5 Diskussion

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5.1 Identifizierung wichtiger Aminosäuren und Proteindomänen für die
lipolytische Aktivität von PlaB

5.1.1 PlaB und Homologe, eine neue Familie von Phospholipasen

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L. pneumophila kodiert für eine Reihe an phospholipolytischen Enzymen, von denen ein Großteil in den Kulturüberstand sekretiert oder in die Wirtszelle injiziert wird [90, 13, 14, 94, 93, 92, 288, 254]. Die höchste PLA/LPLA Aktivität verbleibt jedoch an der Bakterienzelle assoziiert und exponiert [247, 94]. Mit einem über 100-fach gesteigertem Hydrolysepotential, im Vergleich zu sekretierten lipolytischen Proteinen aus Legionella, wird sie durch das Enzym PlaB repräsentiert, einer Phospholipase, die keine Homologie zu bekannten bakteriellen oder auch eukaryontischen Lipasefamilien aufweist [23, 94]. Bisher beschriebene Familien lipolytischer Enzyme können in neun Klassen unterteilt werden, die durch konservierte Motive charakterisiert sind, welche die katalytisch wichtigen Aminosäuren einbetten [9, 15]. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass PlaB eine klassische katalytische Triade aus Serin, Aspartat und Histidin (Ser-85, Asp-203, His-251) ausbildet und dass deren Motive hoch konserviert in PlaB-Homologen sind. Diese Kombination aus katalytisch aktiven Aminosäuren stellt die häufigste Form eines aktiven Zentrums lipolytischer Enzyme dar, jedoch konnten bisher sowohl Triaden bestehend aus Serin, Glutamat und Histidin, als auch Diaden aus Serin und Aspartat beschrieben werden [9, 231, 293]. Die Besonderheit von PlaB und seinen Homologen liegt, bei näherer Betrachtung der Proteine, in den die essentiellen Reste umgebenden Aminosäuren. Hier zeigt sich, dass PlaB von den bis heute bekannten Motiven, unter anderem in dem des aktiven Serins, eindeutig abweicht. Das am Weitesten verbreitete GXSXG Serinmotiv aus pro- und eukaryontischen Lipasen/Esterasen [9, 142] oder auch das GDSL-Motiv der GDSL-Enzyme [283] wird in PlaB und Homologen durch THSTG repräsentiert. Hierbei ersetzt ein Threonin das für gewöhnlich an dieser Position enthaltene Glyzin. Die Notwendigkeit dieses hydrophilen Restes in unmittelbarer Nachbarschaft zum aktiven Serin konnte mittels Substitution durch Glyzin, also durch Wiederherstellung des typischen lipasebasierenden Motivs, verdeutlicht werden. Mutanten des Threoninrestes zeigten sich zu 95% in ihrer Aktivität gegenüber PLA/LPLA Substraten beeinträchtigt (s. 4.1.3). Im Gegensatz dazu wurde für die Lipase Vst aus Vibrio harveyi gezeigt, dass der Glyzinrest essentiell für die Entwicklung katalytischer Aktivität ist [275]. Die Tatsache, dass das in vielen Lipasen essentielle Glyzin in PlaB durch eine andere Aminosäure repräsentiert werden kann, macht PlaB und entsprechende Homologe einzigartig unter bisher beschriebenen lipolytischen Enzymen.

Da Phospholipasen mehr polare als apolare Lipidsubstrate hydrolysieren, kann angenommen werden, dass auch die aktiven Zentren dieser Enzyme entsprechend polare Aminosäuren aufweisen. Für PlaB trifft diese Hypothese bezüglich des Threoninrestes im Bereich des aktiven Serins zu. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht, ob sich die Substitution von Thr zu Gly auch auf die Hydrolysefähigkeit von Lipidsubstraten, wie z. B. 1,2-DG oder TG, auswirkt. So ist es für SHL, einer Phospholipase A/Lipase von Staphylococcus hyicus beschrieben, dass die Substitution eines polaren Serinrestes durch Valin, unmittelbar neben dem aktiven Histidin, die phospholipolytischen aber nicht die ‚echten’ lipolytischen Eigenschaften des Enzyms beeinflusst [286]. Bezüglich PlaB ließ sich allerdings feststellen, dass die Hydrolyse von klassischen Lipasesubstraten durch Deletion eines polaren Restes (Threonin) nicht erhöht war, sondern das Spaltungspotential ähnlich zu den Phospholipiden eher verringert wurde.

Interessanterweise führte die Substitution von Threonin durch den hydrophoben Rest Valin, vorhanden in PlaB-Homologen aus Pseudomonas aeruginosa und Persephonella marina, nur zur Alteration der Substratspezifität von PlaB. Cholinhaltige Phospho- und Lysophospholipide konnten demnach in geringerem Maße umgesetzt werden als korrespondierende Lipide mit Glyzerolresten. Ähnliche Resultate ergaben sich auch nach Substitution der Aminosäure His-7 und noch gravierender im Falle von Ser-129 (s. 4.1.3). His-7 ist zwischen PlaB und Homologen hoch konserviert und umgibt als Teil einer hydrophoben Tasche das zentrale Glyzin (IFVHGWS) des sogenannten „oxianion holes“ [142]. Dieses dient der Stabilisierung des ersten tetrahedralen Übergangszustandes bei der Bildung des Azyl-Enzyme Intermediates während der Hydrolyse von Lipidsubstraten. Eine derartig strikte Konservierung des Serinrestes an Position 129 ist in PlaB-Homologen nicht gegeben. Hier tragen die Enyzme von Psychromonas ingrahamii und Desulfuromonas acetoxidan s ein Glutamin an entsprechender Stelle. Warum gerade cholinkettentragende Lipide durch diese Veränderungen nicht mehr oder weitaus schlechter hydrolysiert werden können, kann nicht aufgrund chemischer Grundlagen erklärt werden. Da Glyzerolseitenketten im Lipidmolekül, wie z. B. bei DPPG oder MPLPG, nach wie vor sehr gut umgesetzt werden konnten, ist zu vermuten, dass cholinhaltige Lipide offensichtlich nicht die bevorzugten Substrate von PlaB darstellen. Denn nur kleine Veränderungen, wie in drei Fällen gezeigt, haben substantielle Auswirkung auf die Aktivität des Enzyms gegenüber dieser Art von Lipidsubstraten.

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Eine weitere Aminosäure, His-270, ist in PlaB in einem sogenannten HPT-Motiv lokalisiert. Dieses Motiv findet sich häufig bei GDSL-Enyzmen als dasjenige, welches das aktive Histidin umgibt [43, 283]. Die H270N Mutante war noch immer in der Lage, im Gegensatz zu der H251N Mutante des aktiven Zentrums, entsprechende Lipide zu einem wesentlichen Prozentsatz (~10%) zu hydrolysieren. Des Weiteren ist His-270 nur in den nächsten „Verwandten“ von L. pneumophila konserviert, nicht aber bei homologen Proteinen außerhalb des Genus Legionella. Daher übernimmt dieser Rest wohl eher eine für die Konformation des PlaB-Proteins wichtige unterstützende Funktion. Lipolytische Enzyme weisen meist eine α/β-Faltung auf [198, 192]. Inwiefern His-270 an der Ausbildung dieser Tertiärstruktur beteiligt ist und ob sich PlaB damit von seinen Homologen und anderen Phospholipasen unterscheidet, kann nicht ohne die Aufklärung der Kristallstruktur diskutiert werden.

Das Histidin der katalytischen Triade befindet sich in dem eher kurzen Konsensusmotiv SHS (Aminosäure 250-252). Auch dieses unterscheidet sich von bisher beschriebenen Enzymen, bei welchen der aktive Rest zumeist mit hydrophoben oder amphiphilen Aminosäuren umgeben ist, so z. B. NHL, HPT, HGF oder GH [9]. Anders verhält es sich dagegen mit dem Konsensusmotiv um den dritten Bestandteil des katalytischen Zentrums, dem aktiven Aspartat. Lokalisiert in der Aminosäureabfolge GSDGVV (AS 201-206), gleicht es sehr stark dem NDGL/VV-Motiv der Familie echter Lipasen [9, 142]. Kleine Unterschiede lassen sich hier nur in den in PlaB konservierten Resten GS (Aminosäure 201/202), die dem aktiven Aspartat vorstehen, erkennen. An Position -2, vom aktiven Aspartat aus gesehen, befindet sich in PlaB und Homologen ein konservierter Glyzinrest. Diese Position ist in anderen Lipasefamilien stark variabel. Zudem ist das in PlaB enthaltene Serin (Position -1) in anderen Enzymen häufig durch eine Aminosäure mit ähnlich polaren, hydrophilen und ungeladenen Eigenschaften, durch Asparagin ersetzt [278]. Ob die die katalytisch essentiellen Aminosäuren umgebenden Seitenketten analog zu Threonin in Nachbarschaft des katalytisch aktiven Serinrestes für die Aktivität von PlaB von Bedeutung sind, wurde in dieser Arbeit nicht weiter untersucht.

Zusammenfassend stellen die drei Konsensusmotive des aktiven Zentrums von PlaB und Homologen, THSTG – GSDGVV – SHS, Aminosäureabfolgen dar, die bisher noch bei keinem anderen lipolytischen Enzym beschrieben worden sind. Somit ist PlaB das erste charakterisierte Enzym einer neuen Familie bakterieller Phospholipasen [23].

5.1.2 Hydrolyse von Phosphatidylcholin als wichtiger Bestandteil der Virulenz

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Die Phospholipase PlaB, Mitglied einer neuen Familie lipolytischer Enzyme, hat zumindest in L. pneumophila besonders starke Aktivität und kann für die exprimierende Bakterienzelle eine essentielle Rolle in der Pathogen-Wirts-Interaktion spielen. Deshalb wäre es von Interesse, ob PlaB-Homologe auch in anderen Spezies neben L. pneumophila von ihren Bakterienwirten als generelle Virulenzfaktoren genutzt werden können. Betrachtet man jedoch verwandte Proteine, so findet man unter den signifikanten Homologen ausschließlich putative Phospholipasen aus  P.  ingrahamii, D.  acetoxidans und S. pealeana oder hypothetische Proteine aus M.  algicola, P.  marina und P.  aeruginosa. Diese Spezies zeichnen sich, wie Legionella dadurch aus Wasserhabitate zu bevorzugen. So findet man Psychromonas im Polarmeer, Persephonella an Tiefseeschloten von Vulkanen oder Marinobacter in marinen Sedimenten [10, 112, 113]. Doch nur Marinobacter, wie auch Shewanella und Pseudomonas Spezies wurden bereits mit eukaryonten Zellen oder Organismen, wie z. B. Dinoflagellaten, assoziiert beschrieben [113, 165, 118]. Zudem konnten nur Shewanella und Pseudomonas, ein bedeutender Erreger nosokomialer Infektionen, bisher als Humanpathogene identifiziert werden [233, 119]. Die Besiedlung von eukaryontischen Organismen durch die anderen Spezies ist zwar nicht auszuschließen, doch kann unter diesen Umständen nicht angenommen werden, dass es sich bei PlaB um einen generellen Virulenzfaktor zur Kolonisierung von Wirtszellen handelt.

Bis heute ist nichts über das Lipidhydrolysespektrum der PlaB-ähnlichen Enzyme bekannt. Daher könnte PlaB bei Legionella pneumophil a, aber nicht als Homolog einer der anderen Spezies, durch seine starke Aktivität und ein breites Lipidspektrum die Bevölkerung zusätzlicher Nischen, wie z. B. die der Lungenmakrophagen im Infektionsversuch des Meerschweinchens, unterstützen (s. 4.3.5.1). Erste Hinweise in diese Richtung ergaben Untersuchungen zum Vorkommen von PlaB-ähnlichen Enzymen in einer Reihe nicht-pneumophila Legionella Spezies. Hierbei stellte sich heraus, dass starke zell-assoziierte PLA/LPLA sowohl bei L. gormanii als auch bei L. spiritensis nachzuweisen war (s. 4.2.2, [23]). Das Protein von L. spiritensis wurde in dieser Arbeit näher untersucht, wobei festgestellt werden konnte, dass zwar das Hydrolysepotential gegenüber glyzerolhaltigen Phospholipiden zu dem von L. pneumophila Corby PlaB vergleichbar war, Lipide mit Cholinseitenketten jedoch weitaus weniger durch L. spiritensis PlaB hydrolysiert wurden (s. 4.2.2.2). Da L. spiritensis PlaB zu 94% homolog zu PlaB aus L. pneumophila ist, unterstreichen die Ergebnisse erneut, dass die PC-abhängige Hydrolyse eine, wenn auch fragile, Besonderheit des PlaB-Enzyms aus L. pneumophila darstellt. Interessanterweise ist keine der hier für die Substratspezifität wichtig befundenen Aminosäuren (His-7, Thr-83, Ser-129) in PlaB aus L. spiritensis verändert. Dies lässt auf weitere essentielle Aminosäuren schließen, die für die leicht inhibierbare Fähigkeit, cholinkettige Lipide zu spalten, von Bedeutung sind.

Es stellt sich dabei die Frage, ob und in wie weit die Fähigkeit, Phosphatidylcholin zu hydrolysieren, als wichtiger Bestandteil bakterieller Virulenz angesehen werden kann. Dies konnte in der vorliegenden Arbeit experimentell beantwortet werden. Es wurde sowohl für PlaB aus L. pneumophila Corby als auch für L. spiritensis PlaB gezeigt, dass ein reduziertes Potential an PC-Hydroylse mit reduzierter Fähigkeit, humane Erythrozyten zu lysieren, korreliert. Das ist insoweit schlüssig, da Phosphatidylcholin den hauptsächlichen Bestandteil der äußeren Phospholipidschicht von eukaryontischen Plasmamembranen darstellt [73]. Doch nicht nur die Plasmamembran ist mit einem hohen Anteil an PC ausgestattet. Die „oberflächenaktive Substanz“ (surface active agent = surfactant) der menschlichen Lunge wird von alveolären Typ II Pneumozyten sekretiert und besteht zu ~90% aus Lipiden, von denen wiederum der Hauptanteil durch Phosphatidylcholin repräsentiert wird [130, 222]. So vermittelt die PC-spezifische Aktivität einen zusätzlichen Vorteil für L. pneumophila, sich eventuell besonders im Infektionsprozess humaner Atemwege zu behaupten, denn bei in vitro Infektionen von A castellanii Amöben und U937 Makrophagenzellen konnte keine Notwendigkeit des PlaB-Enzyms nachgewiesen werden [94]. Mit Sicherheit ist PlaB nicht als alleiniger, zellzerstörender Virulenzfaktor anzusehen, doch interessanterweise konnten Humaninfektionen von nicht-pneumophila Stämmen mit verringertem PC-Hydrolysepotential nur in seltenen Fällen für L. gormanii und noch nicht für L. spiritensis beschrieben werden [82, 187, 114].

5.2 Die Bedeutung von PlaB für Legionella pneumophila

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Die Infektionsstudien am Meerschweinchenmodell zeigen, dass PlaB eine Rolle in der Virulenz von L. pneumophila spielt (s. 4.3.5.1). Ähnliche Beispiele sind für eine Vielzahl von bakteriellen, lipolytischen Pathogenitätsfaktoren beschrieben (s. Einleitung). Eine PLA/LPLA aus P. aeruginosa, ExoU, eingebracht in einen nicht-zytotoxischen Pseudomonas aeruginosa Stamm, reduzierte die letale Dosis einer BALB/c Maus-Infektion um das 39-fache der ursprünglichen LD50 Menge [5]. Im humanen System zeigte jedoch eine Reihe an klinischen Isolaten eine Deletion des ExoU-kodierenden Gens [131]. Gesteigerte Virulenz hingegen korrelierte direkt mit der Sekretion des ExoU Proteins, wie es bei Patientenisolaten mit krankenhauserworbenen Pneumonien beobachtet werden konnte [244]. Dieser offensichtlich wertvolle, aber nicht essentielle Vorteil des Erregers, entsprechende Phospholipasen zu exprimieren, könnte auch auf PlaB aus L. pneumophila zutreffen. Bei der Überprüfung der Verbreitung von PlaB in klinischen Isolaten konnte festgestellt werden, dass zell-assoziierte PLA/LPLA Aktivität in allen getesteten Patientenproben und in einem Umweltisolat vorhanden war (s. 4.2.1). Dieses Ergebnis unterstreicht die Annahme, dass PlaB von wertvollem Nutzen für ein erfolgreiches Überleben der Bakterien auch im humanen Wirt sein kann. Ob sich die PlaB-abhängige Aktivität, besonders auch die PC-hydrolysierenden Eigenschaften, gegen die Eukaryontenzelle oder gar gegen Bakterienzellen richtet, wird in den folgenden Abschnitten diskutiert.

5.2.1 PlaB als Werkzeug für verbesserte Umgebungs- und/oder Wirtsadaptation

PlaB als membranverankerte Phospholipase von Legionella pneumophila [247] kann mittels ihrer hydrolytischen Eigenschaften sowohl auf die Wirtszelle als auch auf die bakterielle Zelle Einfluss nehmen. Die Inhibition der Phago-Lysosomfusion im endozytischen Netzwerk ermöglicht Legionellen in einer spezialisierten Vakuole zu replizieren [268]. Diese zeichnet sich unter anderem durch die Abwesenheit eines für die Phagosomenreifung wichtigen Phospholipids aus, dem Phosphatidylserin (PS) [308]. Dieses Lipid, welches ~9% des Gesamtlipidbestandteils des Phagosoms ausmacht [72], verleiht der Vakuolenoberfläche unter Normbedingungen eine negative Gesamtladung, essentiell für die Rekrutierung kationischer Signalmoleküle und die weitere Reifung im Degradationsweg. Der hohe Anteil an PS in der Phagosomenmembran wird unter Normalbedingungen durch die ständige Verschmelzung mit Endosomen aufrechterhalten [308]. Legionellen könnten daher mittels direkter PS-Degradation durch eine Phospholipase oder durch Störung des Vesikelverkehrs zu der Reduktion an PS in der Phagosomenmembran beitragen. Die aktive Veränderung der umgebenden Vakuolenmembran zur Aufrechterhaltung der Replikationsnische wurde schon für die Glyzerophospholipid:Cholesterol Azyltransferase SseJ aus Salmonella enterica Serovar Typhimurium beschrieben. Es wird angenommen, dass akkumuliertes Cholesterol durch SseJ verestert und somit die Dynamik der umgebenden Vakuolenmembran beeinflusst wird [53, 193]. Ob ähnliche Aktivitäten in Bezug z. B. auf PS-Degradation auch von L. pneumophila PlaB ausgeübt werden können, ist bisher noch nicht bekannt. Zwar ist PlaB in der Lage, PS in hohem Maße umzusetzen (s. 4.1.1.3), doch zeigen in vitro Infektionen der plaB Mutante keinen Replikationsdefekt, wie z. B. die der Salmonella sse J Mutante [197]. Eine Kompensation durch die Hochregulation einer der anderen 16 bisher bekannten Phospholipasen nach plaB Deletion ist jedoch nicht auszuschließen. Somit ist es denkbar, dass PlaB an der Vakuolenmembran substantielle Veränderungen vornimmt und/oder auch lipidbasierende Signalmoleküle freisetzt, um der Pathogenabwehr des Wirtes entgegenzuwirken (s. 5.2.2).

Neben einem möglichen Einfluss auf die Wirtszelle kann eine zell-assoziierte Phospholipase auch die eigene bakterielle Membran verändern, um eine erfolgreiche Anpassung an veränderte Umweltbedingungen zu erreichen. Dieser Mechanismus ist für OMPLA von H. pylori zur Anpassung an das saure Milieu im Magen beschrieben. Es konnte gezeigt werden, dass ein reduzierter pH-Wert zur Aktivierung dieser Phospholipase führt, welche unmittelbar danach den Membrananteil an Lysophospholipiden von <2% auf >50% erhöht [273, 274]. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob PlaB die Überlebensfähigkeit und/oder die Membranzusammensetzung der Bakterien unter verschiedenen Wuchsbedingungen beeinflusst. Dies konnte bei keinem der getesteten Ansätze nachgewiesen werden. Das Wuchsverhalten der plaB Mutante glich dem des Wildtyps. Die durch dünnschichtchromatographische und FT-IR Analyse bestimmte Membranzusammensetzung zeigte keine Differenzen. Ein Unterschied konnte jedoch bei Erniedrigung des pH-Wertes festgestellt werden. Die Reduktion des Wachstums der plaB Mutante konnte bei weiterer Erniedrigung des pH-Wertes noch verstärkt werden, war jedoch bei den verwendeten Stämmen gegenläufig, d. h. der plaB- Stamm aus L. pneumophila 130b zeigte den Defekt, der des Stammes Corby wies diesen nicht auf. Die Membranzusammensetzung unterschied sich in keinem der Fälle von der des Wildtyps. Daher muss davon ausgegangen werden, dass die reduzierte Überlebensrate auf einen anderen Faktor und nicht auf PlaB zurückzuführen ist. Zudem besteht für den Lebenszyklus der Legionellen nur im späteren Verlauf der Replikation die Notwendigkeit, sich an ein säurehaltiges Milieu anzupassen, da sie zuerst, wie bereits erwähnt, die Ansäuerung ihres Replikationskompartimentes nach erfolgter Phagozytose verhindern [138].

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Die Fähigkeit, in der Umwelt oder auch während einer Humaninfektion toxische Stoffe zu spalten, kann für ein Bakterium von wesentlicher Bedeutung sein. Legionellen sehen sich nach Inhalation in die Alveolen der ersten Abwehrkomponente gegenüber, dem Lungensurfactant. Einwirkende Phospholipasen generieren bei der Zerstörung dieser Schutzschicht eine Menge an toxischen Lysophospholipiden. Diese hydrolytischen Abbauprodukte können nicht nur gegen die Wirtszelle, sondern auch gegen die Bakterienzelle wirken, indem sie in die Zielmembran interkalieren, die Membranorganisation stören und permeabilisieren, bis eine osmotische Lyse der Zelle eintritt [299, 215]. Daher kann es als Vorteil angesehen werden, Lysophospholipaseaktivitäten zum Abbau der toxischen Produkte zu synthetisieren. Insgesamt sind 15 der 17 bekannten phospholipolytischen Enzyme aus Legionella mit dieser Funktion ausgestattet [13]. Interessanterweise konnten für das GDSL-Enzym PlaA bereits detoxifizierende Eigenschaften beschrieben werden [93]. Da die Aktivität von PlaA im Vergleich zu PlaB relativ gering ist, wurde in dieser Arbeit der Beitrag von PlaB zur Spaltung toxischer Stoffe und somit zur Überlebensfähigkeit untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass das Enzym unter den getesteten Bedingungen nicht zur Abwehr dieser Substanzen eingesetzt wird.

5.2.2 Veränderung der zellulären Immunantwort als Mechanismus für gesteigerte
Virulenz

Phospholipasen sind nicht nur zellzerstörende Enzyme, sondern können vielmehr durch Generierung von Lipidsignalmolekülen Einfluss auf die Signalweiterleitung der Wirtszellkommunikation nehmen. Dies konnte schon für eine Reihe von lipolytisch aktiven Proteinen gezeigt werden. C. perfringens α-toxin, eine Phospholipase C, induziert die Expression von ELAM-1, ICAM-1 und IL-8 wie auch die der gefäßverändernden (vasoaktiven) Lipide Prostazyklin und PAF (platelet-activating factor), einem Thrombozytenaktivator, zur Störung der Homöostase im zellulären Gefäßsystem bei Wundinfektionen [45, 65]. Gleichermaßen wurde für ExoU von P. aeruginosa die Induktion von IL-8 und die Anreichung der Arachidonsäure zugrunde liegenden Prostaglandine PGE(2) und PGI(2) nachgewiesen [65, 234]. Es wird angenommen, dass dadurch die angeborene Immunantwort überstimuliert wird und, z. B. durch das Chemokin IL-8, angelockte Neutrophile so zu einer erhöhten Zellzerstörung des eigenen Gewebes beitragen. Somit ist die zytotoxische Eigenschaft mancher Phospholipasen zu einem gewissen Prozentsatz der Anregung des Immunsystems zuzuschreiben [242]. Zudem kann durch Synthese von vasoaktiven Lipiden die Gefäßerweiterung gefördert werden, um letztendlich eine Ausbreitung des pathogenen Organismus im Wirtssystem zu unterstützen.

Ganz im Gegensatz dazu reprimiert β-Toxin, eine Sphingomyelinase von S.   aureus, die Sekretion von IL-8 in TNF-α stimulierten Endothelzellen [269]. Dies steht in Einklang mit der beobachteten reduzierten Chemotaxis und Adhäsion von Leukozyten bei einer Infektion mit S. aureus [66, 54]. Offensichtlich nutzt dieses Bakterium nicht die Aktivierung, sondern die Blockierung der Immunantwort zur erfolgreichen Persistenz und Replikation im Wirtsorganismus.

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Wie in der vorliegenden Arbeit beschrieben, konnte PlaB die Sekretion des Chemoattraktants IL-8 induzieren. Dass Legionellen die Sekretion des Interleukins stimulieren, wurde bereits experimentell belegt [241, 103] und als Serummarker bakterieller Pneumonien nachgewiesen [153]. Jenes Interleukin ist neben anderen Chemokinen der CXC- oder CC-Familie für die Rekrutierung von Leukozyten zum Ort des Geschehens, der Infektion, und für deren Aktivierung von großer Bedeutung [12]. Das Einwandern von Neutrophilen, die zu der Klasse der polymorphkernigen Leukozyten gehören, ist ein Kennzeichen einer Infektion durch L. pneumophila [303, 34], aber auch der anderer Pneumonieerreger [64]. Doch im Gegensatz zu den meisten Lungenkeimen erweisen sich Legionellen relativ resistent gegenüber der Eliminierung durch neutrophile Zellen [139, 298]. Somit kann sich eine Il-8-abhängige Zellrekrutierung, vermittelt durch PlaB, positiv auf den Infektionsprozess auswirken, wenn sich die Anlockung und Aktivierung der Immunzellen gegen den Wirtsorganismus richten.

Ein Zusammenhang zwischen IL-8 Sekretion und Legionella virulenz- oder pathogenitäts-assoziierte Faktoren konnte auf verschiedene Weisen bestätigt werden. So zeigte sich z. B., dass die Stimulierung der IL-8 Sekretion im A549 Typ II Pneumozytenmodell bislang als DotO-abhängig, aber DotA-unabhängig, also widersprüchlich bezüglich des Typ IVB Sekretionssystem ist [277, 241]. Weiterhin wurde beschrieben, dass Neutrophileninflux im murinen Modell der Legionelleninfektion von der Expression des Toll-like Rezeptors 2 (TLR2) abhängig ist [102]. TLR bezeichnet eine Familie membranständiger Rezeptoren, die unterschiedliche pathogen-assoziierte molekulare Muster (pathogen-associated molecular patterns = PAMPs) erkennen und mittels Signaltransduktion eine entsprechende Immunantwort einleiten [147]. TLR2 wurde bisher als Rezeptor für die Bindung von Lipoteichonsäuren und peptidoglycan-assoziierten Lipoproteinen beschrieben [243, 251]. Neuesten Erkenntnissen zur Folge zeichnet sich TLR2 jedoch auch durch die Erkennung des bakteriellen Lipopolysaccharides (LPS) aus [109, 80]. Als membranständige Phospholipase wurde PlaB in dieser Arbeit auf den Einfluss der LPS-Zusammensetzung überprüft. Dieser Zucker-Lipid-Komplex wurde bereits experimentell als potenter Stimulator der Immunantwort im Menschen im Zusammenhang mit Infektionen der Lunge beschrieben [134]. Hierbei zeigte sich, dass E. coli LPS-Inokkulation die Ausschüttung der chemoattraktiven Faktoren IL-8 und MCP-1 fördert und somit Neutrophile und Makrophagen zum Infektionsherd lockt und aktiviert. Die gezeigte PlaB-abhängige IL-8 Sekretion konnte jedoch als unabhängig von LPS-Modifikationen eingestuft werden, da in ELISA-Studien als auch in vergleichender SDS-PAGE Analyse im LPS-Profil kein Unterschied zwischen dem Wildtyp und der plaB Mutante festzustellen war.

Im Weiteren wurde noch der Zusammenhang zwischen Flagellenexpression und nachfolgender Induktion der IL-8 Sekretion nach L. pneumophila Infektion humaner Lungenepithelzellen diskutiert [241]. Jedoch zeigte die in dieser Arbeit durchgeführte Flagellenmikroskopie, ähnlich den oben erwähnten LPS-Studien, keinen Unterschied zwischen Wildtyp und der plaB Mutante. Damit ist eine indirekte Beeinträchtigung der Membran und des Motilitätssystems durch PlaB als Wirkmechanismus bzw. als Signalmolekül eher zu vernachlässigen. Dies wirft die Frage nach einem anderen PAMP oder einem Botenstoff zur Stimulierung der Zytokininduktion auf. Die Aktivität von PlaB gegenüber Phospholipiden führt zur Abspaltung einer oder mehrerer Fettsäuren und zur Generierung von Lysophospholipiden. Die Arachidonsäure, die am häufigsten vertretene Fettsäure an sn2-Position eukaryontischer Phospholipide, und deren Derivat Prostaglandin E2 (PGE2) wie auch Lysophosphatidsäure (LPA) und Lysophosphatidylcholin (LPC) repräsentieren putative Signalmoleküle und konnten bereits als Induktoren der IL-8 Expression beschrieben werden [310, 270, 17, 219, 101]. In dieser Arbeit wurde beobachtet, dass A549 Lungenepithelzellen durch Stimulation mittels einer 25µM LPC-, nicht aber einer gleichmolaren LPA-Suspension, das Chemoattraktant in den Kulturüberstand sekretieren (s. 4.3.6.2). Im Lipidhydrolysespektrum von PlaB zeigte sich, dass das Enzym LPC, und somit ein putatives Signalmolekül, durch Spaltung von PC generieren kann (s. 4.1.1.3 und [94]). Ob auch Phosphatidsäure (PA) von PlaB hydrolysiert wird, wurde experimentell nicht untersucht, jedoch ist dieses Lipid nicht als häufiger Vertreter in Membranen anzusehen. Es ist daher wahrscheinlicher, sollte LPA an der Signalweiterleitung zur IL-8 Sekretion nach Legionelleninfektion beteiligt sein, dass durch PlaB generierte Lysophospholipide (LPLs) durch endogene Lysophospholipasen D (lysoLPD) gespalten und auf diesem Wege LPA zur Verfügung gestellt wird.

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LPA vermittelte IL-8 Sekretion ist in humanen bronchial Epithelzellen sowohl auf die Aktivierung des p38 MAPK/NF-κB Weges als auch auf die Aktivierung des JNK-induzierten AP-1 Transkriptionsfaktors zurückzuführen [232]. Ebenso konnte LPC als Stimulator der JNK/AP-1 Kaskade beschrieben werden [83]. Interessanterweise wurde ExoU, einer PLA/LPLA, die Aktivierung des JNK/AP-1 Signalweges und die dadurch abhängige Sekretion des Chemokins IL-8 nachgewiesen, wenn auch das Signalmolekül bislang noch nicht identifiziert werden konnte [65]. Welche Signalwege die PlaB-vermittelte Zytokinsekretion anschaltet, unterliegt Vermutungen. Legionellen-induzierte IL-8 Sekretion ist bisher über die Aktivierung des NF-κB-Signalweges beschrieben [103, 277]. Dieser kürzlich als 2-phasiges Translokationsereignis beschriebene Weg wird in erster Instanz durch Flagellin, in zweiter durch die Fähigkeit der bakteriellen Replikation bestimmt [19]. Untersuchungen der plaB Mutante zeigten bei dem beschriebenen Experiment keinen Unterschied zur NF-κB Nukleustranslokation des Wildtyps (Bartfeld, unveröffentlichte Daten), jedoch ist dies durch den bestätigten Replikationsdefekt in vivo nicht auszuschließen. Ebenso ist bisher nicht eindeutig geklärt, ob synergistisch zum NF-κB-Weg andere Transkriptionsfaktoren, wie z. B. AP-1 im Falle von ExoU, oder allgemein nach Pseudomonas Stimulation humaner Bindehautepithelzellen auch CCAAT/enhancer-binding Protein β (C/EBPβ) an der Zytokinantwort in Bezug auf IL-8 beteiligt sind [65, 292]. Der Zusammenhang zwischen IL-8 Sekretion und der Aktivierung von AP-1 nach Legionelleninfektion wird zwar von Teruya et al. dementiert, ist in deren experimentellen Ausführungen aber nicht eindeutig auszuschließen [277].

Ein ähnliches Prinzip der Zellrekrutierung und Aktivierung zur systematischen Zerstörung des umgebenden Gewebes kann der Sekretion der CC-Chemokine RANTES und MCP-1 zugrunde liegen (s. 4.3.6.1). Im Unterschied zu IL-8 ist MCP-1 chemotaktisch für Monozyten und für deren Initiierung des sogenannten ‚respiratorischen Burst’, der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies zur Eliminierung der Pathogene, verantwortlich [183]. MCP-1 Sekretion nach Legionelleninfektion humaner A549 Zellen wurde, zumindest zum Teil, als abhängig von der p38 MAPK-Signalkaskade beschrieben [241]. Das letzte der drei PlaB-induzierten Chemokine RANTES wiederum ist höchst effektiv in der Rekrutierung und Ausschüttung der, basische Proteine enthaltenen, Granula von basophilen und eosinophilen Leukozyten [224]. Diese Zellformen spielen jedoch eine eher untergeordnete Rolle in der Legionellen-induzierten Immunantwort, die hauptsächlich sowohl im humanen als auch im Mäuse- oder Meerschweinchenmodell durch polymorphkernige Neutrophile und Makrophagenzellen vermittelt wird [303, 34, 146].

Bisher nicht untersucht ist die in der vorliegenden Arbeit beobachtete Reduktion der TIMP-2 Expression nach Legionelleninfektion der Zelllinie A549. TIMP-2 inhibiert, als multifunktionales Protein, in erster Linie matrixdegradierende Metalloproteinasen (MMPs), die eine Vielzahl an Funktionen in der Embryonalentwicklung, der Organmorphogenese und der Wundheilung übernehmen [33]. Ein Ungleichgewicht zwischen den MMPs und ihren Inhibitoren kann in signifikanten Gewebszerstörungen und einer Vielzahl an Erkrankungen enden, so z. B. Krebs und Arthritis. Die Aktivierung von MMPs und die Senkung der TIMP-2 Expression im Zusammenhang mit bakteriellen Infektionen wurden bisher nur in Einzelfällen beschrieben. So reduzierten mit E. coli LPS stimulierte Makrophagen die Expression des Inhibitors [250]. Studien zu Actinobacillus actinomycetemcomitans, einem Erreger der Parodontidis (Entzündungen des Zahnfleischbindegewebes), zeigten zwar keine Veränderung in der TIMP-2-Menge, aber eine erhöhte Sekretion von MMPs, was wiederum als erheblicher Beitrag zur Gewebszerstörung des Zahnhalteapparates diskutiert wurde [30]. Ob und in welchem Maße Legionellen eine Induktion der Metalloproteinasen induzieren oder deren Inhibition blockieren und somit zur Zellzerstörung des infizierten Gewebes beitragen, kann ein interessanter Punkt zukünftiger Forschungsansätze sein. In dieser Arbeit wurde eine PlaB-abhängige TIMP-2 Expression nachgewiesen. Lungenepithelzellen waren in der Expression des Inhibitors nach Infektion mit der p laB Mutante reduziert (s. 4.3.6.1). Eine Sekretion von TIMP-2, stimuliert durch PlaB, hätte bei der oben genannten Annahme eine inhibierende Wirkung auf die Zellzerstörung und ist demnach gegenläufig zu der Stimulierung des Immunsystems durch Expression der Chemoattraktoren IL-8/MCP-1 und RANTES. Dies könnte auf eine Feinmodulation zurückzuführen sein oder auf der Tatsache beruhen, dass TIMP-2 neben der offensichtlichen Inhibition von MMPs und abhängig vom betroffenen Zelltyp gegenläufige Funktionen übernehmen kann. So wurde das Peptid als die Zellproliferation stimulierend oder hemmend, aber auch apoptosefördernd oder anti-apoptotisch wirkend beschrieben [160]. Intensivere Untersuchungen, vor allem in Bezug auf die allgemeine Reduktion des TIMP-2-Levels, könnten gezielte Therapeutika hervorbringen, die die massive Zerstörung von Lungengewebszellen und die Verbreitung der Bakterien innerhalb des Organs minimieren.

5.2.3 PlaB als Bakteriozin?

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PlaB zeigt hydrolytisches Potential gegenüber einem breiten Spektrum an Phospholipidsubstraten (s. 4.1.1.3). Interessanterweise wird bevorzugt Phosphatidylglyzerol gespalten, ein Lipid, welches in Legionella, aber vor allem bei anderen bakteriellen Spezies in der Zellmembran vorliegt [201]. Aus welchem Grund könnte solch eine Phospholipase für L.   pneumophila von Bedeutung sein? Neben Protozoen als hauptsächlichen Replikationsort konnten Legionellen auch in aquatischen Biofilmen nachgewiesen werden [69, 68, 221]. Ob sie sich darin auch extrazellulär vermehren oder sich nur in ihrem Protozoenwirt replizieren, ist bis heute umstritten, in Mikrokolonien persistierende Bakterien konnten jedoch beobachtet werden [221, 190]. Da sich in Biofilmen eine Vielzahl an bakteriellen Spezies befinden kann, ist es essentiell, sich gegen diese zu behaupten und/oder sich gegen diese zur Wehr zu setzen, um das eigene Wachstum und die damit verbundene Nährstoffgrundlage zu gewährleisten. Eine Möglichkeit, dies umzusetzen, kann die Zerstörung gegnerischer Membranen sein. Sekretierte Gruppe IIa Phospholipasen A2 aus Säugetieren sind weitläufig für ihre bakteriziden Eigenschaften bekannt [47, 20, 151]. Sie sind aufgrund ihrer stark kationischen Natur (humane gIIa PLA2 = pI>10.5) in der Lage, die negativ geladenen Membranen Gram positiver Bakterien zu passieren, benötigen jedoch für die Penetration Gram negativer Zellwände zusätzlich den Einsatz eines bakterizid/permeabilisierung-steigernden Proteins BPI (bactericidal/permeability-increasing protein) [47]. Zudem weisen diese Enzyme eine hohe Affinität für anionische Lipidmembranen auf, wie sie in Bakterien zu finden ist und weniger für die zwitterionischen Membranen der eigenen eukaryontischen Zelle. PlaB zeigt zumindest ansatzweise Potential eine solche Rolle einzunehmen. So wird z. B., wie bereits erwähnt, vorwiegend das anionische Lipid PG hydrolysiert. Die Gegenüberstellung der positiv geladenen Lysin-, Arginin- und Histidin- zu negativen Aspartat- und Glutamatresten resultiert in einer Nettogesamtladung für PlaB von +16 (humane gIIa PlaA2 = +19) und damit theoretisch in der Fähigkeit, anionische Membranen passieren zu können. Bisher ist jedoch noch kein Beispiel einer PLA aus Bakterien als Abwehrmechanismus im mikrobiologisch sozialen Umfeld bekannt. Des Weiteren sind die bakteriziden Phospholipasen von Säugetierzellen sekretierten Ursprungs und nicht, wie PlaB, zell-assoziierter Natur. PlaB konnte bisher nur an der äußeren Membran lokalisiert werden [247]. Dies schließt jedoch eine mögliche Sekretion über das Abschnüren von Vesikeln der äußeren Membran, sogenannten OMVs (outer membrane vesicles), nicht aus. Diese Art der Sekretion umfasst sowohl LPS und Phospholipide als auch Proteine der äußeren Membran und des Periplasmas und wird von Bakterien zur Überbringung von Virulenzfaktoren aber auch zur Kommunikation innerhalb einer Kolonie über „quorum sensing“ genutzt [156, 175, 31]. Die Übermittlung einer Phospholipase über OMVs könnte als Übertragungsweg für PlaB in Frage kommen. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass die Vesikel aus L. pneumophila lipolytische Aktivität besitzen [103]. Bisher war es allerdings weder möglich, PlaB in OMVs zu detektieren [103], noch bakterizide Eigenschaften des Enzyms nachzuweisen. Daher bleibt die Frage nach der spezifischen Funktion des Lipidsubstratspektrums für weitere Forschungsansätze offen.

In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue Familie lipolytischer Enyzme begründet werden. PlaB, als erster näher charakterisierter Vertreter, weist ein breites Lipidsubstratspektrum mit der Besonderheit auf, durch Phosphatidylcholinhydrolyse erhebliche zytotoxische Eigenschaften erworben zu haben. Tatsächlich zeigte sich im Tiermodell, dass PlaB einen erheblichen Einfluss auf das Virulenzpotential der Bakterien hat. Neben zytolytischer Aktivität könnte die Generierung von Signalmolekülen auf Lipidbasis und die damit veränderte Immunantwort ein Teil der von PlaB-vermittelten Virulenz darstellen. Da sich in in vitro Infektionen von Makrophagen aber auch von Amöben kein Replikationsdefekt der plaB Mutante nachweisen ließ, ist das Enzym trotz stärkster Aktivität nur als ein Bestandteil einer großen Anzahl lipolytischer Faktoren zu sehen, die für das Überleben von Legionellen in ihrem Wirt aber auch der Umwelt von Nutzen sein könnten.


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25.08.2010