3 Material und Methoden

↓27

3.1 Material

3.1.1 Laborausstattung

↓28

Tabelle 3.1: Auflistung der verwendeten Geräte

Geräte

Bezeichnung

Hersteller

Absorptionsmessgerät für
Mikrotiterplatten

Tecan Sunrise

Tecan

Chemilumineszenzimager

Chemismart 3000

Vilber Lourmat

Brutschränke

a) B20

b) HeraCell 240

Heraeus

Heraeus

Drehrad

neoLab-Rotator 2-1175

neoLab

Dünnschichtkammer

DC-Glastank (Maße: 35×25×12cm)

Desaga

Elektroporationsgerät

Cell Porator

Life Technologies

FPLC

ÄKTAprime

Amersham Bioscience

FT-IR-Spektrometer

IFS-28/B

Bruker

Gelelektrophorese-Apparaturen

a) Gelkammer (Mini) SubCell GT

b) Spannungsgerät PowerPack 300

c) Mini Protean 3

Bio-Rad

Bio-Rad

Bio-Rad

Heizschüttler

Thermomixer Comfort

Eppendorf

Homogenisator

ULTRA-TURRAX T25

IKA®Labortechnik

Inkubatoren

a) InnovaTM 4230

b) InnovaTM 43

c) TH25

New Brunswick Scientific

New Brunswick Scientific

Edmund Bühler

Kamera

EOS 450D Spiegelreflexkamera

Canon

Koloniezählgerät

Acolyte

Synbiosis

Mikroskope

a) Axiovert 200M

b) IMT

Carl Zeiss Jena

Olympus

pH-Elektrode

Toledo MP225 pH Meter

Mettler

PCR-Cycler

a) Thermocycler T-Gradient

b) FlexCycler

c) 7500 Real-time PCR System

Biometra

Analytik Jena

Applied Biosystems

Plattiergerät

Whitley Spiral Plater

Meintrup DWS

Semidry-Elektroblotter

TE77

Pharmacia

Sterilbank

Herasafe

Heraeus

Tisch-Schüttler

a) WT12

b) S410

c) Unimax 1010 (in Inkubator TH25)

Biometra

mLw

Heidolph

Ultraschallgerät

Sonoplus

Bandelin

UV/VIS Spektrophotometer

a) NanoDrop® ND-1000

b) NanoPhotometer

c) DU®520 Spectrophotometer

NanoDrop

Implen

Beckman Coulter

UV-Transluminator

Gel Doc 2000

Bio-Rad

Vortex Mixer

Vortex Mixer 7-2020

neoLab

Waagen

a) CP64; b) 1212 MP

Sartorius AG

Zentrifugen

a) Kühlzentrifuge 5415R

b) Sorvall RC-5 Superspeed Refrigerated Centrifuge

c) Labofuge400

d) Kühlzentrifuge 5810R

Rotoren: A-4-62; F-34-6-38

Eppendorf

Du Pont Instruments

Heraeus

Eppendorf

3.1.2 Spezielle Materialien

Tabelle 3.2: Auflistung spezieller Materialien

Materialbezeichnung

Name/Beschreibung

Artikelnummer

Hersteller

AEX-Säulchen

HiTrap Q FF

17-6002-33

Amersham Bioscience

Cellophanfolie

Folie zur Konservierung von Proteingelen

K422.1

Roth

Chromatographie Papier

17 CHR

3017915

Whatman

Cryo-Gefäße

Zur Lagerung von Glyzerolgefrierkulturen

E309.1

Roth

Dünnschichtplatten

Kieselgel 60 WF254s

1.16484

Merck

Elektroporationsküvetten

Küvetten für den CellPorator

11608-031

Whatman

Filter

a) Rotilabo®Spritzenfilter 13mm

b) FP30/0.3 CA-S Sterilfilter

T056.1

10462200

Roth

Schleicher & Schuell

FT-IR Probenrad

ZnSe Trägermaterial

A 501-B/3

Bruker

Glasröhrchen

Gefäß zur Bakterienkultivierung

231721197

Schott

Kanüle

26-gauge Sterican Gr.17

-

B.Braun (RKI Lager)

Küvetten

Einmal-Küvetten aus PMMA

P95.1

Roth

Mikrotiterplatten

96-well, F-Form

Immuno-Platten, MaxiSorp, 96-well

3911925

439454

Anicrin

Nunc

Objektträger

Poly-L-Lysin Objektträger

L198.1

Roth

PVDF-Membran

Immobilon-P

IPVH00010

Millipore

Reaktionsgefäße

a) 1,5
2ml Safe-Lock Tubes

b) PCR Tubes

c) 15/50ml Tubes

0030.120.086/

0030 120.094

683201

188271/227270

Eppendorf

Eppendorf

Greiner bio-one

Greiner bio-one

Serologische Pipetten

10/25ml, steril, BD Falcon

357530/356535

BD Bioscience

Spritze (Feindosierung)

Omnifix®-F ohne Kanüle

9161406V

B.Braun

Zellkulturflaschen

a) 25cm2 

b) 75 cm2 

c) 175 cm2

a) 156367

b) 178891

c) 159910

Nunc

Nunc

Nunc

Zellkulturplatten

24-well Cellstar

662160

Greiner bio-one

Zählkammer

Neubauer Zählkammer, improved

T729.1

Roth

3.1.3 Chemikalien

Tabelle 3.3: Auflistung der verwendeten Chemikalien

Chemikalienbezeichnung

Artikelnummer

Hersteller

Acrylamid-Bisacrylamid Rotiphorese® Gel 30

3029.2

Roth

Agar

101618

Merck

Agarose

V3125

Promega

Ammonium-Eisen(II)-Sulfat

F-1543

Sigma-Aldrich

Ammoniumpersulfat (APS)

0486

Amresco

Ampicillin Natriumsalz

A9518

Sigma-Aldrich

Biotin

47868

Sigma-Aldrich

Bromphenolblau/Xylencyanol

B3269

Sigma-Aldrich

BSA (Rinderserum Albumin)

K41-001

PAA

BugBuster® Protein Extraction Reagent

70584-3

Novagen

Carbenicillin

69101-3

VWR

Chloramphenicol

C-1919/ C-0378

Sigma-Aldrich

Chloroform

102445

Merck

Coomassie, kolloidal (Roti®-Blue)

A152.1

Roth

3,3’-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid-Hydrat (DAB)

D5637

Sigma-Aldrich

Diethylether

100921

Merck

Dimethylsulfoxid (DMSO)

20385

Merck

Dithiothreitol (DTT)

P2325

Invitrogen

DNA Isolation Reagent for Genomic DNA

A3418,0050

AppliChem

dNTP, Nukleotid Mix 10mM

BIO-39043

Bioline

Eisen (III)-Chlorid

12321

Riedel-de Haën

Eisessig

100063

Merck

Ethanol, zur Analyse

100983

Merck

Ethidiumbromid

111608

Merck

FKS (Fötales Kälberserum)

A-15-043

PAA

Formalin

F8775

Sigma-Aldrich

D-(+)-Glukose

G7021

Sigma-Aldrich

Glyzerol 86%

7533.3

Roth

Glyzin

3908.2

Roth

Guanidinhydrochlorid (GuHCl)

50940

Fluka

Harnstoff

3941.2

Roth

Hefeextrakt

212720

BD Bioscience

Chemikalienbezeichnung

Artikelnummer

Hersteller

HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure)

9105.4

Roth

n-Hexan, zur Analyse

104374

Merck

Isopropyl-β-D-thiogalaktosid (IPTG)

BIO-37036

Bioline

Kaliumchlorid

104936

Merck

Kaliumdihydrogenphosphat

104873

Merck

Di-Kaliumhydrogenphosphat

105104

Merck

Kaliumhydroxid Plätzchen

105033

Merck

Kanamycinmonosulfat

K-1377

Sigma-Aldrich

Legionella α Agarplatten (BCYE)

1860e

Heipha

Legionella Basis Agar

110242

Merck

Legionella Wachstums-Supplement

SR 0110C

Oxoid

Magnesiumchlorid Hexahydrat

105833

Merck

Magnesiumsulfat Heptahydrat

105886

Merck

β-Mercaptoethanol

M7522

Sigma-Aldrich

METAFECTENETM

T020-0.2

Biontex

Methanol

T909.1

Roth

Mucasol

60434

Brand

Naphtol Blauschwarz

195243

Sigma-Aldrich

Natriumazetat-Trihydrat

106267

Merck

Natriumazid

106688

Merck

Natriumcarbonat

106392

Merck

Natriumchlorid

3957.2

Roth

Natriumcitrat

S-4641

Sigma-Aldrich

Natriumdeoxycholat

D6750

Sigma-Aldrich

Natrium EDTA (Triplex III)

108418

Merck

Di-Natriumhydrogenphosphat

106575

Merck

Natriumhypochlorid-Lösung

105614

Merck

Natriumthiosulfat

106512

Merck

Nicotinamid-Adenosin-Dinukleotid (NAD)

N1511

Sigma-Aldrich

Nonidet P-40

74385

Fluka

PeqGOLD RNA PureTM

30-1020

peqLab

Pepton

LP0085

Oxoid

Petrolether

101769

Merck

Phenol

A156.2

Roth

Phorbol-12-Myristat-13-Azetat (PMA)

79346

Sigma-Aldrich

ProLong Gold Antifade mit DAPI

P36931

Invitrogen

2-Propanol, Isopropanol

6752.4

Roth

Protease Inhibitor Mix FY

39104.02

Serva

Reference dye (ROX)

-

Sequenzierlabor, RKI

Roti-Nanoquant (zur Proteinbestimmung)

K880.1

Roth

RPMI 1640 Pulver/Flüssig

51800-043/E15-840

Invitrogen/PMA

Salzsäure, rauchend

100317

Merck

Saponin

4185.1

Roth

Sicapent

100543

Merck

Silbernitrat

101512

Merck

Skim Milk Powder

70166

Fluka

Sodium-Dodezylsulfat (SDS)

CN30.2

Roth

Sorbitol

S3755

Sigma-Aldrich

Tetramethylethylendiamin (TEMED)

2367.3

Roth

Trichloressigsäure

8789.2

Roth

Tris Base

T8,760-2

Sigma-Aldrich

Triton X-100

T8787

Sigma-Aldrich

Trypanblau (0,4%)

T8154

Sigma-Aldrich

Trypsin-EDTA

L11-004

PAA

Trypton

L47

Oxoid

Tween20

817072

Merck

Wasserstoffperoxid (H2O2), 30%

216763

Sigma-Aldrich

X-Gal, 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside

1161

Diagnostic Chemicals Ltd.

YNB (yeast nitrogen base)

Q300-09

Invitrogen

3.1.4 Lipidsubstrate

↓29

Tabelle 3.4: Auflistung der verwendeten Lipidsubstrate

Bezeichnung

Kürzel

Artikelnummer

Hersteller

Cardiolipin

-

840012P

Avanti Polar Lipids

1,2-Dipalmitoyl-sn-Glyzero-3-Phosphocholin

DPPC

850355P

Avanti Polar Lipids

1,2-Dipalmitoyl-sn-Glyzero-3-Phospho-N-Methylethanolamin

MMPE

42558

Fluka

1,2-Dipalmitoyl-sn-Glyzero-3-Phospho-N,N-
Dimethylethanolamin

DMPE

P0399

Sigma-Aldrich

1,2-Dipalmitoyl-sn-Glyzero-3-Phosphoethanolamin

DPPE

850705

Avanti Polar Lipids

1,2-Dipalmitoyl-sn-Glyzero-3-Phospho-rac-1-Glyzerol

DPPG

840455P

Avanti Polar Lipids

1,2-Dipalmitoyl-sn-Glyzero-3-[Phospho-L-Serin]

DPPS

830037

Avanti Polar Lipids

1-Palmitoyl-2-Hydroxy-sn-Glyzero-3-Phosphat

MPLPA

857123P

Avanti Polar Lipids

1-Lauroyl-2-Hydroxy-sn-Glyzero-3-Phosphocholin

MLLPC (C12)

855475P

Avanti Polar Lipids

1-Octanoyl-2-Hydroxy-sn-Glyzero-3-Phosphocholin

MOLPC (C8)

855275P

Avanti Polar Lipids

1-Palmitoyl-2-Hydroxy-sn-Glyzero-3-Phosphocholin

MPLPC (C16)

855675P

Avanti Polar Lipids

1-Palmitoyl-2-Hydroxy-sn-Glyzero-3-Phosphoethanolamin

MPLPE

856705P

Avanti Polar Lipids

1-Palmitoyl-2-Hydroxy-sn-Glyzero-3-Phospho-Glyzerol

MPLPG

858122P

Avanti Polar Lipids

1,2-Dipalmitoyl-rac-Glyzerol

1,2-DG

D2135

Sigma-Aldrich

1-Monopalmitoyl-rac-Glyzerol

1-MPG

M1640

Sigma-Aldrich

Tripalmitin

TPG

T-5888

Sigma-Aldrich

3β-Hydroxy-5-Cholesten (Cholesterol)

Chol

C-3045

Sigma-Aldrich

5-Cholesten-3-Palmitat (Cholesterolester)

CholE

C-78607

Sigma-Aldrich

Palmitinsäure

FFA

P-0500

Sigma-Aldrich

3.1.5 Puffer und Lösungen

Tabelle 3.5: Auflistung der verwendeten Puffer und Lösungen

Puffer/Lösung

Bestandteile

Menge/Konzentration

PBS Puffer (pH 7,2)

zu 1000ml H2Obidest

KCl

KH2PO4

Na2HPO4

NaCl

0,2 g

0,2 g

1,15 g

8 g

Tris Puffer (pH 7,5) für Lipidanalyse

Tris Base

40 mM

Kaliumphosphatpuffer 1M, pH 6,0

K2HPO4 (1M)

KH2PO4 (1M)

132 ml

868 ml

Puffer zur Extraktion von Nukleinsäuren

Lysepuffer für P. pastoris

Tris Base

Natrium-EDTA

NaCl

SDS

Triton X-100

10 mM

1 mM

100 mM

1 %

2 %

Lysepuffer für transfizierte A549 Zellen pH 7,4

Tris Base

NaCl

Natrium-EDTA

Triton X-100

Nonidet P-40

10 mM

150 mM

1 mM

1 %

0,5 %

Puffer für die DNA-Gelelektrophorese

50×TAE Puffer (pH 8,0)

Tris Base

Eisessig

Na2EDTA

2,0 M

1,0 M

0,1 M

DNA Probenpuffer

Bromphenolblau

Glyzerin

0,25 % (w/v)

30 %

Puffer für die „ Combined Chain Reaction ” PCR

CCR Puffer (10×)

Tris Base (pH 8,4)

MgCl2

KCl

NAD

200 mM

30 mM

500 mM

5 mM

Puffer/Lösung

Bestandteile

Menge/Konzentration

Puffer für die Protein-Gelelektrophorese und Western Blot

SDS PAGE Probenpuffer

Tris Base (pH 6,8)

SDS

Glyzerol

β-Mercaptoethanol

Bromphenolblau

62,5 mM

2 %

10 %

5 %

0,001 %

SDS PAGE Laufpuffer (5×)

Tris Base

Glyzin

SDS

25 mM

384 mM

0,2 %

Dehydratisierungslösung für Proteingele

EtOH

Glyzerin (86%)

20 %

10 %

Western Blot Transferpuffer

Tris Base

Glyzin

Methanol

25 mM

192 mM

10 %

Western Blot Waschpuffer (PBST-T)

1×PBS Puffer

Tween20

500 ml

0,1 %

Puffer für die Protein-Silberfärbung

Fixierlösung

Ethanol

Eisessig

40 %

5 %

Sensibilisierungslösung

Natriumthiosulfat (Na2S2O3)

0,2 %

Färbelösung

Silbernitrat (AgNO3)

0,2 %

Entwicklerlösung

Natriumcarbonat (Na2CO3)

Formalin

2 %

0,04 %

Stoplösung

Eisessig

5 %

Puffer zur Proteinreinigung

Resuspensionspuffer für den Zellaufschluss

Tris Base

NaCl

Na2EDTA

50 mM

100 mM

1 mM

AEX Protein-Bindepuffer (pH 9,2)

Tris Base

Na2EDTA

20 mM

5 mM

AEX Protein-Elutionspuffer (pH 9,2)

Tris Base

Na2EDTA

NaCl

20 mM

5 mM

1 M

GST Glutathion-Elutionspuffer

Tris-HCl (pH 8,0)

Glutathion, reduziert

50 mM

10 mM

Puffer zur Reinigung und Solubilisierung von „ inclusion bodies

IB Waschpuffer

Tris Base (pH 7,5)

Na2EDTA

DTT

Triton X-100

NaCl

50 mM

10 mM

5 mM

2 %

500 mM

IB Resuspensionspuffer

Tris Base (pH 7,5)

Na2EDTA

50 mM

10 mM

IB Solubilisierungspuffer

Tris Base (pH 8,0)

GuHCl

50 mM

6 M

SDS-Trenngel

SDS-Sammelgel

10 %

12,5 %

4 %

Acrylamid/Bisacrylamid 30%

3,3 ml

4,2 ml

Acrylamid/Bisacrylamid 30%

530 µl

1,5M Tris Base (pH 8,8)

2,5 ml

2,5 ml

0,5 M Tris Base (pH 6,8)

1 ml

H2O

4 ml

3,1 ml

H2O

2,4 ml

10% SDS

100 µl

100 µl

10% SDS

40 µl

10% APS

100 µl

100 µ

10% APS

50 µl

TEMED

10 µl

10 µl

TEMED

4 µl

3.1.6 Enzyme, Standards, Antikörper

↓30

Tabelle 3.6: Auflistung verwendeter Enzyme, Standards und Antikörper

Enzymbezeichnung

Artikelnummer

Hersteller

Ampligase

A3210K

Epicentre

Benzonase

70746

Novagen

Klenow Fragment

M0210S

NEB

Lysozym

L-7651

Sigma-Aldrich

PCR-Sequenzierungs-Polymerase (BigDye 3.1)

4337035

Applied Biosystems

Pfu DNA Polymerase

EP0501

Fermentas

Platinum®Taq DNA Polymerase

10966-034

Invitrogen

Proteinase K

D3350-02 (Kit)

Omega Bio-Tek

Restriktionsendonukleasen

-

NEB

RNase OUTTM Ribonuklease (RNase) Inhibitor

10777019

Invitrogen

Shrimp alkalische Phosphatase (SAP)

11 758 250 001

Roche

T4 DNA Ligase

M0202

NEB

T4 Polynukleotidkinase

M0236 S

NEB

Taq DNA Polymerase

M0267

NEB

TurboTM DNase

AM2238

Ambion

Standards für Elektrophoresen

Standard

Bereich

Artikelnummer

Hersteller

Gene Ruler DNA Laddermix

0,1 – 10 kb

SM0331

Fermentas

Unstainded Protein Molecular Weight Marker

14,4 – 116 kDa

SM0431

Fermentas

PageRulerTM Unstained Protein Ladder

10 – 200 kDa

SM0661

Fermentas

Macig MarkTM XP

200 – 220 kDa

LC5602

Invitrogen

Antikörper

Bezeichnung (Verdünnung)

Spender

Konjugat

Artikelnummer

Hersteller/Herkunft

Anti-FlaA (1:500)

Kaninchen

-

-

Dr. Heuner

Anti-Flag (1:2000)

Maus

-

F3165

Sigma-Aldrich

Anti-GFP (1:3000)

Maus

-

G6795

Sigma-Aldrich

Anti-GST (B14) (1:1000)

Maus

-

sc-138

Santa Cruz

Anti-Kaninchen IgG (1:300)

Ziege

Alexa Fluor 488

A-11070

Invitrogen

Anti-Maus IgG (1:2500)

Ziege

HRP

A9044

Sigma-Aldrich

3.1.7 Analyse-Kits

Tabelle 3.7: Auflistung der verwendeten Analyse-Kits

Produktbezeichnung

Artikelnummer

Hersteller

BigDye Terminator V.3.1 Ready Cycle Sequencing Kit

4337035

Applied Biosystems

Bulk and RediPack GST Purification Modules

27-4570-01

Amersham

ChampionTM pET Directional TOPO® Expression Kit

K160-01

Invitrogen

ECL Western blotting detection reagent

RPN2106

Amersham Bioscience

Human IL-8 ELISA Set

555244

BD Bioscience

Nefa C Kit

994-75409

Wako Chemicals

OneStep RT-PCR Kit

210212

Qiagen

Pichia Expression Kit

K1710-01

Invitrogen

Pro-MatrixTM Protein Refolding Guide

89867

Pierce

PURExpressTM In Vitro Protein Synthesis Kit

E6800S

NEB

RayBio® Human Inflammation Antibody Array 3

AAH-INF-3

RayBiotech, Inc.

Silver Staining Kit Protein

17-1150-01

Amersham Bioscience

T7 Sample System

L5900

Promega

Wizard Plus Minipreps

A1460

Promega

Wizard SV Gel und PCR cleanup system

A9282

Promega

3.1.8 Plasmide, Oligonukleotide, Bakterienstämme und Zellen

3.1.8.1 Verwendete Plasmide

Tabelle 3.8: Auflistung erworbener Plasmide

Plasmidbezeichnung

Artikelnummer

Hersteller

pBAD202/D/TOPO

K4202-01

Invitrogen

pBCKS+

212217

Stratagene

pEGFP-C2

6083-1

Clontech

pET28b (+)

69865-3

Novagen

pET160/GW/D-TOPO

K160-01

Invitrogen

pGEX-5X-1

27-4584-01

GE Healthcare

pGEX-6P-1

27-4597-01

GE Healthcare

pcDNA3.1(+)

V790-20

Invitrogen

pPIC3.5

K1710-01 (Kit)

Invitrogen

pPIC9

K1710-01 (Kit)

Invitrogen

↓31

Die in der folgenden Liste verwendeten plaB Fragmente haben, außer anderweitig angezeigt, ihren Ursprung ausschließlich in L. pneumophila Stamm Corby. Die Amplifikation der „site-directed“ Mutanten von PlaB (z. B. S85A) erfolgte auf Grundlage des Vektors pJB04, die der Doppelmutanten (z. B. S85A/D203N) auf pJB06-Basis.

Tabelle 3.9: Auflistung erzeugter Plasmide

Plasmid-

bezeichnung

Konstrukt

Größe des Inserts

(bp)

AB-

Resistenz

Amplifizierungs-

Primer

pJB01

pET160/GW/D-TOPO+plaB

(Expressionskonstrukt ohne His-tag)

1685

Amp

plaB_TOPOf/plaB_c1-r

pJB02

pBAD202/D/TOPO + plaB

(Expressionskonstrukt + 6×His-Fusion, C-Terminal)

1446

plaB_pBADf/plaB_pBADr

pJB03

pET160/GW/D-TOPO+plaB

(Expressionskonstrukt + 6×His-Fusion, N-Terminal)

1664

Amp

plaB_TOPf2/plaB_c1-r

pJB04

pBCKS + plaB

1585

Cm

plaB_SalIf/plaB_EagIr (=P1/P2)

pJB06

pBCKS + plaB; S85A

1585

Cm

P1/P2/plaB_S85A

pJB07

pBCKS + plaB; S129A

1585

Cm

P1/P2/plaB_S129A

pJB08

pBCKS + plaB; S200A

1585

Cm

P1/P2/plaB_S200A

pJB09

pBCKS + plaB; S229A

1585

Cm

P1/P2/plaB_S229A

pJB10

pBCKS + plaB; S250A

1585

Cm

P1/P2/plaB_S250A

pJB11

pBCKS + plaB; D75N

1585

Cm

P1/P2/plaB_D75N

pJB12

pBCKS + plaB; D203N

1585

Cm

P1/P2/plaB_D203N

pJB13

pBCKS + plaB; H270N

1585

Cm

P1/P2/plaB_H270N

pJB14

pPIC3.5 + plaB

1511

Amp

plaB_Ecof2/plaB_EagIr

pJB15

pPIC9 + plaB

1511

Amp

plaB_Ecof2/plaB_EagIr

pJB18

pGEX-5X-1 + plaB

(Expressionskunstrukt mit GST-Fusion, N-Terminal)

1511

Amp

plaB_Ecof2/plaB_EagIr

pJB19

pBCKS + plaB; T83G

1585

Cm

P1/P2/plaB_T83G

pJB20

pBCKS + plaB; D167N

1585

Cm

P1/P2/plaB_D167N

pJB21

pBCKS + plaB; D342N

1585

Cm

P1/P2/plaB_D342N

pJB22

pBCKS + plaB; D381N

1585

Cm

P1/P2/plaB_D381N

pJB23

pBCKS + plaB; H7N

1585

Cm

P1/P2/plaB_H7N

pJB24

pBCKS + plaB; H339N

1585

Cm

P1/P2/plaB_H339N

pJB25

pBCKS + plaB; H433N

1585

Cm

P1/P2/plaB_H433N

pJB26

pBCKS + plaB; H251N

1585

Cm

P1/P2/plaB_H251N

pJB27

pBCKS + plaB; S85A/S129A

1585

Cm

P1/P2/plaB_S85A/plaB_S129A

pJB28

pBCKS + plaB; S85A/D203N

1585

Cm

P1/P2/plaB_S85A/plaB_D203N

pJB29

pBCKS + plaB; S85A/H251N

1585

Cm

P1/P2/plaB_S85A/plaB_H251N

pJB31

pGEX-6P-1 + plaB; verkürzte Version von PlaB, AS 1-459; GST-Fusion, NTerminal

1390

Amp

plaB_TOPf2/plaB_truncC_P1

pJB32

pGEX-6P-1 + plaB; verkürzte Version von PlaB, AS 1-388; GST-Fusion, NTerminal

1177

Amp

plaB_TOPf2/plaB_truncC_P2

pJB33

pGEX-6P-1 + plaB; verkürzte Version von PlaB, AS 1-307; GST-Fusion, NTerminal

941

Amp

plaB_Ecof2/plaB_trunc3Eag

pJB36

pBCKS + plaB; T83V

1585

Cm

P1/P2/plaB_T83V

pJB37

pBCKS + plaB aus L. spiritensis

1445

Cm

PlaBspir_BamHI/PlaBspir_NotI

pJB43

pcDNA3.1(+)Flag + plaB

1498

Amp

plaB_fw_XbaI/plaB_EagIr

pJB46

pET28b (+) + plaB

1499

Amp

plaB_NdeI_f/plaB_EagIr

3.1.8.2 Verwendete Oligonukleotide und Sonden

Tabelle 3.10: Auflistung verwendeter Oligonukleotide und Sonden (K=Klonierung)

Primer

Primer

Nr.

Annealing-

Temperatur

Sequenz

Anwendung

AOX1_f

391

54°C

5’-gACTggTTCCAATTgACAAgC-3’

Sequenzierung

AOX2_r

392

54°C

5’-gCAAATggCATTCTgACATCC-3’

Sequenzierung

β-actin fw

865

65°C

5’-CCAACTgggACgACATggAg-3’

RT-PCR

β-actin rv

866

65°C

5’-CgTAgCCCTCgTAgATgggC-3’

RT-PCR

mip-fw

-

60°C

5’-CTTATAgCATTggTgCCgATTTggg-3’

Real-time PCR

mip-rv

-

60°C

5’-gTTCggTTAAAgCCAATTgAgCgC-3’

Real-time PCR

mip-Sonde

-

60°C

5’-FAM-TCATAgCgTCTTgCATgCCTTT

AgCCA-TMR-3’

Real-time PCR

T7Promo

289

54°C

5’-TAATACgACTCACTATAggg-3’

Sequenzierung

T7Terminat

290

54°C

5’-gCTAgTTATTgCTCAgCgg-3’

Sequenzierung

pBC_a1_f

212

55°C

5-ggTTTTCCCAgTCACgA-3’

Sequenzierung

pBC_b1_r

213

55°C

5’-CgCgCAATTAACCCTCAC-3’

Sequenzierung

pGEX_fw

605

54°C

5’-gggCTggCAAgCCACgTTTggTg-3’

Sequenzierung

pGEX_rv

606

54°C

5’-CCgggAgCTgCATgTgTCAgAgg-3’

Sequenzierung

plaB_6A-f

399

60°C

5’-CACCCATggCTggAgTgTCA-3’

RT-PCR

plaB_b1-r

235

50°C

5’-CCAgTAAgTACAAAggAATAg-3’

Sequenzierung

plaB_c1-r

236

50°C

5’-TgCTATATCCAAgTgTAAgAg-3’

K pJB01/pJB03

plaB_d1 f

237

57°C

5’-gCATTgAACCgggAAAgTgTg-3’

Sequenzierung

plaB_D75N

400

56°C

5’-gATAAgCTACgAAATgggCAgCgTT-3’

K pJB11

plaB_D167N

404

56°C

5’-gAAAgCTggCTTAATTATgATTgC-3’

K pJB20

plaB_D203N

401

56°C

5’-gAATCTggATCCAATggggTggTA-3’

K pJB12

plaB_D342N

405

56°C

5’-CACCTTATCAATTATgATCTTTACC-3’

K pJB21

plaB_D381N

406

56°C

5’-CTgACTTATTTTCTTAACTACgAT-3’

K pJB22

plaB_EagIr

362

56-62°C

5’-gACggCCgAATTgTggCTAgATgAC-3’

K pJB04, “site-directed”Mutantenund pJB14/15/18/

43/46

plaB_Ecof2

416

56°C

5’-CCggAATTCAggAgCgTTACCATgATTg-

TT-3’

K pJB14/15/18/33

plaB_f1_f

239

56°C

5’-gCgATgCCTgCAAgTAAAAAg-3’

Sequenzierung

plaB_g1_r

240

55°C

5’-gATTgCCgCggTCATCAA-3’

Sequenzierung

plaB_h1_f

372

52°C

5’-gCAgggTAATCTTgggTTTC-3’

Sequenzierung

plaB_H7N

407

56°C

5’-gTTATCTTCgTCAATggCTggAgT-3’

K pJB23

plaB_H251N

490

56°C

5’-CTACCTggACTTTCAAATTCCg -3’

K pJB26

plaB_H270N

402

56°C

5’-AATgCAgCCACTAACCCCACgg-3’

K pJB13

plaB_H339N

408

56°C

5’-gACCgCggCAATAACCTTAT-3’

K pJB24

plaB_H433N

409

56°C

5’-CACAAAATACTTAATCCgAATgAAA-3’

K pJB25

plaB_pBADf

350

56°C

5’-AggAgCgTTATgATTgTTATC-3’

K pJB02

plaB_pBADr

351

56°C

5’-ACgAAAgAggTATCCATCTATC-3’

K pJB02

plaB_S85A

363

56°C

5’-gTATCACTCACgCTACCggTgggCC-3’

K pJB06

plaB_S129A

364

56°C

5’-CAgCTTggCAAAgCCCgCCTAg-3’

K pJB07

plaB_S200A

365

56°C

5’-ACAggAgAAgCTggATCCgATg-3’

K pJB08

plaB_S229A

366

56°C

5’-gATAACggTgAAgCTCTTgTTgTCg-3’

K pJB09

plaB_S250A

367

56°C

5’-CTACCTggACTTgCACATTCCg-3’

K pJB10

plaB_SalIf

361

56°C

5’-gATgTCgACAAgCTTgAggATTgAg-3’

K pJB04 + “site-directed”Mutanten

plaBspir2r

429

60°C

5’-gTgTAggAgTTTACggCATC-3’

RT-PCR

PlaBspir_BamHI

942

55°C

5’-gAggATCCATgATTgTTATCTTCCTACAT-3’

K pJB37

plaB_NdeI_f

1271

55°C

5’-AgTCTTCATATgATTgTTATCTTCgTCCA-3’

K pJB46

PlaBspir_NotI

943

55°C

5’-gTTAgCggCCgCTCAATCTACCgTTTTT-

CC-3’

K pJB37

plaB_T83G

403

56°C

5’-TTgCTTgTATCggTCACTCTAC-3’

K pJB19

plaB_T83V

611

56°C

5’-TTgCTTgTATCgTTCACTCTACCg-3’

K pJB36

plaB_TOPOf

241

50°C

5’-CACCTTgTgAgACAACgATTC-3’

K pJB01

plaB_TOPf2

373

55°C

5’-CACCAgCgTTATgATTgTTATCT-3’

K pJB03/31/32

plaB_truncC_P1

564

56°C

5’-TCAAAggTTgTTgCTgATACggAAA-3’

K pJB31

plaB_truncC_P2

565

56°C

5’-TCATCCACCTTCCATAATATCgTAgTC-3’

K pJB32

plaB_trunc3Eag

613

56°C

5’-ACggCCgTCAATgCTCATTTTTCTgAgTC-3’

K pJB33

plaB_fw_XbaI

947

62°C

5’-gATCTAgAATgATTgTTATCTTCgTCCA-3’

K pJB43

RTgyr_a1f

285

55°C

5’-CACATATggCCggCTTTAgAg-3’

RT-PCR

RTgyr_b1r

286

55°C

5’-TCgCgCTTgTTTTgCTgAg-3’

RT-PCR

3.1.8.3 Verwendete Bakterien, Zellen und Versuchstiere

↓32

Tabelle 3.11: Auflistung verwendeter Bakterienstämme, Hefen, Zelllinien und Versuchstiere

Bakterienstamm / Zelllinie / Tiere

Katalog-Nr.

Herkunft

Bacillus subtilis ATCC

6633

Dr. Fruth

Escherichia coli BL21

C161003

Invitrogen

Escherichia coli DH5α

18258-012

Invitrogen

Escherichia coli XA90

-

D. Castor, ETH

Escherichia coli Top10

C664-55

Invitrogen

Klebsiella pneumoniae RKI 508

-

Dr. Fruth

L. anisa ATCC

35292

Dr. Neumeister

L. feelii ATCC

35072

Dr. Neumeister

L. gormanii ATCC

33297

Dr. Neumeister

L. jordanis ATCC

33623

Dr. Neumeister

L. longbeachae ATCC

33462

Dr. Neumeister

L. micdadei ATCC

33218

Dr. Neumeister

L. micdadei CDC

F976

Dr. Barry Fields

L. oakridgensis ATCC

33761

Dr. Neumeister

L. parisiensis ATCC

35299

Dr. Neumeister

L. pneumophila Sg1 130b

BAA-74

ATCC

L. pneumophila Sg1 130b plaB1

-

Rydzewski, NG5, RKI

L. pneumophila Sg1 Corby

-

[143]

L. pneumophila Sg1 Corby plaB1

-

[94]

L. pneumophila Sg1 L02-705

-

Dr. Lück

L. pneumophila Sg1 L03-638

-

Dr. Lück

L. pneumophila Sg3 L04-41

-

Dr. Lück

L. pneumophila Sg3 L05-410

-

Dr. Lück

L. pneumophila Sg1 L06-281

-

Dr. Lück

L. pneumophila Sg1 L07-2

-

Dr. Lück

L. pneumophila Sg1 L08-147

-

Dr. Lück

L. pneumophila Sg1 L08336

-

Dr. Lück

L. pneumophila Sg2 W08-231

-

Dr. Lück

L. pneumophila Wasserrohr-Isolat #251

-

Robert Koch-Institut

L. sainthelensis ATCC

35248

Dr. Neumeister

L. spiritensis ATCC

35249

Dr. Neumeister

L. steigerwaltii ATCC

35302

Dr. Neumeister

P. aeruginosa PA01

-

Dr. Häußler

S. aureus H1

-

Dr. Layer

P. pastoris GS115

K1710-01 (Kit)

Invitrogen

P. pastoris KM71

K1710-01 (Kit)

Invitrogen

Acanthamoeba castellanii

30234

ATCC

U937 Makrophagen

CRL-1593.2

ATCC

A549 Epithelzellen

CCL-185

ATCC

Meerschweinchen, Stamm Hartley, männlich, ca. 250-300g

-

Charles River

3.1.9 Verwendete und erzeugte gentechnisch veränderte Organismen (GVO)

Tabelle 3.12: Auflistung verwendeter und erzeugter gentechnisch veränderter Organismen (GVO)

Bezeichnung GVO

Klon-

Nr.

Konstrukt

Bemerkung

E. coli

TOP10 (pJB01)

6

pET160/GW/D-TOPO+plaB

Klonierung zur Überexpression von PlaB ohne tag

BL21 (pJB01)

1

pET160/GW/D-TOPO+plaB

Überexpression von PlaB ohne tag

TOP10 (pJB02)

4

pBAD202/D/TOPO+plaB

Klonierung zur Überexpression von PlaB mit C-terminalem 6× His-tag

BL21

1

pBAD202/D/TOPO+plaB

Überexpression von PlaB mit C-terminalem 6× His-tag

TOP10 (pJB03)

1

pET160/GW/D-TOPO+plaB

Klonierung zur Überexpression von PlaB mit N-terminalem 6× His-tag

BL21 (pJB03)

1

pET160/GW/D-TOPO+plaB

Überexpression von PlaB mit N-terminalem 6× His-tag

DH5α (pJB04)

11

pBCKS+plaB

Komplementationsvektor und Kontrollvektor für „site-directed“ Mutanten von PlaB

DH5α (pJB06)

3

pBCKS+plaB; S85A

site-directed“ Mutante S85A

DH5α (pJB07)

2

pBCKS+plaB; S129A

site-directed“ Mutante S129A

DH5α (pJB08)

6

pBCKS+plaB; S200A

site-directed“ Mutante S200A

DH5α (pJB09)

2

pBCKS+plaB; S229A

site-directed“ Mutante S229A

DH5α (pJB10)

1

pBCKS+plaB; S250A

site-directed“ Mutante S250A

DH5α (pJB11)

5

pBCKS+plaB; D75N

site-directed“ Mutante D75N

DH5α (pJB12)

5

pBCKS+plaB; D203N

site-directed“ Mutante D203N

DH5α (pJB13)

2

pBCKS+plaB; H270N

site-directed“ Mutante H270N

DH5α (pJB14)

3

pPIC3.5+plaB

Klonierung zur Überexpression von PlaB in P. pastoris, intrazelluläre Version

DH5α (pJB15)

8

pPIC9+plaB

Klonierung zur Überexpression von PlaB in P. pastoris, sekretierte Version

DH5α (pJB18)

1

pGEX-5X-1+plaB

Klonierung zur Überexpression von PlaB mit N-terminalem GST-tag

BL21 (pJB18)

1 sk3*

pGEX-5X-1+plaB

Überexpression von PlaB mit N-terminalem GST-tag

XA90 (pJB18)

1

pGEX-5X-1+plaB

Überexpression von PlaB mit N-terminalem GST-tag

DH5α (pJB19)

2 sk1*

pBCKS+plaB; T83G

site-directed“ Mutante T83G

DH5α (pJB20)

3 sk1*

pBCKS+plaB; D167N

site-directed“ Mutante D167N

DH5α (pJB21)

10 sk1*

pBCKS+plaB; D342N

site-directed“ Mutante D342N

DH5α (pJB22)

2 sk4*

pBCKS+plaB; D381N

site-directed“ Mutante D381N

DH5α (pJB23)

4

pBCKS+plaB; H7N

site-directed“ Mutante H7N

DH5α (pJB24)

2 sk1*

pBCKS+plaB; H339N

site-directed“ Mutante H339N

DH5α (pJB25)

4

pBCKS+plaB; H433N

site-directed“ Mutante H433N

DH5α (pJB26)

2

pBCKS+plaB; H251N

site-directed“ Mutante H251N

DH5α (pJB27)

1

pBCKS+plaB; S85A/S129A

site-directed“ Doppelmutante S85A/S129A

DH5α (pJB28)

1 sk4*

pBCKS+plaB; S85A/D203N

site-directed“ Doppelmutante S85A/D203N

DH5α (pJB29)

2

pBCKS+plaB; S85A/H251N

site-directed“ Doppelmutante S85A/H251N

DH5α (pJB31)

1

pGEX-6P-1+plaB; AS 1-459

Klonierung verkürzter PlaB-Version; AS 1-459

BL21 (pJB31)

4

pGEX-6P-1+plaB; AS 1-459

Überexpression verkürzter PlaB-Version; AS 1-459

DH5α (pJB32)

9

pGEX-6P-1+plaB; AS 1-388

Klonierung verkürzter PlaB-Version; AS 1-388

BL21 (pJB32)

1

pGEX-6P-1+plaB; AS 1-388

Überexpression verkürzter PlaB-Version; AS 1-388

DH5α (pJB33)

1

pGEX-6P-1+plaB; AS 1-307

Klonierung verkürzter PlaB-Version; AS 1-307

BL21 (pJB33)

1

pGEX-6P-1+plaB; AS 1-307

Überexpression verkürzter PlaB-Version; AS 1-307

DH5α (pJB36)

1

pBCKS+plaB; T83V

site-directed“ Mutante T83V

DH5α (pJB37)

1

pBCKS+plaB aus L. spiritensis

Klonierung L. spiritensis plaB in pBCKS-Vektor

DH5α (pJB43)

2

pcDNA3.1(+)Flag+plaB

Klonierung plaB zur Transfektion von A549 Zellen; N-terminale Fusion zu FLAG-Epitop

DH5α (pJB46)

4

pET28b(+)+plaB

Klonierung von plaB zur in vitro Translation, Shine Dalgarno 7bp vor Startkodon

L. pneumophila Corby

Wildtyp (pBCKS)

1

pBCKS

Kontrollstamm für Versuche

plaB1 (pBCKS)

1

pBCKS

Kontrollstamm für Versuche

plaB1 (pKH192)

-

pBCKS (Heuner)

Komplementationsvektor; AS101-Substitution N♢S; von Klaus Heuner

plaB1 (pJB04)

1

pBCKS+plaB

Komplementationsvektor und Kontrollvektor für „site-directed“ Mutanten von PlaB

plaB1 (pJB06)

1

pBCKS+plaB; S85A

site-directed“ Mutante S85A

plaB1 (pJB07)

1

pBCKS+plaB; S129A

site-directed“ Mutante S129A

plaB1 (pJB08)

1

pBCKS+plaB; S200A

site-directed“ Mutante S200A

plaB1 (pJB09)

1

pBCKS+plaB; S229A

site-directed“ Mutante S229A

plaB1 (pJB10)

1

pBCKS+plaB; S250A

site-directed“ Mutante S250A

plaB1 (pJB11)

1

pBCKS+plaB; D75N

site-directed“ Mutante D75N

plaB1 (pJB12)

1

pBCKS+plaB; D203N

site-directed“ Mutante D203N

plaB1 (pJB13)

1

pBCKS+plaB; H270N

site-directed“ Mutante H270N

plaB1 (pJB19)

1

pBCKS+plaB; T83G

site-directed“ Mutante T83G

plaB1 (pJB20)

1

pBCKS+plaB; D167N

site-directed“ Mutante D167N

plaB1 (pJB21)

1

pBCKS+plaB; D342N

site-directed“ Mutante D342N

plaB1 (pJB22)

1

pBCKS+plaB; D381N

site-directed“ Mutante D381N

plaB1 (pJB23)

1

pBCKS+plaB; H7N

site-directed“ Mutante H7N

plaB1 (pJB24)

1

pBCKS+plaB; H339N

site-directed“ Mutante H339N

plaB1 (pJB25)

1

pBCKS+plaB; H433N

site-directed“ Mutante H433N

plaB1 (pJB26)

1

pBCKS+plaB; H251N

site-directed“ Mutante H251N

plaB1 (pJB27)

1

pBCKS+plaB; S85A/S129A

site-directed“ Doppelmutante S85A/S129A

plaB1 (pJB28)

1

pBCKS+plaB; S85A/D203N

site-directed“ Doppelmutante S85A/D203N

plaB1 (pJB29)

1

pBCKS+plaB; S85A/H251N

site-directed“ Doppelmutante S85A/H251N

plaB1 (pJB36)

1

pBCKS+plaB; T83V

site-directed“ Mutante T83V

plaB1 (pJB37)

1

pBCKS+plaB aus L. spiritensis

Expression von L. spiritensis plaB in pBCKS-Vektor

P. pastoris

Pp01

1-3

pPIC9+plaB

Überexpression und Sekretion von PlaB in P. pastoris GS115

Pp02

1

pPIC9+plaB

Überexpression und Sekretion von PlaB in P. pastoris KM71

Pp03

1/2

pPIC3.5+plaB

Intrazelluläre Überexpression von plaB in P. pastoris GS115

Pp04

1/2

pPIC3.5+plaB

Intrazelluläre Überexpression von plaB in P. pastoris KM71

*Anmerkung: Einige Stämme sind nach erneutem Ausstreichen für die Herstellung von Glyzerolgefrierkulturen nur in Einzelkolonien gewachsen. Daher wurde von den Einzelkolonien erneut eine Kolonie-PCR durchgeführt und positive Klone als Subklone (=sk) weggefroren. Diese zeigten kein verändertes Wuchsverhalten mehr und wurden für alle weiteren Versuche verwendet.

3.1.10 Kulturmedien für Bakterien und Zellen

Tabelle 3.13: Auflistung verwendeter Nährmedien zur Anzucht von L. pneumophila

BYE-Flüssigmedium

(BYE: Buffered Yeast Extract)

BCYE-Agar-Platten

(BCYE: Buffered Charcoal Yeast Extract)

10 g Hefeextrakt

27,5 g Legionella Basis-Agar:

14,45 g Legionella Wachstums-Supplement:

10 g Hefeextrakt

10 g ACES Puffer

1,5 g Aktivkohle

2,8 g KOH

16 g Agar

1,0 g α-Ketoglutarat-Monoessigsäure-Salz

14,45 g Legionella Wachstums-Supplement:

0,4 g L-Cystein HCl

10 g ACES

H2Obidest zu 1000 ml

2,8 g KOH

1,0 g α-Ketoglutarat-Monoessigsäure Salz

0,4 g L-Cystein HCl

H2Obidest zu 1000 ml

Das Legionella Waschstums-Supplement wurde mit Hefeextrakt in H2Obidest gelöst und steril filtriert.

Der Legionella Basis Agar wurde in H2Obidest suspendiert und autoklaviert. Das Legionella Wachstums-Supplement wurde wie beschrieben angesetzt und nach dem Autoklavieren steril bei 50°C zugegeben.

↓33

Tabelle 3.14: Auflistung der Nährmedien zur Anzucht von E. coli

Luria-Bertani (LB)-Flüssigmedium

Luria-Bertani (LB)-Agar-Platten

10 g Trypton

10 g Trypton

5 g Hefeextrakt

5 g Hefeextrakt

5 g NaCl

5 g NaCl

H2Obidest zu 1000 ml

15 g Agar

H2Obidest zu 1000 ml

Die Bestandteile der beiden Medien wurden zunächst in H2Obidest gelöst und anschließend autoklaviert.

SOB-Medium (pH 7,0)

(Super Optimal Broth Medium)

SOC-Medium

(Super Optimal Broth-Derivat)

20 g Trypton

98 ml SOB-Medium

5 g Hefeextrakt

1 ml 2M Mg2+ Stammlösung (20,33 g MgCl2 × H2O und 24,65 g MgSO4 x 7 H2O je 100ml Stammlösung)

0,584 g NaCl

0,186 g KCl

1 ml 2M Glukose Stammlösung (36,04 g Glukose je 100 ml Stammlösung)

H2Obidest zu 1000 ml

Die Bestandteile wurden zunächst in H2Obidest gelöst und anschließend autoklaviert.

Vor der Zugabe der Lösungen zum SOB-Medium wurde die Mg2+-Stammlösung autoklaviert und die Glukose-Stammlösung steril filtriert.

Tabelle 3.15: Auflistung der Nährmedien zur Anzucht von P. pastoris

YPD Kulturmedium

(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)

MD Selektivagar

(Minimal Dextrose Medium)

10 g Hefeextrakt

100 ml 10× (13,4%) YNB

10 g Pepton

2 ml 500× (0,02%) Biotin

20 g Dextrose (Glukose)

100 ml 10× (20%) Glukose

optional: 20 g Agar für Festmedium

20 g Agar

H2Obidest zu 1000 ml

H2Obidest zu 1000 ml

Hefeextrakt und Pepton wurden in H2O gelöst und autoklaviert. Anschließend wurde die steril filtrierte Glukoselösung zugegeben.

Wasser und Agar wurde vor Zugabe der steril filtrierten Bestandteile autoklaviert.

BMGY/BMMY Kulturmedium

(Buffered Glycerol or Methanol-complex-Medium)

10 g Hefeextrakt

20 g Pepton

100 ml 1M Kaliumphosphatpuffer pH 6.0

100 ml 10× (13,4%) YNB

2 ml 500× (0,02%) Biotin

100 ml 10× (10%) Glyzerol oder

100 ml 10× (5%) Methanol

H2Obidest zu 1000 ml

Hefeextrakt, Pepton und H2O wurden vor Zugabe der steril filtrierten Bestandteile autoklaviert.

Tabelle 3.16: Auflistung verwendeter Nährmedien zur Anzucht von A. castellanii und zur Infektion der Amöben mit L. pneumophila

PYG Kulturmedium

(Peptone-Yeast Extract-Glucose)

Infektionsmedium

20 g Pepton

Bestandteile wie PYG Kulturmedium ohne Pepton, Hefeextrakt und Glukose

1 g Hefeextrakt

10 ml 400mM MgSO4 × 7 H2O

10 ml 40mM CaCl2 × 2 H2O

10 ml 250mM Na2HPO4 × 7 H2O

10 ml 250mM KH2PO4

10 ml 5mM Fe(NH4)2(SO4)2 × 6 H2O

Alle Bestandteile, außer Glukose, wurden in H2Obidest gelöst und autoklaviert. Anschließend wurde die steril filtrierte Glukoselösung dazugegeben.

2,5 g NaCitrat × 2 H2O

50 ml 2M Glukose

900 ml H2Obidest

↓34

Tabelle 3.17: Auflistung des Nährmediums für die Kultivierung und Infektion von U937 Makrophagen und A549 Lungenepithelzellen

RPMI Kultur- und Infektionsmedium mit 10 % FKS

(Roswell Park Memorial Institute Medium)

RPMI 1640 Pulver oder Flüssigmedium

10 % hitzeinaktiviertes FKS

Das Medium wurde nach Angaben des Herstellers angesetzt.

Tabelle 3.18: Auflistung verwendeter Antibiotika und deren Endkonzentration im Medium

Antibiotikum

Stammlösung

Endkonzentration für L. pneumophila (µg/ml)

Endkonzentration für E. coli (µg/ml)

Ampicillin (Amp)

100 g/l H2Obidest 

-

100

Carbenicillin (Carb)

100 g/l H2Obidest

-

100

Chloramphenicol (Cm)

30 g/l EtOH

6

30

Kanamycinmonosulfat (Km)

50 g/l H2Obidest

25

50

Die Stammlösungen wurden steril filtriert, Aliquots bei -20°C gelagert und den autoklavierten Medien in den angegebenen Endkonzentrationen zugesetzt.

3.1.11 Verwendete Software

Tabelle 3.19: Verwendete Software und Internet-Datenbanken

Datenbank

Adresse

Biocyc

http://www.biocyc.org/

COILS Server

http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html

Compute pI/MW tool

http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html

Kyte-Doolittle Hydropathy Plot

http://gcat.davidson.edu/rakarnik/kyte-doolittle.htm

NCBI

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

PEDANT

http://pedant.gsf.de/

ProtCompB

http://linux1.softberry.com/berry.phtml

PSITE

http://linux1.softberry.com/berry.phtml

Sequenz-Alignment

http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html

SignalP 3.0

http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

Programme

Hersteller

Acolyte (Koloniezählprogramm)

Synbiosis

Bio 1D

Vilber Lourmat

Lasergene 8

DNASTAR, Inc.

Magellan V5.03

Tecan

Opus 5.0

Bruker

Origin 8.0

OriginLab

PrimeView & PrimeView Evaluation

Amersham

Prism 5

GraphPad Software, Inc.

Quantity One

Bio-Rad

RayBio® Human Inflammation Antibody Array III and 3.1 Analysis Tool

RayBiotech, Inc

3.2 Methoden

3.2.1 Anzucht von Bakterien und Hefen

3.2.1.1  Legionella pneumophila

↓35

Bei –80°C gelagerte Legionellen wurden mittels einer sterilen Impföse auf BCYEα Agar ausgestrichen („Mutterplatte“) und nach 2 Tagen Inkubation bei 37°C entweder für ca. 1 Monat bei 4°C gelagert oder wiederum auf BCYEα Agar überimpft („Tochterplatte“). Die plaB Kanamycinresistenzkassetten-Insertionsmutante von L. pneumophila wurde zuerst auf antibiotikahaltigen (s. Tabelle 3.18) Mutterplatten ausgestrichen, zur weiteren Verwendung aber auf BCYEα-Platten ohne Antibiotikum kultiviert. Plasmidtragende Bakterien wurden grundsätzlich auf BCYE-Agarplatten mit entsprechenden Antibiotikakonzentrationen angezogen (s. Tabelle 3.18).

Für Infektionen wurden die Kulturen für 2 bis 3 Tage bei 37°C auf Festagar inkubiert. Flüssigkulturen hingegen wurden auf Festmedium für 1 1/2 Tage bei 37°C bebrütet und anschließend zum Animpfen einer Vorkultur in BYE-Nährbouillon mit/ohne Antibiotika verwendet. Diese Vorkultur wurde über Nacht bei 37°C und 250rpm geschüttelt. Nach photometrischer Bestimmung der optischen Dichte bei 660nm wurde die Hauptkultur auf eine OD660 von 0.3-0.4 eingestellt und unter Schütteln bis zur späten (OD660 ~2,0) exponentiellen Phase kultiviert.

Zur Herstellung von Zellpelletlysaten und Kulturüberständen für Aktivitätstests erfolgte die Zellernte mittels Zentrifugation bei 5.000 × g für 5min. Kulturüberstände wurden mit 1/50 Volumen an 300mM NaN3 versetzt und bei 4°C, Bakterienpellets bis zum Zellaufschluss bei –20°C gelagert.

3.2.1.2  Escherichia coli

↓36

Die Kultivierung von E.   coli Wildtypen (s. Tabelle 3.11) und die der mit Plasmiden transformierten Stämme (s. Tabelle 3.12) erfolgte aus Glyzerolstockkulturen (s. 3.2.1.4) auf entsprechenden LB-Agarplatten für 18-24h bei 37°C. Ebenso wie bei L. pneumophila wurden E. coli Stämme auf Tochterplatten überimpft, davon Vorkulturen inokuliert und anschließende Hauptkulturen bei Erreichen einer OD660 ~2.0 geerntet. Die Induktion der Expression eines in trans enthaltenen Gens erfolgte durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1mM) zu Beginn der frühen exponentiellen Phase (OD660 der Kultur von 0,6 bis 0,8). Die Expression wurde für 4h bei 37°C fortgeführt und die Zellen anschließend durch Zentrifugation geerntet und weiterverarbeitet (s. 3.2.11.4).

Zur Anzucht der E. coli Zellen für die Präparation von extrachromosomaler DNA wurden entsprechende Kolonien gepickt und auf eine frische antibiotikahaltige LB-Agarplatte überimpft, bevor diese zur Inokulation der Präparationskultur verwendet wurde. 2ml einer Übernachtkultur (OD660 ca. 2,5) wurden pelletiert und anschließend die plasmidale DNA extrahiert (s. 3.2.3.3).

3.2.1.3  Pichia pastoris

Nach Wachstum auf YPD- oder MD-Selektiv-Agarplatten (s. Tabelle 3.15) für 24h erfolgte die Kultivierung von P. pastoris bei 250rpm und 30°C (Tischinkubator) in YPD-Flüssigmedium zur Extraktion chromosomaler DNA. Für die Überexpression erfolgte die Anzucht der Vorkulturen in BMGY, bevor die Zellen zur Induktion der Proteinexpression bei OD660 von 4 bis 5 geerntet (5.000 × g, 5min) und auf eine Ausgangssuspension von OD660 ~0,9 in BMMY-Flüssigmedium eingestellt wurden. Methanol wurde im 24h-Takt zu einer Endkonzentration von 0,5% des Kulturvolumens zugegeben, um die Expression des Zielproteins aufrecht zu erhalten.

3.2.1.4 Herstellung von Glyzerolgefrierkulturen

↓37

Zur Erzeugung von Langzeitkulturen wurden L. pneumophila, E. coli und P. pastoris (s. Tabelle 3.12) 1-2 Tage auf den zugehörigen Selektivagarplatten angezogen, bis sich ein gut bewachsener Rasen gebildet hatte. Anschließend wurde eine volle Impföse des jeweiligen Stammes in der zugehörigen Nährbouillon ohne Antibiotika resuspendiert und im Volumenverhältnis 1:1 mit sterilem Glyzerol vermischt. Die Lagerung der Kulturen erfolgte bei -80°C.

3.2.2 Anzucht von A549 Lungenepithelzell-, U937 Makrophagen- und
Acanthamoeba- Zellkulturen

Die in flüssigem Stickstoff in Kulturmedium (PYG bzw. RPMI) + 10% DMSO eingefrorenen Zellen wurden bei 37°C im Brutschrank aufgetaut und 2min bei 1.000 x g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde anschließend in Kulturmedium resuspendiert und erneut bei 1.000 x g für 10min pelletiert. Daraufhin wurden die Zellen erneut in Kulturmedium resuspendiert (10ml) und in ein Kulturgefäß überführt. Nach 3 (A. castellanii) bzw. 10 Tagen Inkubation (U937, A549) bei 37°C und 5% CO2 wurden die Zellen erstmalig passagiert. Anschließend wurden die Zellen in Intervallen von 3 bis 4 Tagen regelmäßig passagiert (maximal 30-mal), wobei das Verhältnis von 1:10 bis 1:12 (v/v), Zellen zu Wachstumsmedium, bei den jeweiligen Inkubationslängen berücksichtigt wurde.

3.2.3 Isolierung von Nukleinsäuren

3.2.3.1 Isolierung von chromosomaler DNA aus Lungengewebe

Zur quantitativen Bestimmung der Bakterienlast mittels real-time PCR Analyse, wurden 50mg Lungengewebe von allen Tieren, dies entsprach 50µl Homogenisat, mit 1ml des „DNA Isolation Reagent for Genomic DNA“ (AppliChem) vermischt. Die Isolierung erfolgte nach Angaben des Herstellers, mit Ausnahme, dass die präzipitierte DNA nicht sedimentiert, sondern mittels einer sterilen Pipettenspitze in ein neues Reaktionsgefäß überführt wurde. Nach Zugabe von 100µl H2O wurde die DNA über Nacht bei 55°C inkubiert, um eine maximale Löslichkeit der Nukleinsäure zu erreichen.

3.2.3.2 Isolierung von chromosomaler DNA aus P. pastoris

↓38

Nach der Methode von Harju et al. [120] wurden 2ml einer Übernachtkultur pelletiert (16.000 × g, 2min) und in 200µl Lysispuffer (s. Tabelle 3.5) resuspendiert. Die Zelllyse erfolgte nach der „freeze and thaw“-Methodik. Hierzu wurden die Ansätze abwechselnd in flüssigen Stickstoff getaucht, bis die Lysate komplett gefroren waren, und anschließend in einem 95°C warmen Wasserbad wieder zum Auftauen gebracht. Nach dreimaligem Wiederholen des Vorganges und abschließendem starken Vortexen für 30sek, wurden die Ansätze mit 200µl Chloroform vermischt, erneut für 2min geschüttelt (Vortexer Mixer) und für 3,5min bei 16.000 × g und Raumtemperatur (RT) zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in ein neues Gefäß überführt, mit 400µl eiskaltem EtOH vermischt und für 5min bei RT inkubiert, um die Präzipitation des Nukleinsäurekomplexes zu ermöglichen. Die Pelletierung der DNA erfolgte für 6min bei 16.000 × g (RT). Erhaltenes Präzipitat wurde 1× mit 500µl an 70%igem (v/v) EtOH gewaschen, erneut 4min bei 16.000 × g zentrifugiert und im 37°C-Inkubator getrocknet. Die Konzentration der in 30µl H2O solubilisierten DNA wurde anschließend bei 260nm im Spektrophotometer (Nanodrop-Gerät) bestimmt. Die Lagerung der Nukleinsäure erfolgte bei -20°C.

3.2.3.3 Isolierung von extrachromosomaler DNA

Die Isolierung von Plasmid-DNA erfolgte mittels des Kits „Wizard ®   Plus SV Minipreps DNA Purification System“ der Firma Promega nach dem Protokoll des Herstellers. Die hiermit gewonnene DNA wurde quantitativ durch Messung der optischen Dichte bei 260nm im Spektrophotometer bestimmt und für weitere Experimente wie z. B. der „site-directed Mutagenese, Restriktion durch Endonukleasen und Sequenzierreaktionen verwendet.

3.2.3.4 RNA-Isolierung

Die Isolierung erfolgte mit Hilfe des peqGOLD RNAPureTM Reagenz (PeqLab), einer optimierten Guanidinisothiocyanat/Phenol-Methode zur Extraktion von RNA humanen, tierischen und bakteriellen Ursprungs. Hierbei wurde, nach Angaben des Herstellers, 1ml peqGOLD RNAPureTM zu 500µl einer Bakterienkultur der OD660=2, oder 1ml der Reagenz pro well einer 24-well Zellkuturplatte zugegeben und mit dem empfohlenen Protokoll fortgefahren. Isolierte RNA wurde in 40µl H2O gelöst und quantitativ/qualitativ im Spekrophotometer untersucht.

3.2.4 Fällung von Nukleinsäuren mittels EtOH

↓39

Um nach erfolgter Ligation von Fragmenten reine und aufkonzentrierte DNA zu erhalten, wurde die Nukleinsäure mittels EtOH gefällt. Die zu fällende Lösung wurde mit einer Endkonzentration an 0,3M Natriumazetat pH7,0 und dem doppelten Volumenanteil an unvergälltem 95%igen (v/v) EtOH vermischt und anschließend für 15min bei 16.000 × g und 4°C sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen, das unsichtbare DNA-Präzipitat mit 70% (v/v) EtOH versetzt und erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde anschließend für ca. 15min bei 37°C getrocknet, in 2µl sterilem 10%igem (v/v) Glyzerol aufgenommen und sofort in E. coli DH5α transformiert.

3.2.5 Nukleinsäure-Gelelektrophorese

Die Auftrennung der Nukleinsäuren erfolgte mittels 1 bis 2%igen (w/v) Agarosegelen in 1×TAE-Puffer. Die Proben wurden mit etwa 0,2 Volumenanteilen Probenpuffer (s. Tabelle 3.5) versetzt und bei 105 bis 140V bis zur angestrebten Laufstrecke aufgetrennt. Die anschließende Färbung der Nukleinsäurebanden erfolgte für ca. 20 Minuten im Ethidiumbromid-Bad (2μg/ml EtBr in 1×TAE) und wurde im UV-Transluminator bei 254nm dokumentiert.

Bei präparativen Gelen wurden die Banden mit einem Skalpell aus dem Gel geschnitten und unter Verwendung des „Wizard SV Gel & PCR cleanup System“ eluiert.

3.2.6 Modifikation von Nukleinsäuren

3.2.6.1 Verdau mit Restriktionsendonukleasen/Dephosphorylierung

↓40

Die Restriktion mittels Typ II Restriktionsendonukleasen erfolgt spezifisch innerhalb ihrer, meist palindromer, Erkennungssequenz an doppelsträngiger DNA. Alle Restriktionsenzyme wurden von der Firma New England Biolabs (NEB) erworben und mit den zugehörigen Puffern in die jeweiligen Reaktionen eingesetzt. Für den Verdau von 1µg DNA wurden 10U an Enzym in einem Reaktionsvolumen von meist 20µl verwendet und für 2-12h bei 37°C (Temperatur ist abhängig von dem verwendeten Enzym) inkubiert. Zur Überprüfung erfolgter Restriktion wurden die Fragmente auf ein 1%iges (w/v) Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch ihrer Größe nach aufgetrennt.

Wenn von Interesse, wurde der geschnittene Vektor mit Hilfe einer alkalischen Phosphatase (Schrimp Alkaline Phosphatase, SAP, Roche) dephosphoryliert, um eine Religation des Vektors zu minimieren. Hierzu konnte der hitzeinaktivierte Restriktionsenzym/DNA-Mix ohne einen zusätzlichen Reinigungsschritt verwendet werden. Nach Zugabe von SAP-Puffer und 1U an SAP-Enzym wurde der Ansatz 60min bei 37°C inkubiert und anschließend für 15min bei 65°C inaktiviert.

Um die Puffer- und Enzymreste zu entfernen, wurden die Fragmente mittels des „Wizard SV Gel & PCR cleanup System“ (Promega) entweder direkt aus dem PCR-Ansatz oder nach erfolgter Elektrophorese aus dem Gel ausgeschnitten und gereinigt. Die Konzentrationsbestimmung für anschließende Ligationsansätze (s. 3.2.6.2) wurde mit Hilfe des Nanodrop-Gerätes durchgeführt.

3.2.6.2 Ligation von DNA Fragmenten

↓41

Die Ligation der DNA-Fragmente erfolgte mit Hilfe der DNA Ligase des Bakteriophagen T4. Dabei wurde die Ligation meist in einem Reaktionsvolumen von 10µl durchgeführt. Ungefähr 50ng an Vektor-DNA wurde im molaren Verhältnis von 1:3 mit dem zu insertierenden DNA-Fragment vermischt und unter Zugabe von 400U T4 DNA Ligase für 15-18h bei 16°C oder für 3h bei 25°C inkubiert. Anschließend wurden die Reaktionsansätze für 10min bei 65°C hitzeinaktiviert und mittels EtOH-Fällung (s. 3.2.4) für die Transformation in die jeweiligen Bakterienstämme vorbereitet.

3.2.6.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR)

Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) dient der exponentiellen Amplifikation von Nukleotid-Fragmenten. In dieser Arbeit wurde zu Klonierungszwecken die DNA-Polymerase aus Pyrococcus furiosus (Pfu DNA-Polymerase) und zur Überprüfung positiver Klone, mittels Kolonie-PCR, die DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq DNA-Polymerase) verwendet. Die Reaktionsansätze wurden in einem Volumen von 25μl angesetzt und hatten folgende Zusammensetzung:

Tabelle 3.20: Reaktionsansatz für eine Standard- und Kolonie-PCR

Komponente

[µl]

Stocklösung

Finale Konzentration

DNA

1 Kolonie (Kolonie-PCR) oder

20-200 ng DNA

-

-

Puffer

2,5

10-fach konzentriert

1-fach konzentriert

dNTPs

0,25

10 mM jedes dNTP

0,1 mM jedes dNTP

Oligonukleotid 1

0,25

50 µM

0,5 µM

Oligonukleotid 2

0,25

50 µM

0,5 µM

DNA-Polymerase

1µl (Pfu) oder 0,25µl (Taq)

2,5 U/µl oder 5 U/µl

0,1 U/µl oder

0,05 U/µl

steriles H2O

zu 25µl Gesamtansatz

-

-

↓42

Die Annealingtemperatur wurde den Oligonukleotiden spezifisch angepasst. Für die Kolonie-PCR wurden die zu untersuchenden Zellen vor der PCR mit PCR-Puffer und Wasser für 10min bei 99°C lysiert. Anschließend wurde der Enzym-Primer-Mix zugegeben und folgendes Standard-Programm zur Amplifikation der gewünschten Produkte verwendet:

Tabelle 3.21: Programm für eine Standard-und Kolonie-PCR

Reaktionsschritt

Anzahl der Zyklen

Temperatur

Zeit

1. Denaturierung

1

95°C

4 min

2. Denaturierung

30

95°C

40 sek

3. Primer-Bindung (Annealing)

30

50-65°C

40 sek

4. Synthese (Elongation)

30

72°C

1-2 min

5. Finale Elongation

1

72°C

10 min

6. Pause

4°C

Amplifizierte DNA-Fragmente wurden auf 1%igen (w/v) Agarosegelen elektrophoretisch überprüft und gegebenenfalls weiter gereinigt.

3.2.6.4 Einfügen von Punktmutationen mittels „Combined Chain Reaction“ (CCR)

↓43

Für die zielgerichtete Substitution von Basenpaaren wurde die Methode der „Combined Chain Reaction“ (CCR) nach Bi und Stambrook angewendet [27]. Bei dieser speziellen Art der PCR-Technik wird ein dritter Primer, der die gewünschte Mutation trägt, zu dem PCR-Ansatz gegeben und im laufenden Syntheseprozess von einer thermostabilen Ligase (Ampligase) mit dem fortlaufenden Nukleotidstrang verknüpft. Um dies zu ermöglichen, muss das Oligonukleotid am 5’-Ende phosphoryliert sein. Die Phosphorylierungsreaktion von insgesamt 500pmol an Mutageneseprimer wurde in 1× T4 DNA-Ligasepuffer und 5U an T4 Polynukleotidkinase in einem Gesamtvolumen von 20µl für 1h bei 37°C durchgeführt. Die Reinigung des hitzeinaktivierten (20min bei 65°C) Ansatzes erfolgte mittels EtOH-Fällung (s. 3.2.4). Das Pellet wurde in 30µl sterilem H2O resuspendiert und auf eine Endkonzentration von 20ng/µl an phosphorylierten Oligonukleotiden für die anschließende CCR Reaktion eingestellt. Zur Herstellung von Einfachmutanten wurde pJB04 als Ausgangsplasmid gewählt, für die Doppelmutanten diente pJB06 (S85A-PlaB) als Amplifikationsgrundlage.

Tabelle 3.22: Reaktionsansatz für eine „Combined Chain Reaction“ (CCR)

Komponente

[µl]

Stocklösung

Finale Konzentration

Plasmid pJB04/pJB06

1

20 ng/µl

1 ng/µl

CCR Puffer

2

10-fach konzentriert

1-fach konzentriert

dNTPs

0,5

10 mM jedes dNTP

0,25 mM jedes dNTP

BSA

2

4 mg/ml

0,4 mg/ml

Oligonukleotid 1

1

20 ng/µl

1 ng/µl

Oligonukleotid 2

1

20 ng/µl

1 ng/µl

Mutagenese Primer

1

20 ng/µl

1 ng/µl

Pfu Polymerase

0,5

2,5 U/µl

0,062 U/µl

Ampligase

0,6

5 U/µl

0,15 U/µl

steriles H2O

zu 20µl

-

-

Das PCR-Programm für die CCR stellte sich wie folgt zusammen:

↓44

Tabelle 3.23: PCR-Programm für eine CCR-Reaktion

Reaktionsschritt

Anzahl der Zyklen

Temperatur

Zeit

1. Denaturierung

1

96°C

2 min

2. Denaturierung

30

96°C

30 sek

3. Primer-Bindung (Annealing)

30

56°C

30 sek

4. Synthese (Elongation)

30

72°C

4 min

5. Finale Elongation

1

72°C

7 min

6. Pause

4°C

Die erhaltenen Fragmente wurden auf ihre Reinheit mittels eines 1%igen (w/v) Agarosegels untersucht, gereinigt, mit den Restriktionsendonukleasen SalI und EagI geschnitten und in den, mit diesen Enzymen, linearisierten Vektor pBCKS (s. Tabelle 3.8) ligiert.

3.2.6.5 Real-time Polymerase Kettenreaktion

Für die quantitative Bestimmung der Bakterienlast in Meerschweinchen wurde Gesamt-DNA aus den infizierten Lungen extrahiert (s. 3.2.3.1) und 50ng in Zweifachbestimmung mittels einer Legionella-spezifischen mip (macrophage infectivity potentiator) Gen-Sonde in der real-time PCR analysiert. Die Sonde trug ein 5’-FAM-Fluorophor (Fluorescein) und einen 3’-TMR (tetramethylrhodamine)-Quencher. Anschließend wurden die Werte auf das Ausgangsvolumen, sprich der Lungenmenge, hochgerechnet und demnach als Bakterienlast pro Lunge angegeben (mip Kopienzahl/Lunge). Die PCR und das zugehörige Programm setzten sich wie folgt zusammen:

↓45

Tabelle 3.24: Reaktionsansatz für eine real-time PCR

Komponente

[µl]

Stocklösung

Finale Konzentration

DNA

10

variabel

2 ng/µl

Platinum Taq Puffer

2,5

10-fach konzentriert

1-fach konzentriert

dNTP Mix

2

2,5 mM jedes dNTP

0,2 mM jedes dNTP

MgCl2

0,8

50 mM

1,6 mM

Oligonukleotid 1

0,75

10 µM

0,3 µM

Oligonukleotid 2

0,75

10 µM

0,3 µM

Mip-Sonde

0,25

10 µM

0,1 µM

ROX

0,25

10 µM

0,1 µM

Platinum Taq

0,1

5 U/µl

0,02 U/µl

steriles H2O

7,6

-

-

Tablle 3.25: Programm für eine real-time PCR:

Reaktionsschritt

Anzahl der Zyklen

Temperatur

Zeit

1. Initiale PCR-Aktivierung

1

95°C

10 min

2. Denaturierung

45

95°C

15 sek

3. Annealing und Elongation

45

60°C

1 min

4. Pause

4°C

3.2.6.6 Reverse Transkriptase –Polymerase Kettenreaktion

Für die Bestimmung der Gen-Expression wurde die Methodik der reversen Transkription angewandt. Hierzu wurde isolierte RNA (s. 3.2.3.4) von DNA-Kontaminationen durch den Einsatz von TurboTM DNase (Ambion) befreit. 2U Enzym pro 1µg RNA und 1µl RNaseOUTTM wurden in einem Reaktionsvolumen von 10µl für 1h bei 37°C inkubiert, bevor die DNase durch Temperaturerhöhung auf 75°C für 10min inaktiviert wurde. 1µl des DNase-Restriktionsansatzes wurde in weiterführenden RT-PCR-Experimenten eingesetzt. Einzelsträngige cDNA-Synthese und anschließende Amplifikation des Produktes wurde mit Hilfe des „OneStep RT-PCR“ Kits der Firma Qiagen durchgeführt.

↓46

Tabelle 3.26: Reaktionsansatz für eine RT-PCR

Komponente

[µl]

Stocklösung

Finale Konzentration

RNA

1

~ 100 ng/µl

5 ng/µl

OneStep RT-PCR Puffer

4

5-fach konzentriert

1-fach konzentriert

dNTP Mix

0,8

10 mM jedes dNTP

0,4 mM jedes dNTP

RT-PCR Enzym-Mix

0,8

-

-

Oligonukleotid 1

0,3

50 µM

0,75 µM

Oligonukleotid 2

0,3

50 µM

0,75 µM

steriles H2O

12,8

-

-

Das RT-PCR-Profil wurde nach Angaben des Herstellers erstellt, wobei die Annealing-Temperatur der Oligonukleotide an das jeweilige Experiment angepasst wurde. Für die Amplifikation von plaB wurden die Primer plaB_6A-f und plaBspir2r verwendet (s. Tabelle 3.10).

Tabelle 3.27: Programm für eine Einschritt-RT-PCR

Reaktionsschritt

Anzahl der Zyklen

Temperatur

Zeit

1. Reverse Transkription

1

50°C

30 min

2. Initiale PCR-Aktivierung

1

95°C

15 min

3. Denaturierung

30-50

95°C

40 sek

4. Primer-Bindung (Annealing)

30-50

54-60°C

40 sek

5. Synthese (Elongation)

30-50

72°C

1 min

6. Finale Elongation

1

72°C

10 min

7. Pause

4°C

↓47

Um noch vorhandene DNA-Kontaminationen auszuschließen, wurde bei jedem Experiment ein Ansatz mitgeführt, der nach dem Schritt der reversen Transkription zu den anderen Proben in den Thermocycler gestellt wurde. Nach erfolgter Reaktion wurden die Amplifikate auf einem 2%igen (w/v) Agarosegel analysiert.

3.2.6.7 Sequenzierung-Polymerase Kettenreaktion

Basierend auf der Didesoxy-Methode nach Sanger [236] wurde die DNA-Sequenzierung mit Hilfe von „ABI BigDye Terminator 3.1 Premi x“ (s. Tabelle 3.6) und Plasmid-DNA (in H20bidest gelöst) durchgeführt. Der Reaktionsansatz und das PCR-Profil wurden wie folgt zusammengesetzt:

Tabelle 3.28: Reaktionsansatz für eine Sequenzierungs-PCR

Komponente

[µl]

Stocklösung

Finale Konzentration

DNA

variabel

~ 300 ng/µl

30 ng/µl

ABI Puffer

1,5

5-fach konzentriert

0,75-fach konzentriert

BigDye 3.1

1

-

-

Oligonukleotid

0,5

10 µM

0,5 µM

steriles H2O

zu 10 µl

-

-

↓48

Tabelle 3.29: PCR-Programm für eine Sequenzierungs-Reaktion

Reaktionsschritt

Anzahl der Zyklen

Temperatur

Zeit

1. Denaturierung

1

96°C

2 min

2. Denaturierung

25

96°C

10 sek

3. Primer-Bindung (Annealing)

25

50-58°C

5 sek

4. Synthese (Elongation)

25

60°C

4 min

6. Pause

4°C

Die elektrophoretische Auftrennung und Floureszensdetektion erfolgte durch Mitarbeiter des Robert Koch-Institutes. Die Analyse der Daten wurde mit Hilfe der Lasergene SeqMan Software (s. Tabelle 3.19) durchgeführt.

3.2.7 Herstellung und Transformation von elektrokompetenten Zellen

Damit Zellen in der Lage sind, ein DNA-Molekül aufzunehmen, muss deren physiologischer Zustand an die Transformationsbedingungen angepasst werden. Dies kann unter Anwendung der folgenden Methoden geschehen.

3.2.7.1 Herstellung elektrokompetenter E. coli

↓49

E. coli DH5α und BL21 Stämme (s. Tabelle 3.11) wurden über Nacht auf LB-Agarplatten angezogen und zum Animpfen einer 50ml SOB-Vorkultur verwendet. Diese wurde für ca. 16h unter Schütteln bei 37°C inkubiert, um anschließend 0,5ml der Kultur in 500ml frischen SOB-Mediums zu überführen und sie für weitere 2-3 Stunden bis zum Erreichen einer OD660 von 0,8 schütteln zu lassen. Anschließend wurde das gesamte Kulturvolumen in der gekühlten (4°C) Sorvall RC-5 Zentrifuge für 10min bei 5.000 x g sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet zweimal mit je 500ml eiskaltem 10%igen (v/v) Glyzerol suspendiert und erneut 20min bei 13.000 x g und 4°C abzentrifugiert. Das nach dem letzten Waschschritt erhaltene Zellpellet wurde in 2ml eiskaltem 10%igen (v/v) Glyzerol aufgenommen, zügig in 20-80µl Aliquots aufgeteilt und bis zum Gebrauch bei –80°C gelagert.

3.2.7.2 Herstellung elektrokompetenter L. pneumophila

Zur Erzeugung elektrokompetenter L. pneumophila wurde Koloniematerial von einer 2-3 Tage auf BCYE-Agar gewachsenen Kultur mit einer Impföse entnommen und in 1,5ml PBS-Puffer suspendiert und bei 4.500 × g abzentrifugiert. Das so gewonnene Zellpellet wurde zweimal mit 1,5ml eiskaltem 10%igen (v/v) Glyzerol gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in 45μl 10%igem (v/v) Glyzerol resuspendiert, in 2 Aliquots aufgeteilt und bis zum Gebrauch bei -80°C aufbewahrt.

3.2.7.3 Herstellung elektrokompetenter P. pastoris

Elektrokompetente Pichia-Zellen wurden nach dem Protokoll von Lin-Cereghino et al. [168] hergestellt. Hierzu wurden die Stämme P. pastoris GS115 und KM71 in 15ml YPD-Medium (s. Tabelle 3.15) inokuliert und über Nacht bei 30°C und 200rpm im Tischinkubator geschüttelt. Anschließend wurden die Hefezellen in 240ml YPD-Flüssigmedium auf eine OD600 von ca. 0,2 eingestellt, erneut inkubiert und bei einer OD600 von 0,8 geerntet (Sorvall, 1.500 × g, 5min, 4°C). Das Zellpellet wurde anschließend in 50ml YPD/0,02M HEPES (steril filtriert) resuspendiert und 1,25ml 1M DTT tropfenweise zugegeben. Nach 15min Inkubation bei 30°C und 150rpm, wurden 250ml steriles H2O zugegeben und die Zellen erneut sedimentiert. Es folgten zwei Waschschritte mit zuerst 250ml und dann 150ml sterilem H2Obidest. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Zellen in 10ml 1M Sorbitol (steril filtriert) resuspendiert, pelletiert und in einem finalen Volumen von 1ml 1M Sorbitol aufgenommen, in 40µl und 80µl Aliquots aufgeteilt und bis zur Elektroporation bei -80°C gelagert.

3.2.7.4 Transformation von DNA

↓50

Um DNA als linearisiertes Fragment oder als zirkuläres Plasmid in die Zellen einzubringen und diese damit zu „transformieren“, muss die Zellemembran temporär permeabilisiert werden. Dies geschieht durch das Anlegen eines elektrischen Feldes im sogenannten Elektroporator und führt zur Porenentstehung und somit erleichterten Aufnahmen von DNA Molekülen.

a) E. coli

20µl elektrokompetenter Zellen (s. 3.2.7.1) wurden mit 2µl, in Glyzerol resuspendiertem, Ligationsansatz in einer vorgekühlten Elektroporationsküvette und auf Eis vermischt. Die DNA-Aufnahme erfolgte im eisgekühlten Cell Porator bei 330µF, 200 DC Volt und 4kΩ. Transformierte Zellen wurden in 1ml vorgewärmtem SOC-Medium für 1h bei 37°C geschüttelt und anschließend 100µl der Suspension auf Selektivagar ausgebracht. Die restlichen 900µl wurden für 2min bei 3.200 × g pelletiert, der Überstand abgenommen und die Zellen im Mediumrücklauf erneut resuspendiert und als Ganzes ausplattiert. Die Platten wurden für 18 - 24h bei 37°C im Brutschrank inkubiert und gewachsene Kolonien in anschließender Kolonie-PCR (s. 3.2.6.3) auf die Aufnahme des Plasmides überprüft.

↓51

b) L. pneumophila

Die Elektroporation von Legionellen wurde ähnlich zu der von E. coli Zellen durchgeführt. 20µl elektrokompetenter L. pneumophila wurden mit 20ng des entsprechenden Plasmides vermischt und anschließend im Cell Porator bei 330µF, 400 DC Volt und 4kΩ transformiert. Die Inkubation der Zellen in 2ml BYE-Bouillon erfolgte für 4-5h unter ständigem Schütteln bei 37°C. Ausplattiert wurde analog zu der Vorgehensweise von E. coli, wobei die Inkubation der Platten für 3-4 Tage bei 37°C vollführt wurde.

c) P. pastoris

↓52

Für die Transformation von P. pastoris Zellen musste die plasmidale DNA in einem vorausgehenden Schritt linearisiert werden. Hierzu wurden 15µg pJB14 und pJB15 (s. Tabelle 3.9) mit 20U SalI in NEB3-Puffer/BSA in einem Gesamtvolumen von 20µl für 16h bei 37°C inkubiert und anschließend bei 65°C für 20min hitzeinaktiviert. Der Ansatz wurde mit Hilfe des „Wizard SV Gel & PCR cleanup System“ gereinigt und die Konzentration mittels Absorption bei 260nm bestimmt. Für die Transformation wurden 1µg linearisierter DNA mit 40µl elektrokompetenter P. pastoris Stämme GS115 oder KM71 (s. Tabelle 3.11) vermischt, auf Eis in einer vorgekühlten Küvette kurz inkubiert und mit den Elektroporator-Einstellungen 1.500 V, 200Ω und 25µF transformiert. Nach sofortiger Zugabe von 1ml 1M Sorbitol wurden die Hefen für 1,75h bei 30°C und 200rpm inkubiert, 100µl und der Rest auf MD-Selektivagar (s. Tabelle 3.15) ausgebracht und bei 30°C inkubiert, bis Einzelkolonien sichtbar wurden. Je 8 Kolonien wurden gepickt und erneut über Nacht bei 30°C auf frischen Platten bebrütet. Da sich die Kolonie-PCR für P. pastoris als ungeeignet herausstellte, wurde von den „breitgestrichenen“ Kolonien chromosomale DNA isoliert (s. 3.2.3.2) und 1µg DNA mittels PCR und den Primern plaB_Ecof2 und plaB_EagIr auf die Insertion des plaB Gens überprüft. Positive Klone wurden als Glyzerolgefrierkulturen konserviert (s. 3.2.1.4).

3.2.8 Transfektion von A549 Zellen

Zur Etablierung der Transfektion von A549 Lungenepithelzellen wurden 2×105 A549 Zellen in RPMI + 10% FKS, in 12-well Platten ausgesät und über Nacht bei 37°C und 5%CO2 inkubiert, bis sich eine optische Konfluenz von 90-100% eingestellt hatte. Dies entspricht einer realen Konfluenz der Zellen von 30-60% und ist als optimal anzusehen, um bestmögliche Resultate mit dem Transfektionsreagenz METAFECTENETM zu erzielen. Nach erfolgter Inkubation wurde das Medium abgenommen und die Zellen 1× mit RPMI gewaschen und 1ml serumfreies Medium zu jedem Well zugegeben. Für die Bestimmung des optimalen Verhältnisses von DNA zu dem Lipid-Transfektionsreagenz wurden diese in unterschiedlichen Mengen miteinander in serumfreien RPMI gemischt. Zuerst wurden Plasmidmengen von 100ng – 2µg in 50µl RPMI gegeben, parallel dazu erfolgte die Zugabe von je 1,5µl oder 3µl METAFECTENETM pro 500ng DNA in ebenfalls 50µl RPMI. Anschließend wurde die DNA-Lösung zu der METAFECTENETM-Suspension pipettiert und ohne jeglichen Mischvorgang für 20min bei RT inkubiert. Danach erfolgte die tropfenweise Zugabe der Lösung zu dem konfluenten Zellrasen. Transfektionsreagenz ohne DNA und der Vektor pEGFP-C2 (zur Überprüfung der Transfektionseffizienz) wurden als interne Kontrollen mitgeführt. Nach 5h Inkubation erfolgte ein Mediumwechsel, wobei serumfreies RPMI abgenommen und durch 1ml RPMI + 10% FKS ersetzt wurde. Nach 24h und 48h erfolgte die Überprüfung der Transfektion mittels Fluoreszenzmikroskopie der Transfektionskontrolle pEGFP-C2, die im Durchschnitt um die 50% bei 500ng transfiziertem Vektor erreichte.

Die Bestimmung freier Fettsäuren erfolgte durch Abnahme des Überstandes und Detektion der Fettsäuren mit Hilfe des Nefa C Kits (Wako), wobei RPMI + 10% FKS als Leerwert mitgeführt wurde. Zur Bestimmung der Protein-Expression mittels Western Blot Analyse wurden die Zellen mit einem Zellschaber und durch Zugabe von 100µl Proteinladepuffer vom Wellboden gelöst und für 10min bei 99°C lysiert. Anschließende elektrophoretische Auftrennung und Detektion der Antigene (GFP und Flag-Peptid) erfolgte wie in 3.2.10.4 beschrieben.

↓53

Die Aktivität von exprimiertem PlaB wurde durch Lipidhydrolyse (s. 3.2.12.3) der Zelllysate bestimmt. Hierzu wurden 200µl A549-Lysepuffer (s. Tabelle 3.5) zu den Zellen (ohne Überstände) gegeben, die Suspension in ein 1,5ml Reaktionsgefäß überführt und für 20min auf Eis inkubiert. Weitere Zelllyse erfolgte durch Vortexen und mittels einer „26-gauge“ Kanüle durch wiederholtes Auf- und Abziehen der Suspension. Die Inkubation mit entsprechenden Lipidsubstraten wurde in 1:10 und 1:100 Verdünnungen in 40mM Tris pH 7,5 über 18h bei 37°C und 100rpm durchgeführt. Die freigesetzten Fettsäuren wurden wie im unteren Abschnitt beschrieben detektiert (s. 3.2.12.4).

RNA-Extraktion (von ca. 2×105 Zellen) und anschließende RT-PCR zur Überprüfung der Transkription transfizierter Templates wurde durch Zugabe von 1ml peqGOLD RNAPureTM und des OneStep RT-PCR Kits nach den Angaben der Hersteller durchgeführt (s. 3.2.3.4 und 3.2.6.6). Zur Amplifikation von plaB wurden die Primer PlaB_6A_f und plaB_spir2r, für die der endogenen β-Aktin-Kontrolle die Oligonukleotide β-actin fw und β-actin rv verwendet (s. Tabelle 3.10).

3.2.9 Test auf bakterizide Eigenschaften von PlaB

Für die Testung der bakteriziden Eigenschaften von PlaB wurden L. pneumophila Corby Wildtyp und die plaB Mutante plaB1 für 2 Tage bei 37°C und auf BCYE-Festagar kultiviert. Die auf Inhibition durch Legionellen zu untersuchenden Bakterienstämme E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae, B. subtilis und S. aureus (s. Tabelle 3.11) wurden für 1 Tag auf LB-Agarplatten inkubiert. Anschließend wurden die Legionellen auf eine Zellzahl von 1×107/100µl, alle anderen Bakterienstämme auf 1×105/100µl in PBS-Puffer eingestellt und im Verhältnis 1:1 (je 100µl) vermischt und für 5min bei 16.000 × g sedimentiert. Die Suspension wurde für 20h bei 37°C inkubiert und nach erneutem Mischen 1:10 (entspricht Wert 0, s. Ergebnisse 4.3.3) und im Weiteren bis 10-4 in PBS-Puffer verdünnt. Je 10µl der Verdünnungen wurden auf LB-Agarplatten getropft, um das Legionellenwachstum zu unterdrücken. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und das Waschtum der Konkurrentenstämme anschließend mit einer digitalen Spiegelreflexkamera EOS 450D dokumentiert.

3.2.10 Proteinanalytik

3.2.10.1 Fällung von Proteinen mittels TCA-EtOH

↓54

Zur Entfernung denaturierender Agenzien, wie z. B. Guanidinhydrochlorid (GuHCl), oder zur Konzentrierung des Proteingehalts einer Probe wurde die Trichloressigsäure-Ethanol-Präzipitation nach Lebendiker (http://wolfson.huji.ac.il/purification/) angewandt. Hierzu wurden 10µl Probe mit 90µl H2O vermischt und durch die Zugabe von 100µl einer 20%igen (w/v) TCA-Lösung für 20min auf Eis inkubiert. Nach erfolgter Pelletierung für 15min, 16.000 × g bei 4°C, wurde das Pellet 2× mit 100µl reinem eiskalten EtOH gewaschen und das Pellet anschließend in SDS-Proteinauftragepuffer resuspendiert und auf ein Polyakrylamidgel aufgetragen.

3.2.10.2 Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Konzentrationsbestimmung von Proteinen erfolgte nach der Bradford-Methode und nach den Angaben des Herstellers der Färbelösung „Roti Nanoquant“ (s. Tabelle 3.3).

3.2.10.3 Eindimensionale (1D) - SDS-PAGE

Um die größenabhängige Auftrennung von Proteinen zu erreichen, wurden 10 oder 12,5%ige SDS-Tris-Polyakrylamidgele nach der Methode von Laemmli [158] verwendet (s. Tabelle 3.5). Die Proben wurden mit je 5µl reduzierendem Protein-Probenpuffer versetzt, 90s bei 99°C denaturiert und in SDS-Laufpuffer (s. Tabelle 3.5) bei konstanten 40mA und bei Raumtemperatur (RT) aufgetrennt. Zur Detektion der Proteine im Gel wurden die zwei folgenden Färbemethoden angewandt:

↓55

a) Coomassie-Färbung von Proteinen

Nach der Elektrophorese wurde das Gel über Nacht in kolloidal Coomassie-Färbelösung nach dem Rezept des Herstellers und unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Entfärbung des Hintergrundes wurde durch anschließende Inkubation in H2Obidest vollführt und das Gel nach 30min in Fixierlösung (s. Tabelle 3.5) zwischen zwei Cellophanfolien getrocknet und so konserviert.

b) Silberfärbung von Proteinen

↓56

Zur Erhöhung der Detektionsgrenze bei geringem Proteinanteil wurde die Nachweismethode der Silberfärbung entweder mit Hilfe des „Silver Staining Kit“ nach den Vorgaben des Herstellers (Amersham) oder nach Gharahdaghi et al. [107] und eigens hergestellten Lösungen angewandt (s. Tabelle 3.5). Die Reaktionszeiten des eigenen Protokolls richteten sich nach denen des kommerziell erworbenen Systems von Amersham.

3.2.10.4 Western Blot und Immundetektion

Bei der Methodik des Western Blots werden Proteine, die elektrophoretisch aufgetrennt wurden (s. 3.2.10.3), auf eine Membran übertragen und mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen (s. Tabelle 3.6). Nach erfolgter Elekrophorese wurden das Gel und die PVDF-Membran, die bereits mit 100%igem Methanol aktiviert wurde, für 10min bei RT in Transferpuffer (s. Tabelle 3.5) geschüttelt. Der Proteintransfer wurde anschließend nach Anleitung des Herstellers des verwendeten Semidry-Elektroblotter (Pharmacia) durchgeführt. Hierzu wurden 4, in Transferpuffer getränkte, Whatman Papierstücke anodenseitig in den Blotter gelegt, darauf die äquilibrierte PVDF Membran, dann das SDS-PAGE Gel und abschließend weitere 4 Lagen Whatman Papier. Nach Auflegen der Kathode wurden Proteine mit 0,8mA/cm2 Gel für 1h bei RT auf die Membran übertragen. Nach Beendigung des Proteintransfers wurde die Membran entweder für 1h bei RT oder über Nacht bei 4°C in PBS mit 5% Milchpulver inkubiert. Nach Absättigung der freien Bindungsstellen und kurzem Schwenken der Membran in PBS-Puffer erfolgte die Zugabe des primären Antikörpers (s. Tabelle 3.6) für 1h bei RT. Anschließend wurden drei 10-minütige Waschschritte in PBS-T Lösung vorgenommen, gefolgt von der Inkubation der Sekundärantikörperlösung, welche Meerrettich-Peroxidase gekoppelte Anti-Maus-IgG Antikörper enthielt (1h unter leichtem Schwenken). Nach drei abschließenden Waschschritten mit PBS-T für je 10min erfolgte die Detektion des Zielproteins mit dem „ECL Plus Western Blotting Detection Reagent“ (Amersham). Da die Peroxidase die Oxidation von Luminol unter alkalischen Bedingungen katalysiert und die dabei auftretende Chemilumineszenz mittels einer hochauflösenden CCD-Kamera aufgenommen werden kann, wurde zur Detektion ein Chemilumineszenz-Imager der Firma Vilber Lourmat verwendet. Alternativ zu dieser Detektionsmethode wurde ein kolorimetrischer Nachweis der Proteine mit 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) als HRP-Substrat durchgeführt. Hierbei wurde die Membran in 15ml PBS mit einer Spatelspitze DAB und unter Zugabe von 0,024% H2O2 inkubiert, bis die gesuchten Banden sichtbar wurden.

3.2.11 Expression und Reinigung von Proteinen

Proteine können, nach erfolgter Expression, ihren biochemischen Eigenschaften nach über verschiedene chromatographische Verfahren zur Reinheit gebracht werden. Folgende Expressionssysteme und Reinigungsmethoden wurden nach Angaben der Hersteller oder nach eigenem Protokoll durchgeführt.

3.2.11.1 Proteinexpression in E. coli

↓57

Wie bereits in 3.2.1.2 beschrieben, wurden 500ml E. coli-Kulturen der beginnenden exponentiellen Phase (OD660 0,6 – 0,8) mit einer Endkonzentration von 1mM IPTG zur Proteinproduktion induziert. Nach 4h Inkubation wurden die Zellen bei 10.000 × g für 10 – 20min bei 4°C pelletiert und bis zum Zellaufschluss bei -20°C gelagert. Der Zellaufschluss und die anschließende Proteinreinigung sind in 3.2.11.4 beschrieben.

3.2.11.2 Proteinexpression in P. pastoris

P. pastoris plaB-Positive sowie die Kontrollstämme GS115 und KM71 wurden über Nacht in 10ml BMGY-Flüssigmedium angezogen. Anschließend wurde gerade soviel Zellmaterial abgenommen und abzentrifugiert, dass nach dem Suspendieren in 20ml BMMY eine OD660 von 0,8 – 0,9 erreicht werden konnte. Die Induktion der Proteinexpression erfolgte durch Zugabe von Methanol zu einer Endkonzentration von 0,5% alle 24h. Alle Inkubationsschritte wurden bei 30°C im Tischinkubator unter 250rpm ständigem Schütteln durchgeführt. Die Probenentnahme von je 1ml (5min, 5000 × g, 4°C) und die Messung der optischen Dichte bei 660nm erfolgte nach 0’, 5,5’, 19’, 25’, 48’, 72’ und 96 Stunden. Insgesamt wurden je 2 Klone für die intrazelluläre Expression beider Stämme (s. Tabelle 3.12) und 2 Klone für die sekretierte Version der Stämme KM71 und GS115 auf die Expression von plaB überprüft. Dies erfolgte durch Elektrophorese von 20µl Kulturüberstand oder durch auf eine OD von 1 eingestellte Zellpellets in einem 10%igen Polyakrylamidgel und anschließender Silber- oder Coomassiefärbung (s. 3.2.10.3). Weiterhin wurden die Überstände der PlaB-sekretierenden Stämme auf Enzymaktivität mittels Lipidhydrolyse (s. 3.2.12.3) untersucht.

3.2.11.3  In vitro Translation

Mit der Methode der in vitro Translation lassen sich schwer zu reinigende Proteine, z. B. Enyzme, die in „inclusion bodies“ aggregieren, in einem zellfreien System transkribieren und translatieren. In dieser Arbeit wurden zwei Expressionssysteme verwendet, ein „T7 Sample System“ mit Extrakten aus E. coli, Kaninchen-Retikulozyten und Weizenkeimlingen der Firma Promega, und das „PURExpress TM in vitro Protein Synthesis Kit“, erworben von NEB. Letzteres beruht auf einem hochreinen System rekombinant hergestellter Enzyme des Syntheseapparates, die gleichzeitig als His-Fusionsproteine vorliegen und so durch inverse Affinitätschromatographie aus dem Translationsansatz entfernt werden können. Zudem ist durch die kontrollierten Bedingungen der Abbau des Zielgens bzw. Proteins, vermittelt durch Nukleasen und Proteinasen eines rohen Zellextraktes, vermindert.

↓58

Die Durchführung richtete sich ganz nach den Angaben der Hersteller, wobei die eingesetzte Plasmidmengen 1µg bei den Ansätzen des „T7 Sample System“ und 250ng bei denen des „PURExpress TM in vitro Protein Synthesis Kit“ entsprachen. Da sich das „T7 Sample System“ aus vier verschiedenen Extrakten zusammensetzt, von denen 2 bevorzugt mit linearer DNA arbeiten, wurde der eingesetzte Vektor pJB03 für diese Ansätze vorher mit ZraI linearisiert und anschließend mit Hilfe des „Wizard SV Gel & PCR cleanup System“ gereinigt.

3.2.11.4 Reinigung mittels Ionentausch- und Affinitätschromatographie

Nach erfolgter Expression in E. coli BL21 (s. 3.2.11.1) wurde das Zellpellet in den zugehörigen Puffern resuspendiert und aufgeschlossen:

a) Anionentausch chromatographie

↓59

Für den Zellaufschluss wurde das Zellpellet einer BL21 (pJB01) Kultur in 1/10 des ursprünglichen Kulturvolumens in Resuspensionspuffer (s. Tabelle 3.5) aufgenommen und nach Zugabe von 1× Proteaseinhibitormix 4× 30sek mit Ultraschall und einer Amplitude von 65% auf Eis lysiert. Die Abtrennung der unlöslichen Fraktion erfolgte durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 20min. Der Überstand nach Zelllyse wurde anschließend mittels Lipidhydrolyse (s. 3.2.12.3) auf Aktivität von PlaB hin überprüft. Darauf folgend wurde 1/5 des Überstandvolumens 1:10 mit dem Proteinbindepuffer der Anionentauschchromatographie vermischt und auf die ebenfalls mit Proteinbindepuffer äquilibrierte 1ml HiTrapTM Q FF Säule (Amersham) geladen. Die Beladung und Reinigung wurde an dem FPLC-System ÄktaPrime mit einer Flussrate von 1ml/min durchgeführt. Nachdem die ersten 4 Fraktionen mit 10ml fraktioniert wurden, wurde durch Anlegen des Elutionsgradienten, ein Stufengradient mit jeweils um 10% steigender NaCl-Konzentration (0-100%), mit 2ml fraktioniert. Im Chromatogramm als relevant erscheinende Fraktionen (bezüglich des Proteingehalts) wurden mittels Lipidhydrolyse auf lipolytische Aktivität untersucht. Anschließend wurde die Proteinmenge bestimmt (s. 3.2.10.2) und mit Hilfe der SDS-PAGE auf den Reinheitsgrad des PlaB-Enzyms untersucht.

b) GST-Affinitätschromatographie

Das Zellpellet einer BL21 (pJB18) Kultur wurde in 1/20 des Kulturvolumens mit PBS-Puffer resuspendiert und mit einer Spatelspitze Lysozym, 1mM EDTA und 1× Proteaseinhibitormix für 30min bei 4°C auf einem Drehrad inkubiert. Die vollständige Zellyse wurde durch dreimaliges Schallen der Suspension mit einer Ultraschallsonde für 30sek und einer Amplitude von 65% herbeigeführt. Anschließend wurde die Lösung für 30min bei 9.000 × g und 4°C sedimentiert und der Überstand vor Beladung der Glutathion-Sepharose mit 100U Benzonase von DNA-Kontaminationen befreit und steril filtriert. Die Reinigungsschritte wurden nach Angaben des Herstellers des „Bulk and RediPack GST Purification Modules“ durchgeführt. Das Ausgangsvolumen der Glutathion-Sepharose 4B Suspension wurde auf 500µl festgelegt und entsprechend frisch aus der mitgelieferten Originalsuspension der Sepharose hergestellt. Nach erfolgter Bindung wurden die Beads dreimal mit 1/200 des Kulturvolumens mit PBS gewaschen und die Proteine anschließend in drei Elutionsschritten mit je 1/2000 an Glutathion-Elutionspuffer für 1min bei RT inkubiert und damit von der Sepharose eluiert. Alle zwischenzeitlichen Zentrifugationsschritte erfolgten für 5min bei 500 × g und RT. Um zu überprüfen, ob nach der Elution noch Proteinreste an den Kügelchen gebunden waren, wurden diese erneut in 1/2500 des Kulturvolumens in PBS resuspendiert, davon 1/6 abgenommen, bei 16.000 × g für 1min sedimentiert, die Kügelchen in 15µl Proteinauftragepuffer aufgenommen und der Überstand nach 90sek bei 99°C ebenfalls auf das Polyakrylamidgel aufgetragen.

3.2.11.5 Reinigung und Solubilisierung von „inclusion bodies

↓60

Zur Reinigung von Einschlusskörperchen, den sogenannten „inclusion bodies“ (IB) wurde das Zellpellet einer 500ml Kultur BL21 (pJB01) mit 5ml/gNassgewicht der Zellen an „BugBuster Extraction Reagent“, 2.5 Kilounits/g Lysozym, 15µl Benzonase (375U) und 15µl 1× Proteaseinhibitor für 20min bei RT auf einem Drehrad inkubiert. Die Pelletierung erfolgte anschließend bei 15.000 × g und 4°C für 20min. Für weiterführende Rückfaltungsexperimente wurde das Pellet 2× mit 1/33 des Kulturvolumens an IB-Waschpuffer (s. Tabelle 3.5) und nach dem empfohlenen Protokoll des „Pro-Matrix TM Protein Refolding Guide“ (Pierce) behandelt. Anschließend wurden die „inclusion bodies“ 2× in 1/33 an IB-Resuspensionspuffer aufgenommen, 15min bei 15.000 × g und 4°C sedimentiert und das Nassgewicht der IBs bestimmt. Da die Reinheit der Einschlusskörperchen noch ungenügend war, wurden zusätzliche Reinigungsschritte unternommen. Das IB-Pellet wurde erneut mit 1/100 des Kulturvolumens an BugBuster, einer Spatelspitze an Lysozym, 50U Benzonase und 5µl 1× Proteaseinhibitor behandelt, gewaschen und resuspendiert, wie bereits angegeben. Eine Abtrennung weiterer Proteine wurde durch Inkubation des Pellets in 50mM Tris pH 8,0, 10mM EDTA und 4M Urea erreicht. Die so erhaltenen „inclusion bodies“ wurden mit 1ml IB-Solubilisierungspuffer/20mg Nassgewicht (s. Tabelle 3.5) für 50h bei 4°C inkubiert und die verbleibenden unlöslichen Bestandteile für 20min bei 20.000 × g und 4°C abzentrifugiert. 1/500 der solubilisierten Lösung wurde mittels TCA-Ethanolfällung (s. 3.2.10.1) von GuHCl befreit und auf den Solubilisierungsgrad mit Hilfe der SDS-PAGE überprüft.

3.2.11.6 Rückfaltung von PlaB

Die in Abschnitt 3.2.11.5 gewonnenen und solubilisierten „inclusion bodies“ wurden mittels Roti Nanoquant auf ihren Proteingehalt untersucht (s. 3.2.10.2). Nachfolgende Rückfaltungs-ansätze wurden nach den Angaben des „Pro-Matrix TM Protein Refolding Guide“ (Pierce) zusammengesetzt. Dieser basiert auf einer Rückfaltung durch Verdünnung der denaturierten Proteine (1:20) in entsprechenden Puffersystemen mit die Faltung beeinflussenden Additiven. Die als Grundlage verwendeten Rückfaltungspuffer kombinieren hier die zwei Denaturierungsagenzien L-Arginin und Guanidin in verschiedenen Molaritäten, da diese in geringen Konzentration die Aggregation von Proteinen unterdrücken, die native Form der Enzyme aber nicht beeinflussen sollen. EDTA wurde ebenfalls in allen Reaktionen zur Stabilisierung des Redoxzustandes in einer Konzentration von 1mM mitgeführt. Die durchschnittliche Rückfaltungszeit wurde auf 24h festgelegt. Weiterhin wurde die Proteinkonzentration im Rückfaltungsansatz variiert, da diese eine entscheidende Rolle im Aggregationsprozess (viel Protein ♢ leichtere Aggregation) spielt. Es wurden Ansätze mit 25µg/ml und 100µg/ml an Proteinendkonzentration untersucht. Da die Temperatur einen enormen Einfluss auf die Reaktionsgeschwindigkeit der Faltung nehmen kann, wurden die Rückfaltungsansätze bei verschiedenen Temperaturen von 4°C, 20°C und 30°C inkubiert. Weiterhin war nicht bekannt, welchen Disulfidstatus das PlaB-Enzym besitzt, daher wurden Rückfaltungsexperimente in unterschiedlichen Redoxumgebungen zur eventuellen Bildung von Disulfidbrücken angesetzt, aber auch der Zustand unter ständiger Reduktion des Systems durch Zugabe von 5mM DTT untersucht. Polyethylenglycol (PEG) kann die Aggregation durch Bindung an die hydrophoben Bereiche der Faltungsintermediate verhindern, daher wurde das Agens im molaren Verhältnis von 2:1 und 4:1 zu PlaB in Puffern mit geringen Denaturierungsmittelkonzentrationen eingesetzt. Letztendlich wurde der Einfluss der divalenten Kationen CaCl2/MgCl2 zu je 2mM (ohne EDTA-Zusatz) und der eines natürlichen Substrates von PlaB (MPLPC in einer Endkonzentration von 3mM + 0,2% Triton X-100) untersucht.

3.2.12 Nachweis von Phospholipaseaktivität

3.2.12.1 Gewinnung von Zellpelletlysaten und Kulturüberständen

Nach dem Erreichen der gewünschten Zelldichte (meist OD660=2) in den angezogenen Flüssigkulturen wurde 1ml Kulturvolumen entnommen und bei 5.000 × g für 5min abzentrifugiert. Anschließend wurden die Kulturüberstände von den Zellpellets getrennt. Die Kulturüberstände wurden mit einer finalen Konzentration von 3mM mit Natriumazid versetzt und bei 4°C gelagert. Die Zellpellets wurden bis zur Verwendung bei -20°C weggefroren. Die Zelllyse wurde durch Zugabe von 0,1 % Triton X-100 und 50μl Lysozym (10mg/ml) für 30min bei 37°C durchgeführt. Anschließend wurden die lysierten Zellpellets mit einer „26-gauge“ Kanüle homogenisiert und mit 40mM Tris-HCl pH 7,5 auf das Ausgangsvolumen (1ml) aufgefüllt.

3.2.12.2 Gewinnung von U937 Zelllysaten und Überständen

↓61

1×106 ausdifferenzierte U937 Makrophagen wurden analog zu der in Abschnitt 3.2.14.2 beschriebenen Vorgehensweise mit einer MOI=1 infiziert. Nach den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellüberstände abgenommen und mit einem 0,2µm Filter steril filtriert. Die Zellen wurden in Anwesenheit von 200µl 40mM Tris pH 7,5 entweder durch wiederholtes Auf-und Abziehen durch eine Pipettenspitze oder durch Abschaben der Zellen mit einem, durch reinen EtOH desinfizierten, Metallspatel vom Wellboden abgelöst. Je 100µl wurden in 2 neue Reaktionsgefäße überführt, von denen ein Teil der Zellen bis zur RNA-Extraktion bei -20°C gelagert wurde, der andere durch 10-minütige Inkubation in einem Ultraschallbad lysiert und bis zur Bestimmung der phospholipolytischen Aktivität ebenfalls bei -20°C weggefroren wurde. Für den Verdau von Lipidsubstraten wurde das Zelllysat durch Zugabe von 40mM Tris-Puffer (s. Tabelle 3.5) wieder auf das Ausgangsvolumen der Infektion gebracht und unverdünnt in das Hydrolyseexperiment (3h Inkubation) eingesetzt.

3.2.12.3 Verdau von Lipidsubstraten

Zur Untersuchung der lipolytischen Aktivität wurden verschiedene Substrate (s. Tabelle 3.4) mit L. pneumophila Zelllysaten und Kulturüberständen als auch Zelllysaten der U937 Infektion oder Überstände der plaB-Expression in P. pastoris inkubiert. Gleichermaßen wurden auch E. coli Zelllysate oder Fraktionen der Proteinreinigung behandelt. Hierzu wurden die Lipide mit einer Endkonzentration von 13,4 mM und unter Zusatz von 6mM NaN3, 1% Triton X-100 und 40mM Tris-HCl (pH 7,5, 25°C) angesetzt. Die Substrate wurden für 10min bei RT und anschließend für 30 min bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Zur Förderung der Mizellen-Bildung erfolgte eine Ultraschallbehandlung von jeweils drei 15sek andauernden Intervallen bei einer Intensität von 65 %. Danach wurden die Substrate in einem Verhältnis 1:1 mit den zu analysierenden Proben versetzt (je 25 μl) und variable Zeitspannen in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte bei 37°C und 150 rpm oder 100rpm über Nacht inkubiert. Dabei richteten sich die Inkubationsdauer und die jeweiligen Verdünnungen nach den spezifischen experimentellen Bedinungen. Als Beispiel sei hier die Inkubationszeit und die Verdünnung von plaB-exprimierenden Vektoren (z. B. pJB04) in der L. pneumophila plaB Mutante vermerkt: Die 1:100 Verdünnung eines Zelllysates erreichte ihr Detektionsmaximum für DPPG-Hydrolyse unter Standardbedingung nach 30-45min Inkubationszeit bei 37°C.

Die Negativkontrollen der Kulturüberstände, BYE-Bouillon für L. pneumophila bzw. LB-Bouillon für E. coli, und 40mM Tris-Puffer für die Zellpelletlysate wurden stets mitgeführt und als Basiswert bei anschließenden Kalkulationen vom Probenwert subtrahiert. Bei Messungen der Phospholipaseaktivität von U937 Infektionsüberständen diente RPMI + 10% FKS als Hydrolysekontrolle. Im Anschluss an die Inkubation der Lipid-Proben-Suspension erfolgte die Bestimmung der Menge freigesetzter Fettsäuren.

3.2.12.4 Bestimmung der Menge an freien Fettsäuren

↓62

Die durch lipolytische Enzymaktivitäten freigesetzten Fettsäuren konnten mit Hilfe des „Nefa  C“ Kits der Firma Wako Chemicals nachgewiesen werden. Dies wurde nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Durch den im Kit enthaltenen Oleinsäurestandard wurde die Konzentration der freien Fettsäuren anhand einer Standardkurve mit Hilfe der folgenden Standardkonzentrationen 0/ 0,2/ 0,4/ 0,6/ 0,8 und 1,0 mM freie Fettsäuren, bestimmt.

3.2.12.5 Lipidextraktion und Dünnschichtchromatographie

Die Extraktion verschiedener Lipidspezies, z. B. aus der Zellmembran von Bakterien oder aus dem Lungengewebe von Meerschweinchen, erfolgte nach der Methode von Bligh und Dyer [29]. Hierzu wurde eine 100µl-Probe mit 400µl Methanol und 200µl Chloroform für 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 280µl H2Obidest sowie 200µl Chloroform zugegeben und für eine gründliche Durchmischung der Phasen 10min bei Raumtemperatur auf dem Drehrad inkubiert. Danach wurde zur Phasentrennung 2min bei 2.000 × g zentrifugiert und die Chloroformphase (Lipidphase) in ein neues Reaktionsgefäß überführt und 1/3 unter Vakuum evaporiert. Der restliche extrahierte Ansatz und die lyophilisierten Lipide wurden bei -20°C gelagert. Die getrockneten Lipide wurden vor der Dünnschichtchromatographie in 25µl Chloroform/Methanol (2:1 v/v) aufgenommen und je 10µl auf Kieselgelplatten aufgetragen. Zur Detektion der polaren Lipide aus bakteriellen Zellmembranen wurde die beladene Kieselgelplatte in einen Glastank gestellt und mit einem polaren Laufmittel, bestehend aus n-Propanol:Propionsäure:Chloroform und H2O (30:20:20:10 (v/v/v/v), [67]) für 6h verschlossen inkubiert.

Bei der Verarbeitung von 50µl Lungengewebe aus Meerschweinchen wurden 2 zusätzliche Chloroformwaschschritte (mit je 100µl) vor der Evaporation eingefügt, um etwaige Reste vorhandener Lipide zu extrahieren. Die Chloroformphasen wurden vereinigt, je 50µl davon evaporiert, vollständig auf Kieselgelplatten aufgetragen und mittels 3 unterschiedlicher Laufmittel im Glastank entwickelt. Für polare Substanzen wurde ein Laufmittel, bestehend aus einem Chloroform:Methanol:Wasser-Gemisch [65:25:4 (v/v/v)], verwendet. Die Trennung apolarer Lipide erfolgte mittels einer Lösung an n-Hexan:Diethylether und Essigsäure [70:30:4 (v/v/v)], wohingegen die von Cholesterol und seiner veresterten Form mit Hilfe von Petrolether:Diethylether und Essigsäure [90:10:1 (v/v/v)] durchgeführt wurde. Zur Detektion der Lipide wurden die Kieselgelplatten kurz in Wasser gewaschen, anschließend für 10min mit 0,2% Naphtol Blauschwarz in 1M NaCl inkubiert und schließlich mit 1M NaCl gespült, bis die Lipidspots klar erkennbar waren [206]. Als Lipidreferenzen wurden je 2µl entsprechender Lipidlösungen (10mg/ml) mit auf die Kieselgelplatten aufgetragen.

3.2.12.6 Hämolyseassay

↓63

In Anlehnung an Kirby und Mitarbeiter [150] wurden 37,5µl humane Erythrozyten in 10ml PBS für 5min bei 10.000 × g sedimentiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde zweimal in je 10ml PBS gewaschen und letztendlich in 10ml PBS-Puffer resuspendiert. Zu untersuchende Bakterien wurden für 1 Tag auf Platte (entweder BCYE- oder LB-Agarplatten mit entprechenden Antibiotikas) kultiviert und in PBS-Puffer auf eine OD660 von 0,3 eingestellt. Anschließend wurden 400µl der Blutzellsuspension mit 400µl der Bakterienlösung vermischt, 2min bei 16.000 × g pelletiert und bis zur Vermessung bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Bei den angegebenen Zeitpunkten (s. Ergebnisse) wurde die Suspension für 5sek stark geschüttelt (Vortexer), erneut abzentrifugiert und je 100µl in einer Mikrotiterplatte und bei einer Wellenlänge von 415nm (Absorptionsmaximum von Hämoglobin) vermessen. Als Lysekontrolle wurden anstelle der Bakterien 400µl Ethanol (100%) eingesetzt, als Negativkontrolle diente PBS-Puffer.

3.2.13 Extraktion von Lipopolysaccharid (LPS)

Zur Extraktion von LPS aus L. pneumophila wurde die Hälfte an Bakterienkultur einer dicht bewachsenen BCYEα-Agarplatte, die für 2 Tage bei 37°C bebrütet worden war, abgenommen und in 3ml PBS resuspendiert und zum Abtöten der Keime autoklaviert. Anschließend wurde die Suspension für 5min stark geschüttelt (Vortexer Mixer) und 25min bei 2500 rpm und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und mit 12ml unvergälltem EtOH versetzt und über Nacht bei -20°C inkubiert. Erfolgte Präzipitate wurden für 15min bei 2500 rpm (4°C) sedimentiert und das entstandene Pellet für 2-3h bei RT getrocknet. Um DNA-Spuren zu entfernen, wurde das Pellet in 500µl PBS Puffer suspendiert und mit 25U Benzonase für 24h behandelt. An dieser Stelle wurde das Protokoll für eine Lagerungseinheit bei -20°C unterbrochen. Extrahiertes LPS wurde weiterhin durch Inkubation mit 100µg Proteinase K bei 56°C für 2h von Proteinkontaminationen befreit und anschließend durch Zugabe der gleichen Volumeneinheit (500µl) an 2× Proteinladepuffer für 30min bei 65°C erhitzt. Die so erhaltenen Proben wurden im Vergleich der Stämme Corby Wildtyp und der plaB Mutante plaB1 auf einem 12,5%igen SDS-Polyakrylamidgel mittels Silberfärbung untersucht.

3.2.14 Koinfektion von A. castellanii Amöben, A549 Lungenepithelzellen und
U937 Makrophagen mit L. pneumophila  Corby

3.2.14.1 Test der intrazellulären Vermehrungsfähigkeit in A. castellanii

A.   castellanii Amöben wurden für 3 Tage in PYG-Medium bei 37°C + 5% CO2 kultiviert, anschließend durch Klopfen von der Kulturflasche gelöst und die Zellzahl in einer Neubauer Zählkammer durch Gegenfärbung mit Trypanblau bestimmt. Nach Zentrifugation wurden die Zellen in einer Dichte von 1×105 Zellen/ml in Infektionsmedium resuspendiert und je 1ml in die entsprechenden 24-well Reaktionsplatten gegeben.

↓64

Die 2 Tage bei 37°C auf BCYEα-Agar inkubierten L. pneumophila wurden mit einer sterilen Impföse in PBS überführt und auf eine OD660 von 0,3 (1-5×108 Zellen je ml) eingestellt. Die Suspension wurde anschließend 105-fach mit Infektionsmedium verdünnt und so auf eine Zellzahl von 1×103 Bakterien/ml gebracht. Das Verhältnis von Bakterien zu Amöben wird als MOI (multiplicity of infection) bezeichnet und entspricht in diesem Ansatz einem Wert von 0,01. Pro Zeitpunkt wurden zwei bzw. drei Parallelwerte koinfiziert. Die Probenentnahme erfolgte nach 0, 24, 48 und 72 Stunden, wobei 100µl abgenommen, der Inkubationszeit entsprechend verdünnt und 50µl zur Ermittlung der Bakterienzahl auf BCYEα-Agarplatten in logarithmisch abnehmender Menge ausplattiert wurden. Dies erfolgte unter Verwendung des „Whitley Spiral Plater“ der Firma Meintrup DWS. Anhand der Zählung der koloniebildenden Einheiten CFU (colony forming units) auf Platte mit Hilfe des Acolyte-Koloniezählgerätes konnte die Entwicklung der Zellzahl jedes getesteten Klons rekonstruiert werden. Dieses ist als Maßstab für die intrazelluläre Vermehrung der Legionellen anzusehen.

3.2.14.2 Infektion von U937 Makrophagenzellen

Neben der Gewinnung von Zelllysaten zur Überprüfung der phospholipolytischen Aktivität (s. 3.2.12.2) wurde auch die Vermehrung der Stämme in U937 Makrophagenzellen dokumentiert. Hierzu wurden die passagierten Monozyten (s. 3.2.2) 1 Tag vor der Infektion durch Zugabe von 50ng/ml Phorbol-Ester (Phorbol-12-Myristat-13-Azetat, PMA) zu phagozytierenden Makrophagen ausdifferenziert. Der nun adhärente Zellrasen konnte durch die Inkubation in 10ml 0,2% EDTA in 1×PBS für 5min bei 37°C und durch zusätzliches Klopfen vom Kulturschalenboden gelöst werden. Nach der Überführung in ein Plastikröhrchen wurde die Flasche mit RPMI-Medium ohne FKS-Zusatz gespült und das Zellvolumen auf 50ml aufgefüllt. Die Zellen wurden dann durch 2 Zentrifugationsschritte bei 800rpm für 10min in der Labofuge400 gewaschen. Nach erfolgter Zellzählung in einer Neubauer-Kammer wurden die Zellen mit einer Endkonzentration von 1×106 Zellen/ml in die jeweiligen Wells gegeben und zur erneuten Zelladhäsion für 2h bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert.

Für die U937 Infektion wurden die Legionellen ähnlich vorbereit, wie es bereits beschrieben wurde (s. 3.2.14.1). Von der verdünnten Legionellen-Suspension (~2×106/ml) wurden 0,5 ml entnommen und zu den adhärenten U937 Zellen gegeben (MOI=1). Nach gemeinsamer Inkubation (2h/ 37°C/ 5 % CO2) wurden die Legionellen, die bis dahin nicht in die Wirtszellen eingedrungen oder an diese adhäriert waren, durch dreimaliges Waschen mit RPMI ohne FKS-Zusatz abgespült. Anschließend wurde 1ml RPMI mit 10% FKS zugegeben und die Infektion bis zu 96h inkubiert. Um zu überprüfen, wie sich die Bakterien intrazellulär vermehren, wurde die Koinfektion bei den angegebenen Zeitpunkten mit 10μl Saponin [Stocklösung: 10% (w/v) in PBS] versetzt und 5min bei 37°C/ 5%CO2 inkubiert. Dies führte zur Lyse der U937 Zellen und zur Freisetzung der Bakterien. Ein entsprechend verdünntes Aliquot konnte dann, wie bereits in 3.2.14.1 beschriebener Vorgehensweise, auf BCYEα-Agar ausplattiert werden.

3.2.14.3 Infektion von A549 Lungenepithelzellen zur Bestimmung der Zytokinsekretion

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Für die Bestimmung der Zytokinsekretion nach Legionelleninfektion von A549 Lungenkarzinom-Epithelzellen wurden die passagierten Zellen (s. 3.2.2) 1× mit PBS-Puffer gespült und anschließend durch das Einwirken von 1× Trypsin/EDTA vom Boden der Zellkulturflasche gelöst. Die Zellen wurden 2× mit RPMI ohne FKS-Zusatz bei 800rpm für 5min gewaschen, deren Zahl auf 1×105 Zellen/ml in Vollmedium (RPMI mit 10% FKS) eingestellt und je 1ml in die Löcher einer 24-Well-Platte gegeben. Nach 24h Inkubation wurden das Medium vom konfluenten Zellrasen entfernt und den Zellen durch Zugabe von 1ml RPMI ohne Zusätze wichtige Wachstumsfaktoren entzogen, damit sie besonders suszeptibel für die nachfolgende Infektion waren. Nach weiteren 20h Inkubation erfolgte die Infektion der A549 Zellen mit Legionellen mit einer MOI zwischen 10-100 (Vorgehensweise s. 3.2.14.1). Die Bakterien wurden für 15min bei 800rpm auf die Zellen zentrifugiert und für die angegebenen Zeiträume, 30min bis 23h, bei 37°C / 5% CO2 inkubiert. Anschließend wurde die Koinkubation erneut bei 200 × g für 10min sedimentiert, der Infektionsüberstand für die Messung der Zytokinsekretion abgenommen und mittels ELISA quantifiziert oder bei -20°C für weitere Experimente gelagert.

3.2.15 Infektion von Meerschweinchenlungen

Männliche Meerschweinchen des Stammes Hartley (s. Tabelle 3.11), mit einem Gewicht von ca. 300g, wurden bis zur Infektionsoperation im Tierstall unter Quarantänebedingungen gehalten. Je drei Tiere wurden intratracheal mit einer Bakterienlast von 1-3×106 Legionellen der Stämme L. pneumophila Corby Wildtyp (pBCKS), der plaB Mutante plaB1 (pBCKS) und der Komplementante plaB1 (pJB04) infiziert. Die Bakterien wurden zuvor in BYE-Bouillon bis zur exponentiellen Phase kultiviert und auf die entsprechende Zellzahl in PBS-Puffer eingestellt. Ein zehntes Tier erhielt PBS ohne Bakterien und wurde fortan als Saline-Kontrolltier bezeichnet. Zur Bestimmung der Bakterienlast nach Infektion wurden die Meerschweinchen nach 48h mittels Kohlenstoffdioxid euthanasiert, die Lunge und die Milz entnommen, die Organe gewogen und in entsprechenden Mengen (100µl/100mg) an PBS-Puffer aufgenommen und homogenisiert (Homogenisator Ultra-Turrax T25). Anschließend wurden verschiedene Verdünnungen auf BCYE-Agarplatten ausplattiert, um die koloniebildenden Einheiten (CFU) zu zählen. Um zu überprüfen, ob die Legionellen die enthaltenen Plasmide verloren hatten, wurden einige Klone von den Platten gepickt und auf BCYE und BCYE/Cm-Agarplatten im Vergleich ausgestrichen und das Wachstum dokumentiert (s. Dissertation Schunder). 

3.2.16 Bestimmung der Zytokinsekretion von infizierten A549 Zellen

Für die Detektion und Quantifizierung der Zytokinsekretion von mit Legionellen infizierten A549 Lungenepithelzellen wurden Infektionsüberstände gewonnen (s. 3.2.14.3) und mit Hilfe der folgenden Verfahren auf das Vorhandensein von verschiedenen Immunstimulatoren untersucht.

3.2.16.1  Screening auf Zytokinsekretion mittels des „Human I nflammation Antibody Array 3“

↓66

Mit Hilfe des „Human Inflammation Antibody Array 3“ der Firma RayBio® wurde ein Screen auf 40 verschiedene Entzündungsfaktoren durchgeführt, der, nach Angaben des Herstellers, mit einem Minimum von z. B. 4pg/ml für MCP-1 entsprechende Faktoren detektieren kann. Antikörper gegen die verschiedenen Mediatoren waren jeweils in 2-fach Bestimmung auf der Membran enthalten und konnten nach dem Prinzip des „Sandwich-ELISA“ und einem Chemilumineszenzsignal am Chemiesmart3000-Gerät detektiert werden. Eine Übersicht der Faktoren ist in Abbildung 3.1 gezeigt. Die Durchführung richtete sich nach der Anleitung des Herstellers, wobei der gewonnene Infektionsüberstand (s. 3.2.14.3) unverdünnt oder in einer Verdünnung von 1:2 in Blockierungspuffer auf die vorher abgesättigte Membran gegeben und für 2h bei RT unter leichtem Schwenken inkubiert wurde.

Abbildung 3.1: Übersicht der 40, auf der Membran des „Human Inflammation Antibody Array 3“ der Firma RayBio®, enthaltenen Entzündungsfaktoren.

Nach fünfmaligem Waschen mit 2 unterschiedlichen Puffern wurde die Primärantikörperlösung mit biotinkonjugierten Zytokinantikörpern für 2h bei RT geschwenkt. Es folgte ein weiterer Waschzyklus, dem sich eine Inkubation (2h RT) der Membran mit HRP-fusioniertem Streptavidin anschloss. Nach erneutem Waschen wurde die Membran umgehend mit Substratlösung inkubiert und die entstandene Chemilumineszenz mit einer CCD-Kamera aufgenommen. Mit der Bio1D Software (s. Tabelle 3.19) wurden die Spots anschließend densitometrisch und mit Hilfe der an den Assay angepassten „Human Inflammation Antibody Array III and 3.1 Analysis Tool“ Software rechnerisch ausgewertet.

3.2.16.2 Quantifizierung der Zytokinsekretion mittels ELISA

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Zur quantitativen Bestimmung der IL-8 Sekretion wurde ein „Enzyme-l inked Immunosorbent Assay“ (ELISA) der Firma BD Bioscience verwendet. Hierfür wurde hochreiner IL-8 Antikörper („Capture Antibody“) für ca. 24h an spezielle Immunomikrotiterplatten (s. Tabelle 3.2) gebunden. Nach Blockierung der freien Bindungsstellen mit im Kit enthaltenem Tierserum (1h RT) und dreimaligem Waschen mit detergenzhaltigem Waschpuffer erfolgte die Inkubation mit 100µl verdünnten Infektionsüberständen für 2h bei RT. Je nach MOI oder Molarität der Lysophospholipide mussten die Überstände 1:200 bis 1:400 in Tierserum verdünnt werden, die uninfizierte A549 Kontrolle wurde grundsätzlich 1:20 eingesetzt. Gereinigtes IL-8 Protein wurde als Standard zur Quantifizierung bei jedem Experiment mitgeführt. Anschließend wurden die Überstände abgenommen, die Wells 5× mit Waschpuffer gewaschen und je 100µl der Detektionslösung, biotinhaltiger Detektionsantikörper mit Strepavidin-HRP-Konjugat, zu den Ansätzen gegeben. Nach 1h Inkubation bei RT erfolgten 7 Waschschritte und die Farbentwicklung nach Zugabe der Substratreagenzien. Je nach Intensität wurde die Reaktion nach 10 – 30min durch Zugabe von 50µl phosphorsäurehaltiger Stopplösung terminiert und die Absorption der Wells bei einer Wellenlänge von 450nm ausgelesen.

3.2.17 Immunfluoreszenzmikroskopie

Die Stämme L. pneumophila Corby (pBCKS), die plaB Mutante plaB1 (pBCKS) und die Komplementante plaB1 (pJB04) wurden auf BCYE-Agarplatten für 7 Tage bei 30°C kultiviert. Anschließend wurde eine Bakteriensuspension in PBS auf eine finale OD660 von 0,3 eingestellt und 500µl dieser Suspension für 5min bei 5.000rpm sedimentiert. Das Pellet wurde in 250µl einer 3%igen PFA-Lösung suspendiert und nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur mit 250µl PBS-Puffer vermischt und bei 4°C gelagert. Zur Immunfärbung wurden 30µl der Suspension auf einem Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger angetrocknet und in PBS gewaschen. Die anschließende Absättigung unspezifischer Bindungsstellen erfolgte für 30min bei 37°C mittels 3% BSA in PBS, supplementiert mit 0,2% Tween 20 (PBS-T). Nach einem Waschschritt (10min) in PBS-T wurde der primäre Antikörper (anti-FlaA aus Kaninchen) in einer Konzentration von 1:500 (in PBS-T) für 30min bei 37°C zugegeben. Nach erneutem Waschen (3×5min), der Inkubation mit dem sekundären Antikörper anti-Kaninchen-Alexa488 (1:300 in PBS-T), und letzten Waschschritten (3×5min) wurde der Objektträger erneut getrocknet. Die Versiegelung erfolgte mit dem ProLong Antifade Reagenz, welches zusätzlich den Farbstoff DAPI enthielt. Nach Trocknung der Proben über Nacht bei Raumtemperatur wurden die Ansätze am Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.

3.2.18 FT-IR Spektroskopie

Für die Untersuchung der Membranzusammensetzung mittels FT-IR Spektroskopie wurden L. pneumophila Corby und die plaB Mutante plaB1 entweder in Flüssigkultur (OD660 1,0) oder auf Platte (48 – 144h) kultiviert. Hierzu wurde 1 Impföse Bakterienmaterial von den Mutterplatten entnommen und in 1ml H2Obidest suspendiert. 500µl der Suspension wurden dann auf frische BCYEα-Agarplatten ausplattiert und bei 37°C inkubiert. Nach den angegebenen Zeitpunkten (s. Ergebnisteil) wurde etwas Zellmaterial in 80µl steriles H2O eingerieben und 35µl der Suspension auf ein infrarottransperables Probenrad aus Zinkselenid aufgetragen. Durch das Anlegen eines Vakuums von 66mbar im Exikator erfolgte über dem Trocknungsmittel Sicapent die Lyophilisierung der Proben. Der getrocknete Bakterienfilm auf dem Probenrad wurde dann mit einer Deckscheibe aus KBr (wasserlöslich) verschlossen und in das Spektrometer eingesetzt. Die verschiedenen Probenpositionen wurden jeweils gegen eine Negativkontrolle (Probenradposition ohne Bakterien) gemessen. Die Aufzeichnung des Interferogramms unter Verwendung des IF28/B-Spektrometer und des Programmes Opus erfolgte in einem Frequenzbereich von 3000 – 500 cm-1 und wurde anschließend durch Fourier-Transformation in das dargestellte Spektrum umgewandelt. Diese stellen so den negativen dekadischen Logarithmus des Absorptionsspektrums in absorbance units dar, der gegen die Messwellenlänge aufgetragen wurde.


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25.08.2010