Einfluss der Neutralen Endopeptidase auf Alzheimersche Erkrankung, Alkoholkonsum und Adipositas

Einfluss der Neutralen Endopeptidase auf Alzheimersche Erkrankung, Alkoholkonsum und AdipositasMatthias BeckerI123604#33345I - 1.I - 1.1.6I - 1.2.78I - 1.3.91011603#353I - 1.4.121314I - 2.1516II16II - 1.II - 1.1.1718604#214II - 1.2.19605#2722021605#22622II - 1.3.2324604#264II - 1.4.25604#35026II - 2.II - 2.1.II - 2.2.II - 2.2.1.II - 2.2.2.27II - 2.2.3.2829II - 2.3.30II - 2.4.31II - 2.5.II - 2.6.II - 3.II - 3.1.32605#293II - 3.2.33II - 3.2.1.343536II - 3.2.2.3738II - 3.2.3.II - 3.3.39604#604II - 4.II - 4.1.40414243444546II - 4.2.47604#37048III48III - 1.495051III - 1.1.52III - 2.III - 2.1.III - 2.2.III - 2.2.1.53III - 2.2.2.III - 2.2.3.54III - 2.3.55III - 2.4.III - 2.5.56III - 2.6.57289#128III - 3.III - 3.1.58III - 3.2.5960III - 3.3.III - 3.4.61604#423III - 3.5.62605#187III - 3.6.63III - 3.6.1.64607#329III - 3.6.2.65607#32866III - 4.6768III - 4.1.697071III - 4.2.7273III - 4.3.74IV74IV - 1.75IV - 1.1.76IV - 1.2.77787980IV - 1.3.818283IV - 1.4.IV - 2.IV - 2.1.IV - 2.2.84IV - 2.3.85IV - 2.4.86IV - 2.5.IV - 2.6.87IV - 2.7.IV - 2.8.88IV - 2.9.IV - 2.10.IV - 2.11.89IV - 2.12.IV - 3.IV - 3.1.90604#51791480#72092IV - 3.2.IV - 3.2.1.93607#249IV - 3.2.2.94IV - 3.2.3.95593#358593#36796IV - 3.3.IV - 3.3.1.97605#423IV - 3.3.2.98604#216IV - 3.3.3.99605#265IV - 3.4.100595#305IV - 3.5.101604#500IV - 3.6.102605#265IV - 3.7.IV - 3.7.1.IV - 3.7.2.604#392103IV - 3.8.IV - 3.8.1.104IV - 3.8.2.607#230105106IV - 4.IV - 4.1.107IV - 4.2.108109IV - 4.3.110IV - 4.4.111IV - 4.5.112IV - 4.6.113IV - 4.7.114115V116117118119VI119120121LiteraturverzeichnisEinfluss der Neutralen Endopeptidase auf Alzheimersche Erkrankung, Alkoholkonsum und Adipositas

Dissertationzur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Pharmazieeingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät Ivon
Matthias Becker geboren am 07.06.1974 in Ludwigslust

Präsident der Humboldt-Universität
Prof. Dr. Christoph Markschies

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD Prof. Dr. M. F. Melzig Prof. Dr. T. Walther Tag der mündlichen Prüfung: 17. Juli 2006 (Abstract deutsch)

Als Metallopeptidase mit einem großen Substratspektrum hat die Neutrale Endopeptidase (Neprilysin, EC 3.4.24.11, NEP) Einfluss auf so verschiedene Krankheiten oder pathophysiologischen Vorgänge wie Hypertonie, die Alzheimersche Erkrankung oder krankhafte Prostataveränderungen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Beziehungen der NEP zur Alzheimerschen Erkrankung sowie zu zwei weiteren pathophysiologischen Veränderungen – einem erhöhten Alkoholkonsum unter Stress sowie zu Adipositas/Übergewicht – eingehend untersucht. In Bezug auf die Alzheimersche Erkrankung wurde der Frage nachgegangen, warum Mäuse und Ratten keine vollständige Alzheimer-Symptomatik ausbilden. Dabei wurde ein verlangsamter Abbau des murinen beta-Amyloid-Peptids im Gegensatz zur humanen Form gefunden und biochemisch charakterisiert. Diese Befunde wurden durch den Nachweis, dass das murine im Gegensatz zum humanen Abeta-Peptid keine Amyloidfibrillen ausbildet, komplettiert. Am Modell der NEP-Knockout-Maus wurde in freiwilligen Trinkversuchen ein Alkoholverbrauch beobachtet, der dem von C57BL6-Wildtyp-Mäusen vergleichbar war. Nach einem kurzzeitigen sozialen Stress nahm jedoch der Alkoholkonsum der NEP-Knockout-Mäuse für ca. 3 Wochen deutlich und nach einem weiteren Stress sogar für mehrere Monate zu. An NEP-Knockout-Mäusen wurde überdies erstmals ein übergewichtiger Phänotyp beschrieben, der der menschlichen polygenetischen Adipositas sehr ähnlich ist. Dieser Phänotyp wurde eingehend physiologisch und biochemisch sowie in Abhängigkeit von verschiedenen Futtersorten (fettreiche bzw. Kohlenhydrat-modifizierte Nahrung) charakterisiert. In diesem Rahmen wurde erstmals die Hydrolyse des orexigenen Peptids Galanin durch die NEP beschrieben. Erste Erklärungsansätze für die Ausprägung des übergewichtigen Phänotyps bei NEP-Knockout-Mäusen sowie die Eignung dieses Tiermodells als Modell der komplexen humanen Adipositas werden diskutiert.

Neprilysin Alzheimersche Erkrankung Alkoholkrankheit Adipositas (Abstract english)

As a metallopeptidase with a large substrate spectrum neutral endopeptidase (Neprilysin, EC 3.4.24.11, NEP) influences diseases or pathophysiological states as different as hypertonia, Alzheimer’s disease or pathologic changes of the prostate. In this work the relations of NEP to Alzheimer’s disease and to two other pathophysiologic changes – an increased alcohol consumption under stress conditions as well as to adiposity/obesity – were examined in detail. Regarding Alzheimer’s disease the question was addressed why mice and rats do not show a complete Alzheimer’s pathology. The hydrolytic rate of the murine beta-Amyloid peptide was found to be decreased in contrast to the human form. The hydrolysis was further characterized by biochemistry. These findings were completed by the confirmation that murine abeta peptide does not form amyloid fibrils in contrast to the human peptide. By using the NEP knockout-mouse model in a free-choice drinking paradigm these mice showed an alcohol consumption comparable to that of C57BL6 wildtype mice. However, after a temporary social stress the alcohol consumption of the NEP knockout-mice increased for approx. 3 weeks and after a further stress it remained on a higher level for several months. Moreover, an obese phenotype of NEP knockout-mice was described here for the first time. This phenotype was found to be very similar to the human polygenetic adiposity. It was physiologically and biochemicaly characterized in detail as well as its dependence on different food types (high-fat and carbohydrate-modified diet). Within this work the hydrolysis of the orexigenic peptide galanin by NEP was described for the first time. A first explanatory approach to the development of the obese phenotype in NEP knockout-mice as well as the suitability of this animal model as a model of the complex human obesity is discussed.

neprilysin Alzheimer’s disease alcohol disease obesity Inhaltsverzeichnis

I Einleitung
- I - 1. Überblick über die NEP
  - I - 1.1. Geschichte
  - I - 1.2. Struktur und Moleküleigenschaften
  - I - 1.3. Aktivität und Spezifität
  - I - 1.4. Vorkommen und biologische Funktionen
- I - 2. Zielstellung und Problemdarstellung
II NEP und Alzheimersche Erkrankung
- II - 1. Einleitung
  - II - 1.1. Prävalenz und Pathologie der Alzheimerschen Erkrankung
  - II - 1.2. Entstehung und Biochemie des Aβ-Peptids
  - II - 1.3. Abbau des Aβ-Peptids
  - II - 1.4. Problemstellung der Arbeit
- II - 2. Methoden
  - II - 2.1. Peptide
  - II - 2.2. Amyloid-Inkubation
    - II - 2.2.1. Vorbereitung der Peptide
    - II - 2.2.2. Enzyme
    - II - 2.2.3. Inkubation
  - II - 2.3. HPLC-Analytik
  - II - 2.4. Massenspektrometrie (MS)
  - II - 2.5. Elektronenmikroskopie
  - II - 2.6. Statistik
- II - 3. Ergebnisse
  - II - 3.1. Abbauversuche
  - II - 3.2. Massenspektrometrie (MS)
    - II - 3.2.1. Inkubation von humanem Aβ (1-42):
    - II - 3.2.2. Inkubation von murinem Aβ (1-42):
    - II - 3.2.3. Inkubation von humanem und murinem Aβ (4-15):
  - II - 3.3. Elektronenmikroskopie
- II - 4. Diskussion
  - II - 4.1. Erklärungsansätze für die fehlende Alzheimer-Symptomatik bei Mäusen und Ratten
  - II - 4.2. Hydrolytische Angriffsstellen der NEP innerhalb von Aβ
III NEP und Alkoholkonsum
- III - 1. Einleitung
  - III - 1.1. Aufgabenstellung
- III - 2. Methoden
  - III - 2.1. Tierhaltung
  - III - 2.2. Trinkversuche
    - III - 2.2.1. Allgemein
    - III - 2.2.2. Trinkverhalten unter NEP-Inhibierung durch Candoxatril
    - III - 2.2.3. Trinkverhalten unter Einwirkung von sozialem Stress
  - III - 2.3. Enzym- und Blut-Analytik
  - III - 2.4. Enkephalinabbau
  - III - 2.5. Alkoholabbau-Kinetik nach intraperitonealer Verabreichung
  - III - 2.6. Statistik
- III - 3. Ergebnisse
  - III - 3.1. Präferenztests
  - III - 3.2. Ermittlung einer geeigneten Alkoholkonzentration und der Gesamttrinkmenge
  - III - 3.3. Alkoholabbau-Kinetik nach intraperitonealer Verabreichung
  - III - 3.4. Enkephalinabbau und Einfluss der Opioidrezeptoren
  - III - 3.5. Trinkverhalten unter NEP-Inhibierung durch Candoxatril
  - III - 3.6. Trinkverhalten unter Stress
    - III - 3.6.1. „1. Stressversuch“
    - III - 3.6.2. „2. Stressversuch“
- III - 4. Diskussion
  - III - 4.1. Die Rolle von CRH und anderen peptidischen Mediatoren
  - III - 4.2. Wechselseitige Beziehungen zwischen NEP, Alkoholaufnahme und Stressgeschehen
  - III - 4.3. Einfluss von NEP-Inhibitoren auf den Alkoholkonsum
IV NEP und Übergewicht
- IV - 1. Einleitung
  - IV - 1.1. Mögliche Ursachen für Übergewicht
  - IV - 1.2. Molekulare Regulation von Appetit und Nahrungsaufnahme
  - IV - 1.3. Bedeutung der NEP für peptidische Mediatoren
  - IV - 1.4. Aufgabenstellung
- IV - 2. Methoden
  - IV - 2.1. Allgemeine Bemerkung
  - IV - 2.2. Beschreibung der Tiergruppen
  - IV - 2.3. Versuchstiere und deren Haltung
  - IV - 2.4. Futtersorten
  - IV - 2.5. Bestimmung des Anteils von Körperfett, Muskelmasse und Extrazellularflüssigkeit am Gesamtkörpergewicht
  - IV - 2.6. Organgewichte, Blutparameter und Enzymaktivitäten
  - IV - 2.7. Leptin-Spiegel
  - IV - 2.8. Oraler Glucosetoleranz-Test (OGT)
  - IV - 2.9. Futterverbrauch
  - IV - 2.10. Energiehaushalt
  - IV - 2.11. Peptidabbau durch die NEP
  - IV - 2.12. Statistik allgemein
- IV - 3. Ergebnisse
  - IV - 3.1. Beschreibung des Phänotyps
  - IV - 3.2. Vergleich von pelletiertem und extrudiertem Futter (Gruppe 2)
    - IV - 3.2.1. Gewichtsentwicklung
    - IV - 3.2.2. Organgewichte
    - IV - 3.2.3. Diverse Parameter aus Blut bzw. Serum
  - IV - 3.3. Behandlung mit fettreicher und fettarmer Diät (Gruppe 4)
    - IV - 3.3.1. Anteil von Körperfett, Muskelmasse und Extrazellularflüssigkeit am Gesamtkörpergewicht
    - IV - 3.3.2. Prozentualer Anteil am Körpergewicht
    - IV - 3.3.3. Leptinspiegel (Gruppe 4)
  - IV - 3.4. Oraler Glucosetoleranz-Test (OGT)
  - IV - 3.5. Futterverbrauch (Gruppe 2)
  - IV - 3.6. Energiehaushalt
  - IV - 3.7. Zusammenhang von NEP-Aktivität und Körpergewicht
    - IV - 3.7.1. NEP-Aktivitäten im Hypothalamus wildtypischer Mäuse (Gruppe 2)
    - IV - 3.7.2. NEP-Aktivitäten in peripheren Organen übergewichtiger und normalgewichtiger Mausstämme (Gruppe 5)
  - IV - 3.8. Peptidabbau durch die NEP
    - IV - 3.8.1. CRH und GLP-1
    - IV - 3.8.2. Galanin
- IV - 4. Diskussion
  - IV - 4.1. Allgemeiner Phänotyp
  - IV - 4.2. Einfluss verschiedener Futtersorten
  - IV - 4.3. Anteil von Körperfett, Muskelmasse und Extrazellularflüssigkeit am Gesamtkörpergewicht
  - IV - 4.4. Biochemische Stoffwechselparameter
  - IV - 4.5. Energiebilanz (Futteraufnahme und Stoffwechselrate)
  - IV - 4.6. Orexigene und anorexigene Substrate der NEP
  - IV - 4.7. Zusammenhang von NEP-Aktivität und Körpergewicht
V Schlussbetrachtung und Ausblick
VI Synopsis
Literaturverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis (Auswahl)
Danksagung
Publikationen
Lebenslauf
Selbstständigkeitserklärung

Tabellen

Tab. 1: Physiologische Peptidsubstrate der NEP
Tab. 2: Amyloidosen
Tab. 3: Präferenztests für verschiedene Substanzen
Tab. 4: Gesamttrinkmenge
Tab. 5: Alkoholpräferenzratio aus dem 2. Stressversuch.
Tab. 6: Endogene Mediatoren (Neuropeptide, Neurotransmitter, Hormone) mit Effekt auf das Körpergewicht.
Tab. 7: Mittelwerte des Körpergewichts von NEP(+/+)- und (–/–)-Tieren (Gruppe 1).
Tab. 8: Statistischer Vergleich der Untergruppen aus dem Futtervergleich (Gruppe 2).
Tab. 9: Organgewichte und diverse Blutparameter der Tiere aus Gruppe 2.

Bilder

Abb. 1: Klassifikation der Hydrolasen der Untergruppe 3.4 (Peptidasen; modifiziert nach [McDonald, 86])
Abb. 2: Röntgenkristallstruktur der NEP im Komplex mit Phosphoramidon.
Abb. 3: A: Plaque-Herd, zum großen Teil aus β-Amyloid-Peptid bestehend. B: neurofibrilläre Tau-Bündel
Abb. 4: Amyloidfibrillen.
Abb. 5: Schematische Darstellung des humanen APP und des Aβ-Peptids.
Abb. 6: Spaltstellen innerhalb der Aβ-Sequenz.
Abb. 7: Vergleichende Gegenüberstellung des humanen und murinen Aβ (1-42).
Abb. 8: Abbau der murinen bzw. humanen Aβ-Peptidsequenzen.
Abb. 9: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von humanem (A und B) bzw. murinem Aβ (1-42) (C und D).
Abb. 10: Ergebnisse aus [Howell, 95] im Vergleich mit den hier beschriebenen Resultaten (in Analogie zur Abb. 7).
Abb. 11: Leu-Enkephalin-Abbau in ausgewählten Hirnregionen von NEP (–/–)- und NEP (+/+)-Mäusen.
Abb. 12: Effekte von Candoxatril nach oraler Verabreichung auf (A) den Alkoholkonsum, ausgedrückt als Präferenzratio, (B) die Gesamttrinkmenge, (C) die renale NEP-Aktivität und (D) die NEP-Aktivität im ZNS.
Abb. 13: „1. Stressversuch“: Präferenzratio vor (Tag 1-28) und nach Herausnehmen der Trennwand (Tag 39-57), sowie nach erneutem Angleichen der Ratios (ca. 3 Wochen nach Herausnehmen der Trennwand).
Abb. 14: Präferenzratio vor, während und nach zweier Phasen sozialen Stresses.
Abb. 15: A: Repräsentativer Phänotyp zweier Mäuse auf C57Bl/6-Hintergrund im Alter von 15 Monaten.
Abb. 16: Einzelwerte der Körpergewichte von Gruppe 1.
Abb. 17: Zeitlicher Verlauf des Körpergewichtes bei den Tieren der Gruppe 2.
Abb. 18: Zeitliche Entwicklung von Körper-, Fett- und Muskelmasse sowie freier Körperflüssigkeit bei den Tieren der Gruppe 4.
Abb. 19: Zeitliche Entwicklung der prozentualen Relation von Fett- bzw. Muskelmasse zur Gesamtmasse bei den Tieren der Gruppe 4.
Abb. 20: Korrelation der Leptinwerte (aus den Seren von Gruppe 2) mit dem Körpergewicht
Abb. 21: Oraler Glucosetoleranztest (OGT): Blutglucose-Konzentration 30 min sowie 10 min, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 5 h und 6 h nach oraler Glucoseapplikation in (A) Weibchen und (B) Männchen.
Abb. 22: Futterverbrauch (ad libitum) von pelletiertem bzw. extrudiertem Futter bei 6 und 12 Monate alten Tieren (Gruppe 2).
Abb. 23: Respiratorischer Quotient (RQ) und produzierte Wärmemenge pro Stunde.
Abb. 24: NEP-Aktivität in Organen von schwergewichtigen DU6i-Mäusen und dem Kontrollstamm DUKsi.
Abb. 25: Hydrolytischer Abbau von Galanin (A) durch Hirnmembranen von wildtypischen Mäusen und (B) durch aufgereinigte lösliche NEP.