Das „screening“ einer Genombank von Legionella pneumophila Corby in E. coli Zellen führte zu der Entdeckung eines stark lipolytisch und hämolytisch aktiven Proteins. Eine entsprechende Insertionsmutante in L. pneumophila zeigte, dass das zugrunde liegende plaB Gen für die hauptsächliche zell-assoziierte Phospholipase A/Lysophospholipase A kodiert, mit über 100-fach stärkerer hydrolytischer Aktivität, verglichen zu bisher beschriebenen lipolytischen Enzymen dieses Bakteriums [94]. Da PlaB keine Homologie zu bekannten Lipasefamilien aufweist, sollten in dieser Arbeit zur weiteren Charakterisierung vor allem biochemische Ansätze verfolgt, aber auch Analysen zur Funktion des Proteins während einer Legionelleninfektion durchgeführt werden.

Biochemische Eigenschaften von PlaB

Das PlaB-Protein

In silico Analysen (s. 3.1.11) zur Folge wird das 1425bp lange plaB Gen in ein 474 Aminosäuren-Volllängenprotein translatiert. Das Molekulargewicht beträgt 53,7kDa mit einem theoretischen isoelektrischen Punkt von 8,38. Berechnungen zur Hydrophobizität nach Kyte-Doolittle [157] zeigten keine möglichen Transmembrandomänen auf, ebenso konnte kein putatives Signalpeptid zur Sekretion von PlaB durch bekannte Sekretionssysteme von Gram negativen Bakterien gefunden werden (SignalP 3.0). Vorhersagen zur subzellulären Lokalisation mittels ProtComp (Softberry) weisen jedoch auf eine Assoziation des Proteins mit der äußeren Membran über insgesamt 10 Transmembransegmente [Aminosäure (AS) 112:125 – 144:163 – 170:187 – 197:219 – 236:255 – 262:285 – 308:324 – 337:355 – 373:393 – 408:430] hin. Allerdings erstrecken sich zwei der Transmembrandomänen über den Motivbereich der aktiven Aminosäuren Asp-203 und His-251 (s. 4.1.3). Daher ist die Vorhersage mittels ProtComp mit Vorsicht zu behandeln. Lokalisationsstudien belegen trotz allem eine assoziierte oder integrale Verankerung von PlaB an der äußeren Membran von L.  pneumophila [247]. Ob PlaB an seinem Bestimmungsort durch Dimerisierung oder weitere Prozessierungen seine Aktivität entwickelt, ist nicht bekannt. Fünf N-Glykosylierungs- [AS 26 – 162 – 214 – 297 – 435] als auch 7 putative N-Myristoylierungsstellen [AS 76 – 120 – 140 – 154 – 244 – 248 – 257] zeigen Ansatzpunkte für posttranslationale Modifikation und/oder Membranverankerungen (PSITE, Softberry). Für die N-Myristoylierung bedarf es allerdings eines N-terminalen Glyzinrestes, die angegebenen Aminosäuren befinden sich jedoch im Inneren des Proteins. Zudem ist diese Art der Modifikation in Prokaryonten noch nicht bekannt. Im Weiteren weist eine „coiled coil“ Region im Bereich von Aminosäure 283-309 auf eine mögliche Dimerbildung hin (COILS Server, s. Tabelle 3.19). Somit könnte ähnlich zur „outer membrane phospholipase A“ (OMPLA) aus E. coli die Dimerisierung von PlaB ausschlaggebend für die Entwicklung voller hydrolytischer Aktivität sein.

Konstruktion des Komplementationsvektors pJB04

In der vorliegenden Arbeit wurde, soweit nicht anders erwähnt, ausschließlich Legionella pneumophila Corby PlaB untersucht. Da in dem kürzlich konstruierten Vektor pKH192 [94] ein Aminosäureaustausch an Stelle 101 der Proteinsequenz vorliegt [(aat)N♢(agt)S], wurde in dieser Arbeit ein neuer Komplementationsvektor konstruiert. Hierzu wurde L. pneumophila Corby plaB von genomischer DNA und mit den Primern plaB_SalIf und plaB_EagIr amplifiziert und unter Nutzung der gleichen Schnittstellen in den Vektor pBCKS (Stratagene) ligiert. Nach erfolgter Sequenzierung wurde der resultierende Vektor pJB04 sowohl in die plaB Mutante plaB1 [plaB1(PlaB)] als auch in den Wildtyp [Corby(PlaB)] eingebracht. Als Kontrollen dienten die jeweiligen, mit dem Leervektor (LV) transformierten Stämme.

Lipidhydrolyse-Profil von PlaB

Phospholipolytische Aktivitäten werden anhand der freigesetzten Fettsäuren (FFA) aus Phospholipidsubstraten (PLA-Aktivität) oder Lysophospholipidsubstraten (LPLA-Aktivität) bestimmt, die der „echten“ Lipasen anhand der Fettsäuren aus unpolaren Lipidmolekülen.

Abbildung 4.1: Lipidhydrolyseprofil von L. pneumophila Corby PlaB.

Das hydrolytische Potential von L. pneumophila Corby PlaB wurde durch Freisetzung von Fettsäuren (FFA) aus verschiedenen Lipidsubstraten bestimmt. A) Hydrolyseeigenschaften von Wildtyp und plaB Mutante nach Inkubation mit Phospholipiden (DPPC, DPPG, DPPE, DPPS) und Lysophospholipiden (MPLPC, MPLPG, MPLPE; MPLPA). Um die Löslichkeit der Lipide zu verbessern, wurde bei diesem Experiment eine Lipidendkonzentration von 1mM gewählt. B) Hydrolyse von Cardiolipin durch L. pneumophila plaB Mutante plaB1 (LV) und Komplementante plaB1 (PlaB). Die Daten sind repräsentativ für Doppelwerte von mindestens 2 Wiederholungen. LV=Leervektor pBCKS

Die hydrolytische Aktivität von PlaB bezieht sich fast ausschließlich auf Phospholipid- oder Lysophospholipidsubstrate (Abb. 4.1). Hier wurden vor allem Phospholipide mit einer negativen Nettoladung, wie z. B. Phosphatidylglyzerol (DDPG), Phosphatidylserin (DPPS) und Lysophosphatidsäure (MPLPA), hydrolysiert. Phosphatidylethanolamin (DPPE), ein bipolares Lipid, ohne Nettoladung bei pH neutralen Bedingungen, wurde nur schwach, Lysophophatidylethanolamin (MPLPE) dagegen in weitaus größerem Maßstab gespalten (Abb. 4.1 A). Tendenziell zeigte sich eine Affinität des Enzyms für Lipidsubstrate mit negativer Nettoladung, jedoch lässt sich keine generelle Aussage über die Präferenz treffen, da auch bipolare Lipide, wie z. B. Phosphatidylcholin (DPPC) oder MPLPE, von PlaB hydrolysiert werden konnten. Weiterhin zeigte das Enzym Hydrolysepotential gegenüber dem Diphosphatidylglyzerin Cardiolipin (Abb. 4.1 B), Lipidsubstrate wie 1-MPG, 1,2-DG und TG wurden dagegen nur sehr geringfügig oder nicht umgesetzt (nicht gezeigt).

Selektivität gegenüber Variationen in der Fettsäurekettenlänge

Aus dem Lipidhydrolyse-Profil von PlaB lässt sich erkennen, dass das Enzym relativ spezifisch zwischen Lipidkopfgruppen differenzieren kann. OMPLA aus E. coli akzeptiert ebenso eine Vielzahl an Substratkopfgruppen, verhält sich aber selektiv gegenüber der Azylkettenlänge im Lipidmolekül [259]. Zur Untersuchung, ob PlaB auch Selektivität in Bezug auf die Fettsäurekettenlänge besitzt, wurde Lysophosphatidylcholin mit Azylresten von C8, C12 und C16 Kohlenstoffatomen im Hydrolyseassay auf Freisetzung der entsprechenden Fettsäure überprüft. Abblidung 4.2 zeigt, dass durch PlaB bevorzugt Substrate mit einer Mindestanzahl von 12 Kohlenstoffatomen hydrolysiert wurden. Monooctanoylphosphatidyl-cholin (C8) wurde unter diesen Bedingungen nicht von PlaB gespalten (Abb. 4.2).

Abbildung 4.2: Selektivität von PlaB gegenüber Fettsäurekettenlängen in Lysophospholipidsubstraten.

Zelllysate von L. pneumophila Corby Wildtyp, der plaB Mutante und Komplementante wurden mit Lysophosphatidylcholinsubstraten unterschiedlicher Fettsäurekettenlänge inkubiert und die Freisetzung von Fettsäuren bestimmt. Als interne Kontrollen wurden die Phospholipide DPPC und DPPG und das Lysophospholipid MPLPG mitgeführt. Die Daten sind repräsentativ für Doppelwerte von 2 Wiederholungen und wurden experimentell durch p-Nitrophenolsubstrate verifiziert. Abkürzung: LV = Leervektor pBCKS.

Ähnliche Ergebnisse konnten auch durch Verwendung von p-Nitrophenolsubstraten mit Fettsäurekettenlängen von 4, 12 und 16 Kohlenstoffatomen erzielt werden (nicht gezeigt).

Sequenzhomologie von PlaB und PlaB-ähnlichen Proteinen

Alle bisher annotierten Genome von L. pneumophila (Corby, Paris, Lens, Philadelphia-1) tragen das Gen für die Phospholipase PlaB. Dabei weisen die Stämme Paris, Lens und Philadelphia-1 eine Homologie von mindestens 99% und eine Identität von mindestens 98% zum PlaB Protein von Stamm Corby auf. Erst die ‚nächsten Verwandten’, die nicht-pneumophila Stämme L. spiritensis  und L. drancourtii LLAP12, kodieren für PlaB-Proteine mit etwas erniedrigter Homologie (H 94% beide) und Identität (I 89% bzw. I 87%). Interessanterweise zeigt L. drancourtii PlaB eine N-terminale Extension von 24 Aminosäuren. Durch BLAST Analysen der NCBI Datenbank konnten weitere PlaB-ähnliche Proteine ermittelt werden. Diese beinhalten putative Phospholipasen aus Psychromonas ingrahamii (H 62%, I 44%), Desulfuromonas acet oxidans (H 60%, I 43%) und Shewanella pealeana (H 60%, I 42%) oder hypothetische Proteine aus Persephonella marina (H 46%, I 29%), Maricaulis maris (H 44%, I 28%) und dem pathogenen Bakterium Pseudomonas aeruginosa PA7 (H 41%, I 28%) sowie aus weiteren P. aeruginosa  Stämmen. Jedoch konnte keine Homologie von PlaB zu bereits beschrieben Phospholipasen festgestellt werden. Ebenso weisen putative katalytisch wichtige Aminosäuremotive erhebliche Unterschiede zu bekannten bakteriellen und eukaryontischen Lipasen auf [9, 142]. Aufgrund dessen war es im Folgenden von Interesse, ob PlaB aus L. pneumophila analog zu anderen lipolytischen Proteinen eine katalytische Triade zur effektiven Hydrolyse von Lipidsubstraten besitzt und ob PlaB und Homologe durch die neuartigen konservierten, die Aminosäuren umgebenden Motive eine neue Klasse an lipidhydrolysierenden Enzymen repräsentieren.

Bestimmung der katalytisch relevanten Aminosäuren von PlaB

Lipasen oder Phospholipasen enthalten in ihrer Proteinsequenz hoch konservierte Domänen, welche die katalytisch wichtigen Aminosäuren einbetten. Diese sind häufig als katalytische Triade aus einem Nukleophil (Serin, Aspartat oder Cystein), einer ‚sauren’ Aminosäure (Aspartat oder Glutamat) und einem Histidin zusammengesetzt [9, 293, 283]. Neben Triaden sind auch katalytische Diaden bekannt, so z. B. die Kombination aus Serin und Aspartat bei Patatinen, einer Lipasefamilie aus der Kartoffelknolle [231]. Interessanterweise kodiert L. pneumophila für 11 Patatin-ähnliche Proteine (PLP), die mit weiteren bakteriellen PLPs in einer neuen Klasse lipolytischer Enzyme zusammengefasst werden können [15].

In L. pneumophila PlaB konnten verschiedene Motive ausfindig gemacht werden, die putativ katalytisch relevante Aminosäuren umgeben. In Bezug auf das nukleophile Serin entspricht jedoch keine dieser Aminosäureabfolgen den typischen GXSXG oder GDSL Motiven bekannter bakterieller oder eukaryonter Enzyme [9]. Abbildung 4.3 fasst lipase- und phospholipaseähnliche Motive in PlaB zusammen, die im Folgenden durch Basenpaarsubstitution in ihrer Aminosäurensequenz verändert wurden.

Abbildung 4.3: Sequenzmotive von putativ katalytisch wichtigen Aminosäuren in L. pneumophila Corby PlaB und ihre Lokalisation im Protein.

PlaB unterscheidet sich von bisher beschriebenen bakteriellen Lipasefamilien in der Sequenz der Motive, die putativ wichtige Aminosäuren (Serin, Aspartat und Histidin) umgeben. Dargestellt sind diejenigen Reste in PlaB, die veröffentlichten Motiven ähneln und im Folgenden durch Basenpaarsubstitution mutiert werden sollten. Die relevanten Aminosäuren sind ‚fett’ unterlegt und ihre Aminosäurepositionen (AS) im PlaB-Protein angegeben.

‚Site-directed mutagenesis’ von PlaB

Durch Basenpaarsubstitution wurden relevante Aminosäuren ersetzt, so dass sich zwar das Ladungsverhalten oder der hydrophile Charakter verändert, nicht jedoch die sterischen Eigenschaften, um die Wahrscheinlichkeit einer Alteration der Sekundärstruktur weitgehend zu minimieren. Serinreste wurden demnach durch Alanin, Aspartat und Histidin durch Asparagin ersetzt. Dies erfolgte mittels der Methode der „combined chain reaction“, einer speziellen PCR-Technik [27]. Hierbei wird ein dritter Primer, der die entsprechende Mutation trägt, mit Hilfe einer thermostabilen Ligase während des PCR-Vorgangs mit dem fortlaufenden Strang verknüpft. Auf diese Weise konnten 17 PlaB-Mutanten hergestellt werden, die analog zur Wildtyp PlaB-Kontrolle sowohl in E. coli DH5α als auch in der L.  pneumophila Corby plaB  Mutante plaB1 exprimiert wurden. Die Fähigkeit der Mutantenenzyme, Lipidsubstrate zu hydrolysieren, wird im nächsten Abschnitt vorgestellt.

Lipolytische Aktivität von PlaB-Mutanten

Wie bereits gezeigt, entfaltet PlaB vor allem hydrolytische Aktivität gegenüber Phospholipid- und Lysophospholipidsubstraten. Daher wurden konstruierte „site-directed“ PlaB-Mutanten auf Lipolyse bezüglich DPPG/DPPC und MPLPG/MPLPC hin untersucht. Von je 5 veränderten Ser-, Asp- und His-Resten (s. Abbildung 4.3) zeigten sich die Mutanten S85A, D203N und H251N zu mehr als 99% in ihren hydrolytischen Eigenschaften reduziert (Abb. 4.4 A). Sie repräsentieren demnach eine katalytische Triade, wie sie für die meisten lipolytischen Enzyme beschrieben wurde.

Abbildung 4.4.: Lipidhydrolyseprofile von PlaB-Mutanten mit Auswirkung auf die lipolytische Aktivität des Enzyms.

 Mutierte PlaB Enyzme wurden in L. pneumophila plaB Mutante plaB1 zur Expression gebracht und Zelllysate auf veränderte lipolytische Eigenschaften untersucht. Dargestellt ist die Freisetzung von Fettsäuren durch PlaB Mutantenproteine im Vergleich zu den Leervektor pBCKS (LV)- und Wildtyp-PlaB tragenden Kontrollen (PlaB). A) Substitution von Ser-85, Asp-203 oder His-251 führte zu fast vollständigem Aktivitätsverlust (>99%) des PlaB Enzyms. Sie repräsentieren demnach das aktive Zentrum. B) + C) Ser-129 und His-7 Substitutionen reduzieren die Fähigkeit der Mutanten Phospho- und Lysophospholipide mit Cholinseitenketten zu hydrolysieren. His-339 und His-433 zeigen keine Veränderung der Aktivität nach erfolgter Mutation. D) Der Austausch von His-270 reduziert die Aktivität gegenüber den verwendeten Phospholipid (DPPG, DPPC)- und Lysophospholipidsubstraten (MPLPG, MPLPC) auf 10% der Wildtyp-PlaB-Aktivität. Die Daten repräsentieren Doppelwerte von mindestens 3 Experimenten in Legionella und wurden durch Expression der Gene in E. coli DH5α bestätigt.

Die Relevanz dieser Aminosäuren wurde durch die strikte Konservierung entsprechender Reste in allen PlaB-Homologen noch unterstrichen (s. Abb. 4.6).

Im Weiteren konnten Ser-129, His-7 und His-270 identifiziert werden, die für die Entwicklung voller lipolytischer Aktivität von Bedeutung sind. Durch Substitution von
Ser-129 und His-7 wurde die Hydrolyseeigenschaft gegenüber Substraten verringert, die Cholinseitenketten am Phosphodiester tragen (Abb. 4.4 B/C). Im Falle von DPPC reduzierte sich die Aktivität gegenüber dem Lipid bei Mutante H7N um 80%, bei S129A sogar um fast 100%. Zu ca. 60% (H7N) und 80% (S129A) weniger effizient wurde MPLPC von den Mutanten umgesetzt. Die Hydrolyse von DPPG blieb fast unverändert (reduziert zu 10% bei H7N bzw. 12% bei S129A), wohingegen die Eigenschaft, MPLPG zu spalten, etwas beeinflusst wurde (reduziert zu 43% bei H7N bzw. 22% bei S129A). Ein weiteres Histidin, His-270, konnte in einem HPT-Motiv aus GDSL-Hydrolasen lokalisiert werden [283]. Substitution mit Asparagin reduzierte drastisch die PlaB-Aktivität der Mutante auf verbleibende 10% im Vergleich zum Wildtyp (Abb. 4.4 D).

Andere Substitutionen, wie z. B. S200A, S229A, S250A, D75N, D167N, D432N, D381N, H339 oder H433N, zeigten keinen Einfluss auf das Hydrolysepotential oder -Profil von PlaB (Abb. 4.4 C und 4.5 A/B).

Abbildung 4.5: Lipidhydrolyse von mutierten PlaB-Enzymen ohne gravierende Auswirkung auf die lipolytischen Eigenschaften.

Mutierte plaB-Gene wurden in L. pneumophila plaB1 exprimiert und Zelllysate auf die Freisetzung der Fettsäuren aus PL und LPL Substraten untersucht. Alle gezeigten Aminosäuresubstitutionen hatten keinen signifikanten Einfluss auf die lipolytischen Eigenschaften der Mutanten und setzten Fettsäuren in vergleichbarer Menge zu dem Wildtyp-PlaB-exprimierenden Stamm (PlaB) frei (A + B). Die Daten repräsentieren Doppelwerte von mindestens 3 Experimenten in Legionella und wurden durch Expression der Gene in E. coli DH5α bestätigt. LV = Leervektor pBCKS.

Offensichtlich besitzt PlaB eine klassische katalytische Triade aus Ser, Asp und His für effektive Hydrolyse von Lipidsubstraten, die sich jedoch wesentlich von anderen lipolytischen Enzymen unterscheidet. Das beruht, neben den konservierten Motiven um Aspartat und Histidin, vor allem auf einem Threoninrest, der in unmittelbarer Nachbarschaft zu dem katalytisch aktiven Serin lokalisiert ist (Abb. 4.6).

Das umgebende Motiv kann als THSTG beschrieben werden, welches zwar ähnlich zu bekannten GXSXG Motiven ist, sich aber durch Threonin anstelle von Glyzin deutlich hervorhebt. Aus diesem Grund wurde Thr-83 durch Gly substituiert und veränderte Lipidhydrolyse dokumentiert (Abb. 4.7 A). Die Wiederherstellung des lipasebasierenden Motivs (GXSXG) führte zu einer signifikanten Reduktion von über 95% ursprünglicher Wildtyp-Aktivität (Abb. 4.7 A).

Abbildung 4.6: Sequenzvergleich und resultierende Konsensussequenz der katalytischen Triade von L. pneumophila Corby PlaB und PlaB-Homologen.

Aminosäuren, relevant für die lipolytische Aktivität von L. pneumophila Corby PlaB wurden den homologen Bereichen putativer Phospholipasen oder hypothetischer Proteine nach BLAST-Analyse gegenüber gestellt. Die konservierten Aminosäuren des katalytischen Zentrums sind durch dunkelgraue Schattierungen und Sternchen (*) hervorgehoben. Die resultierende Konsensussequenz beruht auf Aminosäureresten, die am Häufigsten an dieser Position in PlaB und Homologen detektiert werden konnten. Weitere Aminosäuren, wichtig für die hydrolytische Aktivität von PlaB, sind mit einem Quadrat markiert (■). Die Nummern zwischen den homologen Bereichen geben die erste Aminosäure des jeweiligen Homologieabschnittes wider. Der letzte Zahlenabschnitt hingegen spiegelt die Anzahl der restlichen Aminosäuren in den entsprechenden Enzymen wider und ist mit einem Dreieck gekennzeichnet (Δ). Abkürzungen: Legionella pneumophila (L.pneu), Legionella spiritensis (L.spir), Legionella drancourtii LLAP12 (L.dran), Psychromonas ingrahamii (P.ing), Desulfuromonas acetoxidans (D.acet), Shewanella pealeana (S.peal), Marinobacter algicola (M.algi), Pseudomonas aeruginosa PA7 (P.aeru) and Persephonella marina (P.mari). Volllängen-Sequenzvergleich siehe Anhang.

Abbildung 4.7: Bedeutung der Aminosäure Threonin-83 im Konsensusmotiv THSTG des aktiven Serinrestes Ser-85.

Mutierte plaB Gene wurden in der plaB Mutante L. pneumophila plaB1 exprimiert und die Freisetzung von Fettsäuren aus Lipidsubstraten gemessen. A) Die Widerherstellung des typischen Lipasemotivs GXSXG durch T♢G Substitution reduzierte die Aktivität von PlaB um ~95% verglichen zur Aktivität des Wildtypproteins (PlaB). B) Austausch von Threonin durch Valin beeinflusste die Substratspezifität von PlaB. Die Mutante T83V war reduziert in der Fähigkeit cholintragende Lipide zu hydrolysieren. Die Daten repräsentieren Doppelwerte von mindestens 3 Experimenten in Legionella und wurden durch Expression der Gene in E. coli DH5α bestätigt. LV = Leervektor pBCKS.

Um zu überprüfen, ob sich die Substratspezifität durch diese Mutation gegenüber klassischen Lipasesubstraten geändert hat, wurde zusätzlich die Freisetzung von Fettsäuren aus 1,2-DG und TG untersucht. Die Mutation zum typischen Lipasemotiv hatte allerdings keinen Einfluss auf diese spezielle Aktivität von PlaB, welches nach wie vor im Vergleich zu polaren Phospholipiden apolare Lipasesubstrate nicht oder kaum umsetzen konnte (nicht gezeigt, [94]). Die Bedeutung von Threonin für die Aktivität von PlaB, macht dieses Enzym unter bisher bekannten Phospholipasen einzigartig. Interessanterweise zeigen PlaB-Homologe aus P.   aeruginosa eine weitere Variation an dieser Position (Abb. 4.6). Hierbei ersetzt ein hydrophober Valinrest das hydrophile Threonin. Durch Mutation von Thr-83 zu Val konnte gezeigt werden, dass erneut die cholinspezifischen Lipolyseeigenschaften von PlaB um bis zu 70% verringert wurden. Ob nun entsprechende P. aruginosa Homologe ein ähnliches Hydrolyseprofil aufweisen wie L. pneumophila PlaB T83V und ebenso stark DPPG spalten können, ist noch nicht bekannt.

Mutationen im katalytischen Zentrum von PlaB führten zu Aktivitätsverlusten von über 99% (s. Abbildung 4.4 A.). Nach längeren Inkubationszeiten jedoch war PlaB-abhängige Phospholipaseaktivität im Vergleich zur Leervektorkontrolle immer noch messbar (Abb. 4.8 B). Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung des Proteins in verschiedenen Infektionsmodellen. Geringe Restaktivität war daher für nachfolgende Experimente hinderlich. Des Weiteren war es von Interesse, ob andere Aminosäuren neben denen der Triade für katalytische Prozesse wichtig sind. Aufgrund dessen wurde der Versuch unternommen, „loss of function“ Mutanten des PlaB-Enzyms herzustellen.

Abbildung 4.8: Lipidhydrolyse der „loss of function“ Mutanten des PlaB-Enzyms.

A) Doppelmutanten des katalytischen Zentrums (S85A/D203N und S85A/H251N) und eine Serindoppelmutante (S85A/S129A) wurden auf ihr Potential untersucht, Fettsäuren aus Lipidsubstraten freizusetzen. Als interne Kontrollen wurden die Stämme Corby Wildtyp (Corby-LV), die plaB Mutante (plaB1-LV), die Komplementante (plaB1-PlaB) und der Überexpressionsklon (Corby-PlaB) mitgeführt. B) Darstellung der freigesetzten Fettsäuren durch die Einfachmutante und Doppelmutanten im Vergleich zu der plaB Mutante mit Leervektor pBCKS (LV). Die Daten repräsentieren Doppelwerte von 2 Experimenten in Legionella und wurden durch Expression der Gene in E. coli DH5α bestätigt.

Hierzu wurden zusätzliche Mutationen in PlaB/S85A an den Positionen Asp-203 und His-251 eingebracht. Diese entsprechen den verbleibenden Aminosäuren Aspartat und Histidin des katalytischen Zentrums. Zusätzlich wurde eine Serin-Doppelmutante (S85A/S129A) konstruiert, um zu untersuchen, ob S129A zum Teil den nukleophilen Angriff von Ser-85 kompensieren kann. Wie in Abbildung 4.8 (A+B) dargestellt, waren vor allem die Doppelmutanten S85A/D203N und S85A/H251N nicht mehr in der Lage, Lipide in höherem Maße als die plaB Mutante mit korrespondierendem Leervektor zu spalten. Die nun verifizierten „loss of function“ Proteine konnten zur Untersuchung der Funktion von PlaB eingesetzt werden (s. Abschnitt 4.1.3.3 und 4.3.6.2).

Abbildung 4.9: Verteilung der katalytisch wichtigen Aminosäuren innerhalb des PlaB-Proteins.

Die Lokalisation der Aminosäuren der katalytischen Triade, sowie der Reste wichtig für die Aktivität oder Substratspezifität von L. pneumophila Corby PlaB ist schematisch dargestellt. Das Vorkommen wichtiger Aminosäuren beschränkt sich auf den N-terminalen Bereich des Proteins (AS 1 – ca. 300). Damit verbleibt eine C-terminale Domäne unbekannter Funktion (AS ca. 300 – 474).

Die durch gerichtete Mutagenese untersuchten Aminosäuren von L. pneumophila PlaB zeigten, dass relevante Proteinreste im N-terminalen Bereich des Enzyms lokalisiert sind (Aminosäure 1-300). Hiermit verbleibt eine C-terminale Domäne von ca. 174 Aminosäuren, über dessen Funktion noch nichts Näheres bekannt ist (Abb. 4.9). Die Region ist zudem innerhalb der PlaB-ähnlichen Proteine weniger stark konserviert. So zeigen die ersten 300 Aminosäuren von L. pneumophila Corby PlaB eine Homologie von 66% zu dem PlaB-homologen Enzym von Desulfuromonas acetoxidans, der C-terminale und zudem kürzere Bereich (AS 301-474) deckt sich jedoch nur zu 51% mit dem des schwefelreduzierenden Organismus. Die C-Termini von Marinobacter, Persephonella oder auch Pseudomonas PlaB-homologen Enzymen fallen, trotz vorhandener Domäne, unterhalb die durch den Algorithmus festgesetzte Mindesthomologie („t hreshold“). Sie können daher nicht mehr als signifikant homolog zu PlaB aus Legionella angesehen werden (BLASTP, NCBI; Volllängen-Sequenzvergleich s. Anhang).

Hämolytische Aktivität von PlaB-Mutanten

Wie bereits gezeigt wurde, trägt PlaB wesentlich zur hämolytischen Aktivität von L.  pneumophila bei [94]. Die Annahme, dass phospholipolytische Aktivität direkt mit hämolytischem Potential einhergeht, scheint begründet. Jedoch konnte nicht ausgeschlossen werden, dass der verlängerte C-Terminus eine wesentliche Rolle in der PlaB-vermittelten Zytotoxizität spielt. Aus diesem Grund wurden Mutanten des katalytischen Zentrums auf ihre Fähigkeit hin untersucht, humane Erythrozyten zu lysieren. Hierzu wurden PlaB-Mutantenenzyme in der L. pneumophila plaB Mutante plaB1 exprimiert und die Stämme mit humanen roten Blutzellen inkubiert, um anschließend die Freisetzung von Hämoglobin in den Überstand zu messen. Hierbei zeigte sich, dass die Inhibition der katalytischen Aktivität entweder durch die Einfachmutation S85A oder auch durch die Doppelmutation S85A/D230N die hämolytischen Eigenschaften von PlaB aufhebt (Abb. 4.10 A). Die Hämolyse dieser Klone ist vergleichbar mit der plaB Mutante, welche nur den Leervektor pBCKS trägt. Die Mutation H433N führte nicht zu einer veränderten lipolytischen Aktivität von PlaB (Abb. 4.4 C) und zeigte daher keinen Einfluß auf das Lysepotential von Erythrozyten im Vergleich zu Wildtyp PlaB (Abb. 4.10 A+B). Interessanterweise war die Mutante S129A (signifikant reduziert in cholinspezifischer Lipidhydrolyse) nicht mehr in der Lage, rote Blutzellen zu lysieren.

Abbildung 4.10: Hämolytische Aktivität der PlaB-Mutanten.

Humane Erythrozyten wurden mit L. pneumophila plaB Mutanten (A) oder E. coli DH5α (B) Zellen inkubiert, die Varianten der PlaB-Aminosäuresubstitution exprimierten. Die Freisetzung von Hämoglobin in den Überstand wurde nach einer Inkubationsdauer von 105min (A) oder 18h (B) gemessen. Die Daten sind repräsentativ für Dreifachwerte von mindestens 3 unabhängigen Experimenten in Legionella und in E. coli DH5α. LV = Leervektor pBCKS.

Diese Ergebnisse belegten eindeutig, dass die katalytische Aktivität verantwortlich für die hämolytischen Eigenschaften des Enzyms ist. Weiterhin ließ sich erkennen, dass die phosphatidylcholinspezifische Aktivität ausschlaggebend für das zytotoxische Verhalten von PlaB ist. Dies steht mit der Tatsache in Einklang, dass Phosphatidylcholin (PC) das hauptsächliche Phospholipid der äußeren Schicht eukaryonter Zellmembranen darstellt.

Da L. pneumophila, wie in der plaB Mutante zu erkennen ist (Abb. 4.10 A), für weitere Hämolysine neben PlaB kodiert, wurden entsprechende Mutanten zur Verifizierung im nicht-hämolytischen Stamm E. coli DH5α exprimiert (Abb. 4.10 B). Der Unterschied im Lyseverhalten zwischen Wildtyp PlaB und den Mutanten S85A, S129A und S85A/D203N war hierbei noch gravierender und konnte demnach ausschließlich der Aktivität von PlaB, unbeeinflusst von anderen Faktoren, zugeschrieben werden.

Relevanz des C-Terminus

Durch Mutagenese bestimmter Aminosäuren wurde gezeigt, dass sich relevante Reste für die Enzymaktivität im N-terminalen Bereich des Proteins befinden und dem C-Terminus daher noch keine Funktion zugeordnet werden konnte (Abb. 4.9). Auch PlaB-Homologe besitzen diese Extension, die eventuell durch Modifikationen zur Membranverankerung dienen oder ein Sekretionssignal enthalten könnte.

Abbildung 4.11: Relevanz des C-Terminus für die lipolytische Aktivität von PlaB.

A) Übersicht der C-terminal verkürzten Versionen des PlaB-Proteins. Dargestellt sind das resultierende Molekulargewicht und die gemessene hydrolytische Aktivität der Konstrukte. B) SDS-PAGE von E. coli BL21 Zelllysaten. Spuren: 1: Standard; 2: GST; 3: GST-PlaB; 4: GST-PlaB_1-459; 5: GST-PlaB_1-388; 6: GST-PlaB_1-307. C) Lipidhydrolyse der E. coli BL21 Zelllysate. Das Lysat des Volllängen-konstruktes wurde vor Inkubation 10-fach verdünnt, alle anderen Lysate wurden unverdünnt in den Hydrolyseassay eingesetzt. Die Daten sind repräsentativ für Doppelwerte von 3 unabhängigen Experimenten.

Um den Einfluss der C-terminalen Region auf die Aktivität von PlaB zu untersuchen, wurden drei verkürzte Varianten des Proteins kloniert. Im Vergleich zum Volllängenkonstrukt fehlten den PlaB-Versionen 15, 86 oder 167 Aminosäuren vom C-terminalen Bereich des Enzyms (Abb. 4.11 A). Fusioniert zu einem N-terminalen Glutathion-S-Transferase (GST)-tag wurden alle Konstrukte in E. coli BL21 zur Expression gebracht (Abb. 4.11 B). Hierbei ist zu erwähnen, dass die verkürzten Versionen in Vektor pGEX-6P-1 kloniert, das Volllängenkonstrukt jedoch in Vektor pGEX-5X-1 eingebracht wurde. Das Expressionslevel aller Konstrukte war vergleichbar (Abb. 4.11 B), doch zeigte sich deutlich, dass bereits durch das Fehlen von nur 15 Aminosäuren am C-Terminus keine Aktivität mehr nachweisbar war (Abb. 4.11 C). Alle verkürzten Varianten hydrolysierten PLA und LPLA Substrate vergleichbar zu BL21 Zellen, welche zur Expression von GST ohne fusioniertes PlaB induziert wurden. Dies weist darauf hin, dass die C-terminale Region, ebenso wie die relevanten Aminosäuren im N-terminalen Bereich wichtig für die lipolytische Aktivität von PlaB ist. BLAST Analysen der Aminosäureregion 301-474 ergaben nur geringfügige Homologien, z. B. zu einer O-gekoppelten N-Azetylglykosamintransferase (OGT) mit einem „expect value“ von 2,7. Die Homologie bezieht sich jedoch nur auf einen sehr kurzen Teil des PlaB-Proteins. Zudem weisen OGTs 2 katalytische Domänen auf, die nicht durch PlaB abgedeckt werden [163]. Daher ist eine Aktivität als Glykosyltransferase durch PlaB eher unwahrscheinlich.

Expression und Reinigung von PlaB

Zur Bestimmung weiterer biochemischer Eigenschaften und vor allem zur Untersuchung der Funktion und Lokalisation ist die Expression und Reinigung des Proteins notwendig. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Expressionssysteme und ‚Expressionswirte’ ebenso wie verschiedene Reinigungsmethoden untersucht, um PlaB in Reinform zu gewinnen.

Expression in L. pneumophila

Unter allen Systemen stellt die Expression von p laB im Ursprungswirt L. pneumophila die natürlichste Form dar. Bis zum heutigen Datum ist kein Überexpressionssystem für Legionellen erhältlich. Daher konnte eine möglichst große Menge an PlaB-Protein nur mit Hilfe von sogenannten „high copy“ Plasmiden erreicht werden, die in einer Stückzahl von ungefähr 200 Plasmiden pro Zelle vorliegen. Zu diesem Zweck wurde das plaB-Gen in Vektor pBCKS kloniert und zur Expression in L. pneumophila Wildtyp Corby und der plaB Mutante gebracht. So erhaltene Proteine wurden in vergleichender SDS-PAGE und anschließender Silberfärbung analysiert. Hier zeigte sich, dass das Proteinlevel von PlaB durch die hohe Kopienzahl nicht beeinflusst wurde. Es konnten keine Proteinbanden auf entsprechender Höhe von ~54 kDa zwischen den plaB-exprimierenden Stämmen und denen, die den Leervektor trugen, festgestellt werden. Zudem war der Großteil an gemessener Aktivität nach erfolgter Zelllyse in der unlöslichen Fraktion enthalten. Um genügende Mengen an PlaB für eine anschließende Reinigung zu erhalten, wurde daher beschlossen, Systeme aus E. coli und P. pastoris zu verwenden.

Expression in E.coli

Für die Expression von Proteinen in E. coli BL21 Zellen ist eine Vielzahl an verschiedenen Vektoren erhältlich. Daher wurde eine Reihe von Fusionsproteinen hergestellt, die eine anschließende Reinigung über Affinitätschromatographie ermöglichen. Hierbei wurden N- und C- terminale Fusionen zu His₆-tags (Vektoren pET160/GW/D-TOPO und pBAD202/D/TOPO) und eine N-terminale Fusion zur Glutathion-S-Transferase (GST in Vektor pGEX-5X-1) aus Schistosoma japonicum konstruiert. Zudem wurde plaB in Vektor pET160/GW/D-TOPO ohne jegliche Fusion zur Expression gebracht und versucht mittels Ionentauschchromatographie anzureichern und zu reinigen. Schon die ersten Expressionsstudien aller Varianten zeigten, dass p laB zwar in ausreichenden Mengen exprimiert wurde, jedoch zu unlöslichen Aggregaten präzipitierte, den sogenannten „inclusion bodies“ (IB). Des Weiteren ist zu vermerken, dass die Aktivität von PlaB durch fusionierte Peptidreste negativ beeinflusst wurde. So zeigten sich sowohl N- als auch C-terminale Fusionen eines His₆-tags, im Vergleich zu analog behandelten Expressionsansätzen von PlaB ohne Fusion, um das 100-fache an lipolytischer Aktivität reduziert. Der Zellaufschluss pelletierter Bakterienkulturen erfolgte entweder durch Lysozym und/oder Sonifizierung oder durch das kommerziell erworbene Extraktionsreagenz ‚BugBuster’. Dieses besteht aus einem Detergenzmix zur Perforation der Zellwände, ohne jedoch Proteine zu denaturieren. Nach erfolgter Zelllyse zeigte sich, dass nach Bestimmung der Aktivität der Fraktionen, nicht aber nach Detektion mit spezifischen Antikörpern ein gewisser Anteil (ca. ¼) aktiven PlaBs trotz der IB-Präzipitate auch in löslicher Form vorhanden war. Aus diesem Grund wurde versucht, das Enzym aus der löslichen Fraktion durch Chromatographie anzureichern.

Durch die besonders hohe Affinität von GST zu Glutathion-Sepharose lassen sich GST-Fusionsproteine entsprechend gut bis zur Homogenität reinigen.

Abbildung 4.12: Reduzierende SDS-PAGE nach Affinitätschromatographie von GST-PlaB.

Der Überstand einer 500ml E.coli BL21 (pJB18) Klon 1sk3 Kultur wurde nach Zellaufschluss mit Glutathion-Sepharose Kügelchen versetzt und gebundenes Protein nach erfolgten Waschschritten in 2000-facher Konzentration des ursprünglichen Kulturvolumens eluiert. Spuren: 1: Standard SM#0661; 2: Zelllysat nach Zellaufschluss; 3: Überstand nach Zellaufschluss; 4: Durchfluss; 5: Waschen 1; 6: Waschen 2; 7: Waschen 3; 8: Eluat 1; 9: Eluat 2; 10: Eluat 3; 11: Kügelchen. Die Bande des GST-PlaB-Proteins ist mit dem Symbol „*“ gekennzeichnet.

Wie in Abbildung 4.12 dargestellt, konnte nach Affinitätschromatographie kein PlaB gereinigt und angereichert werden, obwohl das Elutionsvolumen einer 2000-fachen Konzentration des ursprünglichen Kulturvolumens entsprach. Ähnliche Ergebnisse erzielten Reinigungsversuche mit den konstruierten His₆- Fusionen sowohl unter nativen als auch denaturierenden (8M Harnstoff) Bedingungen.

Da durch Affinitätschromatographie kein reines PlaB gewonnen werden konnte, wurde die Reinigung mittels Ionentauschchromatographie durchgeführt. Hierzu wurde das Zellpellet einer E. coli BL21 (pJB01) Kultur aufgeschlossen, die lösliche Fraktion in 20mM Tris pH 9.2 Laufpuffer auf eine äquilibrierte Anionentausch (AEX)-Q Sepharose FF Säule geladen und mit einem Stufengradienten mit je 10% steigender NaCl-Konzentration eluiert (Abb. 4.13 A). Die gesammelten Fraktionen wurden auf Phospholipaseaktivität untersucht und gereinigte Proteine nach SDS-PAGE mittels Sibernitratfärbung sichtbar gemacht (Abb. 4.13 B/C). Wie durch Lipidhydrolyse deutlich gezeigt, eluierte das gut gebundene PlaB nach Zugabe von 30-50% NaCl (Abb. 4.13 B, Fraktionen 21-25 und 28-34). Die entsprechenden Gelspuren der verschiedenen Fraktionen wiesen jedoch keine distinkte Bande um 54 kDa auf (Abb. 4.13 C). Gereinigte Proteine (im Bereich ca. 55 – 80 kDa, markiert mit „*“) wurden mittels Maldi-Tof-Analysen der trypsinverdauten Fragmente eindeutig als E. coli Proteine [GroEL, Fr. 32; molekulares Chaperon, Fr. 22; Polyribonukleotid-Nukleotidyltransferase, Fr. 28] identifiziert.

Abbildung 4.13: Reinigung von PlaB mittels Anionentauschchromatographie.

Der Überstand nach Zellaufschluss einer E. coli BL21 (pJB01) Klon 1 Überexpression wurde auf eine HiTrap^TM 1ml Q FF Säule geladen und mit ansteigender NaCl-Konzentration gebundenes Protein eluiert. A) Chromatogramm des Reinigungsverlaufes von PlaB an der AEX-Säule. B) Gesammelte Fraktionen der Reinigung wurden auf hydrolytische Aktivität gegenüber DPPG und MPLPG untersucht. C) Reduzierende SDS-PAGE und anschließende Silberfärbung verschiedener Fraktionen der Anionentausch-chromatographie. Mit „*“ markierte Banden wurden als E. coli Proteine identifiziert.

Durch weitere Versuche, z. B. durch Absenken des pH-Wertes oder der Intervalle des Stufengradienten konnte PlaB nicht weiter von den anderen Proteinen getrennt werden, noch war es möglich, größere Mengen an PlaB anzureichern.

Aus diesem Grund wurde nachfolgend eine Vielzahl an Bedingungen getestet, um die Bildung der IBs soweit wie möglich zu unterdrücken. Dies beinhaltete Expressionsbedingungen bei verschiedenen

• Temperaturen (Konstrukte pJB01/pJB02/pJB03/pJB18 bei 37°C; Konstrukt pJB18 bei 30°C, 20°C und 16°C im Zusammenhang mit E.   coli XA90 Zellen),

• Induktionszeiten (Konstrukte pJB01/pJB02/pJB03/pJB18 für 4h bei 37°C oder Konstrukt pJB18 über Nacht bei niedrigeren Temperaturen) und

• Induktionskonzentrationen (IPTG 0,01 – 1mM für pET- oder pGEX-basierende Vektoren pJB01/pJB03/pJB18; 0,0002 – 0,2% Arabinose für den pBAD-basierenden Vektor pJB02).

Durch die erwähnten Bedingungen konnte keine verbesserte Löslichkeit von PlaB erreicht werden. Daher mussten im nächsten Schritt verschiedene Möglichkeiten zur Solubilisierung des präzipitierten GST-fusionierten PlaB gefunden werden.

Verwendete Reagenzien beinhalteten:

• 0,5% Nonidet P-40

• 0,5% Natriumdeoxycholat

• 10% Glycerol

• 0,5% Triton X-100

• 6.7mM DPPC/DPPG/MPLPC und MPLPG (ohne 0,1% Triton X-100)

• 6.7mM MPLPG (mit 0,1% Triton X-100).

Die Inkubation erfolgte sowohl bei 37°C, RT oder 4°C. Abbildung 4.14 zeigt einen anti-GST-detektierten Westernblot der Solubilisierungsversuche mit Nonidet, Natriumdeoxycholat und Triton X-100. Keines der Detergenzien konnte PlaB aus den IBs herauslösen, denn PlaB assoziierte noch immer mit der unlöslichen Pelletfraktion.

Der Western Blot deutete 2 weitere Banden unterhalb von PlaB an (Abb. 4.14, ca. 60 und 40kDa). Da sich der GST-tag am N-Terminus von PlaB befindet, weisen die zusätzlichen Banden auf eine C-terminale Degradation von PlaB in E. coli hin.

Abbildung 4.14: Anti-GST Western Blot der PlaB-Solubilisierungsversuche.

Nach Zelllyse von GST-plaB exprimierenden E. coli BL21 (pJB18) Klon 1sk3 Zellen wurde der Versuch unternommen mit den Reagenzien Natriumdeoxycholat, Triton X-100 und Nonidet P-40 PlaB aus den ‚inclusion bodies’ zu solubilisieren. Die Solubilisierungsansätze wurden für ~60h bei 4°C inkubiert. Danach wurden Pellet- und Überstandsfraktionen durch Zentrifugation getrennt und in gleichen Mengen auf das SDS-Gel aufgetragen. Spuren: 1: Standard MagicMark; 2/3: Pellet bzw. Überstand nach Natriumdeoxycholat-Inkubation; 4/5: Pellet bzw. Überstand nach Nonidet P-40-Inkubation; 6/7: Pellet bzw. Überstand nach Triton X-100-Inkubation.

Da beschriebene Agenzien PlaB nicht solubilisieren konnten, wurde im letzen Schritt die Denaturierung und anschließende Rückfaltung des Enzyms untersucht. Denaturierungsmittel beinhalteten:

• 0,2 SDS

• 2, 4, 6 und 8M Harnstoff

• 6M Guanidinhydrochlorid (GuHCl).

Alle Reagenzien führten zu totalem Aktivitätsverlust von PlaB. Nur 8M Harnstoff- oder 6M GuHCl-Puffersysteme lösten das Protein zu großen Teilen aus den IBs. Da die Rückfaltung aus 8M Harnstofflösungen durch Dialyse zum Präzipitieren des Proteins führte, wurde versucht, PlaB mittels Verdünnungsmethodik und mit Hilfe des „Pro-Matrix Protein Refolding Kit“ (Pierce) rückzufalten. Hierzu wurden gereinigte „inclusion bodies“, bestehend aus PlaB ohne Peptidfusionen, mit 6M GuHCl in 50mM Tris solubilisiert. Neben den empfohlenen Konditionen, z. B. verschiedenen Proteinmengen, Temperaturen, Redox-Umgebung, Disulfidstatus, Polyethylenglycol und divalenten Kationen, wurde auch der Einfluß von 3mM MPLPC + 0,2% Triton X-100 auf die Rückfaltung von PlaB ermittelt. Wie sich in anschließenden Lipidhydrolyseansätzen herausstellte, konnte keine der Bedingungen, ausgehend von 6M GuHCl oder auch durch 8M Harnstoff denaturiertem PlaB, das Enzym zu seiner nativen bzw. aktiven Konformation zurückbringen.

Da alle erwähnten Versuche nicht zu einer erfolgreichen Reinigung von aktivem PlaB aus E.  coli führten, sollten im Folgenden weitere Expressionsmodelle getestet werden.

Expression in P. pastoris

Als neuer Expressionswirt wurden Hefezellen der Gattung P. pastoris aus dem „Pichia Expression Kit“ (Invitrogen) verwendet. P .  pastoris ist eine methylotrophe Hefe und kann Methanol als alleinige Kohlenstoffquelle verwerten. Die Alkoholoxidase, kodiert von den Genen AOX1 und AOX2, ist das erste Enzym im Methanolmetabolismus und steht unter einem sehr starken, methanol-induzierbaren Promotor. Die zu exprimierenden Gene werden unter die Kontrolle des AOX1-Promotors gestellt und stabil in das Genom der Hefen integriert. Hierbei kann das Protein entweder mit einem Signalpeptid zur extrazellulären Sekretion ausgestattet oder ohne Fusionspeptid intrazellulär exprimiert werden. Das plaB-Gen wurde sowohl in das Plasmid für die sekretierte Form (pPIC9) als auch in das Plasmid für die intrazelluläre Variante (pPIC3.5) eingebracht. Die resultierenden Vektoren pJB15 und pJB14 wurden in je zwei verschiedene P. pastoris Stämme (s. Material und Methoden) elektroporiert.

Abbildung 4.15: Expression von plaB in P. pastoris.

Das Sekretom der plaB-Expression in den Integrationsstämmen Pp01 Klon1 (GS115-plaB) und Pp02 Klon2 (KM71-plaB) ist im Vergleich zu den jeweiligen Wildtypen mittels reduzierender SDS-PAGE und Silberfärbung dargestellt (A+B). Die Expression wurde über einen Zeitraum von 0 - 96h verfolgt. C) Hydrolytische Aktivitäten der korrespondierenden Kulturüberstände gegenüber dem Phospholipid DPPG. Die Bestimmung freier Fettsäuren erfolgte nach einer Inkubationszeit von 19h bei 37°C.

Eine stabile Integration von plaB in den Locus der Histidinoldehydrogenase wurde mittels PCR mit chromosomaler DNA verifiziert und die plaB Expression verschiedener Klone über einen Zeitraum von 96h dokumentiert. Analysen des Sekretoms mit Hilfe von reduzierender SDS-PAGE (Abb. 4.15 A/B/) und Lipidhydrolyse (Abb. 4.15 C) zeigten, dass PlaB unter diesen Bedingungen nicht ausreichend sekretiert wurde. Eine Exzision des plaB Gens aus dem Hefegenom konnte durch PCR bei allen Zeitpunkten ausgeschlossen werden (nicht gezeigt). Sowohl weitere Klone als auch die Konstrukte der intrazellulären Expression führten nicht zu einer erfolgreichen Überexpression von plaB und wurden daher nicht weiter zur Reinigung herangezogen.

In vitro Translation und Transfektion

Ein weiterer Versuch zur plaB Expression und anschließender Reinigung wurde mit den Systemen der in vitro Translation und der Transfektion von humanen Lungenepithelzellen unternommen.

Für die in vitro Translation wurden 2 verschiedene Kits verwendet. Das T7 System der Firma Promega basiert auf Zellextrakten unterschiedlicher Herkunft, so z. B. Retikulozytenextrakt aus Kaninchen, Weizenkeimextrakt oder Zelllysat von E. coli T7 S30. Die in vitro Translationen wurden nach den Angaben des Herstellers und mit unterschiedlichen plaB-exprimierenden Vektoren durchgeführt. Für den E. coli Extrakt konnten sowohl His-/GST- als auch Flag-PlaB-Fusionsvektoren (pJB03, pJB18 und pJB43) verwendet werden. Die Retikulozyten- und Weizenkeimextrakte waren auf das Vorhandensein eines T7 Promotors angewiesen und konnten daher nur im Zusammenhang mit den Vektoren pJB18 (GST-PlaB) und pJB43 (Flag-PlaB) getestet werden. In keinem dieser Fälle, überprüft durch Western Blot mit entsprechenden Antikörpern und mittels Lipidhydrolyse, konnte eine Expression von plaB nachgewiesen werden. Verwendete Vektoren zeigten jedoch geringe Abweichungen zu den vom Hersteller unterstützten Anforderungen, so sollte die Shine Dalgarno Sequenz (in E. coli: -AGGAGGA-) nur 6-8 Nukleotide vom Translationsstart entfernt liegen. Daher wurde ein neuer Vektor konstruiert, der dieser Anforderung entsprach. Das plaB-Gen wurde hierfür in pET-21b (resultierendes Protein trägt keinen tag) kloniert, mit einem Abstand der Shine Dalgarno Sequenz und des Translationsstartes von 7 Nukleotiden. Der resultierende Vektor pJB46 wurde nach überprüfter und erfolgreicher Expression in E. coli BL21 mit einem zweiten in vitro Translationskit weiteren Expressionsstudien unterzogen. Im Gegensatz zu dem Kit der Firma Promega beruht der PURExpress Kit (NEB) auf zellfreier Proteinsynthese durch rekombinant hergestellte His-Fusionsproteine des Transkriptions- und Translationsapparates. Dies ist vor allem für eine anschließende inverse Reinigung von Vorteil, da die Proteine des Expressionssystems an eine Matrix gebunden werden können, das gesuchte Protein aber in Lösung verbleibt. Jedoch konnte auch durch dieses System keine Expression von plaB bewirkt werden, wie sich durch Aktivitätstests eindeutig belegen ließ (nicht gezeigt).

Ein letzter Versuch, PlaB in Reinform zu erhalten, wurde durch Transfektion von Zellkultursystemen, in diesem Fall A549 Lugenepithelzellen, unternommen. Hierzu wurde plaB in den eukaryonten Transfektionsvektor pcDNA3.1(+)-Flag kloniert. Der auf pcDNA3.1(+) – basierende Vektor trägt einen Flag-tag-Linker, welcher über die Schnitt-stellen ApaI und XbaI eingefügt wurde und die Reinigung und Detektion des Zielproteins erleichtern sollte. METAFECTENE (Biontex), ein polykationisches Transfektionsreagenz in liposomaler Form, wurde zur Etablierung der Transfektion von A549 Zellen eingesetzt. Abbildung 4.16 zeigt unterschiedliche Mengen an transfiziertem Vektor pJB43 im Vergleich zu pEGFP-C2 Kontrolltransfektionen und Zellen, die nur mit dem Transfektionsreagenz (TR) behandelt wurden. Letztere waren nach 24h Inkubation noch vital, wo hingegen Plasmidmengen ab ~500ng toxisch für A549 Zellen waren. Das zeigte sich unabhängig von verwendeten Plasmiden oder zu exprimierenden Genen, da der pEGFP-C2 Vektor ebenso wie der plaB-exprimierende Vektor pJB43 zum Abrunden der Zellen und Abkapseln von apoptotischen Körperchen führte (Abb. 4.16).

Abbildung 4.16: Etablierung der Transfektion von A549 Lungenepithelzellen mit dem plaB-exprimierenden Plasmid pJB43 Klon 2.

Ein optisch konfluenter Rasen von A549 Zellen wurde mit verschiedenen Konzentrationen eines plaB-exprimierenden Plasmids (pJB43 Klon 2) transfiziert. Zum Vergleich dienten Zellen, die nur mit Transfektionsreagenz (TR) behandelt und Ansätze, die mit 1µg des Kontrollvektors pEGFP-C2 transfiziert wurden. Die Zellen wurden nach 24h Inkubation mikroskopisch untersucht und auf ihre Transfektionseffizienz durch Bestimmung der GFP-Fluoreszenz überprüft. Die Aufnahmen sind repräsentativ für mindestens 3 unabhängige Experimente.

Zusätzlich konnte eine Überproduktion und damit eine erhöhte Phospholipaseaktivität von PlaB als Grund für den Abfall an Zellviabilität ausgeschlossen werden, da sich sowohl die Membranzusammensetzung der plaB-transfizierten Zellen, als auch die Freisetzung von Fettsäuren in der Zellkulturüberstand nicht von den leervektortragenden Zellen unterschied (nicht gezeigt). Bei einer Transfektionseffizienz von durchschnittlich ~40% konnte in nachfolgenden Western Blot Analysen nur GFP-Expression, nicht aber die von Flag-PlaB nachgewiesen werden (nicht gezeigt). Ob plaB überhaupt nach erfolgter Transfektion exprimiert wurde, konnte mit reverser Transkription von RNA ermittelt und durch Lipidhydrolyse verifiziert werden. Wie sich am RNA-Level im Vergleich zu der endogenen Kontrolle β-Aktin zeigte, wurde die transfizierte plaB-DNA gut transkribiert (Abb. 4.17).

Abbildung 4.17: Expression von plaB in transfizierten A549 Lungenepithelzellen.

Der plaB-exprimierende Vektor pJB43, wie auch der Kontrollvektor pEGFP-C2 wurden in A549 Lungenepithelzellen transfiziert und sowohl die Expression des plaB-Gens (A) als auch die Aktivität (B) des PlaB-Enzyms nachgewiesen. A) RT-PCR der plaB- und, als Kontrolle, der β-Aktin-Expression. Spuren 1/2: 1µg bzw. 500ng pJB43 Transfektion nach 24h; 3/4: 1µg bzw. 500ng pJB43 Transfektion nach 48h; 5: 500ng pEGFP-C2 Transfektion nach 24h. B) Lipidhydrolyse transfizierter A549 Zellen. Der Vektor pJB43 trägt das plaB-Gen, welches innerhalb von 20h Transfektionszeit in aktives Protein umgesetzt werden konnte. Die Daten sind repräsentativ für Doppelwerte von 3 unabhängigen Experimenten.

Es konnten plaB-Transkripte sowohl nach 24h als auch nach 48h nachgewiesen werden (Abb. 4.17 Spuren 1/2 bzw. 3/4). Alle Ansätze waren frei von DNA-Kontaminationen. Zellaufschluß und Lipidhydrolyse eines weiteren Transfektionsversuches zeigten, dass auch PlaB als aktives Protein translatiert wurde (Abb. 4.17 B). Da die Aktivität jedoch sehr gering war, wird vermutlich nicht genügend plaB exprimiert, um im Western Blot detektiert werden zu können. Nachfolgende Erhöhung der Anzahl an Lungenepithelzellen brachte nicht mehr Ausbeute an PlaB. Daher wurde die angestrebte Reinigung des Enzyms aus A549-Zellkultur an dieser Stelle abgebrochen.

Alles in allem konnte PlaB unter verschiedensten Bedingungen und einer Vielzahl an Systemen nicht als funktionelles Enzym gereinigt werden.

Alle vier bisher sequenzierten Genome von L. pneumophila (Lens, Paris, Philadelphia-1 und Corby) sowie der Stamm 130b kodieren für das plaB-Gen. Es war nun im Folgenden von Interesse, ob die zell-assoziierte Aktivität auch noch in weiteren Stämmen gefunden werden kann. Neben klinischen Isolaten wurden auch Legionellenspezies untersucht, welche nicht zu der Gruppe L. pneumophila, dem hauptsächlichen Erreger der Legionellose, gehören.

Lipolytische Aktivität klinischer Isolate von L.  pneumophila

Wie sich im Tiermodell zeigte, ist PlaB von Vorteil für das Infektionspotential von L.  pneumophila  (s. 4.3.5.1). Ob sich Ähnliches auch im Zusammenhang mit Humaninfektionen bestätigt, kann durch eine Überprüfung vorhandener plaB-Gene und/oder zell-assoziierter Aktivität klinischer Isolate getestet werden. Zelllysate und korrespondierende Kulturüberstände von neun klinischen L. pneumophila Isolaten unterschiedlicher Serogruppen wurden daher auf ihre Fähigkeit hin überprüft, Phospholipide und Lysophospholipide zu hydrolysieren.

Abbildung 4.18: Lipidhydrolyse klinischer Isolate und eines Umweltisolates von L. pneumophila und Expression von plaB-ähnlichen Genen.

Zelllysate (A) und Kulturüberstände (B) der klinischen Isolate von L. pneumophila und eines Umweltisolates Lpn # 257 wurden mit Phospholipiden und Lysophospholipiden inkubiert und die Freisetzung von Fettsäuren bestimmt. Die Daten sind repräsentativ für Doppelwerte von 2 unabhängigen Experimenten. C) RT-PCR zur Überprüfung der plaB Expression der klinischen Isolate und des Umweltisolates im Vergleich zur endogenen Kontrolle gyrB (Untereinheit B der Gyrase).

Alle klinischen Isolate und ein Umweltisolat (Lpn #257) zeigten eine vergleichbare zell-assoziierte Aktivität zu der des Referenzstammes L. pneumophila Corby (Abb. 4.18 A/B). Die Aktivitätsschwankungen zwischen den Isolaten sind nicht als gravierend einzustufen, da auch die Stämme Corby und 130b oder Philadelphia-1 die Lipide mit unterschiedlicher Intensität spalten (nicht gezeigt). Hierzu ist anzumerken, dass die Enyzme verschiedener sequenzierter L. pneumophila Stämme eine sehr hohe Homologie und Identität untereinander aufweisen. So zeigen z. B. die Proteine Corby PlaB und PlaB des Stammes Paris eine Homologie und Identität von 99%. Das die detektierte zell-assoziierte Aktivität der klinischen Isolate von PlaB-ähnlichen Enzymen her resultiert, konnte in RT-PCR Analysen weiter untermauert werden. Alle in der Lipidhydrolyse getesteten Stämme zeigten ein Amplifikat mit plaB-spezifischen Primern auf Höhe der Wildtypbande (Abb. 4.18 C). DNA-Kontaminationen konnten ausgeschlossen werden. Interessanterweise ist ein L. pneumophila Stamm (Lpn #257), isoliert aus einem Wasserleitungssystem, gleichermaßen in der Lage, Lipide zu spalten, und transkribiert ein plaB-Gen analog zu den klinischen Isolaten und dem Referenzstamm L. pneumophila Corby (Abb. 4.18 A-C).

Vorkommen von PlaB-Enzymen in nicht-pneumophila Legionellenstämmen

Gegenwärtig wurden mindestens 50 verschiedene Legionella-Spezies beschrieben, von denen 19 bisher als humanpathogen auffällig identifiziert werden konnten (zusammengefasst von Muder und Yu [187]). Mit einem prozentualen Anteil von über 90% stellt L. pneumophila den häufigsten Erreger einer Legionelleninfektion dar, gefolgt von L. longbeach a ea (3,9%) und L. bozemanii (2,4%) [309]. Das allgemeine Interesse, unter anderem für Therapieansätze,

Abbildung 4.19: Zell-assoziierte Lipidhydrolyse von nicht-pneumophila Legionellen im Vergleich zu L. pneumophila 130b.

Die angegebenen Stämme wurden bis zu einer OD₆₆₀ von 1,5 angezogen, sedimentiert und die Freisetzung von Fettsäuren durch lipolytische Aktivtät der Zellpellets bestimmt. Die Daten repräsentieren Doppelwerte von 3 unabhängigen Experimenten (Rydzewski und Flieger in Bender et al. 2009).

besteht vornehmlich in der Identifizierung von Virulenzfaktoren, die ausschließlich in
pathogenen Spezies vorhanden sind. Daher wurde untersucht, ob auch nicht-pneumophila Stämme für PlaB-Enzyme kodieren und diese aktiv exprimieren. Wie in Abbildung 4.19 gezeigt, wiesen vor allem L. gormanii und L. spiritensis eine vergleichbare zell-assoziierte Hydrolysestärke zu L. pneumophila 130b auf [23]. Mit ansteigender Inkubationszeit war bei den Spezies L. anisa, L. jordanis, L. parisiensis und L. sainthelensis quantitativ geringere zell-assoziierte Aktivität messbar. Interessanterweise waren alle nicht-pneumophila Stämme in ihrer Fähigkeit, cholinhaltige Lipidsubstrate wie z. B. DPPC zu spalten, reduziert (Abb. 4.19).

Die Möglichkeit der lipidspezifischen Lipolyse von Phosphatidylcholin scheint L. pneumophila Stämmen vorbehalten zu sein, da sowohl Stamm Corby als auch die Stämme 130b und Philadelphia-1 starke Aktivität gegenüber diesen Lipiden besitzen (nicht gezeigt).

plaB-Gene im Genom von L. gormanii und L. spiritensis 

Da unter den nicht-pneumophila Stämmen besonders L. gormanii und L. spiritensis in der Lage waren, Lipide durch zell-assoziierte Aktivitäten zu spalten, sollte im Weiteren entschlüsselt werden, ob tatsächlich PlaB-ähnliche Proteine für diese Aktivität verantwortlich sind. Daher wurde eine Zusammenstellung an Oligonukleotiden, ursprünglich für die Amplifikation von L. pneumophila Philadelphia-1 plaB entworfen, für den Nachweis der plaB-Genpräsenz in den nicht-pneumophila Stämmen verwendet. Durch PCR konnte ein Volllängentranskript aus L. spiritensis amplifiziert werden. Von L. gormanii wurde nur eine verkürzte Version erhalten [23]. Beide Fragmente wurden sequenziert und auf ihre Homologie zu L. pneumophila plaB bzw. PlaB überprüft. Das Gen für L. spiritensis plaB (Genbank Zugangsnummer EF408871) zeigte 86% Identität, das korrespondierende Protein 88% Identität und 94% Homologie zu L. pneumophila Corby plaB und PlaB. Die verkürzte Version aus L. gormanii wies ebenso eine Proteinidentität und Homologie von 86% und 95% zu L. pneumophila Corby PlaB auf (Aminosäuren 16-256). Wie schon in sequenzvergleichender Analyse für L. spiritensis gezeigt (Abb. 4.6), besitzt auch L. gormanii PlaB die hydrolytisch essentiellen Aminosäuren Ser-Asp-His der katalytischen Triade sowie Ser-129, eine Aminosäure, wichtig für die Substratspezifität von L. pneumophila Corby PlaB.

Lipolytische und hämolytische Aktivität von L. spiritensis PlaB

Das Gen von L. spiritensis plaB wurde für weiterführende Experimente in den Vektor pBCKS kloniert und im Vergleich zu L. pneumophila Corby plaB in E. coli DH5α exprimiert. Hierbei bestätigte sich, dass L. spiritensis PlaB gegenüber L. pneumophila PlaB um einen Faktor von 2.5 in der Fähigkeit reduziert war, Phosphatidylcholin zu hydrolysieren (Abb. 4.20 A).

Abbildung 4.20: Lipidhydrolyse- und Hämolyseeigenschaften von L. spiritensis PlaB.

L. spiritensis plaB wurde im Vergleich zu L. pneumophila plaB in E. coli DH5α Zellen exprimiert und die Zelllysate auf ihre Eigenschaft hin untersucht Phospholipide und Lysophospholipide zu spalten (A). Die verringerte DPPC Hydrolyse konnte nach Kalkulation dreier unabhängiger Experimente als signifikant (p<0,05) eingestuft werden. Um die Zytotoxizität der transformierten E. coli DH5α zu bestimmen wurden die Bakterien mit humanen roten Blutzellen inkubiert und die Freisetzung von Hämoglobin in der Überstand gemessen (B). Die Daten sind repräsentativ für Doppelwerte von mindestens 3 unabhängigen Experimenten. LV= Leervektor pBCKS.

Dieser Defekt spiegelte sich in nachfolgenden Hämolysestudien wider. Auch hier zeigte L. spiritensis PlaB im Vergleich zu L. pneumophila PlaB ein 2.2-fach niedrigeres Lysepotential zur Freisetzung von Hämoglobin in den Überstand der Erythrozyten-Bakterien-Suspension (Abb. 4.20 B).

Die Ergebnisse demonstrieren, dass plaB nicht restriktiv von L. pneumophila kodiert und zu einem aktiven Protein translatiert wird. Jedoch weisen die nicht-pneumophila PlaBs reduzierte Aktivität gegenüber Phosphatidylcholin, dem Hauptbestandteil der äußeren Lipidschicht von eukaryotischen Zellmembranen, auf [73].

Im vorherigen Abschnitt konnte mittels biochemischer Charakterisierung von PlaB gezeigt werden, dass das Enzym eine neue Klasse von lipolytischen Enzymen repräsentiert. Bisher ist jedoch, zusätzlich zu den lipolytischen und hämolytischen Aktivitäten, weder etwas über die Funktion von PlaB noch über die der PlaB-Homologe bekannt. Phospholipasen und auch Lysophospholipasen können herausragende Rollen während eines Infektionsprozesses übernehmen. So tragen sie z. B. zu der Etablierung der replikativen Nische (SseJ, Salmonella; PLC A-D, Mycobacterium), der Zytotoxizität gegenüber der Wirtszelle (α-toxin, Clostridium) oder der Stimulierung/Blockierung des Immunsystems (ExoU, Pseudomonas; β-toxin, Staphylococcus) bei (s. Einleitung). Erste Versuche zum Einfluss von PlaB auf die Virulenz von L. pneumophila in Zellkulturinfektionen von Acanthamoeba castellanii Amöben oder U937 Makrophagen zeigten keine Reduktion des Replikationspotentials von plaB Mutanten im Vergleich zu den Wildtypstämmen Corby und 130b [94]. Wie jedoch mittels Lipidhydrolyse von L. pneumophila infizierten U937 und Amöben demonstriert werden konnte, stellt PlaB die höchste phospholipolytische Aktivität während einer Infektion dar (s. 4.3.4, [23]. Expressionsstudien zeigten, dass plaB, im Gegensatz zu vielen Virulenz-faktoren der transmissiven Phase, während einer Amöbeninfektion eher konstitutiv exprimiert wird [42]. Vergleicht man das mRNA Level 8h und 14h post Infektion, steigt das Transkriptionslevel nur um einen Faktor von 1.48 an. In vitro Untersuchungen demonstrierten zudem, dass das maximale Level an mRNA von plaB während der exponentiellen Wuchsphase in BYE-Bouillon zu finden ist, das Aktivitätsmaximum des Enzyms sich aber vielmehr in die postexponentielle Replikationsphase verschiebt [247]. Da PlaB die höchste Aktivität unter allen Phospholipasen von Legionella pneumophila einnimmt, ist eine zufällige Akquirierung des Gens unwahrscheinlich. Folgende Untersuchungen liefern erste Ergebnisse in der schrittweisen Entschlüsselung der Funktion und Bedeutung von PlaB für L. pneumophila.

Beeinflussung der Viabilität von L. pneumophila durch PlaB-Aktivität

Lokalisationsstudien von PlaB weisen auf eine starke Assoziation des Enzyms mit der äußeren Membran von Legionellen hin [247]. Da PlaB im Gegensatz zu den bisher identifizierten GDSL-Enzymen und Patatin-ähnlichen Phospholipasen A nicht in den Kulturüberstand sekretiert oder direkt in die Wirtszelle injiziert wird [13, 288], könnte das Enzym im Verlauf des Lebenszyklus’ neben dem Einfluss auf die Zielzelle auch die Viabilität der Bakterien beeinflussen. Studien zu OMPLA von H. pylori zeigen, dass die Aktivität dieses Enzyms die Etablierung der replikativen Nische im sauren Milieu des Magens unterstützt ([273], s. Einleitung). Dies geschieht durch reversible Veränderung des Lysophospholipidanteils der Helicobacter-Membran. Aus diesem Grund wurden L. pneumophila Wildtyp Corby bzw. 130b und die entsprechenden plaB Mutanten unter verschiedenen Wuchsbedingungen angezogen und insbesondere bei abweichendem Wuchs die Lipidzusammensetzung der bakteriellen Membranen untersucht.

Zuerst wurde der Einfluss verschiedener Temperaturen auf das Wuchsverhalten des Wildtypes und der plaB Mutante dokumentiert. Temperaturveränderungen spielen bei Legionellen im Zusammenhang mit Motilität, Piliation und Virulenz eine große Rolle [200, 167, 176]. 

Abbildung 4.21: Wuchsverhalten von L. pneumophila Corby Wildtyp und plaB Mutante bei verschiedenen Temperaturen.

Die Bakterien wurden in BYE-Bouillon bei 30°C (A), 37°C (B) und 40°C (C) über einen Zeitraum von ~24h geschüttelt und die optische Dichte der Kulturen bei OD₆₆₀ bestimmt. Die Daten stehen vor Doppelwerte von 2 unabhängigen Experimenten.

Die Wuchsexperimente zeigten jedoch, dass sowohl niedere Temperaturen (30°C) als auch Körpertemperatur (37°C) oder leicht erhöhte Gradzahl (40°C) keinen Einfluss auf die PlaB-abhängige Replikation von Legionellen in BYE-Bouillon haben (Abb. 4.21 A/B/C). Das schließt eine Veränderung der Membranzusammensetzung in Abhängigkeit von PlaB allerdings nicht aus. Diese Fragestellung wurde mit Hilfe der Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (FT-IR) genauer bearbeitet. Hierzu wurde eine Legionellensuspension nach Anzucht bei 37°C in einem Frequenzbereich von 2825 – 2956 cm^-1 vermessen, welcher die Region der Fettsäure-Streckschwingung, allgemein die der symmetrischen und asymmetrischen CH₂- bzw. CH₃-Streckschwingung, widerspiegelt. Zusätzlich wurde der Bereich der zugehörigen Deformationsschwingung (1400 – 1500 cm^-1 untersucht [nicht gezeigt]). Hierbei konnte kein Unterschied zwischen den Spektren der Wildtypmembranen und der der plaB Mutante festgestellt werden (Abb. 4.22). Die Ergebnisse verifizieren die Annahme, dass PlaB unter Standard-Wuchsbedingungen keinen Einfluss auf die Viabilität der Bakterien und Lipidzusammensetzung der Legionellenmembran hat. Weitere FT-IR spektroskopische Untersuchungen von 48h – 144h Legionellenanzucht auf Platte oder in Flüssigkultur zeigten ebenfalls keinen Unterschied im Lipidspektrum der beiden Stämme.

Abbildung 4.22: FT-IR Spektroskopie der Legionellenmembran.

L. pneumophila Wildtyp Corby und die plaB Mutante wurden für 120h bei 37°C auf BCYE-Agarplatten inkubiert. Die Zusammensetzung der bakteriellen Membran wurde im Frequenzbereich der C-H-Streckschwingung (2825 – 2956 cm^-1) analysiert. Das Spektrum repräsentiert eines von 3 unabhängigen Experimenten.

Interessanterweise akkumulierte die plaB Mutante bei 72h Inkubation auf Platte das Speicherlipid Polyhydroxybutyrat (PHB, Frequenzbereich 1741 cm¹, nicht gezeigt). Die reduzierte Fähigkeit, PHB zu spalten, konnte jedoch nicht durch das Einbringen eines plaB-exprimierenden Plasmides komplementiert werden und bleibt deshalb fragwürdig.

Das Wuchsverhalten von Wildtyp und plaB Mutante verhielt sich bei veränderten pH-Bedingungen unterschiedlich.

Abbildung 4.23: Wuchsverhalten von L. pneumophila Corby oder 130b und der isogenen plaB Mutanten bei pH6.5.

Die Wildtypen L. pneumophila Corby (A) und 130b (B) und ihre isogenen plaB Mutanten wurden in BYE pH6.5 angezogen und die Zunahme der optischen Dichte bei 660nm bestimmt. Die Daten sind repräsentativ für Doppelwerte von 3 unabhängigen Experimenten.

Obwohl Legionellen in Abhängigkeit vom Zelltyp, nach erfolgter Phagozytose, die Ansäuerung des Phagosoms und die Reifung im endozytotischen Netzwerk blockieren [138], zeigte sich in Wuchsanalysen unter leicht sauren Bedingungen (pH 6.5), dass die plaB Mutanten der Stämme Corby und 130b in ihrer Replikation leicht inhibiert waren (Abb. 4.23 A/B). Ein weiteres Absenken des pH-Wertes führte allerdings zu widersprüchlichen Ergebnissen. Hier zeigte die plaB-Mutante des Stammes 130b einen noch gravierenderen Replikationsdefekt (Abb. 4.24 B).

Abbildung 4.24: Wuchsverhalten von L. pneumophila Wildtypen und plaB Mutanten bei pH6.0.

L. pneumophila Corby (A) oder 130b (B) und ihre isogenen plaB Mutanten wurden in BYE Bouillon bei erniedrigtem pH von 6.0 angezogen. Die Wachstumsrate der Stämme Corby Wildtyp und der plaB Mutante von 130b war extrem verlangsamt und musste über einen Zeitraum von bis zu ~ 70h dokumentiert werden. Die Daten repräsentieren Doppelwerte von 3 unabhängigen Experimenten.

Die plaB Mutante des Stammes Corby hingegen verlor ihr Replikationsdefizit und wies unter sauren Bedingungen ein im Vergleich zum Wildtyp beschleunigtes Wachstum auf (Abb. 4.24 A).

Ob sich der Unterschied im Wuchsverhalten auf die Membranzusammensetzung der Legionellen auswirkt, wurde mittels Lipidextraktion und anschließender Dünnschicht-chromatographie der polaren Lipide untersucht.

Abbildung 4.25: Polare Dünnschichtchromatographie extrahierter Lipide aus der Legionellenmembran, nach Wachstum bei pH6.0.

L. pneumophila Corby oder 130b und die isogenen plaB Mutanten wurden in BYE Bouillon pH6.0 angezogen und Lipide aus unterschiedlichen Wuchsphasen extrahiert und untersucht. Proben der Ansätze wurden bei OD₆₆₀ von 2.0 – 2.1 entnommen, die Ansätze ‚s’ entsprechen den spät stationären Wachstumsphasen (72h). Die Analyse wurde zwei weitere Male wiederholt.

Die Lipidzusammensetzung der Legionellenmembran bei beiden Stämmen zeigte keine Alteration nach plaB-Deletion (Abb. 4.25). Der Grund für den observierten Mengenunterschied an Monomethylethanolamin (MMPE) zwischen beiden Wildtypen und den korrespondierenden Mutanten war auf das verlangsamte Wuchsverhalten der verschiedenen Stämme zurückzuführen. MMPE-Akkumulierung in der späten stationären Phase (Abb. 4.25, gekennzeichnet durch „s“) konnte durch verlängertes Wachstum auch in der Membran der plaB-Mutante von Stamm 130b sowie der des Corby Wildtyps nachgewiesen werden. Die widersprüchlichen Ergebnisse im Wuchsverhalten der Stämme Corby bzw. 130b und den jeweiligen Mutanten konnten nicht durch das Einbringen eines plaB-exprimierenden Vektors komplementiert werden (nicht gezeigt). Daher ist anzunehmen, dass die Diskrepanz im Wuchsverhalten nicht auf die Aktivität von PlaB zurückzuführen ist, sondern durch eventuelle „second site“ Mutationen oder andere Faktoren beeinflusst wird.

Neben der Veränderung der Membranzusammensetzung zur Adaption an veränderte Umweltbedingungen könnte eine zell-assoziierte Phospholipase für die Bereitstellung fettsäurebasierender Nährstoffe wichtig sein. Daher wurden L. pneumophila Corby Wildtyp und die plaB-Mutante plaB1 in BYE-Bouillon mit nur ¼ der herkömmlichen Menge an Hefeextrakt angezogen. Hierbei konnte die allgemeine Reduktion der Nährstoffe ebenfalls als unabhängig von der PlaB-Präsenz oder -Absenz ermittelt werden (Abb. 4.26 A).

Abbildung 4.26: Wuchsverhalten von L. pneumophila Wildtyp und plaB Mutante nach Reduktion an Nährstoffen oder Phosphat.

L. pneumophila Corby Wildtyp und die korrespondierende plaB Mutante wurden in ihrem Replikationsverhalten in verschiedenen Mangelmedien untersucht. A) Wachstum in BYE Bouillon mit nur ¼ Hefeextrakt. B) Wachstum in Phosphatmangelmedium, bei dem der Eisenpyrophosphatanteil durch Eisenchlorid ersetzt wurde (250mg/l).

Die starke phospho- und lysophospholipolytische Aktivität von PlaB kann Einfluss auf den Phosphatgehalt und –Anspruch der wachsenden Bakterien nehmen. Zu diesem Zweck wurde Eisenphosphat durch Eisenchlorid im Medium ersetzt und das Wuchsverhalten der Wildtyp- und Mutantenstämme verglichen. Die plaB-Mutante zeigte keinen Effekt auf Phosphatmangel und replizierte in vergleichbarem Maßstab wie der Wildtypstamm L. pneumophila Corby (Abb. 4.26 B).

Die Zerstörung der „grenzflächenaktiven Substanz“ (surface active agent = surfactant) der Lunge, ein Gemisch aus Phospholipiden und Proteinen im Verhältnis 10:1, wird als Virulenzeigenschaft während einer bakteriellen Pneumonie diskutiert. Die Hydrolyse dieser Phospholipide durch eine sekretierte LPLA/PLA, PlaA, aus Legionella konnte schon in vitro nachgewiesen werden [91]. Da durch die Spaltung von Phospholipiden toxische Lysophospholipide entstehen, die nicht nur gegenüber der Wirtszelle zytotoxisch sein können, ist eine Detoxifizierung auf bakterieller Seite durch die Aktivität einer LPLA möglich. Da auch PlaB diese Aktivität besitzt, wurde durch Zugabe von zytotoxischen Mengen (0,2mM) an Lysophosphatidylcholine (MPLPC) während der exponentiellen Wachstumsphase die Notwendigkeit von PlaB für das Überleben der Bakterien untersucht. Wildtyp und plaB-Mutante zeigten in gleichem Maße eine Hemmung der Replikation nach Zugabe von MPLPC (Abb. 4.27). Demnach ist PlaB nicht essentiell für eventuelle Detoxifizierungen, zumindest nicht unter den getesteten Bedingungen.

Abbildung 4.27: Wachstum von L. pneumophila Corby Wildtyp und plaB Mutante in Anwesenheit des Zytotoxins MPLPC.

L. pneumophila Corby Wildtyp und die plaB Mutante plaB1 wurden bei Erreichen der mittleren exponentiellen Wachstumsphase durch Zusatz von toxischen Mengen (0,2mM) an MPLPC (roter Pfeil) in ihrer Replikation inhibiert. Dargestellt ist der Vergleich inhibierten Wachstums (gepunktete Linien) zu normal wachsenden Bakterienzellen (durchgezogene Linien) ohne das Zytotoxin MPLPC.

Zusammenfassend konnten durch Deletion der hauptsächlichen PLA/LPLA Aktivität von Legionella pneumophila keine Unterschiede in der Viabilität und den Membranzusammen-setzungen der Bakterien in Abhängigkeit von PlaB festgestellt werden.

Untersuchungen zur LPS-Zusammensetzung

Aufgrund der Verankerung im äußeren Teil der Membran könnte PlaB indirekt Einfluss auf die Zusammensetzung des Lipopolysaccharides (LPS) der Legionella Bakterien nehmen. Daher wurde LPS aus L. pneumophila Wildtyp Corby, der plaB Mutante plaB1, der Komplementante plaB1 (pJB04) und dem Überexpressionsstamm Corby (pJB04) extrahiert und mittels vergleichender SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert. Hierbei zeigte sich kein Unterschied im LPS-Profil zwischen den vier Stämmen (nicht gezeigt). Um dies zu verifizieren, wurden Wildtyp und Mutante auf ihre Reaktivität mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern (MAb) gegen Legionella-LPS im ELISA-Verfahren getestet [296]. Es konnte bei keinem der MAbs (8/5, 3/1, 3, 8/4, 12/2, 88/1, 88/3, 30/4) ein Unterschied zwischen dem Wildtyp und der plaB Mutante festgestellt werden (Daten von Jürgen Helbig, TU Dresden). Somit ist die LPS Zusammensetzung von Legionella als PlaB-unabhängig zu betrachten.

PlaB als Bakteriozin

Das Lipidhydrolysespektrum von PlaB (Abb. 4.1 A) zeigte tendenziell eine Bevorzugung von Phospholipiden mit einer negativen Nettoladung als hauptsächliche Substratquelle. Die Membran von L . pneumophila weist jedoch einen hohen Bestandteil an Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylethanolamin (PE), bipolaren Lipiden ohne Nettoladung bei neutralem pH, auf [88]. Da auch eukaryontische Zellen primär PC als Membranbestandteil der äußeren Lipidschicht tragen, stellt sich die Frage, wozu ein Bakterium eine derart potente Phospholipase, PlaB, mit gezeigtem Lipidhydrolysespektrum exprimiert. Ein möglicher Grund liegt in der Nutzung dieser Aktivität zur Abwehr von Konkurrenten z. B. im Verband des Biofilms. Zur Überprüfung dieser These wurden Legionellen mit einer Reihe an Gram negativen und Gram positiven Bakterien für 20h inkubiert und eine Inhibition des Wachstums dieser Stämme in Abhängigkeit von PlaB bestimmt. Da Legionellen auf LB-Agarplatten nicht kultivierbar sind, konnte durch Auftropfen der Suspension auf dieses Nährmedium selektiv die Anzucht der Konkurrenzstämme gefördert werden. Um Kontaminationen der Legionellensuspension zu überprüfen, wurden Wildtyp und plaB Mutante ohne Konkurrenzbakterien inkubiert und ebenfalls auf LB-Kontrollplatten (Abb. 4.28 L. pneumophila) ausgebracht. Die Studie zeigte, dass Gram negative Bakterien kein Wachstumsdefizit durch die Anwesenheit von Legionellen aufwiesen (Abb. 4.28, verglichen werden hierbei WT bzw. PlaB- mit dem Wachstum der Bakterien ohne Legionella Konkurrenz, gekennzeichnet mit „/“). Bei Gram positiven Stämmen wurde jedoch eine Steigerung des Wachstums angedeutet, wenn diese mit Legionellen inkubiert wurden (S. aureus und B. subtilis). Ob und in welcher Weise L. penumophila das Wachstum der beiden Konkurrenzstämme fördern könnte, wurde in dieser Arbeit nicht weiter untersucht. Wie sich sowohl bei Gram negativen als auch bei Gram positiven Stämmen herausstellte, war zwischen den Inkubationsansätzen des Wildtyps und der plaB Mutante kein signifikanter Unterschied zu erkennen.

Abbildung 4.28: Untersuchung der bakteriziden Eigenschaften von PlaB.

L. pneumophila Wildtyp Corby (WT) oder plaB Mutante plaB1 (PlaB-) wurden in einem Verhältnis von 100:1 (10⁷ CFU/100µl zu 10⁵ CFU/100µl) mit den Gram negativen Bakterien E. coli, P. aeruginosa und K. pneumoniae bzw. den Gram positiven Stämmen S. aureus oder B. subtilis für 20h bei 37°C in PBS inkubiert. Aliquots der verschiedenen Verdünnungsstufen (0/-1/-2/-3/-4) wurden auf LB-Agarplatten aufgetropft und das Wachstum der Konkurrenzstämme dokumentiert. Als Kontaminationskontrollen wurden sowohl Legionellen, als auch die Gram negativen bzw. positiven Bakterien ohne einen Legionella Konkurrenten (/) inkubiert. Stämme: Legionella pneumophila Corby (L. pneumophila); Escherichia coli DH5α (E.coli); Pseudomonas aeruginosa PA01 (P. aeruginosa); Klebsiella pneumoniae RKI 508 (K. pneumoniae); Staphylococcus aureus H1 (S. aureus); Bacillus subtilis ATCC6633 (B. subtilis). Die Aufnahmen sind repräsentativ für 2 unabhängige Experimente.

Demnach ist unter den getesteten Bedingungen auszuschließen, dass PlaB zur Verteidigung der Legionellen im sozialen Umfeld als Bakteriozin eingesetzt wird.

Untersuchung der intrazellulären Vermehrung und lipolytischer Aktivität von
L.   pneumophila plaB Mutanten in Zellkultur

Die intrazelluläre Vermehrung der Wildtypen L. pneumophila Corby und 130b in den Infektionsmodellen A. castellanii und U937 Makrophagen unterschied sich nicht von ihren isogenen plaB Mutanten [94]. Um zu überprüfen, ob und in welchem Maße plaB unter Infektionsbedingungen exprimiert wird, wurden U937 Makrophagen mit L. pneumophila Wildtyp Corby, der plaB Mutante plaB1 und einem Komplementationsstamm plaB1 (pKH192) infiziert. Die Expression des Gens wurde mittels RT-PCR, die Aktivität des Enzyms per Lipidhydrolyse untersucht und die koloniebildenden Einheiten auf Agarplatte bestimmt. Hierbei zeigte sich erneut kein Unterschied in der Vermehrungseffizienz der drei Stämme (Abb. 4.29 A). In der Hydrolyse von DPPG und MPLPC (Abb. 4.29 B+C) der Zelllysate wurde jedoch deutlich, dass die hauptsächliche lipolytische Aktivität während einer Legionelleninfektion auf PlaB zurückzuführen ist. Die plaB Mutante war nicht mehr in der Lage, die eingesetzten Lipide zu spalten, und hatte daher ein vergleichbares Lipolyseniveau wie die uninfizierte Kontrolle der U937 Makrophagen.

Abbildung 4.29: Bestimmung der lipolytischen Aktivität und der Expression von plaB während einer Makrophageninfektion.

U937 Makrophagen wurden mit einer MOI1 mit L. pneumophila Corby Wildtyp, der plaB Mutante plaB1 und einem Komplementationsstamm plaB1 (pKH192) infiziert. A) Bestimmung der Vermehrungsrate durch CFU-Zählung. B) DPPG-Hydrolyse der Zelllysate und D) korrespondierenden Überständen. C) MPLPC-Hydrolyse der Zelllysate und der zugehörigen E) Überstände der Infektion. F) RT-PCR zur Bestimmung der Expression von plaB nach 48h Infektionsdauer. Da die Oligonukleotide zur Bestimmung des plaB RNA-Transkriptes vor dem Insertionsort der Kanamycin-Resistenzkasette liegen, ist auch in der plaB Mutante RNA nachweisbar. Als quantitative Kontrolle wurde die Expression der Untereinheit B der bakteriellen DNA Gyrase (gyrB) mitgeführt. Die Daten repräsentieren Triplicate von mindestens 3 unabhängigen Experimenten.

Um auszuschließen, dass es sich bei den gemessenen Aktivitäten um zelluläre Phospholipaseaktivität des Infektionswirtes handelt, wurden diese durch Zugabe von 6,25mM (Endkonzentration) EDTA im Lipidhydrolyseansatz inhibiert. Die Freisetzung von Fettsäuren durch Phospholipasen in den Überständen der Infektion (Abb. 4.29 D+E) nach 72h und 97,5h der Inkubation ist wahrscheinlich auf zunehmende Zelllyse zurückzuführen, da die Bakterien durch Filtration (0,2µm) von den Überständen separiert wurden. Im Weiteren konnte die Expression des plaB-Gens mittels RT-PCR Analyse exemplarisch nach 48h Inkubation eindeutig nachgewiesen werden (Abb. 4.29 F). DNA-Kontaminationen konnten ausgeschlossen werden. Zusammenfassend zeigte dies, dass plaB während des Infektionsprozesses exprimiert wird und die größte PLA/LPLA Aktivität direkt auf das Enzym zurückzuführen ist.

Die verwendete plaB Mutante plaB1 wurde mittels Integration einer Kanamycinkassette in das entsprechende plaB-Gen hergestellt. Die Unterbrechung des Leserasters führte zu totalem Aktivitätsverlust des Enzyms. Jedoch wurde nachweislich immer noch mRNA gebildet (s. 4.29), welche eventuell in Proteinfragmente translatiert werden und durch phospholipolytischunabhängige Funktionen in zelluläre Prozesse eingreifen könnten. Durch isogene Deletionsmutanten wurde jedoch bestätigt, dass PlaB-Fragmente, die durch die Insertionsmutante entstehen könnten, keinen Einfluss auf die Vermehrungseffizienz der plaB Mutante haben [246]. Die Deletionsmutanten wurden im Weiteren für IL-8 ELISA-Studien verwendet (s. 4.3.6.2).

Untersuchung zur intrazellulären Vermehrung der L.   pneumophila plaB
Mutante nach Meerschweincheninfektion 

Infektionsstudien von in vitro Modellsystemen, wie z. B. U937 Makrophagen, sind ein gängiges und gutes Verfahren zur Überprüfung des Virulenzpotentials von Legionella Bakterien. Sie spiegeln jedoch nicht die Komplexität und Organisation eines ganzen Organismus wider, wie z. B. die Zell-Zellkommunikation und daraus resultierende Prozesse. Da, wie bereits in vitro belegt, kein anderes Enzym von L .  pneumophila so starke extra- und intrazelluläre Aktivitäten aufweist, war es von Interesse, ob sich die plaB Mutante in Meerschweincheninfektionsexperimenten vergleichbar zum Wildtyp replizieren kann.

Bestimmung der Bakterienlast in Meerschweinchenlungen und Milz

In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Higa (Universität Ryukyus, Japan) konnte bereits gezeigt werden, dass PlaB entscheidend zur Virulenz der Legionellen im Tierversuch beiträgt [247]. Zur Verifizierung und für weitergehende Experimente wurden männliche Meerschweinchen des Stammes Hartely intratracheal mit 10⁶ L . pneumophila Corby Bakterien infiziert. Nach 2 Tagen Inkubation wurden die Tiere euthanasiert und sowohl Lungenflügel, als auch die Milz auf ihre Legionellenlast untersucht. Hierzu wurden die Lungen- und Milzhomogenisate in verschiedenen Verdünnungen auf BYCE-Agarplatten ausplattiert und die CFU-Werte bestimmt. Es zeigte sich, dass die plaB Mutante in der Vermehrung in der Lunge als auch in der Verbreitung zur Milz inhibiert war (Abb. 4.30 A/C).

Abbildung 4.30: Bestimmung der Bakterienlast in Meerschweinchenlungen mittels CFU-Zählung und real-time PCR.

Drei Meerschweinchen pro Stamm wurden mit je 1x10⁶ Bakterien infiziert, nach 2 Tagen Inkubation euthanasiert und die Bakterienlast in der Lunge per Zählung der „colony forming units“ (CFU) (A) und mittels real-time PCR (B) bestimmt. Bei der angegebenen Kopienzahl des „macrophage infectivity potentiator“ mip gilt: 1 Kopie des Gens = 1 Bakterienzelle. C) Bestimmung der CFU in Milzhomogenisaten. Dargestellte Werte entsprechen der Bakterienmenge des jeweiligen Organs dividiert durch das Inokkulum der Infektion. Dieses Experiment wurde in Kooperation mit Prof. Higa und erhöhter Tierzahl zweimal wiederholt (1.n=3; 2.n=4). LV = Leervektor pBCKS.

Die Bakterienlast in den Lungen wurde zusätzlich durch real-time PCR Analysen mit Hilfe von mip-Taqman-Sonden verifiziert (Abb. 4.30 B). Der Vermehrungsdefekt der Mutante konnte somit bestätigt werden, jedoch wiesen die Werte eine sehr hohe Diskrepanz innerhalb der einzelnen Infektionsgruppen, z. B. innerhalb der mit der plaB Mutante infizierten Tiere, auf. Durch real-time PCR können auch unkultivierbare Bakterien oder bereits tote Zellen erfasst werden. Dies könnte die erhöhten mip Kopienzahlen der plaB Mutante erkären, da die Werte der CFU-Zählung deutlich unter denen des Wildtypes lagen (Abb. 4.30 A+B). Der Replikationsdefekt der plaB Mutante konnte zum Teil durch das Einbringen eines plaB-tragenden Expressionsplasmides (pJB04) ausgeglichen werden, erreichte jedoch nicht Wildtyplevel (Abb. 4.30 A). Ein Grund hierfür könnte der Verlust des Plasmides vor oder während der Infektion sein, da von den Bakterien post Infektion nur noch sehr wenige der Komplementanten die plasmidständige Chloramphenicolresistenz aufwiesen. Dies wurde durch Ausplattieren auf antibiotikahaltigen BCYE-Agarplatten bestimmt. Histologische Untersuchungen des Lungengewebes ergaben deutlich stärkere Entzündungsprozesse bei Wildtyp- und Komplementanteninfektionen als bei vergleichbaren Sektionen der mit der plaB Mutante infizierten Meerschweinchen [247].

Untersuchungen zur veränderten Lipidzusammensetzung der Lungenproben
nach Legionelleninfektion

Wie im Tiermodell gezeigt, trägt PlaB zur Virulenz von Legionellen bei (Abb. 4.28). Da PlaB besonders starke hydrolytische Aktivität gegenüber Phospholipiden aufweist, könnte eine mögliche Funktion während des Infektionsprozesses darin bestehen, zelluläre Lipide abzubauen. Aus diesem Grund wurden mittels Dünnschichchromatographie und Bestimmung freier Fettsäuren mögliche Veränderungen in der Lipidzusammensetzung der Meerschweinchenlungen untersucht. Die Dünnschichtchromatographien mit Laufmitteln zur besonderen Auftrennung polarer, apolarer und cholesterolesterspezifischer Lipide zeigten keinen gravierenden Unterschied in den Lipidbestandteilen der infizierten oder nichtinfizierten Meerschweinchenproben (Abb. 4.31 A/B/C). Auch die Lipidzusammen-setzungen der Lungenproben der mit L. pneumophila Wildtyp oder der plaB Mutante und dem Komplementationsstamm plaB1 (pJB04) infizierten Tiere verhielten sich ähnlich. Einen geringfügigen Unterschied konnte man jedoch zwischen dem Salinekontrolltier (PBS) und den mit Legionellen infizierten Meerschweinchen feststellen. Hierbei waren auf der Chromatographieplatte weniger freie Fettsäuren bei dem PBS-Kontrolltier zu erkennen (Abb. 4.31 B/C).

Abbildung 4.31: Dünschichtchromatographische Analyse der extrahierten Lipide aus infizierten Meerschweinchen-lungen.

Aus 50mg infiziertem Lungengewebe wurden quantitativ Lipide extrahiert und mittels Dünnschichtchromatographie bei unterschiedlichen Laufmitteln verglichen. Dargestellt sind jeweils die extrahierten Proben aus den infizierten Tieren Nr.1, Corby (LV) 1, plaB1 (LV) 1, plaB (pJB04) 1 und das mit PBS infizierte Kontrolltier. A) polare Dünnschichtchromatographie mit dem Laufmittel Chloroform:Methanol:Wasser 65:25:4. B) apolare Dünnschichtchromatographie mit dem Laufmittel n-Hexan:Diethylether:Eisessig 70:30:4. C) Cholesterolesterdetektion mit dem Laufmittel Petrolether:Diethylether:Eisessig 90:10:1. Der schwarze Pfeil markiert den reduzierten Fettsäureanteil im PBS-Kontrolltier. LV=Leervektor pBCKS.

Um dies zu verifizieren und zu quantifizieren, wurden erneut Lipide aus 50mg der Meerschweinchenproben extrahiert und auf ihren Gehalt an freien Fettsäuren mittels des NefaC-Kits untersucht. Abbildung 4.32 A+B zeigt die Einzelwerte der gemessenen freien Fettsäuren im Vergleich zu den Einzelwerten der CFU-Bestimmung der jeweiligen Tiere aus dem Infektionsversuch. Eine Zunahme an freien Fettsäuren mit ansteigender Bakterienmenge war deutlich zu erkennen. Dies verhielt sich aber unabhängig von der plaB-Expression. So zeigte zwar die plaB  Mutante in Tier 1 (plaB1 (LV) 1) eine geringere CFU-Anzahl als die Wildtypinfektion in Tier 1 (Corby (LV) 1), jedoch in der Bestimmung der Fettsäuren einen leicht erhöhten Spiegel an freien Säureketten (Abb. 4.32).

Abbildung 4.32: Bestimmung der freien Fettsäuren aus der Meerschweinchenlunge im Vergleich zu dokumentierten CFU-Werten.

A) Aus je 50mg der Meerschweinchenlungen wurden Lipide extrahiert und 1/10 dieser zur Bestimmung der freien Fettsäuren für jedes einzelne Tier herangezogen. Die Daten repräsentieren Doppelwerte von 3 unabhängigen Experimenten. B) Korrespondierende Bakterienlast dargestellt in kolonieformenden Einheiten (CFU) pro infizierten Meerschweinchenlungen (s. Abb 4.30 A). Für die Experimente wurden je drei Tiere zur Infektion mit L. pneumophila Corby Wildtyp, der plaB Mutante plaB1 und der Komplementante plaB1 (pJB04) verwendet. Ein Tier wurde mit PBS inokuliert und diente als Kontrolle für fortlaufende Experimente. LV=Leervektor pBCKS.

Aus den erfassten Daten der Lipidzusammensetzungen und der Bestimmung freier Fettsäuren konnte keine Aussage über eine mögliche Funktion von PlaB als wirtszellzerstörender Virulenzfaktor währen einer Legionelleninfektion getroffen werden.

Beeinflussung der Zytokinexpression durch PlaB

Zellzerstörung durch besonders aktive Phospholipasen während einer Wirtszellinfektion stellt einen möglichen Mechanismus zur Etablierung der replikativen Nische von Pathogenen dar. Dies konnte anhand des α-Toxins aus C.   perfringens oder auch von ExoU aus P. aeruginosa eindeutig gezeigt werden. Es wird jedoch angenommen, dass neben zytotoxischer Aktivität vielmehr die sublytischen Mengen der Enzyme zur Veränderung der Signaltransduktionswege der Zielzelle beitragen und so aktiv auf die Immunantwort des Wirtes Einfluss nehmen [45, 49, 100, 234, 65]. Ob Ähnliches auch auf PlaB zutrifft und dieses den Replikations- und Verbreitungsdefekt im Meerschweinchenmodell zum Teil erklären könnte, sollte im Folgenden durch Untersuchung plaB-vermittelter Zytokinsekretion bestimmt werden.

„ Screening “ auf veränderte Zytokinexpression nach Infektion von A549
Lungenepithelzellen

Ein Dot Blot, basierend auf Protein-Antikörper-Interaktion, sollte einen ersten Überblick geben, welche entzündungsreaktiven Faktoren durch PlaB beeinflusst werden. Hierzu wurden A549 Zellkulturüberstände nach einer Infektion mit L. pneumophila Corby Wildtyp, der plaB Mutante und der Komplementante plaB1 (pJB04) mit dem „H uman I nflammation A ntibody A rray 3“ der Firma RayBio® inkubiert (s. Material und Methoden) und Veränderungen unter 40 verschiedenen Entzündungsmediatoren untersucht. Werte >10% der Positivkontrolle (=100%) wurden als signifikant eingestuft und näher betrachtet. Hierbei zeigten sich 4 Zytokine von der Expression von plaB beeinflusst. Die Sekretion der Chemokine Interleukin 8 (IL-8), Monozyten-Chemoattraktorprotein-1 (MCP-1) und RANTES („regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted“), sowie des Inhibitors von Metalloproteinasen TIMP-2 war in den mit der plaB Mutante infizierten A549 Zellen reduziert (Abb. 4.33 A/B). Die Defekte konnten durch episomale Expression von plaB komplementiert werden. Die negative Darstellung der TIMP-2 Sekretion kommt durch die Subtraktion der durch Legionellen infizierten Ansätze von denen der uninfizierten Kontrolle zustande. Somit reprimiert L. pneumophila generell die Expression bzw. Sekretion des Inhibitors von Metalloproteinasen, welche eine Schlüsselrolle in der Entwicklung und Wundheilung des Bindegewebes einnehmen.

Abbildung 4.33: Sekretion von Entzündungsmediatoren nach Legionelleninfektion.

A549 Lungenepithelzellen wurden mit L. pneumophila Corby Wildtyp (Corby), der plaB Mutante (plaB1) und der Komplementante (plaB1-pJB04) infiziert und die Sekretion putativer Signalmoleküle in den Überstand bestimmt. Bei diesem „Screen“ auf 40 verschiedene Entzündungsmediatoren zeigten drei Chemokine (IL-8, MCP-1 und RANTES) und der Inhibitor von Metalloproteinasen Timp-2 eine PlaB-abhängige Sekretion. Die Daten repräsentieren Doppelwerte von insgesamt 3 unabhängigen Experimenten. LV = Leervektor pBCKS.

PlaB hat demnach sowohl stimulierende, aber auch inhibierende Wirkung auf das Immunsystem. Zum einen werden Immunzellen durch Chemoattraktoren zum Infektionsort gelockt, zum anderen aber wird durch Stimulierung der Inhibitorsekretion der Abbau der extrazellulären Matrix verhindert und somit die Durchlässigkeit des Gewebes vermindert.

Quantifizierung der Zytokinsekretion mittels „Enzyme-linked Immunosorbent
Assay (ELISA)“

Die durch die Screening-Methode (s. 4.3.6.1) identifizierten Entzündungsmediatoren sollten im Weiteren durch Quantifizierung mittels ELISA verifiziert werden. Dabei wurde vor allem die Sekretion des Chemokins IL-8 genauer untersucht. Zur Etablierung und Verbesserung des

Abbildung 4.34: Kinetik der Legionellen-induzierten IL-8 Sekretion.

A549 Lungenepithelzellen wurden mit L. pneumophila Corby und der plaB Mutante plaB1 infiziert und die Sekretion des Chemokins IL-8 zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Hierbei konnte erst nach 5-stündiger Inkubation und einer ausreichend großen Bakterienmenge (MOI50), IL-8 Sekretion erfolgreich detektiert werden. Die Daten repräsentieren Triplikate von 3 unabhänhigen Experimenten. LV = Leervektor pBCKS.

ELISA-Experimentes wurde eine Kinetik der Legionellen-induzierten IL-8 Sekretion erstellt. A549 Lungenepithelzellen wurden mit L. pneumophila Wildtyp und der plaB Mutante plaB1 infiziert und die Abgabe des Chemoattraktors in den Überstand zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Hierbei zeigte sich, dass die durch Bakterien induzierte IL-8 Sekretion nach ca. 5 Stunden messbar ist, eine gute Effektstärke jedoch erst bei Inkubationen über Nacht (>15h) erreicht wird (Abb. 4.34). Im Weiteren sollte festgestellt werden, ob die hydrolytische Aktivität und somit die Möglichkeit, z. B. Lysophosphatidylcholin (LPC) zu generieren, ausschlaggebend für die Induktion der IL-8 Expression ist. Das PlaB in der Lage ist, LPC aus dem Vorläufer Phosphatidylcholin zu generieren, konnte bereits experimentell bestätigt werden [94]. Daher wurden Mutanten des katalytischen Zentrums auf ihre Fähigkeit hin überprüft, IL-8 Sekretion zu vermitteln. Wie in Abbildung 4.35 zu sehen, ist die plaB Mutante in der Induktion der IL-8 Expression reprimiert, welches durch Einbringen eines plaB-exprimierenden Vektors wiederhergestellt werden konnte (Abb. 4.35 A). Die verschiedenen Mutanten des katalytischen Zentrums (S85A/D203N/H251N) waren zwar in der Lage, etwas mehr IL-8-Sekretion zu stimulieren als die plaB Mutante mit entsprechendem Leervektor (plaB1-LV), zeigten sich jedoch im Vergleich zum Wildtyp plaB-exprimierenden Stamm (plaB1-PlaB) in der Expression des Chemokins reduziert (Abb. 4.35 A).

Abbildung 4.35: IL-8 Sekretion in Abhängigkeit der katalytischen Aktivität von PlaB und der Lysophospholipide MPLPC und MPLPG.

A) A549 Lungenepithelzellen wurden entweder mit L. pneumophila Corby, der plaB Mutante plaB1, der Komplementante plaB1 (PlaB) oder Mutanten des katalytischen Zentrums mit einer MOI 10 infiziert und die Sekretion des Chemokins IL-8 nach 18h Inkubation bestimmt. Vier Lysophospholipide (MPLPC, MPLPG, MPLPE, MPLPA) wurden in einer Konzentration von 25µM eingesetzt und die Freisetzung von IL-8 dokumentiert. B) Zeitabhängige Sekretion des Interleukins durch Inkubation der A549 Zellen mit 25µM MPLPC. Die Daten repräsentieren Triplikate von mindestens 3 unabhängigen Experimenten. LV = Leervektor pBCKS.

Ein ähnliches Bild ergab sich mit den Überständen der Infektion der S129A Mutante. Diese trägt einen Aminosäureaustausch, der vor allem für die Spaltung von Lipiden mit Cholinseitenketten von Bedeutung ist. Auch die Mutante war in der IL-8 Sekretion im Vergleich zum Komplementationsstamm plaB1 (PlaB) reduziert.

Der nächste Schritt in der Aufklärung der durch eine Phospholipase induzierten Chemokinsekretion war die Suche nach der aktivierenden Substanz. Zur Klärung dieser Fragestellung wurden verschiedene Lysophospholipide, mögliche Reaktionsprodukte von PlaB, auf Induktion der IL-8 Sekretion untersucht. Hier waren vor allem MPLPC und MPLPG in der Lage, dosisabhängig (Maximum bei 25µM) die Expression und Sekretion des Chemokins zu induzieren. Eine detaillierte Kinetik der MPLPC-induzierten IL-8 Expression zeigte deutlich, dass sich nach nur 5h die Sekretion nahe der Sättigungsgrenze befand (Abb. 4.35 B).

Es sollte erwähnt werden, dass etliche Wiederholungen des Experimentes zum Teil gegenläufige Resultate ergaben. So war z. B. die plaB Mutante nicht mehr in der IL-8 Sekretion inhibiert oder der Überexpressionsstamm komplementierte nicht mehr. Die plaB Mutante wies durch die Insertion einer Kanamycin-Resistenzkasette immer noch plaB Transkript auf (s. 4.29). Um zu untersuchen, ob mögliche PlaB-Fragmente für die Schwankungen bezüglich der IL-8 Sekretion verantwortlich sind, wurden ELISA-Experimente mit den plaB Deletionsmutanten durchgeführt. Diese unterlagen jedoch gleichermaßen den zuvor beobachteten Variationen. Da ähnliche Ergebnisse auch für die weiter oben erwähnten Zytokine erzielt wurden, kann heute noch nicht eindeutig belegt werden, ob und in welchem Ausmaß PlaB zur Sekretion von Zytokinen und anderen Entzündungsmediatoren beiträgt.

Untersuchung zum Einfluss von PlaB auf die Flagellenexpression

Die bakterielle Flagelle ist ein besonders potenter Stimulator des angeborenen Immunsystems. Die erste physikalische und immunmodulatorische Barriere der Atemwege, die Epithelzellschicht der Mukosa, zeigt sich besonders durch den Bewegungsapparat der Pathogene aktiviert [210]. Die resultierende Signaltransduktion wird in Legionellen und anderen Bakterien unter anderem durch das Transmembranprotein „T oll-like“ Rezeptor 5 (TLR5) vermittelt, welches die Flagelle als sogenanntes pathogen-assoziiertes molekulares Muster („pathogen-associated molecular pattern“, PAMP) erkennt und die Immunantwort einleitet [123, 124]. Die Induktion der Interleukin-8 Sekretion kann dabei ein Resultat der flagelleninduzierten immunmodulatorischen Antwort sein [123, 241]. Daher war es von Interesse zu überprüfen, ob die plaB-abhängige IL-8 Sekretion durch Veränderungen in der Flagelle zustande kommt. Die Stämme L . pneumophila Wildtyp Corby, die korrespondierende plaB Mutante und Komplementante wurden für 7 Tage auf BCYE-Platten bei 30°C (optimale Temperatur für die Flagellenexpression [200]) kultiviert und anschließend die Flagellen nach Immunfluoreszenzfärbung mikroskopisch untersucht. Hierbei zeigte sich kein Unterschied in der Menge an Flagellenprotein FlaA (nicht gezeigt). Ähnliche Ergebnisse ergaben sich durch Analysen der FlaA-Menge zwischen Wildtyp und Mutante in Western Blot Analysen (Heuner, unveröffentlichte Daten). Der Einfluss von PlaB auf die Sekretion wichtiger Entzündungsmediatoren kann demnach als unabhängig von der Flagellenexpression angesehen werden.