2 Einleitung

↓2

2.1 Die Rolle von Legionella pneumophila als Krankheitserreger

2.1.1 Entdeckung von L. pneumophila

Im Jahre 1976 kam es in Philadelphia (USA) beim Veteranentreffen der American Legion zu einem, durch einen bis dato unbekannten Erreger verursachten, folgenschweren Ausbruch einer Pneumonie. Es wurden insgesamt 221 Personen infiziert, von denen 34 an der Erkrankung verstarben [74]. Nur 6 Monate nach der vermeintlich ersten Epidemie präsentierten McDade und Shepard ein Bakterium als ätiologisches Agens, das nach den Erkrankten und der Lokalisation in der Lunge als Legionella pneumophila benannt wurde [178]. Im Nachhinein konnten etliche Fälle dieser Lungenentzündung, der Legionärskrankheit, unbekannten Ursprungs mit Legionellen in Verbindung gebracht werden. Der bisher älteste beschriebene Fall geht auf das Jahr 1943 und auf die Spezies L. micdadei (früher als Tatlock-Stamm bezeichnet) zurück, wohingegen der erste L. pneumophila Stamm zwar 1947 isoliert, aber erst 1979 bestimmt werden konnte [126, 177]. Neben schwerwiegenden Pneumonien ist dem Erreger eine zweite, mildere Verlaufsform einer Infektion zuzuweisen, das sogenannte Pontiac Fieber. Die selbstlimitierende, Grippe ähnliche Krankheit, ohne Anzeichen einer Lungeninfektion, wurde nach dem Ausbruch einer fieberhaften Erkrankung von 144 Personen in Pontiac (Michigan) im Jahre 1968 benannt [111]. Ob es sich beim Erreger des Pontiac Fiebers allerdings um „lebendige“ Legionellen und nicht um die Inhalation toter Mikroorganismen, assoziierter Endotoxine und einer nur geringen Dosis an Legionella Bakterien handelt, ist nach wie vor umstritten [78].

2.1.2 Mikrobiologie und Ökologie

Wie von McDade, aber auch von Benson beschrieben, handelt es sich bei Legionellen um Gram negative, stäbchenförmige und obligat aerobe Bakterien, die polar oder lateral begeißelt sind [178, 25]. Gegenwärtig sind über 50 verschiedene Spezies des Genus Legionella beschrieben, von denen alleine L. pneumophila in mindestens 15 Serogruppen unterteilt werden kann [74, 25, 86]. Von diesen sind die Serogruppen 1, 4 und 6 am häufigsten mit einer Legionelleninfektion assoziiert. Neben L. pneumophila, verantwortlich für ca. 90% der Infektionen, wurden bislang 19 weitere Spezies als humanpathogen eingestuft [187]. Eine repräsentative, nationalweite Studie von 508 bestätigten Kulturen ambulant erworbener („community-acquired pneumonia“, CAP) Legionärskrankheit belegte, dass 91,5% der Fälle dem Erreger L. pneumophila, 3,9% L. longbeachae, 2,4% L. bozemanii und weitere L. micdadei, L. feeleii, L. dumoffi, L. wadsworthii und L. anisa zugeordnet werden konnten [309].

↓3

Wasser stellt das hauptsächliche Reservoir für Legionellen dar. Dabei spielen neben Süßwasserquellen, wie z. B. Seen, vor allem von Menschenhand erschaffene Wasser-reservoirs, so z. B. Wasserleitungen, Klimaanlagen, Kühltürme, Whirlpools und sogar Gemüsebefeuchtungsanlagen, eine Rolle [95, 261, 186, 24, 172]. Interessanterweise konnte die Spezies L. longbeachae und kürzlich auch L. pneumophila der Serogruppe 1 aus Blumenerde isoliert werden [228, 290]. Weiterhin wurden atmungsunterstützende Apparaturen mit nosokomial erworbenen Legionellenpneumonien in Verbindung gebracht [305]. Letztendlich stellen alle kontaminierten Wasserquellen, die Aerosole erzeugen können, potentielle Ausbruchsquellen dar, da diese neben einigen Fällen an Aspiration den Übertragungsweg der Bakterien repräsentieren [264].

Legionellen stellen hohe Anforderungen an ihr Nährmedium und benötigen Aminosäuren als primäre Energiequelle. Des Weiteren zeigen sie sich anfällig gegenüber freien Sauerstoffradikalen, weswegen bei der Anzucht Aktivkohle dem Medium zugesetzt wird [132]. Daraus ist ein Kulturmedium hervorgegangen, bestehend aus Hefeextrakt-Aktivkohleagar, L-Cysteinhydrochlorid, Eisenpyrophosphat, ACES-Puffer und α-Ketoglutarat mit einem finalen pH Wert zwischen 6,85 und 6,95 [84, 204, 79]. Diese Ansprüche an komplexe Nährstoffe sind in den vielfältigen Reservoirs, in denen Legionellen vorzufinden sind, nur sehr selten allgegenwärtig. Tatsächlich wurde belegt, dass sich die Bakterien vor allem im nährstoffreichen intrazellulären Raum in freilebenden Protozoen vermehren. Bisher wurden mindestens 15 verschiedene Spezies an Amöben, zwei begeißelte Protozoen und ein Schleimpilz (eine Amöbenunterart, hier Dictyostelium) als Replikationsort nachgewiesen [85, 116, 225, 249]. Weiterhin sind Spezies beschrieben, die sich ausschließlich in Amöben kultivieren lassen und demnach zuerst als „Legionella -like amoebal pathogens“ (LLAPs) bezeichnet, später aber immer wieder dem Genus Legionella zugeordnet werden konnten [2]. Eine zusätzliche Quelle komplexer Nährstoffangebote und somit ein möglicher Vermehrungsort der Bakterien außerhalb von Wirtszellen stellt der Biofilm dar. Legionellen konnten bereits in solchen Mikroorganismen-Konglomeraten nachgewiesen werden [221]. Eine Studie von Murga und Mitarbeitern belegte die Persistenz der Legionellen in Abwesenheit von Wirtszellen, eine Vermehrung fand aber nur nach Zugabe von Hartmanella ver m iformis statt [190]. Somit ist bis heute umstritten, ob sich die Bakterien auch außerhalb ihres Wirtes unter Umweltbedingungen vermehren können.

Neben dem Vorhandensein von Protozoen ist die Umgebungstemperatur für eine erfolgreiche Vermehrung der Legionellen ausschlaggebend. Trotz des relativ breiten Spektrums zwischen 25 und 42°C replizieren sie bei einer Optimaltemperatur von ca. 35°C [145]. Dies unterstützt die These, dass die meisten Legionellosefälle auf durch Menschen hergestellte Wasserquellen zurückzuführen sind. Bei diesen ist die durchschnittliche Temperatur höher als unter natürlichen Bedingungen. Zudem ist bewiesen, dass sich die Bakterien bei höheren Temperaturen besser intrazellulär replizieren können [256]. Dadurch kommt es zu einem Anstieg und zur Freisetzung der Bakterien, welches die Infektionslast der jeweiligen putativen Quellen deutlich erhöht.

2.1.3 Legionellose – Pathogenese, Diagnostik und Therapie

↓4

Manifestationen einer Legionärskrankheit können sowohl ambulanten oder nosokomialen, aber auch Reise assoziierten Ursprungs sein [166]. Sporadische oder auch epidemische Infektionen treten hierbei vor allem in den Sommer- und Herbstmonaten auf, da hier das Wachstum der Erreger durch warme Temperaturen gefördert wird (s. 2.1.2).

Durch Inhalation kontaminierter Aerosole gelangen die Erreger in die Lunge und replizieren in Makrophagen und Zellen des Epithelsystems [268]. Wie schwerwiegend eine solche Infektion verläuft, hängt neben der Quantität an eingeatmeten Erregern auch von dem Immunstatus des Patienten ab. Ältere Menschen, Suppression der respiratorischen Leistung und des Immunsystems, starkes Rauchen, aber auch das männliche Geschlecht stellen Risikofaktoren für eine Legionelleninfektion dar [40, 174]. Zudem wurde festgestellt, dass amöbenpassagierte Legionellen ein höheres Virulenzpotential besitzen als in Medium angezogene Bakterien und die Ko-Inokulationen beider Organismen (Legionellen + Amöben) schwerwiegendere Erkrankungen nach sich ziehen [59, 35].

Anhand klinischer Symptome ist es nicht möglich, eine Legionellenpneumonie von einer durch Pneumococcen ausgelösten Lungenentzündung zu unterscheiden. Unspezifische Symptome, wie z. B. Fieber, Übelkeit, Appetitlosigkeit und Kopfschmerzen oder auch Durchfall und mentale Verwirrtheit, sind häufig bei der Legionärskrankheit feststellbar [264, 40]. Hyponatriämie (ein zu niedriger Natriumspiegel im Blut) und alveoläre Infiltrate werden jedoch wesentlich häufiger als bei anderen Pneumonien diagnostiziert [264, 170]. Der Nachweis einer Legionelleninfektion geschieht vor allem durch Kultivierung der Bakterien. Zwar sind nicht alle Spezies auf diese Weise detektierbar, doch erlaubt die Methode, bei Zugabe spezieller Farbstoffe, die parallele Diagnose verschiedenster Legionellen [188]. Neben serologischer Testung, Gen-spezifischen PCRs und direkter Fluoreszenz-Antikörper Färbung hat sich der Urin-Antigen-Test als Detektionsmethode herauskristallisiert [207]. Dieser reagiert zwar fast ausschließlich mit L. pneumophila der Serogruppe 1, doch da diese für bis zu 90% der Legionellosen verantwortlich ist, gilt er heute als zuverlässige diagnostische Methode [86, 128].

↓5

Die Legionärskrankheit ist durch Antibiotikagabe heilbar, jedoch steigt die Mortalitätsrate durch verspätet angesetzte Therapie signifikant an [125]. Es wird daher empfohlen, in schwerwiegenden Pneumoniefällen ein gegen Legionellen gerichtetes Antibiotikum, auch ohne Legionellendiagnostik, in die Behandlung mit einzuschließen. Diese könnte Makrolide, Quinolone, Rifampicin oder auch Tetrazykline beinhalten [264]. Bis zum heutigen Datum ist noch kein multi-resistenter Legionellenstamm aufgetreten.

2.1.4 Epidemiologie und Prävention

Das Robert Koch-Institut berichtete in seinem infektionsepidemiologischen Jahrbuch meldepflichtiger Krankheiten für 2008 von insgesamt 522 Fällen einer Legionelleninfektion in Deutschland [1]. Das entspricht einer bundesweiten Inzidenz von 0,6 Erkrankungen pro 100.000 Einwohner (Vorjahr: 0,7). Von insgesamt 81,1% der gemeldeten Fälle konnten 95,5% L. pneumophila, die restlichen 4,5% anderen Legionella Spezies zugeordnet werden. Nur ca. die Hälfte der Infektionen mit L. pneumophila wurde subtypisiert und konnte zu insgesamt 82,7% als Vertreter der Serogruppe 1 definiert werden.

Es ist jedoch davon auszugehen, dass die Zahl der tatsächlichen Legionelleninfektionen die der gemeldeten deutlich übersteigt. Nach Angaben des Kompetenznetzwerks für ambulant erworbene Pneumonien („CAPNETZ“) wurde bei ca. 4% der insgesamt 2503 teilnehmenden Patienten eine Legionellenpneumonie festgestellt [295]. Dies würde, Hochrechnungen zur Folge, zwischen 15.000 und 30.000 Fälle sporadischer Lungenentzündungen bedeuten, die auf Legionellen zurückzuführen sind.

↓6

Eine Schutzimpfung wird bis dato nicht angeboten. Um den Bakterientiter nach Trinkwasserverordnung in öffentlichen Gebäuden (<100 CFU/100ml) so gering wie möglich zu halten, wurden folgende Präventionsmaßnahmen entwickelt: Erhitzen des Wassers (70-80°C), Kupfer-Silber-Ionisationsbehandlung und Hyperchlorierung, wobei von letzterem wegen der an Wasserleitungen entstehenden Korrosionsschäden vermehrt Abstand genommen wird [264, 187].

2.2 Lebenszyklus und Virulenzfaktoren von Legionella Bakterien

Rowbotham bemerkte erstmalig im Jahre 1986, dass sich der intrazelluläre Lebenszyklus von Legionella in zwei unterschiedliche Phasen gliedert [226]. Dies trifft auch auf extrazelluläre, in Medium kultivierte Bakterien zu [52]. Durch eine Verknappung des Nährstoffangebotes an Aminosäuren akkumulieren die Zellen das Alarmon ppGpp und treten von dem als „replikative Phase“ bezeichneten Zustand in die sogenannte „transmissive Phase“ über [117]. Zellen dieser Phase zeichnen sich phänotypisch durch Natriumsensitivität, Zytotoxizität, osmotische Resistenz und der Fähigkeit, Phago-Lysosomfusionen zu entgehen, aus [268].

Bei Kontakt mit einer Wirtszelle kommt es zur Aufnahme der Legionellen. Diese erfolgt größtenteils nach dem Mechanismus der „coiling“ Phagozytose, bei dem Pseudopodien die Bakterienzelle wie eine Spindel umschließen (s. Abb. 2.1, [137]), sie kann aber auch auf konventionelle Weise geschehen [214].

↓7

Abbildung 2.1: Übersicht des intrazellulären Infektionszyklus’ von Legionellen.

Dargestellt sind die verschiedenen Stadien einer Wirtszellinfektion durch Legionella Bakterien (A). Nachdem die Erreger mittels Phagozytose in die Wirtszelle aufgenommen wurden (B), verhindern sie die Phago-Lysosomfusion und replizieren in einem eigens modellierten Kompartiment, der Legionella-enthaltenen Vakuole (C). Nach Beendigung der Vermehrung treten die Bakterien in die transmissive Phase über. Durch Lyse der Wirtszellen werden die flagellierten Legionellen entlassen, bereit einen neuen Infektionszyklus zu starten. Bildquellen: A) http://microbewiki.kenyon.edu/images/a/a0/Legionella.png. B+C) [89].

Die dafür notwendige Adhäsion an die Wirtszelle kann durch das „major outer membrane protein“ (MOMP), gebunden an den Komplementrezeptor C3, vermittelt werden [21]. Da sich dieser jedoch nicht auf Protozoen befindet, werden komplementunabhängige Mechanismen, wie z. B. Lectinbindung (in Protozoenmembran) oder Typ IV Pili induzierte Adhäsion, diskutiert [291, 263]. Nicht ausschlaggebend für die Adhäsion, aber doch für eine gesteigerte Aufnahme ist das Typ IVB Sekretionssystem, welches die Schlüsselrolle der Virulenz von Legionella pneumophila übernimmt [129]. Das System wird von insgesamt 25 Genen des icm/dot Komplexes (intracellular multipl ication/defective for organelle trafficking) kodiert und ist in der Lage, sowohl DNA als auch eine enorme Anzahl an Proteinen in Wirtszellen zu injizieren [248, 294, 96]. Bis dato sind 145 verschiedene Effektorproteine beschrieben, denen, neusten Hochrechnungen zur Folge, noch einmal 150 unidentifizierte folgen könnten [196, 127, 51]. Damit kodieren schon heute ca. 5% der offenen Leseraster des L. pneumophila Genoms für Effektoren des Typ IVB Sekretionssystems. Es zeigte sich, dass das System an sich für die intrazelluläre Vermehrungsfähigkeit essentiell ist, die meisten Effektoren alleine aber keinen Einfluss auf die Viabilität der Bakterien im Wirtsorganismus ausüben [227, 26, 191, 62, 155]. Eine Gemeinsamkeit der Effektoren liegt in der Manipulation der Wirtszelle zur Etablierung einer replikativen Nische, der Legionella-enthaltenen Vakuole (Legionella-containing vacuole = LCV). Diese weist eine besondere Morphologie auf und fusioniert vorerst nicht, wie durch das endozytotische Netzwerk vorgegeben, mit säurehaltigen Lysosomen [135, 136]. Die so verhinderte Degradation sichert das Überleben des Erregers.

Die Bildung der spezialisierten Vakuole beginnt schon 5min nach erfolgter Phagozytose der Bakterien. In einem Zeitraum von ca. 2h binden vermehrt, dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) entstammende, Vesikel und auch Mitochondrien an der Phagosomenoberfläche und hüllen diese bis zu 98% ein [279, 218]. Im Anschluss erfolgt die Anlagerung von Ribosomen und die Veränderung der ursprünglichen Plasmamembran in eine ER-ähnliche Struktur. Die Abschottung der LCV durch Vesikel und Ribosomen wurde als möglicher Mechanismus zur Verhinderung der Phago-Lysosomfusion diskutiert, konnte aber experimentell nicht belegt werden, da z. B. Mutanten im sidC Gen oder auch L. micdadei kein ER rekrutieren, sich aber intrazellulär vermehren können [211, 106]. Dies wurde durch icmS oder icmW Mutanten bestätigt, die zur Anlagerung von ER-Vesikeln befähigt sind, trotz allem aber einer Fusion der LCV mit Lysosomen nicht entgehen können [60].

↓8

Für die Rekrutierung vesikulärer Partikel oder Störung des Transportweges wurde eine Reihe Typ IVB sekretierter Proteine beschrieben [96, 41] und ihr Mechanismus und eukaryontische Interaktionspartner im Detail untersucht. Zu ihnen gehören die Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) RalF und SidM/DrrA, die durch Bindung an die kleinen GTPasen ARF und Rab1 den vesikulären Transport umleiten [191, 171, 189]. Neben der Beeinflussung sekretorischer Wege wurden andere Effektorproteine wie SidF und SdhA mit der Inhibition bzw. dem verspäteden Auslösen von Apoptose in Verbindung gebracht [16, 159].

Die LCV wird solange aufrechterhalten, bis die Legionellen ihre replikative Phase abgeschlossen haben und Nährstoffe knapp werden. Mit Übergang in die transmissive Phase kommt es durch Expression zytolytischer Faktoren wie IcmT oder durch einen nicht-zytolytischen Weg, vermittelt durch LepA und LepB, zum Austritt der Bakterien aus ihrer Wirtszelle [6, 184, 57]. Interessanterweise zeigen sich Legionellen dieser Phase neben den bereits erwähnten Merkmalen auch säureresistent. Dies ist notwendig, da Phagosomen bestimmter Zelltypen trotz anfänglicher Blockierung der Lysosomenfusion nach 12 bis 24h Infektionszeit lysosomale Marker rekrutieren und eine Absenkung des pH Wertes aufweisen [265]. Die nun ausgetretenen Bakterien sind zudem flagelliert und somit in der Lage, neue Wirtszellen zu erreichen und diese als neue Replikationsnische auszubeuten.

Neben den Effektoren und ihrem Typ IVB Sekretionssystem sind weitere Virulenzfaktoren von L. pneumophila beschrieben worden. Zu diesen zählen der „macrophage infectitvity potentiator“ Mip und das Lsp Typ II Sekretionssystem, welches unter anderem auch hydrolytische Enzyme, wie z. B. Phospholipasen, transportiert [58, 223, 13]. Da in der vorliegenden Arbeit eine zell-assoziierte Phospholipase von Legionella charakterisiert wurde, werden in den folgenden Abschnitten die Reaktionsmechanismen und Einflüsse lipolytischer Enzyme auf die Pathogenität von Bakterien näher erläutert.

2.3 Phospholipasen und Pathogenität

2.3.1 Eigenschaften und Klassifizierung von Phospholipasen

↓9

Lipasen und ihre Untergruppe, die Phospholipasen, stellen eine diverse Gruppe an Enzymen dar, die mit einer Vielzahl an Lipidsubstraten reagieren können. Dabei kommt es durch die katalytischen Eigenschaften der Enzyme zur Spaltung einer oder mehrerer Ester-Verbingungen im Lipidmolekül.

Neutrale Lipasen hydrolysieren bevorzugt Azylesterbindungen aus langkettigen Mono-, Di- oder Triglyzerolen und setzen Fettsäuren frei [202]. Phospholipasen hingegen agieren vor allem mit polaren, amphipatischen Molekülen, den Phospholipiden. Diese Lipidgruppe stellt die hauptsächliche Komponente von sowohl eukaryontischen als auch prokaryontischen Zellmembranen dar. Neben der strukturgebenden Funktion übernehmen Phospholipide eine Vielzahl anderer Aufgaben, z. B. bei der Kompartimentierung von Zellorganellen, der Energiespeicherung durch Ladungstrennung (Membranpotential), der Schutz- und Atmungsfunktion als Lipidschicht im ‚Lungensurfactant’, aber auch bei der intrazellulären Signaltransduktion durch Freisetzung von Botenstoffen („second messenger“) auf Lipidbasis.

Die Anzahl an verschiedenen Lipidgruppen, z. B. Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidyl-glyzerol (PG) und deren asymmetrische Verteilung in der Phospholipiddoppelschicht diskriminiert nicht nur Bakterien von eukaryontischen Zellen, sondern auch bakterielle Gruppen untereinander. So setzen sich die Zellmembranen von E. coli oder B. subtilis vor allem aus Phosphatidylethanolamin (PE) und PG zusammen [201], die der Legionellen enthält dagegen einen höheren Anteil an PC (~43%), dem hauptsächlichen Phospholipid der äußeren Hülle eukaryontischer Doppelschichten [201, 258, 73]. Zur Modellierung ihrer eigenen Membranstruktur, aber auch zur aktiven Beeinflussung der Funktion ihrer Wirtszellen haben pathogene Bakterien (Clostridium perfringens), aber auch Pilze (Cryptococcus neoformans), parasitäre Protozoen (Toxoplasma gondii) und Viren (Adeno-associated virus type 2) eine Reihe phospholipolytischer Enzyme mit unterschiedlichen Substratspezifitäten entwickelt, um sich ihrer biologischen Nische entsprechend für eine erfolgreiche Vermehrung und Persistenz anzupassen [11, 63, 55, 110, 217].

↓10

Dabei können die verschiedenen Enzyme bezüglich ihrer Spaltstellen im Lipidsubstrat, aber auch auf Grund ihrer homologen Sequenzblöcke in folgende Gruppen zusammengefasst werden:

1) Klassifizierung von Phospholipasen aufgrund ihrer Substratspezifität

Es sind 4 Arten von phospholipolytisch aktiven Proteinen beschrieben, die bezüglich ihrer Spaltstelle im Lipidsubstrat durch den Anhang A-D gekennzeichnet sind. Phospholipasen A (PLA) spalten die Azylesterbindung entweder an sn-1 (PLA1) oder sn-2 (PLA2) Position des Lipidmoleküls, wo hingegen Phospholipasen B (PLB) an beiden Stellen wirken können (s. Abb. 2.2). Wird eine der veresterten Fettsäuren freigesetzt, entsteht ein zytotoxisches Lysophospholipid. Dieser Bestandteil kann durch eine Lysophospholipaseaktivität (LPLA) in die verbleibende Fettsäure und den Glyzerol-Phosphoesterrest hydrolysiert werden (s. Abb. 2.3). In vielen Fällen besitzen PLAs ebenfalls eine LPLA Aktivität, so z. B. die Enzyme von L. pneumophila oder ExoU, ein sekretiertes Toxin aus P. aeruginosa [13, 205, 271].

↓11

Phospholipasen C (PLC) und D (PLD) sind durch die Spaltung des Phosphodiesters eines Phospholipids charakterisiert (s. Abb. 2.2). Dabei setzt eine PLC das Lipidsubstrat in 1,2-Diazylglyzerol und einen Alkohol-Phosphomonoester um, die Aktivität der PLD hinterlässt hingegen Phosphatidsäure und einen entsprechenden Amino- oder Zuckeralkohol.

Abbildung 2.2: Strukturelle Eigenschaften eines Glyzerophospholipids und die Angriffsorte der Phospholipasen A-D:

Phospholipasen A und B hydrolysieren die Azylesterbindung des Lipidmoleküls, Phospholipasen C und D die Phosphoesterbindungen. Bei der Hydrolyse eines Lipids durch eine PLA2 entstehen ein 1-Azyl-Lysophospholipid und eine freie Fettsäure. Bildquelle [22].

Abbildung 2.3: Angriffspunkt einer Lysophospholipase im Lipidmolekül. 

Durch die Hydrolyse des Lysophospholipids mittels einer Lysophospholipaseaktivität wird die verbleibende Fettsäure freigesetzt und es entsteht Glyzerol-3-Phosphat, welches einen Alkoholrest verestert an der Phosphatseitengruppe tragen kann. Bildquelle [22].

↓12

Eine weitere Untergruppe der Phospholipide stellen die Sphingophospholipide dar. Hier bildet jedoch nicht Glyzerol, sondern Sphingosin das Rückgrat des Lipidmoleküls, an welches der Phosphoester gebunden ist. Bei der Spaltung von Sphingomyelin durch ein PLC entsteht so Phosphorylcholin und Ceramid, ein wichtiger „second messenger“. Als Beispiel einer Spingomeylinase und PLC Aktivität in einem Enzym sei hier das α-Toxin von C. perfringens genannt [284].

2.) Klassifizierung von Lipasen anhand homologer Sequenzblöcke

Da, wie bereits erwähnt, verschiedene Aktivitäten (PLA/LPLA) in einem Enzym enthalten sein können, ist die Klassifizierung nach der Substratspezifität ein oft langwieriger Prozess. Aus diesem Grund wurde durch Arpigny und Jaeger eine weitere Einordnung der unterschiedlichen bakteriellen Enzyme anhand homologer Proteinsequenzabschnitte vorgeschlagen und insgesamt acht Familien postuliert [9]. Allen Familien gemein ist das aktive Zentrum, welches aus drei essentiellen Aminosäuren gebildet wird. Diese katalytische Triade besteht aus einem nukleophilen Serin/Cystein oder Aspartat, einer sauren Aminosäure (Aspartat oder Glutamat) und einem aktiven Histidinrest. Die Familie I dieser Einteilung, die der „wahren“ Lipasen, beinhaltet eine Vielzahl an Enzymen unterschiedlicher Herkunft und Größe, die im Weiteren in bis zu sechs Unterfamilien gruppiert wurden, sich aber alle durch das Vorhandensein eines konservierten Pentapeptides aus GXSXG auszeichnen. Die konservierte Domäne umschließt hier das aktive Serin einer katalytischen Triade mit Aspartat und Histidin und ist keine Besonderheit bakterieller Enzyme, sondern in vielen Lipasen eukaryontischen Ursprungs hoch konserviert [142]. Mitglieder der Familie II lipolytischer Enzyme gehören den sogenannten GDSL-Hydrolasen an. Diese unterscheiden sich von der gängigen Konsensussequenz um das aktive Serin durch die aminoterminale Aminosäureabfolge FGDSLS, die kurz als GDSL-Motiv bezeichnet wird [283]. Die Sequenz ist in einem von insgesamt fünf konservierten Blöcken enthalten, die weitere essentielle Aminosäuren für die Ausbildung einer katalytischen Triade bereitstellen [43]. Eine weitere Besonderheit der GDSL-Enzyme ergibt sich durch das sehr flexible aktive Zentrum, welches nach einem Mechanismus des „induced fit“ Modells nicht nur die Spaltung von Lipiden, sondern auch die von Proteinen erlaubt [4, 164]. Enzyme der Familien III bis V zeigen entweder Homologien zur Plasmaisoform der humanen „platelet-activating factor“ Azetylhydrolase, zu Sequenzblöcken der humanen hormonsensitiven Lipase (HSL) oder zu einer Reihe von nicht-lipolytischen Enzymen, wie z. B. Epoxidhydrolasen oder Dehalogenasen [9]. Sowohl Familie IV, als auch die Mitglieder der Gruppe V werden von psychrophilen, mesophilen, aber auch thermophilen Bakterien exprimiert. Kleine Esterasen (23-26 kDa) wurden in Familie VI zusammengefasst, wo hingegen Familie VII eher aus großen Proteinen (55 kDa) und Familie VIII letztendlich aus Enzymen bestehen, die Homologien zu Klasse C β-Laktamasen aufweisen.

↓13

Die Enteilung nach Arpigny und Jaeger beinhaltet jedoch nicht eine weitere Gruppe von bakteriellen Lipasen, die stark konservierte Bereiche mit einer eukaryontischen Phospholipase A, dem Kartoffelpatatin, besitzen [8, 15]. Obwohl das katalytisch aktive Serin in dem weit verbreiteten Motiv GXSXG auftritt, nehmen die Patatin-ähnlichen Proteine (PLP) mit der Ausbildung einer katalytischen Diade aus Serin und Aspartat eine Sonderrolle innerhalb der bakteriellen Phospholipasen ein [231]. Interessanterweise kodieren Bakterien, die als Symbionten oder Pathogene eng mit der Eukaryontenzelle in Kontakt stehen auch für eine Vielzahl an PLPs (z. B. Legionella pneumophila = 11, Mycobacterium tuberculosis = 8, Bradyrhizobium japonicum = 8).

In dieser Arbeit konnte eine weitere Klasse an Phospholipasen begründet werden. Diese sich an die GXSXG-tragenden Familien anlehnende Gruppe sticht durch die Besonderheit der Aminosäuresequenz um das aktive Serin, THSTG, aber auch um die der katalytischen Triade zugehörigen Reste Aspartat und Histidin deutlich hervor [23].

2.3.2 Faltung und Wirkmechanismus von Phospholipasen

Bis auf wenige Mitglieder der Familie II lipolytischer Enzyme bilden die meisten Lipasen durch 8 fast parallel zueinander liegenden β-Faltblättern, verbunden mit α-Helices, die namensgebende α/β-Faltung aus [198]. Charakteristisch hierbei ist der „nukleophile Ellenbogen“, der durch eine besondere Anordnung eines β-Faltblattes und der nachstehenden Helix den aktiven Serinrest regelrecht nach außen streckt (s. Abb. 2.4).

↓14

Abbildung 2.4: Übersicht der drei essentiellen Aminosäuren der katalytischen Triade und Darstellung der Position des „nucleophilic elbow“[245].

Dargestellt ist die katalytische Triade am Beispiel der Lipase aus Candida rugosa mit den aktiven Aminosäuren Serin, Glutamat und Histidin. Deutlich zu sehen ist die Exposition des aktiven Serinrestes. Durch die abgeknickte Konformation des „nucleophilic elbow“ wird der nukleophile Angriff des Sauerstoffatoms sterisch unterstützt.

Trotz der Exposition des einen aktiven Restes weisen die meisten Lipasen/Phospholipasen erst eine erhöhte Aktivität auf, wenn sie mit Wasser-Lipid-Grenzflächen in Kontakt treten [70, 46]. Durch die sogenannte lipidinduzierte Grenzflächenaktivierung kommt es zur Konformationsänderung des PLA-Moleküls und zur Öffnung einer als „Deckel“ das aktive Zentrum bedeckenden, helikalen Struktur. Damit wird die Reaktionstasche dem Substrat zugänglich gemacht und der nukleophile Angriff durch das Sauerstoffatom des Serinrestes an das Carbonylkohlenstoffatom des Substrates kann erfolgen. Als Protonenakzeptor dient der aktive Histidinrest, der wiederum durch die negativ geladene Seitengruppe des Aspartates im Elekronenüberschuss stabilisiert wird. Das erste von zwei tetrahedralen Intermediaten, das sogenannte „oxyanion hole“, wird durch Rückgratatome stabilisierender Aminosäuren aufrechterhalten. Der die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmende Zerfall des Komplexes in das Azyl-Enzymintermediat und einen Alkoholrest geht anschließend durch die Bindung eines Wassermoleküls an den Carbonylkohlenstoff der Azyl-Enzymverbindung in den entscheidenden Prozess der Hydrolyse über. Durch die Ausbildung eines ähnlichen zweiten tetrahedralen Komplexes kommt es zur Abspaltung der Carbonsäure und zur Wiederherstellung des Grundzustandes des aktiven Zentrums.

2.3.3 Phospholipasen als bakterielle Virulenzfaktoren

Gegenwärtig gelangt eine Vielzahl an Phospholipasen in den Focus der Wissenschaft, da sie durch ihre hydrolysierenden Eigenschaften gegenüber Phospholipiden, dem Hauptbestandteil aller Zellmembranen, zur immensen Zellzerstörung während eines Infektionsprozesses beitragen können (s. Abb. 2.5). So ist ExoU, eine sekretierte Patatin-ähnliche Phospholipase aus P. aeruginosa, ein wesentlicher Bestandteil bei der Beschädigung des Lungenepithels in vivo [87]. Es ist dabei aber nicht zu vernachlässigen, dass Phospholipasen auch indirekt, durch die Generierung von zytotoxischen Lysophospholipiden, die Membranen destabilisieren können und durch die so entstehende Ionenpermeabilität zur osmotischen Lyse der Zelle beitragen [299].

↓15

Neben der hydrolytischen Wirkung und daraus resultierender Zelllyse ist es Phospholipasen aber auch möglich, auf andere Weise Einfluss auf den Infektionsvorgang zu nehmen. Die Phospholipase PLB1 aus Cryptococcus neoformans trägt maßgeblich zur erfolgreichen Adhäsion des Pilzes an A549 Lungenepithelzellen bei [104]. Die Autoren begründen dies in der Anreicherung von freien Fettsäuren, die wiederum die Bindeeigenschaften des Surfactant-Proteins D (SP-D) für Kohlenhydratreste des adhärierenden Pilzes positiv beeinflussen [104, 71, 162].

In den vergangenen Jahren kristallisierte sich zudem ein ganz anderer Beitrag der lipolytischen Aktivität zur Virulenzsteigerung verschiedener Pathogene heraus, die Induktion immunmodulatorischer Prozesse (s. Abb. 2.5). Clostridium perfringens α-Toxin z. B. induziert die Expression des Endothelzell-Leukozyten-Adhäsions-Moleküls (ELAM-1), des Interzellulären-Leukozyten-Adhäsions-Moleküls (ICAM-1), des Chemoattraktants Interleukin-8 (IL-8) und der vasoaktiven Moleküle PAF und Prostazyklin [45, 49]. Die Akkumulierung von Arachidonsäure und die daraus resultierenden Syntheseprodukte Prostaglandin, Leukotrien und Thromboxan kommen durch die Abspaltung der Carbonsäure durch Phospholipase A Aktivität zustande. ExoU, welche diese Aktivität aufweist, wurde bereits als potenter Stimulator der Arachidonsäure- und Prostaglandinakkumulierung beschrieben [234].

Abbildung 2.5: Übersicht der möglichen Wirkmechanismen von Phospholipasen während der Infektion von Wirtszellen.

Dargestellt sind Effekte phospholipolytischer Aktivität während des Infektionsprozesses. Schwarze und lila Pfeile markieren Produkte hydrolytischer Aktivität und die daraus resultierenden Effekte (adaptiert aus Bender and Flieger, 2009).

↓16

Bei C. perfringens α-Toxin, einer PLC, benötigt die Induktion der Thromboxan, Leukotrien- und Prostaglandinexpression die Aktivierung einer zellulären PLA2 [100, 182]. Dies geschieht durch das Spaltprodukt Diazylglyzerol [240]. Die Akkumulierung dieses Lipidsignalmoleküls kann entweder direkten Einfluss auf die Aktivierung der zellulären PLA2 nehmen [50] oder durch eine Zwischenstufe der Stimulierung einer Proteinkinase C zur Induktion des endogenen Enzyms führen [81]. Die Ausschüttung der Mediatoren wie Prostaglandin und Thromboxan erhöhen die Entzündungsreaktion, die Membranpermeabilität und Durchlässigkeit des vaskulären Systems und fördern somit die Verbreitung der pathogenen Organismen in ihrem Wirt.

Ebenfalls immunstimulierend induziert ExoU aus P. aeruginosa die Expression und Sekretion von IL-8, Staphylococcus aureus β-Toxin hingegen vermindert die Ausschüttung des Chemokins [65, 269]. Die Komplexität dieser Effekte zeigt, dass einige Pathogene, in Abhängigkeit von einer Phospholipase, die Zerstörung des Gewebes durch Anlockung und Aktivierung von Leukozyten vorantreiben [242], andere wiederum die zelluläre Immunantwort verhindern, um sich in ihrer geschaffenen Nische optimal vermehren zu können.

Im nachfolgenden Abschnitt werden einzelne Beispiele für Phospholipasen als Virulenzfaktoren extra- und intrazellulärer Bakterien näher vorgestellt.

2.3.3.1 Phospholipasen als Virulenzfaktoren von extrazellulären Bakterien

↓17

Extrazellulär replizierende Pathogene sehen sich einer immensen Abwehrmaschinerie ihres Wirtes gegenüber, doch werden sie teilweise nur geringfügig davon betroffen. Im Gegenzug verwenden sie die Immunstimulierung, z. B. abhängig von phospholipolytischer Aktivität, um sich an die jeweiligen Bedingungen anzupassen und eine Replikationsnische zu schaffen.

I. Clostridium perfringens α-Toxin fördert die Bedingungen für anaerobes Wachstum

C. perfringens, der Erreger des Wundbrandes, ist ein anaerob wachsendes, sporenbildendes Bakterium, welches durch Infektion verletzten Gewebes schwerwiegende Nekrosen hervorrufen und im Falle einer Ausbreitung der Bakterien in den Blutstrom eine Sepsis und den Tod zur Folge haben kann [280]. Die Phospholipase C, auch als α-Toxin bezeichnet, wurde als der hauptsächliche Virulenzfaktor für die Entwicklung der Krankheit beschrieben [11]. Insertionsmutanten des Gens zeigen reduziertes Virulenzverhalten in einem Maus-Nekrosemodell, ohne die determinierenden Anzeichen, wie z. B. ein Anschwellen und Verdunkeln der Füße, nach bakterieller Infektion. Weiterhin konnte gezeigt werde, dass eine Mausinfektion mit aufgereinigtem α-Toxin tödlich verlief [262]. Das Enzym setzt sich aus einer N-terminalen Domäne mit PLC und Sphingomyelinaseaktiviät zusammen, entwickelt seine zytolytischen Eigenschaften aber erst durch eine C-terminal vermittelte und Ca2+-abhängige Membraninsertion [154, 194].

↓18

Trotz der Fähigkeit zur Membranzerstörung [281] wird gegenwärtig angenommen, dass eher sublytische Mengen des Toxins die Immunantwort modulieren [282]. Wie bereits erwähnt, stimuliert das Enzym die Sekretion von ELAM-1, ICAM-1 und IL-8. Es wird vermutet, dass die Sekretion dieser Mediatoren zur Anlockung und Festsetzung von Neutrophilen an der Endotheloberfläche dient und so die zell-vermittelte Zerstörung des Gewebes vorangetrieben wird [45]. Interessanterweise zeigte sich schon 1917, dass Leukozyten nicht zum Ort des Geschehens vordringen und auch im Mausmodell war die Abwesenheit dieser Zelltypen an der infizierten Stelle beobachtet worden [280, 11]. Im Weiteren wurde festgestellt, dass α-Toxin maßgeblich an der Aggregation von Thrombozyten und Neutrophilen in vitro und in vivo beteiligt ist und die Expression des thrombozytenaktivierenden Faktors (PAF) induziert [266, 44, 49]. Zusätzlich konnte die Stimulierung der Arachidonsäurekaskade auf die Aktivität des Toxins zurückgeführt werden [115]. Alles in allem kommt es so durch Störung der vaskulären Homöostase zu erhöhter Gefäßpermeabilität und durch die Aggregation der angelockten Neuthrophilen und Thrombozyten zur lokalen Verstopfung des Gefäßsystems [44]. Dies führt letztendlich zu den für den Gasgangrän typischen Ödemen und zur Abschottung einer anoxischen Umgebung, essentiell für die Vermehrung eines obligat anaeroben Bakteriums.

II. PldA von H elicobacter pylori unterstützt die Adaption des Bakteriums an das saure Milieu im Magen

Das Gram-negative, microaerophile Bakterium H. pylori ist mit einer Vielzahl an gastrointestinalen Erkrankungen, wie z. B. chronischer Gastritis, Magen- oder Zwölfinger-darmgeschwüren oder auch Drüsenkrebs assoziiert [77]. Nach oraler Aufnahme kontaminierter Lebensmittel kolonisiert das Pathogen die Schleimhaut des menschlichen Magens und führt durch Ausschüttung einer Urease zu lokal pH neutralen Bedingungen, um sich replizieren zu können [56]. Doch nicht nur die Expression von Urease wird in Zusammenhang mit der Adaption von H. pylori an die harschen Umweltbedingungen gebracht, sondern auch die Veränderung der eigenen Lipid- oder der LPS-Zusammensetzung [48, 179]. Dies ist darauf zurückzuführen, dass H. pylori den Anteil an Lysophospholipiden von <2% der normalen (L) Variante auf >50% in der Lyso-(S)-Variante verändern kann [274]. Die Zugabe von HCl zum Kulturmedium führte hierbei zur spontanen Ausbildung der Lysovariante mit erhöhten hämolytischen, adhesiven und invasiven Eigenschaften [48]. Weiterführende Experimente zeigten, dass dies auf die Aktivierung der Phospholipase A PldA zurückzuführen ist, Mitglied einer Gruppe homologer Proteine, die in den äußeren Membranen von vielen Gram negativen Bakterien lokalisiert sind [273, 257]. Durch Wachstum von H. pylori unter sauren pH Bedingungen kommt es während der DNA Replikation zum Sprung in einem homopolymeren Abschnitt des pldA Gens und so zur Expression des Volllängentranskriptes, welches bereits 1999 als hämolytisches Enzym mit Phospholipase A2 Aktivität beschrieben wurde [273, 76]. Hierbei zeigte sich auch, dass der generierte pldA Deletionsstamm in seiner Fähigkeit, Mäuse nach 2 und 8 Wochen zu kolonisieren, inhibiert war. Die immense Bedeutung von PldA im Infektionsprozess wurde 2005 noch verdeutlicht, als Tannaes und Mitarbeiter in 40 untersuchten Patientenisolaten einen direkten Zusammenhang zwischen der Phospholipaseaktivität und dem Auftreten von Magengeschwüren aufzeigen konnten [272]. Dahinter steht die Vermutung, dass ein erhöhter Lysophospholipidanteil zu vermehrter Membranpermeabilität führt. Somit können pH verändernde Enzyme, wie die Urease, leichter die Membran passieren, den Protoneninflux und die Eliminierung des Bakteriums unterdrücken und zu einer toleranteren Vermehrungsumgebung beitragen [273]. Dies wurde zumindest teilweise bestätigt, da Lysovarianten mit gesteigerter PldA Aktivität und höherem Lysophospholipidanteil eine erhöhte Ausschüttung von Urease in den extrazellulären Raum aufwiesen [48].

↓19

III. Pseudomonas aeruginosa ExoU weist zytotoxische und immunmodulatorische Eigenschaften auf

Der ubiquitär vorkommende Boden- und Wasserkeim P. aeruginosa zeigt ein breites Wirtsspektrum von Mensch, Tier und Pflanze auf. In immunsupprimierten oder an zystischer Fibrose leidenden Menschen können Infektionen zu schwerwiegenden Pneumonien oder septischen Erkrankungen führen und somit P. aeruginosa als bedeutsamen nosokomialen Erreger ausweisen [235]. Nach Eintritt in die oberen Atemwege kann sich das Pathogen durch seine zytolytischen und zell-manipulierenden Eigenschaften sehr schnell im Blutkreislauf ausbreiten [149]. Bei immunmodulatorischen Prozessen spielen auch die 3 bisher identifizierten Phospholipasen C eine Rolle [18, 152, 276], es soll im Folgenden jedoch auf die Phospholipase A ExoU eingegangen werden.

Als Effektor des Typ III Sekretionssystems (TTSS) wird ExoU direkt in die Wirtszelle injiziert, um dort durch Lipiddegradation Einfluss auf die zellulären Prozesse zu nehmen [97]. Das Enzym wurde als zytotoxisch gegenüber einer Vielzahl an Zelltypen in vitro und in vivo beschrieben, was sich durch die Generierung einer Deletionsmutante und der damit verbundenen Abschwächung des zytolytischen Effektes bestätigen ließ [5, 87, 121, 239, 285]. Zusätzlich konnten Allewelt und Mitarbeiter den nicht-zytotoxischen Stamm PA01 mit einem exoU exprimierenden Plasmid transformieren und so die lethale Dosis bei einer Mausinfektion um das 39-fache reduzieren [5]. Dies unterstrich die Bedeutung von ExoU für eine erfolgreiche Infektion des Wirtsorganismus, trotz allem aber fehlte mehreren klinischen Isolaten das exoU kodierende Gen [131]. Auf der anderen Seite wurde gesteigerte Virulenz von Stämmen aus krankenhausassoziierter Pneumonie direkt der Sekretion von ExoU zugeschrieben. Dies lässt darauf schließen, dass das Enzym einen zwar nicht essentiellen, dafür aber nützlichen Einfluss auf die Infektiösität von P. aeruginosa hat [244].

↓20

Weiterführende Studien belegten, dass es sich bei dem Enzym um ein Patatin-ähnliches Protein [s. 2.3.1 2] mit PLA und LPLA Aktivität handelt und gezielt durch Inhibitoren zytosolischer und Ca2+-unabhängiger Phospholipasen blockiert werden kann [205, 238, 271]. Interessanterweise benötigt die Aktivierung zur Entfaltung voller zytotoxischer Aktivität von ExoU einen eukaryontischen Kofaktor, die Superoxiddismutase [239, 237].

Durch die Degradation der zellulären Phospholipide kommt es zu einer ExoU-abhängigen Freisetzung von Arachidonsäure in vitro, zur Akkumulierung der Prostaglandine PGE(2) und PGI(2) und zum Einstrom polymorphkerniger Leukozyten sowohl in Injektions- als auch in Inhalationsexperimenten im Mausmodell [234]. IL-8 als Chemoattraktant für den Neutrophileninflux konnte im Weiteren als möglicher Entzündungsmediator bestätigt werden [65]. Die Gruppe um Cuzick betrachtete den Signaltransduktionsweg im Detail und konnte die Aktivierung des c-Jun N-terminalen Kinasekaskadewegs und die Bildung des AP-1 Transkriptionsfaktors auf erfolgte ExoU-Stimulierung zurückführen [65]. Die Induktion dieses Weges wurde zuvor schon von einer anderen Arbeit angedeutet, in welcher die AP-1 vermittelte Expression verschiedener Gene, unter anderem von IL-6, durch ExoU Zugabe hervorgerufen wurde [181]. Ein mögliches Signalmolekül zur Induktion der Kaskade konnte allerdings noch nicht identifiziert werden, jedoch kann ExoU mittels PLA Aktivität Lysophospholipide generieren, von denen LPC, aber auch LPA bereits als Induktoren der AP-1 Aktivierung beschrieben wurden [83, 232]. Somit sind auf der einen Seite die potenten zell-zerstörenden Eigenschaften, auf der anderen Seite die Induktion der vaskulären Permeabilität durch Auschüttung von Prostaglandinen als auch die Akkumulierung inflammatorischer Zelltypen ausschlaggebend für die schnelle Verbreitung des Pathogens im Wirtsorganismus.

IV. Staphylococcus aureus β-Toxin unterdrückt die zelluläre Immunantwort

↓21

S. aureus ist ein kommensaler Keim der Hautflora und der oberen Atemwege des Menschen, wobei Nasenschleimhäute den hauptsächlichen Ort der Besiedlung darstellen. Durch Verletzungen kolonisierter Schleimhäute können die Bakterien in das durchbrochene Gewebe eindringen und sich rapide im Blutkreislauf vermehren. Dies kann zu einer Reihe von Krankheiten, wie z. B. von Hautinfektionen (Furunkel oder Pickel) bis hin zu lebensbedrohlichen Erkrankungen, wie dem toxischen Schocksyndrom, einer Endokarditis oder einer Pneumonie, führen [169]. Gegenwärtig spielen vor allem krankenhausassoziierte Infektionen eine schwerwiegende Rolle, da es vermehrt zur Zunahme multiresistenter Stämme, wie z. B. einigen methicillinresistenten S. aureus (MRSA), kommt. Neben anderen Virulenzfaktoren, z. B. Superantigenen und weiteren Zytolysinen wie α-, γ- und δ-Toxinen, wurde β-Toxin, eine Sphingomyelinase und befähigt zur Hydrolyse von Lysophosphatidylcholin, beschrieben [98, 75, 141, 304]. β-Toxin weist zytotoxische Aktivitäten gegenüber verschiedenen Zelltypen auf und es konnte beobachtet werden, dass auf β-Toxin Stimulierung das Zytokin IL-1β sekretiert und die Rezeptoren für IL-6 und LPS von Monozytenmembranen gelöst werden [173, 297, 141]. Die Daten lassen eine immunmodulatorische Rolle im Infektionsprozess vermuten, welches in Einklang mit vorhergehenden Experimenten steht, bei denen Russell und Mitarbeiter eine Inhibition der Monozytenmigration nach β-Toxin Zugabe zeigen konnten [230]. Zwar konnte kein Effekt auf das Anlocken von Neutrophilen beschrieben werden, neueste Studien zeigen jedoch, dass die Sphingomyelinase C durch Inhibition der IL-8 Expression die Rekrutierung dieses Zelltyps verhindert [269]. Der Signalweg wurde, zumindest zum Teil, als abhängig von extrazellulär regulierten Kinasen (ERK) beschrieben, wobei angenommen wurde, dass das Lipidsignalmolekül Ceramid aktiv in diesen Prozess eingreift. Im Gegensatz zu den oben genannten Beispielen von C.  perfringens PLC und α-Toxin oder ExoU aus P. aeruginosa ist β-Toxin nicht durch Aktivierung, sondern durch Unterdrückung einer adäquaten Immunantwort an der Pathogenität von S. aureus maßgeblich beteiligt.

2.3.3.2 Phospholipasen als Virulenzfaktoren von intrazellulären Bakterien

Im Gegensatz zu extrazellulären Erregern sind intrazellulär replizierende Bakterien durch die Wirtszelle von einer Reihe antimikrobieller Abwehrmechanismen geschützt. Jedoch müssen sie Strategien entwickeln, um z. B. intrazelluläre Degradation zu verhindern. Dies kann auf verschiedene Weisen und in Abhängigkeit von phospholipolytischer Aktivität geschehen, von denen einige im nachfolgenden Abschnitt beschrieben werden.

I. Die Phospholipasen C von Mycobacterium tuberculosis tragen zur Persistenz in Tuberkeln bei

↓22

M. tuberculosis, einer der gefährlichsten Erreger unserer Erde, fordert weltweit über 2 Millionen Todesopfer pro Jahr [28]. Durch Inhalation kontaminierter Aerosole gelangen die Bazilli in die Lunge, wo sie sich in Makrophagenzellen vermehren können. Doch muss es nach erfolgter Infektion nicht unbedingt zum symptomatischen Ausbruch einer Krankheit kommen. Durch Abschirmen der Bakterien in sogenannten Tuberkeln kann der Erreger über Jahre hinweg als asymptomatische, latente Tuberkulose weitergetragen werden [235]. Der Persistenz liegt ein multifaktorieller Mechanismus zugrunde, wobei die ungewöhnlich dicke Zellwand der Bakterien sie intrinsisch resistent gegenüber vielen toxischen Agenzien macht [32, 133]. Ein direkter Einfluss auf die Überdauerung der Erreger konnte der Regulation des eigenen Stoffwechsels und, neusten Studien zur Folge, der Bildung von Endosporen zugeschrieben werden [180, 108]. Interessanterweise kodiert das Genom unterschiedlicher Mycobakterien eine Vielzahl an phospholipolytischer PLC, PLD oder lysophospho-lipolytischer Aktivität [144, 209, 302, 301]. Bei der Deletion der von M. tuberculosis exprimierten Gene plcA-D konnte eine signifikante Reduktion des Replikationspotentials in der Lunge infizierter Mäuse beobachtet werden [213]. Hierbei waren Differenzen in der Vermehrungsfähigkeit zwischen Wildtyp und der Tripel- oder Quadrupelmutante zu späteren Zeitpunkten der Infektion besonders ausgeprägt. Dies begründeten die Autoren mit einem Beitrag der Phospholipasen zur Persistenz des Erregers. Die Hypothese wird durch Experimente zum Glyoxylatzyklus unterstützt, der einen Seitenzweig des Zitratzyklus’ darstellt und unter Verwertung von Azetyl-CoA Fettsäuren als Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen kann. Hierbei konnte demonstriert werden, dass die Isocitratlyase, ein Schüsselenzym des Glyoxylatweges, ähnlich reguliert ist wie die „upstream“ der Reaktion liegenden Phospholipasen C und im Weiteren einen Einfluß auf die Persistenz der Bakterien nimmt [180]. Da bereits angenommen wird, dass freie Fettsäuren als Nährstoffgrundlage von persistierenden Mycobakterien genutzt werden, könnten phospholipolytische Aktivitäten im Falle mycobakterieller Persistenz eher zur Beschaffung von Nährstoffen als zur Zerstörung des umliegenden Zellverbandes beitragen [300, 302].

II. Die GDSL Lipase SseJ fördert die Umstrukturierung der „Salmonella-enthaltenen Vakuole“

Das Genus Salmonella umfasst eine Reihe pathogener Serovare, die durch Aufnahme kontaminierter Lebensmittel eine Vielzahl an Krankheiten in verschiedenen Wirtsorganismen auslösen können. Hierbei kommt es im Menschen durch Salmonella enterica Serovar Typhimurium (S. Typhimurium) immer wieder zu zwar selbstlimitierenden, aber schwerwiegenden Gastroenteriden und nur in seltenen Fällen zur Entwicklung einer Sepsis [235]. Als fakultativ intrazellulärer Erreger induzieren Salmonellen ihre Aufnahme in Wirtszellen durch den Mechanismus des sogenannten „membrane ruffling“ und überdauern letztendlich in einer spezialisierten Nische, ähnlich zu Legionellen, in der Salmonella enthaltenen Vakuole (Salmonella-containing vacuole = SCV). Diese Art der Anpassung wird vor allem durch die zwei, auf den Pathogenitätsinseln SPI-1 und SPI-2 lokalisierten, Typ III Sekretionssysteme vermittelt [140].

↓23

Bisher konnten sowohl PLC und PLD als auch Patatin-ähnliche Proteine in Salmonella identifiziert werden, jedoch wurde keines hinsichtlich seiner Virulenzeigenschaften näher untersucht [255, 311, 15]. Im Gegensatz dazu ist SseJ, ein zur Gruppe der GDSL-Hydrolasen gehörendes Enyzm, als SPI-2 Typ III-Effektorprotein und Virulenzdeterminante beschrieben worden [99, 197]. Deletionsmutanten oder solche des katalytischen Zentrums von SseJ waren im Mausmodell als auch in Makrophageninfektionsversuchen in ihrer Vermehrungsfähigkeit attenuiert [99, 161, 197, 229]. Nach erfolgter Sekretion lokalisiert SseJ an der Vakuolenmembran und in röhrenförmigen Membranverlängerungen, den Salmonella-induzierten Filamenten (Sifs) [99, 260]. Die Funktion der Sifs ist nach wie vor unklar, jedoch vermindert eine Deletion dieser Ausdehnungen die Überlebensfähigkeit in Mausinfektionen [260]. Als Antagonist des SPI-2 Effektorproteins SifA, wird angenommen, dass SseJ durch Destabilisierung dem aufbauenden Prozess der Vakuole und der Sifs entgegenwirkt und ihm so dynamische Eigenschaften verleiht. Dies konnte experimentell nachgewiesen werden, als sifA Mutanten nicht mehr in der Lage waren, stabile SCVs zu bilden, der Defekt aber durch die zusätzliche Deletion von sse J wieder behoben werden konnte [229]. Die Modellierung der Membran geschieht nach Nawabi und Mitarbeitern mittels Esterifizierung von Cholesterol durch die implizierte Funktion einer Glyzerophospholipid-Cholesterol Azyltransferase (GCAT) [193]. Cholesterol akkumuliert bei Salmonelleninfektionen in SCVs und stellt daher ein perfektes Substrat in unmittelbarer Nachbarschaft zu dem sekretierten Enzym dar [53]. SseJ beeinflusst so durch Bildung von Cholesterolestern die Dynamik der SCV, um dem Erreger intrazelluläre Vermehrung und Überleben zu garantieren.

III. Phospholipasen von L egionella  pneumophila 

Ähnlich zu M. tuberculosis kolonisiert L. pneumophila nach Inhalation kontaminierter Aerosole Makrophagenzellen der menschlichen Lunge. Wie in Abschnitt 2.2 beschrieben, ist dies jedoch nur ein unbeabsichtigter Nebenweg bakterieller Verbreitung, da sich Legionellen vor allem in frei lebenden Protozoen vermehren.

↓24

L. pneumophila kodiert für insgesamt 17 PLA Enzyme, davon 11 Patatin-ähnliche PLAs, 3 GDSL-Hydrolasen (evtl. +2) und PlaB, eine zell-assoziierte PLA/LPLA [13]. Diese immens hohe Anzahl hydrolytischer Enzyme lässt auf eine enorme Bedeutung der Phospholipaseaktivität für den Überlebens- und/oder Infektionsprozess der Bakterien schließen. Als intrazellulär replizierende Pathogene kommen Legionellen in direkten Kontakt mit unterschiedlichen Phospholipiden der Wirtszellen. So stellt das Lungensurfactant die erste zu überwindende Barriere nach Inhalation der Organismen dar. Die grenzflächenaktive Substanz („surface active agent“) besteht bis zu 90% aus Phospholipiden und konnte bereits als Substrat für sekretierte PLA Aktivität bestätigt werden [91]. Eines dieser Enzyme, genannt PlaA, zeigt zusätzlich LPLA Aktivität und ist in der Lage, die Bakterien vor den toxischen Effekten von Lysophospatidylcholin durch Degradation des Lipids zu schützen. Daher wird diesem Protein eine protektive Rolle in den destruktiven Bedingungen während einer Lungeninfektion zugeschrieben [93]. PlaA ist, ebenso wie die Enzyme PlaC und PlaD, ein Mitglied der GDSL-Hydrolasefamilie (s. 2.4.1, 2). Neben PLA/LPLA Aktivität besitzt PlaC die Fähigkeit, Azylreste auf Akzeptormoleküle, wie z. B. Cholesterol, zu übertragen, muss dazu aber mittels der Zink-Metalloprotease ProA proteolytisch aktiviert werden [14]. Insertionsmutanten aller drei Enzyme zeigten jedoch keinen Defekt der intrazellulären Vermehrungsfähigkeit in U937 Makrophagenzellen und Acanthamoeba castelanii Amöben [93, 14]. Dieses Phänomen trifft ebenso auf das Patatin-ähnliche Protein VipD/PatA zu ([288], Aurass und Flieger, unveröffentlichte Daten). VipD wurde zeitgleich von zwei Arbeitsgruppen als Effektorprotein des Typ IVB Sekretionsapparates beschrieben und beeinflusst aller Wahrscheinlichkeit nach den Vesikeltransport der Wirtszelle [288, 254]. Dies wurde jedoch als unabhängig von der aktiven Patatin-Domäne des Enzyms gezeigt [254]. VipD weist zudem Homologie zu dem aus P. aeruginosa bekannten Zytotoxin ExoU auf und könnte so in ähnlicher Weise eine immunmodulatorische Rolle während des Infektionsprozesses übernehmen (s. 2.3.3.1 III).

PlaB, eine zell-assoziierte Phospholipase A / Lysophospholipase A Aktivität von L.  pneumophila

Wie Flieger und Mitarbeiter 2004 zeigen konnten, kodiert das plaB Gen für die hauptsächliche zell-assoziierte phospholipolytische Aktivität von L. pneumophila [94]. Zudem weist das Enzym eine kontaktabhängige hämolytische Eigenschaft auf, die allerdings nur ca. 30% des gesamten Hämolysepotentials von L . pneumophila Corby gegenüber humanen Erythrozyten ausmacht. Im Infektionsmodell von Acanthamoeba castellanii Amöben oder auch U937 Makrophagenzellen verhielt sich die Insertionsmutante des plaB Gens in ihrem Replikationsvermögen analog zum Wildtyp, was auf eine weniger bedeutsame Funktion des Enzyms während des Infektionsprozesses oder auf eine Kompensation der relevanten Aufgaben durch andere Phospholipasen schließen lässt. Die Komplementation der besonders starken lipolytischen Aktivität ließ sich allerdings nicht beobachten.

↓25

Das Genom von L. pneumophila Corby kodiert nicht für homologe Proteine, wie es z. B. bei der GDSL-Familie der Fall ist, von denen bisher 3 (evtl. +2) verschiedene beschrieben werden konnten [212]. Nur ein kurzer Sequenzabschnitt (Aminosäure 2-141) im N-terminalen Bereich von PlaB zeigt geringe Homologie und Identität von 42% und 25% zu einer Lipase, LipB genannt. Betrachtet man die genomische Umgebung des plaB Gens in allen vier bisher sequenzierten L. pneumophila  Stämmen (s. Abbildung 2.6), so kann festgestellt werden, dass plaB stets einzeln und nicht in einem Opern kodiert bzw. transkribiert wird. Die umgebenden Gene gehören entweder verschiedenen Stoffwechselwegen an, z. B. capP, eine Phosphoenolpyruvat Carboxylase, oder sind noch keiner Funktion zuzuordnen.

Abbildung 2.6: Genomische Situation am offenen Leserahmen (ORF) von plaB in sequenzierten L. pneumophila Stämmen.

Dargestellt sind genomische Regionen und ihre Orientierung das plaB-Gen (lila) umschließend. Die Software biocyc.org wurde zur Gegenüberstellung der genomischen Situation um das plaB-Gen der sequenzierten Stämme L. pneumophila Corby, Lens, Philadelphia-1 und Paris herangezogen.

Die Transkription des plaB Gens konnte als konstitutiv beschrieben werden, wobei es zu einer Abnahme des plaB Transkriptes mit Beginn der stationären Phase kommt [247]. Brüggemann und Mitarbeiter bestimmten die Expression aller L . pneumophila Gene während einer Amöbeninfektion im Microarray-Verfahren [42]. Hierbei zeigte sich ein vernachlässigbarer Anstieg des plaB-Transkriptes um den Faktor von 1.48 zwischen der replikativen (8h) und der transmissiven Phase (14h) einer Infektion. Die Regulation der Expression wurde weiterhin im Detail betrachtet, wobei sich herausstellte, dass die zell-assoziierte PLA/LPLA Aktivität und damit höchstwahrscheinlich PlaB in rpoS und letA Mutanten signifikant reduziert war [39]. Im Gegensatz zur Repression der plaB Transkription zeigt sich das PlaB-Enzym am Ende der exponentiellen Phase maximal aktiv [247], was auf zusätzliche posttranskriptionelle Regulation hinweist. Die Sequenzen des PlaB-Proteins aller sequenzierten L. pneumophila Stämme Corby, Lens, Philadelphia-1 und Paris sind sehr stark konserviert und weisen mindestens 98% Identität und 99% Homologie zueinander auf.

2.4 Immunabwehr einer Legionelleninfektion

↓26

Nachdem man feststellte, dass Makrophagen der A/J Mäuse suszeptibel gegenüber einer Legionelleninfektion waren, wurden erste Experimente zur angeborenen Immunität unternommen [307]. Die Untersuchungen ergaben, dass ein Längenpolymorphismus im naip5 (neuronal apoptosis inhibitory protein 5) Gen für diesen Effekt verantwortlich war [306]. Naip5 gehört der Familie der NOD-like Rezeptoren, intrazellulärer Erkennungsmoleküle von „pathogen associated molecular patterns“ (PAMPs), an. Es wird vermutet, dass vor allem Naip5 und weniger der extrazellulär lokalisierte Toll-like Rezeptor 5 (TLR5) an der Erkennung von Flagellin beteiligt ist [185, 216]. Ebenso permissiv für Legionellainfektionen verhielten sich Ipaf-/- Makrophagenmutanten aus Mäusen [7]. Ipaf (ICE-protease activating factor) stellt ein weiteres NLR (NOD-like Rezeptor) Protein dar und könnte mit Naip5 ein Inflammasom zur ausschließlichen Erkennung von Flagellin bilden, welches anschließend durch Aktivierung der Protease Caspase-1 das Wachstum von Legionellen negativ beeinflusst [147]. Jedoch geben die Daten bisher weniger Aufschluss über die tatsächliche Immunantwort im Menschen, da hier eher die konventionelle apoptotische Caspase-3 eine Rolle spielt, die die Replikation von Legionellen aber nicht inhibieren kann [105]. Dies lässt auf weitere Induktionswege, stimuliert durch das Ipaf-Inflammasom, schließen.

Toll-like Rezeptoren sind in der Erkennung von Legionella-PAMPS ebenfalls von großer Bedeutung. Bisher wurden TLR5 für Flagellin [123], TLR4 im Zusammenhang mit LPS [148] und TLR2 zur Erkennung von Lipopeptiden identifiziert [252, 3]. Zusätzlich wurde TLR2 als Rezeptor für bakterielles LPS beschrieben. Dies ließ im Weiteren vermuten, dass TLR2 bedeutsamer für die durch Legionellen induzierte Immunantwort als der klassische LPS-Rezeptor TLR4 ist [109]. Als Adaptormolekül zur Signalweiterleitung konnte vor allem MyD88 identifiziert werden. In MyD88-/- Mäusen wurde nach Infektion mit Legionellen eine signifikant höhere Bakterienlast in der Lunge und Verbreitung dieser zur Milz beobachtet [122]. Des Weiteren konnten hierbei weniger Zytokine detektiert werden, was zu einer reduzierten Neutrophilenrekrutierung in die Alveoli führte. Neben den in dieser Arbeit detektierten Chemokinen MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2) und KC (keratinocyte-derived chemokine) werden eine Reihe anderer inflammatorischer Faktoren auf eine Legionelleninfektion hin exprimiert und sekretiert. Diese beinhalten G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor), GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), IL-1α (Interleukin-1α), IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-17, IL-18, IFN-α (Interferon-α), IFN-β, INF-γ, MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1), NO (Stickstoffoxid) und TNF-α (Tumornekrosefaktor-α) [241, 253, 203, 37, 61, 199, 289, 38, 208]. So ist neben der Aktivierung des angeborenen Immunsystems durch z. B. die Sekretion verschiedener Chemokine, wie IL-8 oder MCP-1, auch der Übergang zur Induktion der adaptiven Immunantwort, z. B. durch INF-γ, geschaffen. Dieses wird von T-Zellen, die unter anderem durch die Zytokine IL-12 oder IL-18 aktiviert werden, sezerniert und inhibiert mittels eines multifaktoriellen Mechanismus’ das Legionellenwachstum in vitro [287]. Die adäquate Stimulierung einer T-Zell-Antwort erfordert die Bindung eines T-Zell-Rezeptors an fremdartige Peptide, die auf dendritischen oder Makrophagen-Zellen durch die „major histocompatibility complex“ (MHC) Moleküle der Klasse I oder II präsentiert werden. Hierbei aktivieren MHCII Moleküle CD4 positive Helferzellen, wo hingegen MHCI präsentierte Peptide CD8 positive zytotoxische T-Zellen stimulieren. Durch die Infektion von dendritischen Zellen mit L. pneumophila konnte bereits die Hochregulierung der MHCI/II Proteine bewiesen werden [220]. Ebenso zeigten sich Mäuse, deren CD4 und CD8 positive T-Zellen deletiert waren, wesentlich suszeptibler gegenüber einer intratrachealen Infektion mit L. pneumophila [267]. Die MHCII-abhängige INF-γ Produktion aktivierter T-Helferzellen wurde in vitro im Detail untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass die Präsentation Legionella spezifischer Antigene mit der Kinetik der Phagosom-Lysosomfusion korreliert [195]. Den Experimenten zur Folge erreichten dot/icm Mutanten zeitiger das Maximum an IFN-γ Sekretion als die Ansätze der Wildtypinfektion, die erst später im Verlauf des Infektionszyklus lysosomale Marker in der LCV aquirieren und diese ansäuern [265]. Dies steht mit den Anforderungen einer MHCII Präsentation in Einklang, die den Abbau der Peptide in sauren Kompartimenten erfordert, während Moleküle zur MHCI-Bindung zytosolischen Ursprungs sind.

Die zweite Seite erworbener Immunität wird durch die humorale Immunantwort repräsentiert. Anti-Legionella Antikörper rekrutierter B-Zellen konnten nach ca. 5 Tagen im Blutplasma infizierter Mäuse festgestellt werden [36]. Bakterien, die mit diesem Antikörper prä-inkubiert wurden, zeigten eine verminderte Vermehrungsfähigkeit. Es wird vermutet, dass dies das Resultat gesteigerter, jedoch komplementunabhängiger Phagozytose ist, welche auf noch unbekannte Weise alveoläre Makrophagen restriktiver gegenüber bakterieller Replikation macht.

2.5 Ziel der Arbeit

↓27

L. pneumophila kodiert für 17 Enzyme, denen aufgrund von Homologien oder durch experimentelle Bestimmung phospholipolytische Aktivitäten mit hoher Wahrscheinlichkeit zugewiesen werden können. Hierzu gehört auch eine zell-assoziierte Phospholipase A/Lysophospholipase A, PlaB, die zudem hämolytische Eigenschaft besitzt [94]. Da sich dieses Enzym durch besonders starke Aktivität auszeichnet und zu keiner der bisher bekannten Lipasefamilien Homologie zeigt, war es in der vorliegenden Arbeit von Interesse, das Protein biochemisch und funktionell näher zu charakterisieren.

Für den Aspekt der biochemischen Analyse sollten die katalytisch aktiven Zentren identifiziert und die Substratspezifität im Hinblick auf alkoholische Seitenketten und Länge der Fettsäurereste untersucht werden. Im Weiteren sollten die hämolytischen Eigenschaften mit der katalytischen Aktivität in Zusammenhang gebracht werden. Die Rolle des C-Terminus in Bezug auf das aktive Protein sowie die PlaB-assoziierten Hydrolyseeigenschaften von nicht-pneumophila Stämmen oder klinischen L. pneumophila Isolaten sollten näher untersucht werden.

Die funktionelle Charakterisierung betreffend war es von Interesse, welchen Einfluss PlaB auf die Überlebensfähigkeit von Legionellen in vitro, aber auch in vivo zeigt. Effekte im Meerschweinchenmodell sollten anschließend in Bezug zu einer veränderten Immunantwort der Wirtszellen gebracht werden.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
25.08.2010