander entwickeln. Abb. 16 zeigt, dass die einzelnen Körpergewichte der NEP-Knockout-Tiere über einen wesentlich größeren Bereich streuen, als ihre wildtypischen Kontrollen.

Abb. 16: Einzelwerte der Körpergewichte von Gruppe 1.

(A) Männchen (2096 Datenpunkte bei NEP (–/–), 642 Datenpunkte bei NEP (+/+)),
(B) Weibchen (1236 Datenpunkte bei NEP (–/–), 614 Datenpunkte bei NEP (+/+)).

↓92

Als Ursache für die Streuung der Tiergewichte innerhalb der Gruppen wurden verschiedene Parameter vermutet, vor allem Haltungsbedingungen wie die Käfigbelegung, Käfigausstattung, Raumbelegung oder verschiedene Futtersorten. Bei der Käfigbelegung wurde in einer retrospektiven Auswertung der oben genannten Daten gefunden, dass die für Typ II-Käfige normale Belegung von 2-5 Tieren wenig unterschiedliche Gewichtskurven-Verläufe brachte. Die Zugabe von 1-2 ungefärbten und ungebleichten Papiertüchern erwies sich durchweg als positiv und wurde seit dem in allen Tierversuchen angewandt [s. auch Koolhaas, 97]. Einen mindestens ebenso großen Einfluss hatten die räumlichen Gegebenheiten. Die Untersuchungen wurden in mehreren Tierräumen in den Versuchstierhaltungen dreier unterschiedlicher Institute durchgeführt. Dabei konnte festgestellt werden, dass in gering belegten Tierräumen mit einer niedrigen Frequenz von störenden Einflüssen – vor allem einer geringen Tierbelegung und daraus resultierend seltenerem Füttern und Tränken – die Gewichtsdifferenz zwischen Wildtypen und Knockouttieren deutlich zunahm. Zwar legten auch die Kontroll-Tiere an Gewicht zu, die Zunahme fiel jedoch bei den Knockouttieren stärker aus.

Den stärksten Einfluss auf die Auseinanderentwicklung der Gewichte, hatte allerdings die Wahl der Futtersorte. Die Tiere wurden in den unterschiedlichen Laboratorien zunächst mit verschiedenen Futtersorten versorgt. Alle diese Sorten hatten vergleichbare, nur minimal von einander abweichende Zusammensetzungen, wie im Methodenteil aufgelistet. Wesentliche Unterschiede lagen jedoch in der Art der Herstellung und der weiteren Aufbereitung vor der Verfütterung. Es wurde entweder pelletiertes oder extrudiertes Futter verwendet. In einem der Tierlabore wurde das pelletierte Futter wiederum erst nach Autoklavierung verfüttert, um in diesem Raum eine Keimreduzierung zu erreichen.

IV - 3.2. Vergleich von pelletiertem und extrudiertem Futter (Gruppe 2)

IV - 3.2.1. Gewichtsentwicklung

Zur näheren Charakterisierung der letztgenannten Beobachtungen wurde ein Versuch konzipiert, in dem der Effekt von pelletiertem und extrudiertem Futter auf die Gewichtsentwicklung beider Genotypen untersucht werden sollte. Dafür wurde wöchentlich von der 7. bis zur 67. Lebenswoche das Körpergewicht von wildtypischen sowie NEP-defizienten Tieren ermittelt, die entweder pelletiertes oder extrudiertes Futter bekamen. 15 Männchen NEP (+/+), 20 Männchen NEP (–/–), 8 Weibchen NEP (+/+) und 18 Weibchen NEP (–/–) wurden mit pelletiertem Futter gefüttert sowie 14 Männchen NEP (+/+), 19 Männchen NEP (–/–), 10 Weibchen NEP (+/+) und 20 Weibchen NEP (–/–) mit extrudiertem Futter (Anzahlen zu Beginn des Versuches; während des Versuches gestorbene Tiere wurden nicht ersetzt). Wie in Abb. 17 zu sehen, setzt bei den mit extrudiertem Futter gefütterten Männchen die Auseinanderentwicklung relativ früh ein. Bei den restlichen Gruppen sind auch in diesem Versuch deutliche Unterschiede zwischen Wildtyp und Knockout erst später zu beobachten, z. B. bei den Weibchen mit extrudiertem Futter nach dem 10. Monat. Bei den Tieren, die mit pelletiertem/autoklaviertem Futter gefüttert wurden entwickelten sich dagegen kaum Unterschiede.

↓93

Abb. 17: Zeitlicher Verlauf des Körpergewichtes bei den Tieren der Gruppe 2.

Die Gewichtskurven wurden im Zeitraum der 17.-64. Woche durch Dreifaktorielle Varianzanalyse mit wiederholten Messungen (Alter x Genotyp x Futter) nach Wilks-Lambda verglichen.
A (Männchen): P = 0,01. N (Anzahl der Tiere): Pelletiertes Futter: 14 (+/+), 18 (–/–) ; Extrudiertes Futter: 14 (+/+), 16 (–/–).
B (Weibchen): P konnte aufgrund ungenügender Residuen-Freiheitsgrade nicht berechnet werden (weitere statistische Auswertungen siehe Tab. 8). N (Anzahl der Tiere): Pelletiertes Futter: 8 (+/+), 17 (–/–) ; Extrudiertes Futter: 7 (+/+), 19 (–/–).

Die statistische Auswertung der verschiedenen Gruppen gegeneinander ist in Tab. 8 dargestellt (s. folgende Seite).

IV - 3.2.2. Organgewichte

Die Gewichte verschiedener Organe können durch das Körpergewicht, besonders durch das Körperfett sowie Blutfettwerte, beeinflusst werden. Ein auffälliger Trend unserer Messungen zeigte sich beim abdominalen Fettgewebe. In Analogie zu ihrem Körpergewicht waren auch die Fettpolster der mit extrudiertem Futter gefütterten Tiere schwerer als bei den Tieren des gleichen Genotyps unter pelletiertem Futter (siehe die korrespondierenden Genotypen in Tab. 9, s. S. 108). Ebenso zeigte sich

↓94

Tab. 8: Statistischer Vergleich der Untergruppen aus dem Futtervergleich (Gruppe 2).

A. Zweifaktorielle Varianzanalyse der einzelnen Untergruppen der Gruppe 2
über den
gesamten Zeitraum *

Verglichene Untergruppen

Mittelwerte ± SEM
(gesamter Zeitraum)

Diffe renz

Sign.

Untergruppe 1

Untergruppe 2

 

Männchen

(+/+) pelletiert vs. (+/+) extrudiert

32,79 ±1,12 g

36,15 ±1,12 g

3,36 g

(–/–) pelletiert vs. (–/–) extrudiert

34,71 ±0,99 g

41,89 ±1,05 g

7,18 g

✭✭✭

(+/+) pelletiert vs. (–/–) pelletiert

32,79 ±1,12 g

34,71 ±0,99 g

1,92 g

n.s.

(+/+) extrudiert vs. (–/–) extrudiert

36,15 ±1,12 g

41,89 ±1,05 g

5,74 g

✭✭

Weibchen

(+/+) pelletiert vs. (+/+) extrudiert

27,77 ±0,93 g

29,82 ±1,00 g

2,05 g

n.s.

(–/–) pelletiert vs. (–/–) extrudiert

28,87 ±0,64 g

31,52 ±0,61 g

2,65 g

✭✭

(+/+) pelletiert vs. (–/–) pelletiert

27,77 ±0,93 g

28,87 ±0,64 g

1,10 g

n.s.

(+/+) extrudiert vs. (–/–) extrudiert

29,82 ±1,00 g

31,52 ±0,61 g

1,70 g

n.s.

B. Vergleich der Gruppen während der letzten 10 Wochen (t-Test)

Verglichene Gruppen

Mittelwerte ± SEM
(Wochen 58-67)

Diffe renz

Sign.

Gruppe 1

Gruppe 2

 

Männchen

(+/+) pelletiert vs. (+/+) extrudiert

37,77 ±0,10 g

41,07 ±0,06 g

3,30 g

✭✭✭

(–/–) pelletiert vs. (–/–) extrudiert

40,23 ±0,07 g

49,14 ±0,10 g

8,91 g

✭✭✭

(+/+) pelletiert vs. (–/–) pelletiert

37,77 ±0,10 g

40,23 ±0,07 g

2,86 g

✭✭✭

(+/+) extrudiert vs. (–/–) extrudiert

41,07 ±0,06 g

49,14 ±0,10 g

8,07 g

✭✭✭

Weibchen

(+/+) pelletiert vs. (+/+) extrudiert

31,67 ±0,16 g

33,17 ±0,11 g

1,50 g

✭✭✭

(–/–) pelletiert vs. (–/–) extrudiert

34,40 ±0,34 g

38,76 ±0,19 g

4,36 g

✭✭✭

(+/+) pelletiert vs. (–/–) pelletiert

31,67 ±0,16 g

34,40 ±0,34 g

2,73 g

✭✭✭

(+/+) extrudiert vs. (–/–) extrudiert

33,17 ±0,11 g

38,76 ±0,19 g

5,59 g

✭✭✭

Im oberen Teil der Tabelle (A) sind die Mittelwerte der verschiedenen Gruppen über den gesamten Zeitraum sowie deren Differenzen dargestellt (* um Gruppen mit konstanter Tieranzahl zu erhalten wurde der Zeitraum 17.-64. Woche ausgewertet). Die Gewichtskurven der einzelnen Gruppen wurden mittels Zweifaktorieller Varianzanalyse mit wiederholten Messungen (Alter x Genotyp bzw. Alter x Futter) verglichen.
Im unteren Teil der Tabelle (B) sind die Mittelwerte der einzelnen Gruppen während der letzten 10 Wochen sowie deren Differenzen bei direktem Vergleich mittels t-Test aufgeführt. In dieser Zeit erreichten die meisten Gruppen eine Phase relativer Gewichtskonstanz (Plateauphase).
n.s.: P > 0,05; ✭: P ≤ 0,05; ✭✭: P ≤ 0,01; ✭✭✭: P ≤ 0,001

beim Vergleich der Genotypen gegeneinander eine Parallelität der Fettmengen zum Körpergewicht: Während unter pelletiertem Futter keine signifikanten Unterschiede zwischen Knockout und Wildtyp auftraten, war die Fettmasse der NEP-Knockout-Tiere unter extrudiertem Futter erhöht (jedoch bei den Männchen ohne statistische Signifikanz). Beim Gewicht von Herz, Niere und Milz zeigte sich dagegen kein solcher Trend. Bei der Milz der Weibchen NEP (+/+) (Extrudiertes Futter) konnte nur von einem Tier ein Wert erfasst werden. Da dieses Tier offensichtlich eine krankhaft vergrößerte Milz hatte, resultiert hier ein extrem hoher Wert.

IV - 3.2.3. Diverse Parameter aus Blut bzw. Serum

Zu Versuchbeginn wurden bei durchschnittlich 7 Wochen alten Tieren die Glucose- und Ketonwerte gemessen. Dabei zeigten sich keine signifikanten Differenzen zwischen den korrespondierenden Genotyp-Gruppen. Auch am Versuchsende waren keine Unterschiede bei diesen Parametern auszumachen.

↓95

Bei den biochemischen Parametern, die eine wichtige Rolle beim Fettstoffwechsel spielen (wie z B. Lipoproteine und Triglyceride) wurden zwischen den Genotypen (innerhalb der jeweiligen Futter- und Geschlechtsgruppe) einige signifikante Unterschiede beobachtet. Diese zeigten jedoch nicht durchgängig bei beiden Futtersorten und bei beiden Geschlechtern die gleiche Tendenz. Häufig waren aber die Werte in beiden Futtergruppen ähnlich groß. Deshalb wurden zusätzlich zu der futterspezifischen Auswertung (siehe Tab. 9) auch die über beide Futtergruppen gemittelten Werte analysiert (nicht in der Tabelle abgebildet). Bei dieser Auswertung wurde das Ergebnis mit der deutlichsten Tendenz beim Gesamtcholesterol beobachtet: Die Mittelwerte der jeweiligen Knockout-Gruppe lagen immer unter denen der korrespondierenden Kontrollgruppe. Signifikant waren die Unterschiede jeweils bei Männchen (P<0,05) und Weibchen (P<0,01) in den über beide Futtersorten gemittelten Gruppen:
Weibchen : NEP [+/+]: 115,3±3,6 mg/dl, N=16 vs. NEP [–/–]: 104,3±1,4 mg/dl, N=35,  Männchen : NEP [+/+]: 152,4±7,4 mg/dl, N=28 vs. NEP [–/–]: 129,9±7,0 mg/dl, N=34.

Eine Mittelung der Werte von Männchen und Weibchen wurde nicht vorgenommen. Zwar wiesen diese oft die gleiche Tendenz auf; da die absoluten Werte aber meist stark differierten, wurde die Auswertung auch hier geschlechtsspezifisch vorgenommen.

Tab. 9: Organgewichte und diverse Blutparameter der Tiere aus Gruppe 2.

Organgewichte und diverse Parameter aus Blut/Serum der Weibchen (A) bzw. Männchen (B) aus Gruppe 2.
Organgewichte sind in [g] angegeben, Ketonwerte in [mmol/l], die restlichen Blutwerte in [mg/dl]. Die Auswertung erfolgte für jedes Paar Wildtyp/Knockout getrennt mittels t-Test. Mit farblichem Rahmen hervorgehoben sind Parameter, bei denen im Vergleich zwischen den Genotypen eine ähnliche Tendenz bei beiden Geschlechtern und z. T. auch bei beiden Futtersorten erkennbar ist. Diese Tendenz ist nicht in jedem Falls statistisch nachweisbar. Andererseits sind statistisch signifikante Unterschiede nicht hervorgehoben, bei denen keine Analogie bei den Geschlechtern oder Futtersorten erkennbar war. n.s.: P > 0,05; ✭: P ≤ 0,05; ✭✭: P ≤ 0,01; ✭✭✭: P ≤ 0,001

↓96

Bei Vergleich der Werte innerhalb einer spezifischen Futtergruppe war beim Gesamtcholesterol und beim HDL eine Tendenz der NEP-Knockout-Mäuse zu erniedrigten Werten erkennbar. Beim Gesamtcholesterol waren die Differenzen bei den Männchen in der Gruppe mit extrudiertem Futter und bei den Weibchen in der Gruppe mit pelletiertem Futter signifikant. Auch die Triglyceride hatten zum überwiegenden Teil eine Tendenz zu niedrigeren Werten bei den Knockouttieren. Die einzige signifikante Differenz bei den Triglyceriden wurde allerdings bei den erhöhten Werten der Männchen (–/–) (extrudiertes Futter) gefunden. Generell erhöhte Blutfettwerte bei den NEP-Knockout-Tieren können jedoch entgegen unserer Erwartung ausgeschlossen werden.

IV - 3.3. Behandlung mit fettreicher und fettarmer Diät (Gruppe 4)

In diesem Versuch wurde die Entwicklung der Körperzusammensetzung (Fettmasse, Muskelmasse, freie Körperflüssigkeit) unter dem Einfluss von fettreichem und fettarmem Futter über mehrere Monate untersucht. Dazu wurden NEP-Knockout-Weibchen mit ihren wildtypischen Kontrollen verglichen. Dieser Versuch wurde durch ein differenziertes Fütterungsregime unterlegt: Beide Gruppen erhielten entweder Standardfutter („Low Fat“) oder Nahrung mit stark erhöhtem Fettanteil („High Fat“). Im Anschluss an diesen Beobachtungszeitraum wurden die Tiere hinsichtlich ihres Respiratorischen Quotienten, des BMI sowie der Leptinkonzentration im Serum untersucht.

IV - 3.3.1. Anteil von Körperfett, Muskelmasse und Extrazellularflüssigkeit am Gesamtkörpergewicht

Durch NMR-Analyse wurde die Körperzusammensetzung, getrennt nach Fettmasse, überwiegend proteinhaltigem Gewebe (hier kurz Muskelmasse genannt) und freier Körperflüssigkeit, am lebenden Tier über ca. 8 Monate verfolgt. Alle vier Gruppen (2 Genotypen x 2 Futtersorten) gingen im Alter von durchschnittlich 23 Wochen (Variation ± 2 Wochen) ohne signifikante Unterschiede hinsichtlich Körpergewicht, Fettmasse, Muskelmasse sowie freier Körperflüssigkeit (nach Monofaktorieller Varianzanalyse) in den Versuch. Wie schon im Versuch mit pelletiertem und extrudiertem Futter (Abb. 17) beobachtet, entwickeln die NEP-defizienten Tiere auch unter diesem Fütterungsregime ein höheres Körpergewicht, und auch hier treten die Differenzen zeitlich verzögert (hier: ab ca. dem 6. Lebensmonat) ein (Abb. 18). Wie zu erwarten, hatten die mit fettreicher Nahrung gefütterten Tiere ein höheres Körpergewicht als die Tiere unter Standarddiät.

↓97

Abb. 18 zeigt, dass beim Körpergewicht – wie erwartet – die Wildtypen unter Low-Fat-Futter den flachsten Kurvenverlauf haben und die Knockouttiere unter High-Fat-Futter den steilsten. In der Reihenfolge der verbleibenden zwei Gruppen lag die Gruppe [NEP (+/+) / High Fat] über der Gruppe [NEP (–/–) / Low Fat]. Dieses Ergebnis kann in Analogie zum Versuch mit pelletiertem vs. extrudiertem Futter gesehen werden (Gruppe 2), wo die Wildtypen mit dem besser verstoffwechselbaren Futter ebenfalls über den Knockout-Mäusen mit Standardfutter lagen.

Abb. 18: Zeitliche Entwicklung von Körper-, Fett- und Muskelmasse sowie freier Körperflüssigkeit bei den Tieren der Gruppe 4.

Die Kurven wurden durch Zweifaktorielle Varianzanalyse (Alter x Genotyp bzw. Alter x  Futter) verglichen. Zur besseren Veranschaulichung wurden die Teilabbildungen „Körpergewicht“, „Fettmassen“ und „Muskelmasse“ mit derselben Spreizung der Ordinate gezeichnet. Die P-Werte waren bei fast allen verglichenen Kurvenpaaren signifikant (mit P < 0,05, zumeist sogar P < 0,001). Lediglich beim Vergleich der freien Körperflüssigkeit zwischen (+/+) und (–/–) in der Low-fat-Gruppe unterschieden sich die Kurvenverläufe nicht signifikant.
Anzahl der Tiere zu Beginn der Untersuchung (N):
Low-fat-Futter: 4 (+/+), 11 (–/–) ; High-fat-Futter: 6 (+/+), 12 (–/–).

Die Abb. 18 zeigt auch, dass das höhere Körpergewicht in den schwereren Tiergruppen vor allem auf eine Zunahme der Fettmassen zurückzuführen ist, während die Muskelmasse in weit geringerem Maße zunimmt. Die freie Körperflüssigkeit wird im Gegensatz zur Fettmasse kaum durch den Genotyp beeinflusst (auch wenn sich die Kurven beim Vergleich [+/+] vs. [–/–] beim High-fat-Futter signifikant unterschieden) – sie steigt dagegen bei beiden Genotypen deutlich beim Einsatz von Low-fat-Futter an.

IV - 3.3.2. Prozentualer Anteil am Körpergewicht

↓98

Dass die Erhöhung des Körpergewichts vor allem auf die vermehrten Fettansammlungen und nicht auf eine Zunahme der Muskelmasse zurückzuführen ist, wird durch Abb. 19 verdeutlicht. In der Teilabbildung „Verhältnis Fettmasse / Körpergewicht“ ist der prozentuale Fettanteil am Gesamtkörpergewicht im zeitlichen Verlauf dargestellt. Die überdurchschnittliche Zunahme des Fettanteils ist, wie zu erwarten, besonders bei den mit High-fat-Diät gefütterten Gruppen sichtbar: Der Anteil des Fettgewebes nimmt bei der NEP-(–/–)-High-Fat-Gruppe zu Versuchsende sogar rund 60% des gesamten Körpergewichtes ein. Wichtiger jedoch für den Zusammenhang zur NEP ist der deutlich erhöhte Fettanteil bei den NEP-Knockout-Tieren im Vergleich mit den Wildtypen der gleichen Futtergruppe. Dieser Unterschied kann sogar besonders deutlich bei den lediglich mit Low-fat-Diät gefütterten Tieren beobachtet werden. Dort beträgt die Differenz zu den Wildtypen zu Versuchsende ca. 20%.

Die Teilabbildung „Verhältnis Muskelmasse / Körpergewicht“ veranschaulicht den prozentualen Anteil der Muskelmasse am Gesamtkörpergewicht im gleichen Zeitraum. Auch hier wird klar ersichtlich, dass der Anstieg des Körpergewichts kaum auf einer Zunahme der Muskelmasse beruht. Auch wenn die absolute Muskelmasse in allen Gruppen leicht ansteigt (Abb. 18), sinkt ihr Anteil am Gesamtkörpergewicht in derselben Abstufung zwischen den einzelnen Gruppen, wie er bei den Fettmassen zunimmt.

Abb. 19: Zeitliche Entwicklung der prozentualen Relation von Fett- bzw. Muskelmasse zur Gesamtmasse bei den Tieren der Gruppe 4.

Zur besseren Veranschaulichung wurden die Ordinaten mit derselben Spreizung gezeichnet. Die P-Werte waren bei fast allen verglichenen Kurvenpaaren signifikant (mit P < 0,05, zumeist sogar P < 0,001). Lediglich beim Vergleich des prozentualen Anteils der Muskelmasse zwischen (+/+) und (–/–) in der High-fat-Gruppe unterschieden sich die Kurvenverläufe nicht signifikant. Die übrigen Angaben zur Statistik sind der Abb. 18 zu entnehmen.

IV - 3.3.3. Leptinspiegel (Gruppe 4)

↓99

Die Leptinkonzentrationen im Serum der untersuchten Tiere wurde wegen der geringen Tierzahl der Wildtypen zu Versuchsende nicht nach den unterschiedlichen Futtersorten getrennt ausgewertet. Beide Genotypen zeigten eine starke Abhängigkeit vom jeweiligen Körpergewicht, was sich bei den NEP [–/–] in einem hohen Korrelationskoeffizienten ausdrückte (0,92). Korrelations- und Regressionsanalyse war bei den wildtypischen Tieren wegen der geringen Tierzahl (N = 4) nicht möglich; aus dem gleichen Grund konnten die Kurven der beiden Genotypen auch nicht statistisch gegeneinander verglichen werden. Bis auf einen Wert folgen jedoch die Werte der Wildtypen dem Kurvenverlauf der Knockouttiere. Ein Anhaltspunkt für erhöhte Leptinwerte bei den NEP-Knockout-Mäusen, wie sie für einen übergewichtigen Tierstamm häufig beschrieben werden [Wallenius, 05], findet sich jedenfalls nicht. Wenn also die Regressionsgerade der NEP-Knockout- im Gegensatz zu den Wildtyptieren erniedrigt ist, müssten die NEP [–/–] bei gleichem Körpergewicht einen erniedrigten Leptinspiegel haben. Die Bedeutung für den Zusammenhang NEP-Körpergewicht kann daraus jedoch noch nicht abgeleitet werden, zumal dieses Ergebnis wegen der geringen Anzahl an Tieren in der Gruppe NEP [+/+] nicht sehr robust ist. Außerdem scheint die Verteilung der NEP [–/–] eher einem sigmoidalen Verlauf zu folgen, der mit der Geraden der NEP [+/+] statistisch kaum verglichen werden kann.

Ein Vergleich der Mittelwerte beider Genotypen erschien wegen der sehr starken Streuung der Werte (von ca. 4 ng/ml bis ca. 400 ng/ml) als nicht sinnvoll.

Abb. 20: Korrelation der Leptinwerte (aus den Seren von Gruppe 2) mit dem Körpergewicht

IV - 3.4. Oraler Glucosetoleranz-Test (OGT)

↓100

Ein weiterer Grund für das erhöhte Körpergewicht der NEP-Knockout-Tiere könnte in einer verschlechterten Glucoseaufnahme aus dem Blutkreislauf in die Zellen liegen. Obwohl, wie oben beschrieben, kein eindeutiger Hinweis auf unterschiedliche Glucosekonzentrationen bei freiem Zugang zum Futter gibt, sollte der Blutglucose-Verlauf nun unter kontrollierten Bedingungen verfolgt werden: Nach oraler Glucoseapplikation zeigte die Blutglucose-Kurve der NEP-defizienten Mäuse bei beiden Geschlechtern signifikant höhere Werte als bei den wildtypischen (Zweifaktorielle Varianzanalyse, P<0,0001; s. Abb. 21). Bei Vergleich der Konzentrationen zum jeweiligen Zeitpunkt mittels t-Test gab es zu fast allen Zeitpunkten eine signifikant erhöhte Glucosekonzentration bei den Knockouttieren. Lediglich 10 min nach oraler Applikation war der Glucosespiegel der Knockout-Weibchen gegenüber den Wildtyp-Weibchen (nicht signifikant) erniedrigt, was auf eine verzögerte Resorption der Glucose in den Knockout-Mäusen hinweisen könnte.

Abb. 21: Oraler Glucosetoleranztest (OGT): Blutglucose-Konzentration 30 min sowie 10 min, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 5 h und 6 h nach oraler Glucoseapplikation in (A) Weibchen und (B) Männchen.

Die Zweifaktorielle Varianzanalyse ergab für beide Kurvenvergleiche P-Werte < 0,0001. Die Werte zu den einzelnen Zeitpunkten wurden mittels t-Test verglichen (✭: P ≤ 0,05; ✭✭: P ≤ 0,01).

IV - 3.5. Futterverbrauch (Gruppe 2)

Ein nahe liegender Grund für das erhöhte Körpergewicht und die vermehrten Fettmassen bei den NEP-Knockout-Tieren könnte ein erhöhter Futterverbrauch sein. Zur Klärung dieser Frage wurde während jeweils zweier Wochen im 6. bzw. 12. Lebensmonat der Tiere aus Gruppe 2 der Futterverbrauch ermittelt. Trotz einer Tendenz zu erhöhtem Futterverbrauch bei den NEP (–/–)-Weibchen war ein allgemeiner Trend nicht nachweisbar. Auch bei Zusammenfassung der Werte von Männchen und Weibchen bzw. von pelletiertem und extrudiertem Futter wurden keine signifikanten Differenzen beobachtet. In diesem Versuch wurden demnach keine sicheren Hinweise auf einen veränderten Futterbrauch der NEP-Knockout-Mäusen beobachtet.

↓101

Abb. 22: Futterverbrauch (ad libitum) von pelletiertem bzw. extrudiertem Futter bei 6 und 12 Monate alten Tieren (Gruppe 2).

Die Gruppen (jeweils [+/+] vs. [–/–]) wurden mittels t-Test verglichen (keine signifikanten Differenzen bis auf Vergleich der Weibchen bei pelletiertem Futter im 12. Monat). Angabe der Fehlerindikatoren als SD.
Anzahl der Tiere (N):
Weibchen: Pelletiertes Futter: 4 (+/+), 9 (–/–) ; Extrudiertes Futter: 5 (+/+), 10 (–/–).
Männchen: Pelletiertes Futter: 8 (+/+), 10 (–/–) ; Extrudiertes Futter: 7 (+/+), 10 (–/–).
✭: P ≤ 0,05

IV - 3.6. Energiehaushalt

Da sich beide Genotypen in ihrer Futteraufnahme kaum unterschieden, könnte eine veränderte Stoffwechselrate Ursache für das Übergewicht der Knockouttiere sein. Über die indirekte Kalorimetrie werden zunächst der Verbrauch an Sauerstoff und die Abgabe von Kohlendioxid ermittelt werden. Diese können erste Hinweise über Unterschiede in der Verbrennung von Energiereserven geben. Der sich daraus errechnende respiratorische Quotient (RQ) gibt Aufschluss über die Art der oxidierten Energiereserven (siehe Methoden). Aus diesen Verbrauchsdaten lässt sich indirekt über Vergleichswerte (kalorische Äquivalente) die dabei frei werdende Wärmemenge berechnen.

RQ-Werte von 0,743 ±0,006 bei den NEP (–/–) bzw. 0,731 ±0,017 bei den NEP (+/+) weisen auf eine Verbrennung von Fetten und Proteinen hin, dagegen nicht auf eine Kohlenhydrat-Verbrennung (Abb. 23, links). Es gibt also keine Anzeichen für eine unterschiedliche Verbrennung der Energiereserven zwischen den beiden Genotypen (P>0,05). Auch die produzierte Wärmenge zeigt keinerlei signifikante Differenzen (0,471 ±0,016 kcal/h bei den NEP [–/–] bzw. 0,476 ±0,049 kcal/h bei den NEP [+/+], P>0,05, Abb. 23, rechts).

↓102

Abb. 23: Respiratorischer Quotient (RQ) und produzierte Wärmemenge pro Stunde.

Die Werte (gemittelt über beide Futtersorten) Tiere wurden mittels t-Test ausgewertet (keine signifikanten Unterschiede).
Anzahl der Tiere (N): 4 (+/+), 17 (–/–).

IV - 3.7. Zusammenhang von NEP-Aktivität und Körpergewicht

IV - 3.7.1. NEP-Aktivitäten im Hypothalamus wildtypischer Mäuse (Gruppe 2)

Da der Hypothalamus eines der wichtigsten Zentren hormoneller Steuerung des ZNS darstellt, wurde überprüft, ob in dieser Region die NEP-Aktivität wildtypischer Tiere in einem Zusammenhang mit dem Körpergewicht steht. Der Pearson-Korrelationseffizient aller untersuchten Tiere der Gruppe 2 beträgt 0,227 (P>0,05). Auch bei statistischer Analyse einzelner Gruppen (innerhalb eines Geschlechts, einer Futtersorte) resultieren immer Korrelationskoeffizienten unter 0,6. In den wildtypischen Mäusen dieses Versuches konnte folglich für die NEP-Aktivität im Hypothalamus kein Zusammenhang mit dem Körpergewicht nachgewiesen werden. Diese fehlende Korrelation könnte einerseits von den zu geringen Gewichtsunterschieden zwischen den untersuchten Gruppen herrühren, andererseits aber auch durch die Heterogenität der Gruppen verursacht worden sein (Tiere unterschiedlichen Geschlechts und/oder unterschiedlicher Futtersorte).

IV - 3.7.2. NEP-Aktivitäten in peripheren Organen übergewichtiger und normalgewichtiger Mausstämme (Gruppe 5)

Um die Übertragbarkeit des NEP–Gewichts–Konzeptes auf andere Tiermodelle zu testen, wurde die NEP-Aktivität in zwei weiteren Mausstämmen untersucht. Der Stamm DU6i wurde am FBN in Dummerstorf auf dem Hintergrund des Stammes
Abb. 24: NEP-Aktivität in Organen von schwergewichtigen DU6i-Mäusen und dem Kontrollstamm DUKsi.

Körpergewicht DU6i: 97,7 g ±2,3 g, N=8 ; Körpergewicht DUKsi: 40,0 g ±0,9 g, N=10.
Die Mittelwerte der Gewichte und NEP-Aktivitäten wurden durch t-Test verglichen.
✭✭: P ≤ 0,01

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DUKsi selektiv auf Übergewicht gezüchtet [Buenger, 90]. Die NEP-Aktivität wurde in der Lunge und in der Niere beider Gruppen gemessen (die Tiere wurden von C. C. Metges/ FBN zur Verfügung gestellt). Bei den übergewichtigen DU6i-Tieren (mittleres Körpergewicht: 97,7 g) war die NEP-Aktivität in beiden Organen signifikant niedriger als bei den DUKsi-Kontrolltieren (mittleres Körpergewicht: 40,0 g; Abb. 24).

IV - 3.8. Peptidabbau durch die NEP

Wie in der Einleitung beschrieben, stellen eine Anzahl von orexigenen bzw. anorexigenen Peptiden gute Substrate der NEP dar. Bei Betrachtung weiterer orexigener bzw. anorexigener Peptide fielen einige als potentielle Kandidaten für den Abbau durch die NEP auf. Davon wurden folgende ausgewählt, um auf Hydrolyse durch die NEP getestet zu werden (siehe auch Tab. 6): die Orexine A und B, das am Ser 3 octanoylierte Ghrelin (sowie Des-Octanoyl-Ghrelin), Galanin, AGRP 86-132, CRH, GLP-1 und CART 55-102. Keins dieser Peptide ist länger als 48 Aminosäuren, und alle enthalten eine oder mehrere typische Spaltstellen der NEP. Unter In-vitro-Bedingungen, die bei humanem Aβ zu vollständigem Abbau führten, konnte bei den Orexinen, Des-Octanoyl-Ghrelin, AGRP 86-132 und CART 55-102 kein Abbau festgestellt werden. Ghrelin zeigte bei langer Inkubationszeit (>2h) mit löslicher, aufgereinigter NEP (siehe Kap. 2.2.2) eine Reduktion des Peptids um ca. 15%, die sich durch Candoxatrilat hemmen ließ; der Abbau durch Gesamthirn-Membranen ließ sich jedoch durch Candoxatrilat nicht inhibieren. Der geringfügige Abbau durch die lösliche NEP wurde als marginal für die Steuerung des Ghrelin-Stoffwechsels eingestuft und wurde deshalb nicht weiter verfolgt.

IV - 3.8.1. CRH und GLP-1

In Vorversuchen zum CRH-Abbau wurde bereits bei kurzer Inkubationszeit nach HPLC-Separation eine deutliche Reduktion des CRH-Signals beobachtet. Während des Bearbeitungszeitraums wurde allerdings ein Artikel veröffentlicht, der detaillierte Aussagen zum Abbau von CRH durch die NEP zum Inhalt hatte. Die dort beschriebenen Untersuchungen (mit unterschiedlichen Enzymquellen sowie mit aufgereinigtem Enzym durchgeführt) wurden als ausreichend für eine Verwendung in unserer Argumentation erachtet. Der von Ritchie et al. ermittelte K m-Wert von 42 µM [Ritchie, 03a] entsprach den von uns ermittelten hohen Abbaugeschwindigkeiten.

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Ebenso konnte in Vorversuchen ein deutlicher Abbau von GLP-1 durch die NEP beobachtet werden. Ein solcher Zusammenhang wurde zwar schon in einer früheren Arbeit beschrieben [Hupe-Sodmann, 97], allerdings sind diese Ergebnisse lediglich an Zellen unter Verwendung der nicht sehr spezifischen Inhibitoren Thiorphan und Phosphoramidon erzielt worden. Hier wird dagegen der Katabolismus von GLP-1 durch reines rekombinantes Enzym beschrieben. Mit rekombinanter NEP (0,27ng/µl) wurden 4µM Peptid innerhalb von 60 min fast vollständig abgebaut, die t1/2 lag unter 20 min. Die sich daraus ergebenden Schlussfolgerungen hinsichtlich Körpergewicht, Diabetes mellitus sowie Lernen und Gedächtnis wurden als so wichtig eingestuft, dass weitere Aspekte zum GLP-Abbau Thema einer separaten Arbeit werden.

IV - 3.8.2. Galanin

Weitere Abbauversuche zeigten, dass das stark orexigene Peptid Galanin ebenfalls ein gutes Substrat der NEP ist. Abb. 25 zeigt Abbaukurven von Galanin während der Inkubation sowohl mit Membranpräparationen aus wildtypischem Großhirn als auch mit dem aufgereinigten löslichen Enzym. Die Abbaukurven mit Hirnmembranen Abb. 25A) zeigen, dass die NEP von großer Bedeutung für den Galanin-Abbau ist. Nach 1 h wurde durch die ungehemmte Membran bereits mehr als doppelt so viel Peptid abgebaut wie durch die NEP-gehemmten Membranen. Für die verbleibende Galanin-hydrolysierende Aktivität (nach Inhibierung der NEP) sind nicht zwangsläufig Enzyme verantwortlich, welche unter physiologischen Bedingungen für den spezifischen Galanin-Abbau relevant sind. In den Membran-Präparationen aus Großhirn ist nämlich eine Vielzahl an unspezifischen, membranständigen Enzymen enthalten, welche das Galanin nicht an dessen Freisetzungs- oder Wirkort hydrolysieren oder unter physiologischen Umständen erst gar nicht in Kontakt mit dem Galanin kommen. Für einen weiteren Beweis der Hydrolysierbarkeit von Galanin durch die NEP wurde das Peptid mit der aufgereinigten löslichen NEP inkubiert. Der resultierende Abbau wurde durch Candoxatrilat vollständig inhibiert (Abb. 25B). In einer weiteren Messreihe wurde der K m-Wert mit 41,7 µM ermittelt. Dieser Wert weist das Galanin als ähnlich gutes Substrat der NEP aus wie SP (31,9 µM) oder [Met5]-Enkephalin (62,0 µM).

Abb. 25: Hydrolytischer Abbau von Galanin (A) durch Hirnmembranen von wildtypischen Mäusen und (B) durch aufgereinigte lösliche NEP.

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Die Bedeutung der NEP für den Galanin-Abbau in vivo belegen auch Mikrodialyse-Experimente, die in Kooperation mit R. Richter (FMP) durchgeführt wurden. Dabei wurde über eine Sonde Galanin in den Hippocampus von wildtypischen Mäusen appliziert und an gleicher Stelle zu drei Zeitpunkten innerhalb 1 h Proben aus dem austretenden Dialysat entnommen. Danach wurde für 2 h mit Candoxatrilat (5 mM) perfundiert und anschließend wieder zu drei Zeitpunkten innerhalb 1 h Proben aus dem Dialysat entnommen. In den Dialysaten wurden per Massenspektrometrie Galanin und daraus entstandene Bruchstücke analysiert. Diese Methode erlaubt nur semiquantitative Aussagen – es wurde aber deutlich, dass nach Einspritzung von Galanin zusammen mit Candoxatrilat die Galanin-Signale stärker wurden und einige vorher große Bruchstück-Signale nicht mehr vorhanden oder deutlich verringert waren. Im Folgenden sind die Bruchstück-Signale aufgeführt, die zu allen drei Zeitpunkten vor Candoxatrilat-Gabe sehr deutlich und danach kaum vorhanden waren. Sie konnten folgenden Galanin-Teilsequenzen zugeordnet werden. Hierbei sind die Bruchstücke nach absteigender Größe der korrespondierenden HPLC-Peaks aufgeführt; die Anzahl der Sternchen spiegelt in etwa die Größe des HPLC-Peaks wider. Einige Bruchstücke haben gleiche theoretische Massen. Die aus theoretischer Sicht wahrscheinlicheren Bruchstücke sind in fetter Schriftart hervorgehoben. Die jeweilige Aminosäuresequenz ist dahinter mit Unterstreichung aufgeführt. Bei alternativen Möglichkeiten ist nur die wahrscheinlichere abgebildet. Die jeweils folgende Aminosäure N- und C-terminal von der Spaltstelle ist ohne Unterstreichung in Klammern angegeben.

Sequenz 1-30:

Gly 1 -Trp 2 -Thr 3 -Leu 4 -Asn 5 -Ser 6 -Ala 7 -Gly 8 -Tyr 9 -Leu 10 -Leu 11 -Gly 12 -Pro 13 -His 14 -Ala 15 -Val 16 -Gly 17 -Asn 18 -His 19 -Arg 20 -Ser 21 -Phe 22 -Ser 23 -Asp 24 -Lys 25 -Asn 26 -Gly 27 -Leu 28 -Thr 29 -Ser 30

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IV - 4.  Diskussion

Die NEP ist, wie bereits mehrfach dargestellt, am Katabolismus einer großen Zahl von Peptidhormonen beteiligt. Dies führt zu vielfältigen Beziehungen der NEP zu physiologischen und pathologischen Zuständen des Organismus. Die Funktionen der NEP bei der Blutdruckregulation, bei Suchtprozessen und bei der Alzheimerschen Erkrankung wurden bereits ausführlich dargestellt.

Dass die NEP bei Suchtvorgängen eine wichtige Funktion ausübt, wurde wegen ihrer Fähigkeit zur Enkephalin-Hydrolyse früh postuliert [Malfroy, 78a]. Auch das Wissen um weitere NEP-Substrate wie NPY oder CRH, für die eine Funktion im Suchtgeschehen bekannt ist, legt diesen Zusammenhang nahe. Die genannten Peptide üben aber auch einen Einfluss auf die Nahrungsaufnahme aus. Somit sind bisher unbekannte Einflüsse der NEP auf die Entwicklung des Körpergewichtes nahe liegend. Wie allerdings die NEP in die Regulierung der Nahrungsaufnahme bzw. des Körpergewichtes involviert ist, wurde bisher noch nicht untersucht.

IV - 4.1.  Allgemeiner Phänotyp

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Während unserer Arbeiten mit NEP-Knockout-Mäusen in Bezug auf die Alkoholaufnahme und auf die Alzheimersche Erkrankung fiel auf, dass viele dieser Tiere besonders in der 2. Lebenshälfte im Vergleich zu wildtypischen Kontrollen ein erhöhtes Körpergewicht sowie große Fettansammlungen im Bauchraum aufweisen. Die exakte Erfassung dieses Gewichtsunterschiedes über längere Zeiträume war die Grundlage für spätere Untersuchungen.

Zunächst waren die eindrucksvollen Gewichtsunterschiede, wie sie aus den vorher beobachteten Einzelbefunden zunächst abgeleitet wurden, bei den Tieren der zunächst untersuchten Gruppe 1 im Mittelwert nicht derart ausgeprägt. Vielmehr zeichnete sich ein differenzierteres Bild: Die Ausprägung des Übergewichtes der NEP-Knockout-Tiere hing von deren Alter, der verwendeten Futtersorte sowie von den generellen Haltungsbedingungen ab. In diesem 1. Teilversuch nahmen beide Genotypen während der ersten 8 – 9 Monate kontinuierlich an Gewicht zu; danach verringerte sich bei den wildtypischen Mäusen die Zunahme des Körpergewichtes spürbar und mündetet in eine Plateauphase, während die Knockouttiere bis zu ihrem Lebensende an Gewicht zunahmen. Dieser Effekt wurde möglicherweise durch höhere Stressorbelastung verursacht (hohe Gesamtbelegung der Räume, in denen dieser Teilversuch stattfand; höhere Käfigbelegung; relativ motivationsarme Käfiggestaltung). Bei Haltung in weniger belegten Räumen, in Käfigen mit zwei Mäusen und unter Zusatz von Zellstofftüchern („enriched environment“) war die Gewichtsdifferenz zwischen den Genotypen dagegen deutlich größer: ca. 8 – 9 g bei den Männchen und ca. 4 g bei den Weibchen (Gruppe 2, extrudiertes Futter).

IV - 4.2. Einfluss verschiedener Futtersorten

Ein weiterer eindrucksvoller Effekt wurde durch verschiedene Futtersorten verursacht. Bei einem Wechsel von pelletiertem zu extrudiertem Futter kam es innerhalb von 1 – 2 Wochen zu einem deutlichen Gewichtszuwachs, der zwar auch die Wildtypen betraf, bei den Knockout-Mäusen jedoch wesentlich stärker ausgeprägt war. Bemerkenswert ist, dass es sich bei letzterer Futtersorte nicht um eine energie- oder fettreichere Diät handelte, sondern lediglich um einen Unterschied im Herstellungsverfahren. Bei der Herstellung des extrudierten Futters wirken höhere Temperaturen und Drücke auf die Futtermischung ein, was zu einem partiellen Aufschluss bestimmter Kohlenhydrate führt (siehe weiter unten).

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In einer umfangreichen prospektiven Studie wurde danach unter möglichst stressarmen Bedingungen das Körpergewicht beider Genotypen und Geschlechter über einen Zeitraum von ca. 15 – 16 Monaten unter Verabreichung von pelletiertem und extrudiertem Futter – gleichmäßig auf alle Gruppen verteilt – verfolgt (Gruppe 2). Bei den Männchen wie bei den Weibchen zeichnete sich ein vergleichbares Bild: Bei beiden Futtersorten lagen die gemittelten Gewichtskurven der Knockouttiere über denen der Wildtypen. Beim pelletierten Futter trat diese Differenz allerdings erst später ein. Die mit diesem Futter gefütterten Knockout- und Wildtyptiere zeigen im Kurvenverlauf über den gesamten Zeitraum keinen signifikanten Unterschied; erst in den letzten 10 Wochen (annähernd Plateauphase) weisen die Knockouttiere auch bei diesem Futter ein signifikant erhöhtes Körpergewicht auf (ca. 3g). Die mit extrudiertem Futter gefütterten NEP-Knockout-Mäuse hatten dagegen deutlich steilere Gewichtskurven als die vergleichbaren Wildtyptiere, obwohl auch hier die Auseinanderentwicklung nicht unmittelbar einsetzte. Das gegenüber den Wildtypen erhöhte Körpergewicht der männlichen Knockout-Mäuse war bei extrudiertem Futter auch über den gesamten Kurvenverlauf hoch signifikant.

Der unterschiedliche Einfluss von pelletiertem und extrudiertem Futter auf das Körpergewicht ist bereits in der Literatur erwähnt worden, die Ursache aber noch nicht befriedigend beantwortet. Zur näheren Charakterisierung dieses Unterschiedes wurden beide Futtersorten in Kooperation mit C. C. Metges et al. am FBN in Dummerstorf noch eingehend untersucht: Dabei wurde gefunden, dass extrudiertes Futter, bedingt durch das Herstellungsverfahren bei höherem Druck und höherer Temperatur, durch α-Amylase zu 100% aufgeschlossen wird – im Gegensatz zu 81% bei pelletiertem Futter. Die Stärke in extrudiertem Futter lässt sich daher im Gegensatz zur Stärke in pelletiertem Futter von den Mäusen besser verdauen und folglich resorbieren und metabolisieren. Warum sich dieser Unterschied allerdings bei den NEP-Knockout-Mäusen wesentlich stärker auf das Körpergewicht auswirkt, bleibt unklar. Hier scheint die genetische Veranlagung zum Tragen zu kommen. Geringe Unterschiede in der Nahrung, die bei wildtpyischem Genotyp nur geringe Auswirkungen auf den Phänotyp haben, können bei genetischer Prädisposition (NEP-Defizienz) das Körpergewicht wahrscheinlich gravierender beeinflussen.

In einer weiteren Langzeitstudie wurde untersucht, ob auch fettreiche Nahrung in einem ähnlichen Maße wie das extrudierte Futter die Differenz zwischen den Körpergewichten beider Genotypen vergrößert (Gruppe 4). Die mit fettreicher Diät gefütterten Tiere unseres Versuches waren zwar – wie zu erwarten – deutlich schwerer, und die Differenz zwischen Knockout- und Wildtyptieren war ebenfalls groß, jedoch nahm sie gegenüber der Standarddiät nicht in dem Maße zu wie bei dem Vergleich von pelletiertem und extrudiertem Futter.

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Da also durch das fettreiche Futter das Körpergewicht der Wildtypen fast ebenso stark erhöht wurde wie bei den Knockout-Mäusen, ist zu vermuten, dass die Wirkung der NEP nicht in demselben Maße durch den Fettgehalt der Nahrung beeinflusst wird, wie durch deren Kohlenhydrate. Die Ursache hierfür lässt sich aus diesen Experimenten nicht ableiten.

Unsere Ergebnisse zeigen eine spät einsetzende Entwicklung zu Übergewicht und Fettleibigkeit bei den NEP-Knockout-Mäusen. Dieser genetisch bedingte Trend wird deutlich beeinflusst durch eine Reihe von äußeren Faktoren wie Stress und Futterqualität. Im Unterschied zu anderen monofaktoriellen Adipositas-Tiermodellen (z. B. Leptin-defizienten Tieren) werden die Fettakkumulation und die Zunahme des Körpergewichtes nicht nur von einem Hormon-Rezeptor-System beeinflusst. Die Vielzahl von NEP-Substraten mit orexigenen oder anorexigenen Eigenschaften, aber auch mit Beziehungen zu Stressverarbeitung und anderen physiologischen Vorgängen, führen zu einem Phänotyp, der letztlich dem polyfaktoriellen Gesamtbild der menschlichen Adipositas weit mehr entspricht als die vorgenannten Modelle. Die NEP könnte daher eine übergeordnete „Schaltstelle“ sein, die über ihre Substrate in die verschiedenen Regelkreise der Nahrungsaufnahme, des Nahrungsstoffwechsels und des Energiehaushalts und damit auch des Körpergewichts eingreift.

IV - 4.3. Anteil von Körperfett, Muskelmasse und Extrazellularflüssigkeit am Gesamtkörpergewicht

Zur Charakterisierung des Phänotyps der übergewichtigen NEP-Knockout-Mäuse sollte belegt werden, inwieweit deren höheres Körpergewicht vor allem auf einen höheren Fettanteil zurückzuführen ist. Dies war zwar schon nach Tötung und Organentnahme bei einzelnen Tieren vermutet worden, die Einzelfallbeobachtung wurde nun durch Analyse der Körperzusammensetzung einer größeren Gruppe von NEP-Knockout-Mäusen im Vergleich zu Wildtypen bestätigt (Gruppe 4). Im Gegensatz zu den herkömmlichen Methoden wie Röntgenanalyse oder Wägung ausgewählter Fettgewebe ermöglichte uns die Verwendung eines NMR-Gerätes die Untersuchung am lebenden Tier und über einen größeren Zeitraum.

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Die NEP-defizienten Tiere besaßen nicht nur wesentlich größere absolute Fettmengen; auch der prozentuale Anteil des Fettgewichts am Gesamtkörpergewicht betrug zu Ende des Beobachtungszeitraumes bei der Knockout-Gruppe mit fettreichem Futter 60% im Gegensatz zu nur 50% bei den Wildtypen der gleichen Futtergruppe, 40% bei den Knockouttieren mit Standardfutter und lediglich 20% bei den Wildtypen mit Standardfutter. Parallel dazu sank dagegen der prozentuale Anteil der Muskelmasse am Gesamtkörpergewicht, die absolute Muskelmasse in den einzelnen Gruppen erhöhte sich nur unwesentlich. Die freie Körperflüssigkeit wiederum zeigte keine Abhängigkeit vom Genotyp – sie nahm aber in allen Gruppen, die mit fettreichem Futter gefüttert wurden, zu.

IV - 4.4. Biochemische Stoffwechselparameter

Nach Beschreibung des Phänotyps stellte sich die Frage nach möglichen Mechanismen der Adipositas-Entstehung bei NEP-Knockout-Mäusen. Der Verweis auf die Substrate der NEP allein (s. unten) gibt darauf noch keine hinreichende Antwort, da sich darunter sowohl orexigene als auch anorexigene befinden. Weiterhin könnten diese peptidischen Substrate zwar mögliche Ursachen für die unterschiedliche Fett- und Gewichtszunahme bei den NEP-defizienten Tieren erklären; diese Stimuli müssen jedoch auch einen Niederschlag im Fett- und Energiestoffwechsel finden. Zunächst wurden deshalb an verschiedenen der oben aufgeführten Tiergruppen mehrere biochemische Parameter mit Bezug zum Energie- und Fettstoffwechsel erfasst.

Einen ersten Hinweis auf die veränderte Stoffwechsellage der NEP-Knockout-Mäuse ergaben der OGT sowie die Messung der Nüchtern-Glucosekonzentration (Gruppe 3). In diesem Versuch verliefen die Kurven der Knockout-Mäuse bei beiden Geschlechtern signifikant oberhalb der der Wildtypen, was für eine geringere Glucosetoleranz spricht. Schon die basale Glucosekonzentration im nüchternen Zustand war im Blut der Knockouttiere höher als bei den Wildtypen. Dieser Unterschied war jedoch bei den Tieren der Gruppe 2 nicht nachweisbar, bei denen die Glukosekonzentration nicht nach 8 h Nüchternheit (wie beim OGT), sondern nach ständigem freien Zugang zum Futter bestimmt wurde. Die veränderte Stoffwechsellage der NEP-Knockout-Mäuse scheint sich aber nicht nur nach massiver Glucoseapplikation, sondern bereits im nüchternen Zustand auszuwirken. Diese Befunde sprechen dafür, dass die Knockouttiere die applizierte Glucose schlechter aus dem Blutkreislauf in die Zellen transportieren können.

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Aufgrund der starken Fetteinlagerungen, auf die letztlich das erhöhte Körpergewicht der NEP-Knockout-Mäuse zurückzuführen ist, wurden vor allem bei Parametern des Fettstoffwechsels, wie Triglyceriden und Lipoproteinen, deutliche Veränderungen erwartet – was sich nicht bestätigte. Bei diesen Werten wurden beim Vergleich Knockout vs. Wildtyp kaum Unterschiede beobachtet, die in allen Gruppen konsistent waren. So waren z. B. die Triglyceride bei den Knockouttieren der Gruppe Männchen/extrudiertes Futter signifikant erhöht, dagegen aber bei den Männchen/pelletiertes Futter und den Weibchen/extrudiertes Futter tendenziell erniedrigt und bei den Weibchen/pelletiertes Futter annähernd gleich. Die einzigen bei mehreren Gruppen sichtbaren Tendenzen zeigten sich beim HDL-Wert und beim Gesamtcholesterol. Überraschenderweise ergaben sich bei den NEP-Knockout-Mäusen jedoch erniedrigte Werte. Für generell erhöhte Blutfettwerte bei den Knockouttieren, wie sie aus deren erhöhtem Körpergewicht und den erhöhten Fettmassen erwartet wurden, gab es dagegen keine Hinweise.

Das für den Fettstoffwechsel und allgemein für das Körpergewicht wichtige Leptin wurde im Serum der Tiere der Gruppe 4 untersucht. Zwar zeigte sich auch hier – ähnlich den Ergebnissen zur Wärmemenge – bei beiden Genotypen die erwartete eindeutige Korrelation zum Körpergewicht; Unterschiede zwischen den Wildtypen und den Knockout-Mäusen waren jedoch nicht nachweisbar. Hierbei ist anzumerken, dass die Anzahl der wildtypischen Mäuse zum Versuchsende für eine sichere Ermittlung von Differenzen nicht mehr ausreichend waren.

IV - 4.5. Energiebilanz (Futteraufnahme und Stoffwechselrate)

Bei Betrachtung der Energiebilanz kann das erhöhte Körpergewicht der NEP-Knockout-Mäuse grundsätzlich auf zwei Ursachen zurückgeführt werden: Zum einen könnte die Futteraufnahme bei den Knockout-Mäusen erhöht sein, zum anderen könnte die Stoffwechselrate bei diesen Tieren erniedrigt sein, d. h. dass die aufgenommene Nahrung in stärkerem Maße in Fettdepots eingelagert wird und/oder die Verbrennung dieser Energiereserven erniedrigt ist. In beiden Fällen – der erhöhten Futteraufnahme und der erniedrigten Stoffwechselrate – wäre die Energieaufnahme erhöht (positive Energiebilanz). In mehreren Versuchen wurde jedoch kein eindeutiger Beweis für eine erhöhte Futteraufnahme festgestellt. Es muss jedoch erwähnt werden, dass sowohl in einem Experiment zum Alkoholverbrauch [Siems, 00b] als auch bei bisher unveröffentlichten Teilversuchen am FBN in Dummerstorf (persönliche Mitteilung von C. C. Metges) ein erhöhter Futterverbrauch festgestellt wurde. Ebenso soll hier auf einen Versuch zur oralen Applikation von Candoxatril hingewiesen werden. Bei einer solchen pharmakologischen Inhibierung der NEP wurde neben dem erwarteten Anstieg des Körpergewichts auch ein signifikant erhöhter Futterverbrauch beobachtet (auf diese Beobachtung wird weiter unten näher eingegangen).

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Bei der respiratorischen Austauschrate und der abgegebenen Wärmemenge ergaben sich ebenfalls keine eindeutigen Differenzen zwischen den Genotypen. Dagegen gab es – wie zu erwarten – bei beiden Genotypen einen klaren Zusammenhang zwischen erzeugter Wärmemenge und Körpergewicht; bei der respiratorischen Austauschrate war die Korrelation weniger eindeutig.

Aus diesen Ergebnissen wird nicht ersichtlich, woraus das erhöhte Körpergewicht und die Adipositas der NEP-Knockout-Mäuse resultieren. Ein möglicher Grund für das Fehlen von Unterschieden in den hier beschriebenen Experimenten besteht darin, dass die evtl. vorhandenen geringen Differenzen durch die Messungen der Energieauf- und -abnahme (besonders der Futteraufnahme) über den relativ kleinen Messzeitraum (max. 2 Wochen) hinweg nicht detektiert werden können. Solche geringen Differenzen, z. B. beim Futterverbrauch, können sich aber über den großen Zeitraum bis zum Auseinanderdriften der Gewichtskurven (mehrere Monate) derartig summieren, dass es im Laufe der Zeit zu einem Gewichtsunterschied kommt (siehe Beispielrechnung in der Einleitung). Solche geringen Differenzen wurden zwar in einigen Teilversuchen durchaus beobachtet. Diese Unterschiede waren aber nur in wenigen Fällen signifikant und wurden auch nicht in jeweils beiden Geschlechts-, Futter- bzw. Altersgruppen mit der gleichen Tendenz beobachtet. Umgekehrt wurde aber auch in keinem Teilexperiment bei den Knockouttieren eine geringere Futteraufnahme oder ein erhöhter Energieverbrauch beobachtet. Die hier beschriebenen Ergebnisse können eine positive Energiebilanz bei den NEP-Knockout-Mäusen zwar nicht zweifelsfrei belegen. Zusammen genommen mit weiteren Experimenten unserer AG und von Kooperationspartnern weisen sie jedoch in diese Richtung. Diese Fragestellung wird daher Gegenstand weiterer intensiver Forschung unserer Arbeitsgruppe sein.

IV - 4.6. Orexigene und anorexigene Substrate der NEP

Die biochemischen Prozesse, die zur Fettakkumulation und zum erhöhten Körpergewicht bei den NEP-Knockout-Mäusen führen, sind – wie dargelegt – noch weitgehend unklar und werden Gegenstand neuer Untersuchungen mit verfeinerten Methoden sein. Es ist allerdings sehr wahrscheinlich, dass die molekularen Ursachen für den adipösen Phänotyp dieser Tiere im NEP-abhängigen Katabolismus von Peptidhormonen (oder anderen peptidischen Mediatoren) liegen müssen. In Tab. 6 in der Einleitung wurden bekannte Substrate aufgeführt, die orexigene oder anorexigene Eigenschaften haben. Da jedoch auch in weiteren wichtigen orexigenen und anorexigenen Peptiden typische NEP-Spaltsequenzen ausgemacht wurden, wurden einige dieser Verbindungen auf ihre Hydrolysierbarkeit durch die NEP untersucht. Bei den orexigenen Peptiden Orexin A und B, Ghrelin, Des-Octanoyl-Ghrelin und AGRP sowie bei dem anorexigenen CART konnte eine Hydrolyse durch die NEP nicht nachgewiesen werden. Für weitere Substrate wie NPY, PYY, GLP-1 und CRH wurde der schnelle Abbau durch die NEP – der nach Literaturangaben z. T. nicht eindeutig auf die NEP zurückzuführen war – mit Hilfe des reinen rekombinanten Enzyms bestätigt. Im Fall von Galanin, einem orexigenen Peptid mit 30 Aminosäuren, wird ein schneller Abbau durch die NEP hier erstmals beschrieben. Bei Inkubation mit wildtypischen Hirnmembran-Präparationen bzw. mit löslicher aufgereinigter NEP wurde die Galanin-Hydrolyse durch NEP-Inhibitoren teilweise bzw. vollständig gehemmt. Der errechnete K m-Wert von 41,7 µM stellt Galanin in eine Reihe mit besonders guten Substraten der NEP wie den Enkephalinen, SP, CCK-8, Bradykinin oder Neurotensin.

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Die Konzentrationen dieser Peptide müssen im nächsten Schritt in für den Energiehaushalt wichtigen Körperregionen, besonders im Fettgewebe und im Hypothalamus, bestimmt werden. Durch diese Werte – im Vergleich Knockout vs. Wildtyp – könnten Informationen über einen Mechanismus gewonnen werden, der letztlich zu dem übergewichtigen Phänotyp der NEP-Knockout-Mäuse führt. Möglicherweise wird dadurch sichtbar, in welche Regelkreise der Gewichtsregulation die NEP eingreift und in welcher Relation zu einander diese Regelkreise stehen.

IV - 4.7. Zusammenhang von NEP-Aktivität und Körpergewicht

Letztlich stellt sich die Frage nach einer Gewichtsabhängigkeit der NEP-Aktivität bei wildtypischen Mäusen und verallgemeinernd die Frage nach der Beeinflussbarkeit des Körpergewichts durch Modulation der NEP (Hemmung oder Aktivierung). Beiden Fragen wurde in unserer Arbeitsgruppe nachgegangen:

Zur Beantwortung der ersten Frage wurden zwei orientierende Experimente durchgeführt. Im ersten Versuch wurde keinerlei Beziehung der NEP-Aktivität im Hypothalamus (wildtypische Mäuse aus Gruppe 2) zum Körpergewicht festgestellt (weder bei Auswertung nach Geschlecht oder Futter noch nach gemeinsamer Auswertung). NEP-Aktivität und Körpergewicht korrelierten nicht miteinander. In einem weiteren Versuch, in dem die NEP-Aktivität in Niere und Lunge eines normalgewichtigen Zuchtstammes (DUKsi) mit der eines stark übergewichtigen (DU6i) verglichen wurde (beide Mausstämme waren aus der gleichen Linie abgeleitet), wurde dagegen eine starke Abhängigkeit von der NEP-Aktivität beobachtet. In den genannten peripheren Organen der übergewichtigen Tiere war die NEP-Aktivität signifikant erniedrigt. Diese Ergebnisse sollen zukünftig an weiteren peripheren Organen und ZNS-Regionen von übergewichtigen Tierstämmen und ihren normalgewichtigen Kontrollen bestätigt sowie durch Messungen an humanem Material ergänzt werden.

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Bei der Beantwortung der Frage nach dem Einfluss von NEP-Inhibitoren auf das Körpergewicht erzielte unsere Arbeitsgruppe bereits erste Erfolge: Während der oralen Behandlung von 22 wildtypischen männlichen C57BL6-Mäusen mit dem spezifischen NEP-Inhibitor Candoxatril (im Futter enthalten) war das Körpergewicht dieser Tiere bereits nach 10 Behandlungstagen gegenüber der Kontrollgruppe (n=21, mit einem Placebofutter behandelt) signifikant erhöht (persönliche Mitteilung von W.-E. Siems/FMP). Am 63. Behandlungstag betrug die Gewichtsdifferenz bereits 3,03 g (33,88 ±0,56 g bei Behandlung mit Placebo; 36,91 ±1,00 g bei Behandlung mit Candoxatril; P < 0,01). Ebenso waren die abdominalen Fettmengen bei Versuchsende deutlich erhöht. Durch die Inhibition des Enzyms resultierte ein deutlich schnellerer Anstieg des Körpergewichts als durch die NEP-Defizienz bei den Knockout-Mäusen. Im Gegensatz zu den Versuchen an NEP-Knockout-Mäusen wurde bei den Candoxatril-behandelten Wildtypen eine signifikant erhöhte Futteraufnahme beobachtet (110,1 ±2,18 g/kg/d bei Behandlung mit Placebo;
122,1 ±3,50 g/kg/d bei Behandlung mit Candoxatril; P < 0,01).

Die Ursachen für den schnelleren Gewichtsanstieg und die erhöhte Futteraufnahme bei den Candoxatril-behandelten Tieren gegenüber den NEP-defizienten sind noch unklar. Siems et al. hatten zwar gefunden, dass in den NEP-Knockout-Tieren verwandte Metallopeptidasen wie ACE und APN in wichtigen Hirnregionen nicht gegenreguliert sind [Siems, 00a] – eine teilweise Substitution der NEP durch andere Peptidasen kann jedoch nicht ausgeschlossen werden [vgl. auch Oliveri, 01]. Aber auch in den Candoxatril-behandelten Tieren kann eine Gegenregulation anderer Peptidasen nicht ausgeschlossen werden [vgl. auch Helin, 94]. Weiterhin könnte zu dem schnelleren Gewichtsanstieg der Candoxatril-behandelten Tiere beigetragen haben, dass diese Tiere zu Versuchsbeginn 7 Monate alt waren, die rasche juvenile Gewichtszunahme also schon abgeschlossen war. Im Gegensatz dazu war bei den Knockouttieren das Enzym bereits vor der Geburt ausgeschaltet.

Besondere Aufmerksamkeit sollte finden, dass nach unseren Untersuchungen zur ZNS-Gängigkeit (siehe oben beschriebene Versuche zum Alkoholkonsum) das Candoxatril die Blut-Hirn-Schranke nicht überwindet. Die oben beschriebenen Effekte des Candoxatrils können also auf die Hemmung der peripheren NEP zurückgeführt werden. Nach Untersuchungen von Schling und Schäfer spielt das Renin-Angiotensin-System (und darin besonders die NEP) eine bedeutende Rolle im peripheren Fettgewebe [Schling, 02]. Im menschlichen Fettgewebe ist hauptsächlich die NEP für die Inaktivierung von Angiotensin II verantwortlich, welches für die Neubildung von Adipocyten und Präadipocyten verantwortlich ist [Engeli, 03a]. Durch den Abbau von Angiotensin II könnte also die NEP eine regulierende Funktion auf die Adipogenese ausüben. Für diese Hypothese spricht auch, dass die Gewichtszunahme der NEP-Knockout-Tiere fast ausschließlich dem Fettgewebe zuzuschreiben ist und die NEP vor allem in peripheren Organen übergewichtiger Mäuse erhöht ist. Über den beschriebenen Mechanismus im Fettgewebe wäre auch der gewichtssteigernde Effekt des peripher wirksamen Candoxatril erklärbar.

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Diese Ergebnisse zeigen auf der einen Seite die Gefahren auf, die in der therapeutischen Nutzung von NEP-Inhibitoren liegen können. Dass der gewichtssteigernde Effekt in Tierversuchen bisher jedoch nicht beobachtet wurde, kann sowohl an der kleinen Anzahl bisher durchgeführter Langzeitstudien liegen als auch an der geringeren Dosis bei diesen Experimenten (50 mg/kg/d bei Arnal et al. [Arnal, 01a] im Gegensatz zu 200 mg/kg/d in unseren Versuchen). Beim Einsatz von NEP-Inhibitoren am Menschen (besonders bei der langfristigen Behandlung des Blutdrucks, der oft mit einem erhöhten Körpergewicht einhergeht) muss diese mögliche gewichtssteigernde Nebenwirkung in Betracht gezogen und in klinischen Studien abgeschätzt werden.

Unsere Ergebnisse wecken auf der anderen Seite aber auch die Hoffnung, dass Körpergewicht und Fettakkumulation durch eine Modulation der NEP-Aktivität gesteuert werden können. Diese Möglichkeit einer Induktion der NEP wurde zwar in letzter Zeit – besonders im Zusammenhang mit der Alzheimerschen Erkrankung – häufiger diskutiert [Iwata, 05a]. Die verstärkte Expression der NEP durch Transfer des Enzym-Gens in das Gehirn von Mäusen wurde zwar schon mehrfach erprobt [u. a. beschrieben in Marr, 03b], und inzwischen gibt es vielfältige Ansätze zur experimentellen Induktion der NEP [u. a. durch Quercetin und Resveratrol in Melzig, 02b; oder durch Grünteeextrakt in Melzig, 03b]; noch fehlen aber realistische Behandlungsansätze.

Die viel versprechenden therapeutischen Chancen (u. a. Behandlung der Adipositas, der Alzheimerschen Erkrankung und der Alkoholkrankheit) erfordern jedoch neben Lösungen zur sicheren Induktion der NEP (welche sich auch lokal und zeitlich begrenzt steuern lassen muss) immer auch Risikoabschätzungen. So muss in jedem Fall beachtet werden, dass die Hemmung der NEP zu negativen Folgen u. a. für den Blutdruck, die Hämodynamik und die Natriurese führen kann. Und die NEP kann – wie in der Diskussion zum Alzheimer-Kapitel (2.4) beschrieben – gerade im Alter einen protektiven Einfluss auf kognitive und Lernfähigkeiten ausüben. So entsteht das Bild eines vielseitigen und vielseitig nutzbaren, jedoch auch janusköpfigen Enzyms.


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24.11.2006