Die NEP wurde erstmalig als eine unbekannte Aktivität in der Bürstensaummembran von Rattennieren beschrieben. Präparationen daraus hydrolysierten in vitro bei neutralem pH-Wert die B-Kette des Insulins [Wong-Leung, 68]; das Enzym wurde deshalb kidney brush border neutral proteinase genannt. Es wurde 1974 aus Rattennieren homogen aufgereinigt [Kerr, 74] und als Metallopeptidase erkannt. Die NEP macht ungefähr 4% der Proteinmasse der Bürstensaummembran der Niere aus.

Die weitere Charakterisierung der NEP ergab große Übereinstimmungen mit den Eigenschaften der bakteriellen Metallopeptidase Thermolysin, u. a. hemmte der Thermolysin-Inhibitor Phosphoramidon auch die NEP (K _i 2 nM; [Kenny, 77]). Unabhängig davon wurde die NEP auch in Hirnmembranen entdeckt und wegen seiner inaktivierenden Wirkung auf Enkephaline als „Enkephalinase“ bezeichnet [Malfroy, 78b].

1987 wurde das Enzym kloniert und sequenziert [Devault, 87a], woraus die Identität mit dem Leukozyten-Oberflächenantigen common acute lymphoblastic leukemia antigen (CALLA oder CD 10) erkannt wurde [Letarte, 88]. 1992 hat die IUBMB wegen der vielfältigen Bezeichnungen für diese Peptidase den Namen Neprilysin vorgeschlagen.

Als integrales Membranprotein vom Typ II ist die NEP in der Plasmamembran verankert mit Orientierung des Aminoterminus zum Zellinneren und des Carboxyterminus zum Extrazellularraum. Der größte Teil des Moleküls inklusive des katalytischen Zentrums befindet sich im Extrazellularraum, weshalb man auch von einem Ektoenzym spricht. In den meisten Spezies existiert die NEP als nichtkovalent assoziiertes Homodimer [Fulcher, 83]. Im Zentralnervensystem (ZNS) ist sie meist auf axonalen Membranen und in der perisynaptischen Region der Neuronen prä- und postsynaptisch lokalisiert, oft in räumlicher Nähe mit dem Produktionsort ihrer Substrate oder mit deren Rezeptoren. Deshalb wird die NEP im ZNS auch als „Cholinesterase der peptidergen Synapsen“ bezeichnet [Turner, 03].

Die Molmasse der NEP variiert in den verschiedenen Geweben von ca. 85 bis 100 kDa, abhängig vom Ausmaß der Glykosylierung an 5 bis 6 Glykosylierungsstellen. Mindestens 4 Disulfidbrücken innerhalb des Proteins sind wichtig für die Aufrechterhaltung von Struktur und Aktivität [Tam, 85]. Insgesamt 12 Cysteine sind im Molekül enthalten, von denen 10 innerhalb der gesamten M13-Familie der Metallopeptidasen konserviert sind.

Die M13-Familie ist charakterisiert durch 2 Zink-bindende Domänen innerhalb der letzten 250 Aminosäuren der extrazellulären, C-terminalen Region. Diese beiden Sequenzen, eingebaut in 3 α-Helices und 4 β-Faltblattstrukturen, bewirken die Koordination des Zinkions. Die Peptidasen der M13-Familie besitzen im Gegensatz z. B. zum ACE nur ein katalytisches Zentrum. Außer der NEP gehören der M13-Familie so bedeutende Enzyme wie die Endothelin-Konversionsenzyme 1 und 2 (endothelin converting enzyme, ECE-1 und -2), aber auch weniger bekannte Peptidasen, deren Funktion bis heute noch relativ unbekannt sind, wie das KELL-Blutgruppen-Antigen, „Phosphat-regulierendes Genprodukt mit Homologien zu Endopeptidasen auf dem X-Chromosom“ (PEX), die „Orphan“-Peptidase XCE (X converting enzyme, neuere Bezeichnung ist ECE-like 1, ECEL-1), die lösliche Endopeptidase (solubleoder secreted endopeptidase, SEP, bzw. neprilysin-like enzyme 1, NL-1,in der Ratte als NEP 2 bezeichnet), und DINE ( d amage- i nduced n euronal e ndopeptidase, evtl. das orthologe Enzym der Ratte zum menschlichen XCE) an. Seit längerem bekannt und auch in die M13-Familie gehörend ist das bereits erwähnte bakterielle Enzym Thermolysin, das wegen seiner gut aufgeklärten Struktur und Substratspezifität oft zu Vergleichen mit der NEP und anderen Mitgliedern der M13-Familie heran gezogen wird.

Die Identifikation der NEP als Enkephalinase und die Bemühungen um eine Potenzierung der Enkephalin-Wirkungen waren Anlass für die Entwicklung des potenten Inhibitors Thiorphan [Roques, 80], der zunächst oft zur Unterscheidung der NEP von anderen Mitgliedern der M13-Familie der Metallopeptidasen herangezogen wurde. Da Thiorphan außer Thermolysin und der NEP aber auch eine Reihe weiterer Enzyme hemmt, ist die Verwendung neuerer Inhibitoren wie Candoxatrilat – das in den üblicherweise verwendeten Konzentrationen keins der NEP-verwandten Enzyme hemmt – vorteilhafter.

Das Gen für die NEP existiert in einer einzelnen Kopie, umspannt mehr als 80 kb, besteht aus 24 Exons und ist innerhalb der Säugetiere hochkonserviert [D'Adamio, 89]. Es wurde 1989 auf der chromosomalen Region 3q21-q27 lokalisiert [Barker, 89]. Neuere Untersuchungen haben die Region auf 3q25.1-25.2 eingegrenzt [GeneCards, 04]. Die Klonierung der cDNA ergab bei den untersuchten Säugerspezies relativ einheitliche Moleküllängen: 750 Aminosäuren beim Kaninchen [Devault, 87b], 742 Aminosäuren bei der Ratte [Malfroy, 87] und 752 Aminosäuren für die menschliche NEP [Malfroy, 88].

Die N-terminale, cytoplasmatische Domäne der humanen NEP besteht aus 27 Aminosäuren, gefolgt von der transmembranalen Domäne mit 22 hydrophoben Aminosäuren und der großen extrazellulären Domäne einschließlich des katalytischen Zentrums mit insgesamt 703 Aminosäuren. Der C-Terminus des Enzyms beinhaltet das für viele Zink-Peptidasen typische HExxH-Motiv. Die beiden Histidine in diesem Motiv (His⁵⁸³ und His⁵⁸⁷) und das Glutamat in Position 646 bilden die Zink-komplexierenden Elemente. Das Glutamat in Position 584 (innerhalb des HExxH-Motivs) ist bei Vorhandensein einer freien Carboxylgruppe in P2’-Position des Substrates (2. Aminosäure C-terminal der Spaltstelle, s. unten) in der Lage, diese Gruppe zu stabilisieren und damit die Katalyse zu begünstigen. Auch die Aminosäuren Arg¹⁰², Asn⁵⁴², Asp⁶⁵⁰, His⁷¹¹ und Arg⁷⁴⁷ sind für die Funktion der NEP essentiell oder zumindest Katalyse-beschleunigend, sei es durch Interaktion mit dem Substrat oder durch Stabilisierung des Übergangszustandes während der Reaktion.

Die NEP ist über einen großen pH-Bereich aktiv; das pH-Optimum wird meist mit ca. pH 67 angegeben. Das Substratspektrum der NEP ist – wie oben erwähnt – außergewöhnlich breit. In einem Großteil der Substrate ähnelt es dem der bakteriellen Zink-Metalloproteinase Thermolysin, welche sich ebenfalls durch Phosphoramidon hemmen lässt. Die NEP wirkt im Wesentlichen als Oligopeptidase, für die die Hydrolyse von Peptiden mit bis zu 42 Aminosäuren nachgewiesen ist, wobei die Effektivität der Hydrolyse mit zunehmender Länge der Peptide im Allgemeinen abnimmt. Eins der am schnellsten hydrolysierten Substrate ist das Undecapeptid Substanz P (K _m = 31,9 µM, [Matsas, 84a]). Eine Ausnahme von der steigenden Effektivität bei kürzeren Substraten bildet das β-Amyloid-Peptid, das von der NEP mit einem K _m-Wert von 2,8 µM hydrolysiert wird [Takaki, 00b].

Die Substratspezifität der NEP wurde in vitro anhand eines großen Spektrums an synthetischen und natürlichen Peptidsubstraten ausführlich untersucht, wohingegen die Liste der Moleküle, bei deren Abbau für die NEP auch in vivo eine bedeutende physiologische Rolle eindeutig belegt werden konnte, bisher limitiert ist. Zu den NEP-Substraten, für die auch aus In vivo-Experimenten klare Beweise für einen NEP-bedingten Katabolismus existieren, gehören die Enkephaline, Tachykinine wie Substanz P, ANP und das β-Amyloid-Peptid. Für Bradykinin, Neurotensin, das chemotaktische Peptid formyl–Met–Leu–Phe, Gastrin, Bombesin und einige andere Peptide konnte neben der In vitro-Spaltung auch die gemeinsame immunhistochemische Anfärbung in situ gezeigt werden.

In Abbauversuchen in vitro wurdedie Substratspezifität der NEP hingegen ausführlich untersucht. Aus den daraus gewonnenen Erkenntnissen sind neue, potentielle Substrate zwar nicht mit Sicherheit vorhersagbar, jedoch lassen sich daraus einige grundsätzliche Anforderungen an solche Peptide und orientierende Merkmale für potentielle Spaltsequenzen innerhalb von Peptiden ableiten. Endogene Peptide, die die entsprechenden Strukturmerkmale aufweisen, können dann auf Hydrolyse durch die NEP getestet werden. Es stellt daher einen viel versprechenden Ansatz dar, für einen physiologischen/pathophysiologischen Vorgang, bei dem ein Zusammenhang mit der NEP vermutet wird oder erwiesen ist, eine Liste der darin involvierten Peptide systematisch auf mögliche Kandidaten einer Spaltung durch die NEP zu durchsuchen und diese anschließend experimentell zu analysieren. Dieser Ansatz wurde auch in der vorliegenden Arbeit verfolgt und im Ergebnis neue In vitro-Substrate der NEP aufgefunden.

Die primäre Voraussetzung für die Spezifität der NEP ist ein raumgreifender hydrophober Aminosäurerest in der P1’-Position des Substrates (Aminosäuren N-terminal der Spaltstelle des Substrates werden mit P bezeichnet und interagieren mit der S-Bindungstasche des Enzyms, wohingegen die Aminosäuren C-terminal der Spaltstelle mit P’ und die gegenüberliegende Stelle des Enzyms mit S’ bezeichnet wird). Leu in der P1’-Position ergibt die höchsten Hydrolyseraten, Phe die niedrigsten K _m-Werte [Turner, 98]. Auch Tyr ist eine der bevorzugten Aminosäuren in der P1’-Position, mit Einschränkungen auch Val.

Eine freie Carboxylgruppe in der P2’-Position bewirkt ebenfalls höhere Hydrolyseraten, da das Arg ¹⁰² der NEP mit dem Carboxylrest eine schwache Salzbrücke bildet [Dion, 97]. Die NEP zeigt in diesem Fall Peptidyldipeptidase-Charakter, ein Beispiel hierfür ist das [Leu]-Enkephalin Tyr–Gly–Gly–Phe–Leu mit Spaltung an der Gly–Phe-Bindung. Wenn die Aminosäure in P2’-Position zusätzlich hydrophoben Charakter hat [Quay, 94], ergeben sich sehr schnelle Abbaukinetiken, wie beim [Leu]-Enkephalin (k _cat/K _m = 43,9 min¹ mM¹). Die Bezeichnung „Neutrale Endopeptidase“ deutet jedoch darauf hin, dass es Peptide gibt, die die Anforderung nach einer freien Carboyxlfunktion in P2’-Position nicht erfüllen und dennoch ausgezeichnete NEP-Substrate sind. Inzwischen ist eine größere Anzahl an NEP-Substraten mit mehreren Aminosäuren C-terminal des P1’-Restes bekannt. Dies weist auf eine größere S2’-Bindungstasche hin, die wahrscheinlich wenigstens 4 weitere Aminosäuren aufnehmen kann. Mittlerweile wurden sogar so große NEP-Substrate gefunden wie das β-Amyloid-Peptid aus den Alzheimer-Plaques, das 42 Aminosäuren lang ist und C-terminal der hauptsächlichen NEP-Spaltstelle 33 Aminosäuren zählt. Diese C-terminalen Peptidketten können natürlich nicht mehr von der Bindungstasche aufgenommen werden, und reichen aus dem Molekül heraus. Wegen sterischer Hinderungen ist dies nur bei einer begrenzten Anzahl an Peptiden möglich.

Das kleinste identifizierte NEP-Substrat ist das chemotaktische Peptid formyl–Met–Leu–Phe, (mit Spaltung an der Met┼Leu-Bindung, K _m = 59 µM, k _cat = 3654 min^-1) [Connelly, 85]). Weitere gut charakterisierte Substrate und ihre Hauptspaltstellen sind in Tab. 1 aufgeführt.

Es gibt verschiedene fluorimetrische und colorimetrische Analysenverfahren zur Bestimmung der NEP-Aktivität, meist unter Verwendung synthetischer Substrate. In der vorliegenden Arbeit wird der Abbau von [D-Ala ²,Leu ⁵]-Enkephalin (DALEK) zur Aktivitätsbestimmung genutzt. Dieses Enkephalinderivat stellt ein sensitives, relativ spezifisches NEP-Substrat dar, bei dem die Hydrolyse durch Aminopeptidasen behindert ist, und das mittels HPLC quantitativ gut erfassbar ist [Winkler, 98a].

Wichtige physiologische Peptidsubstrate der NEP, deren hauptsächliche Spaltstellen und kinetischen Konstanten. Die K _m-Werte wurden aus der Arbeit [Matsas, 84b] entnommen. Das Symbol ┼ bezeichnet nachgewiesene initiale Spaltstellen. (n. b.: nicht bekannt).

Substrat

Aminosäure-Sequenz mit Spaltstellen

K _m [µM]

[Leu⁵]-Enkephalin

Tyr-Gly-Gly┼Phe-Leu

86,2

[Met⁵]-Enkephalin

Tyr-Gly-Gly┼Phe-Met

62,0

Substanz P

Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln┼Phe┼Phe-Gly┼Leu-Met-NH₂

31,9

Bradykinin

Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro┼Phe-Arg

92,2

Neurotensin

Glp-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro┼Tyr┼Ile-Leu

78,0

CCK-8

Asp-Tyr-Met-Gly┼Trp-Met-Asp┼Phe-NH₂

67,4

Angiotensin I

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro┼Phe-His-Leu

n. b.

Tab. 1: Physiologische Peptidsubstrate der NEP

Die im Jahr 2000 veröffentlichte Röntgenkristallstruktur der extrazellulären Domäne der humanen NEP bei 2,1 Å im Komplex mit Phosphoramidon hat viele der früheren Erkenntnisse aus Proteinchemie und Molecular Modelling bestätigt [Oefner, 00a]. Sie hat aber auch neue Aspekte der NEP-Struktur aufgezeigt und ein wesentlich detaillierteres Verständnis der Substratbindung sowie des katalytischen Mechanismus, vor allem aber ein effektiveres Design neuer Inhibitoren ermöglicht [Sahli, 04]. Die extrazelluläre NEP-Domäne besteht aus zwei separaten α-helikalen Untereinheiten, die durch verflochtene Peptidsegmente mit einander verbunden sind. Das größere N-terminale Segment (das im intakten zellgebundenen Enzym dem transmembranären Anker folgt) enthält die Zink-bindende Domäne sowie das katalytische Zentrum und zeigt die erwarteten Ähnlichkeiten mit dem bakteriellen Thermolysin (Abb. 2). Diese Zwei–Domänen–Struktur der NEP erklärt auch, warum das Enzym nur als Oligopeptidase arbeitet, während Thermolysin auch Substrate von Proteingröße spalten kann. Die kleinere C-terminale Domäne der NEP, die in Thermolysin fehlt, scheint den Zugang zum katalytischen Zentrum in der N-Domäne auf Peptide unter 50 Aminosäuren zu begrenzen.

Abb. 2: Röntgenkristallstruktur der NEP im Komplex mit Phosphoramidon.

Die Grafik wurde von einer Internetdatenbank [The Protein Data Bank, 04] generiert und basiert auf Daten aus der Arbeit [Oefner, 00b].

Die NEP ist ein weit verbreitetes, wenn auch nicht ubiquitär vorkommendes Enzym auf der Oberfläche von Säugetierzellen. NEP-artige Enzyme kommen auch in niederen Organismen wie Caenorhabditis elegans und Drosophila melanogaster vor. Bei Säugern unterliegt das Enzym in bestimmten Zellarten – z. B. auf Lymphozyten – einer entwicklungsabghängigen regulatorischen Kontrolle, in den meisten ist es jedoch konstitutiv vorhanden. Die bei weitem höchste Aktivität weist die NEP in der Bürstensaum-Membran der proximalen Tubuli und Glomeruli der Niere auf. Lunge, Darm, Plazenta, Prostata und der Plexus chorioides des Auges enthalten ebenfalls höhere NEP-Aktivitäten. In vielen weiteren Geweben und Zellarten, wie z. B. im Gehirn (siehe unten), den Ovarien, im Fettgewebe oder im Pankreas, tritt sie mit geringeren Aktivitäten in Erscheinung, kann dort aber ebenso wichtige Aufgaben erfüllen, auf die im Folgenden z. T. näher eingegangen wird. Im Blut und im Seminalplasma kommt die NEP in einer löslichen Form vor. Vermutlich wird sie hier durch unspezifische Abschilferungsprozesse (shedding [Soleilhac, 96a]) oder in Analogie zum ACE durch Sekretasen von den Zellmembranen der Blutgefäße bzw. der Leydig-Zellen in den Testes enzymatisch abgelöst.

Die besonders hohe Aktivität der NEP in der Niere und der Lunge versetzt das Enzym in die Lage, wichtige blutdruckregulierende Peptide wie ANP und den stärksten bekannten Vasokonstriktor, Endothelin-1, aus dem Blutkreislauf abzufangen und zu inaktivieren [Kenny, 88; Yamaguchi, 92]. Hierbei zeigt sich das oftmals ambivalente Verhalten der NEP, da das ANP erheblich zur Natriurese und damit zur Senkung des Blutdrucks beiträgt, wohingegen Endothelin-1 durch Verengung der Gefäße blutdrucksteigernd wirkt. Außerdem bewirkt das Enzym die Umsetzung von Angiotensin II zum vasodilatorischen und kardioprotektiven Angiotensin (1-7) und entzieht damit dem Blutkreislauf das vasokonstriktorische Angiotensin II. Aus solchen in vitro oder in einfachen physiologischen Abbauversuchen gewonnenen Erkenntnissen lässt sich jedoch nur bedingt die physiologische Hauptwirkung bei Hemmung des Enzyms vorhersagen. Im Fall der NEP-Hemmung zeigte sich eine blutdrucksenkende Wirkung. Der therapeutische Nutzen von NEP-Inhibitoren in der Bluthochdruck-Therapie wurde allerdings deutlich durch kombinierte Inhibitoren (mixed inhibitors), so genannte Vasopeptidase-Hemmer, übertroffen. In hypertensiven Tiermodellen sowie in klinischen Studien konnte die Wirksamkeit und Überlegenheit solcher kombinierten Hemmer der NEP und des ACE bzw. von NEP, ACE und ECE gegenüber reinen ACE-Hemmern belegt werden [Rouleau, 00; d'Uscio, 01]. Omapatrilat als erster Vertreter aus der Gruppe der ACE-/NEP-Inhibitoren wurde trotz seiner Überlegenheit gegenüber ACE-Inhibitoren bezüglich der Blutdrucksenkung wegen einer erhöhten Gefahr von Angioödemen durch die US-amerikanische Arzneimittelbehörde FDA nicht zugelassen.

Eine weitere wichtige Funktion übt die NEP beim Metabolismus chemotaktischer und proinflammatorischer Peptide aus, was z. B. bei Entzündungsprozessen der Lunge eine Rolle spielt, bei denen die Aktivität der NEP deutlich reduziert ist [Shipp, 91]. Im Zusammenhang mit Fällen von Prostatakrebs wurde eine dramatische Down-Regulation der NEP beobachtet. Dies legt auch einen Einfluss des Enzyms auf die Tumorgenese nahe [Papandreou, 98]. Die Beziehung der NEP zu leukämischen Erkrankungen ist seit der Identifikation als Oberflächenantigen CALLA (CD10) auf zahlreichen malignen Zellarten bekannt.

Anders als in der Peripherie, wo die NEP in den jeweiligen Organen meist gleichmäßig verteilt vorliegt oder im jeweiligen Organ auf bestimmte Regionen beschränkt ist, weist die NEP im ZNS ein wesentlich feineres Verteilungsmuster auf. Sie ist im Gehirn zwar weit verbreitet, allerdings mit deutlichen regionalen Unterschieden. Relativ hohe Aktivitäten finden sich in Striatum (Nucleus caudatus und Putamen), Tuberculum olfactorium, Substantia nigra, Globus pallidus, Nucleus accumbens sowie in der Substantia gelatinosa des Rückenmarks. Aber auch in Amygdala, Hippocampus, Hypophyse, Hypothalamus sowie im Stratum moleculare des Kleinhirns kommt sie in moderaten Aktivitäten vor [Roques, 93; Barnes, 88]. Dabei ist ihre Aktivität in den genannten Hirnregionen nicht gleichmäßig verteilt, sondern konzentriert sich innerhalb dieser Strukturen nochmals auf feinere Areale und Substrukturen, in denen sie relativ hohe Aktivitäten erreichen kann. Dieses neuroanatomisch sehr fein strukturierte Verbreitungsmuster, zusammen mit dem ebenfalls auf bestimmte Regionen konzentrierten Verteilungsmuster der endogenen NEP-Substrate, befähigt das Enzym, trotz weiter Verbreitung und großem Substratspektrum, je nach Region eine sehr unterschiedliche und spezifische Wirkung zu entfalten.

Die erste für die NEP erkannte physiologische Funktion überhaupt zeigte sich durch ihre synaptische, perisynaptische und axonale Lokalisation in den genannten ZNS-Regionen, welche ihr erlaubt, die physiologische Wirkung vieler peptidischer Neurotransmitter zu terminieren, die an gleicher Stelle freigesetzt werden oder zu ihren Rezeptoren diffundieren. Besonders trifft dies auf die Enkephaline (bzw. deren Rezeptoren) und die Substanz P zu, deren Immunreaktivitäten in Striosomen der striatonigralen Nervenbahn, einigen Nervenendigungen in der Substantia nigra sowie weiteren ZNS-Regionen mit der NEP kolokalisiert sind [Waksman, 86; Barnes, 93]. Auch die Inaktivierung von CCK, Bombesin, Neurotensin, NPY oder Somatostatin im ZNS ist an bestimmte, scharf abgegrenzte Hirnregionen gebunden. Diese sehr scharf regionalisierte Kolokalisation des Enzyms mit einem seiner Substrate hat vielfältige Auswirkungen auf spezifische physiologischen/pathophysiologische Prozesse wie Entzündungen, Schmerz, Nahrungsaufnahme oder den Missbrauch suchtauslösender Stoffe.

In den letzten 10 Jahren sind überdies noch zahlreiche weitere Substrate der NEP gefunden geworden, die auf vorher nicht bekannte physiologische und pathologische Bezüge zur NEP und damit potentielle therapeutische Angriffspunkte hinweisen. Einige davon werden in den folgenden Kapiteln beschrieben. An dieser Stelle sei lediglich das im ZNS vorkommende β-Amyloid-Peptid erwähnt, das in vivo von der NEP abgebaut wird und in den letzten Jahren wegen seiner Rolle bei der Alzheimerschen Krankheit im Mittelpunkt des Interesses vieler Peptidase-Forscher steht.

Aus der großen Anzahl möglicher NEP–Substrat–Interaktionen und den daraus resultierenden vielfältigen physiologischen und pathophysiologischen Funktionen dieses Enzyms befasst sich unsere Arbeitsgruppe mit den Auswirkungen der NEP auf das reproduktive System, das Herz-Kreislauf-System, das Körpergewicht, die Alzheimersche Erkrankung sowie die freiwillige Alkoholaufnahme. Viele dieser Untersuchungen wurden erst möglich durch die Verfügbarkeit von NEP-Knockout-Mäusen sowie reinem, löslichem Enzym und hochselektiven NEP-Inhibitoren.