Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies

Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit vom 1.12.2005 bis zum 30.09.2009 unter Anleitung von Herrn Prof. Dr. Erwin Schneider am Institut für Biologie der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin und im Labor von Frau PD Dr. Antje Flieger am Robert Koch-Institut durchgeführt.

Inhaltsverzeichnis

• 1 Zusammenfassung

• 2 Einleitung

  • 2.1 Die Rolle von Legionella pneumophila als Krankheitserreger

    • 2.1.1 Entdeckung von L. pneumophila

    • 2.1.2 Mikrobiologie und Ökologie

    • 2.1.3 Legionellose – Pathogenese, Diagnostik und Therapie

    • 2.1.4 Epidemiologie und Prävention

  • 2.2 Lebenszyklus und Virulenzfaktoren von Legionella Bakterien

  • 2.3 Phospholipasen und Pathogenität

    • 2.3.1 Eigenschaften und Klassifizierung von Phospholipasen

    • 2.3.2 Faltung und Wirkmechanismus von Phospholipasen

    • 2.3.3 Phospholipasen als bakterielle Virulenzfaktoren

      • 2.3.3.1 Phospholipasen als Virulenzfaktoren von extrazellulären Bakterien

      • 2.3.3.2 Phospholipasen als Virulenzfaktoren von intrazellulären Bakterien

  • 2.4 Immunabwehr einer Legionelleninfektion

  • 2.5 Ziel der Arbeit

• 3 Material und Methoden

  • 3.1 Material

    • 3.1.1 Laborausstattung

    • 3.1.2 Spezielle Materialien

    • 3.1.3 Chemikalien

    • 3.1.4 Lipidsubstrate

    • 3.1.5 Puffer und Lösungen

    • 3.1.6 Enzyme, Standards, Antikörper

    • 3.1.7 Analyse-Kits

    • 3.1.8 Plasmide, Oligonukleotide, Bakterienstämme und Zellen

      • 3.1.8.1 Verwendete Plasmide

      • 3.1.8.2 Verwendete Oligonukleotide und Sonden

      • 3.1.8.3 Verwendete Bakterien, Zellen und Versuchstiere

    • 3.1.9 Verwendete und erzeugte gentechnisch veränderte Organismen (GVO)

    • 3.1.10 Kulturmedien für Bakterien und Zellen

    • 3.1.11 Verwendete Software

  • 3.2 Methoden

    • 3.2.1 Anzucht von Bakterien und Hefen

      • 3.2.1.1  Legionella pneumophila

      • 3.2.1.2  Escherichia coli

      • 3.2.1.3  Pichia pastoris

      • 3.2.1.4 Herstellung von Glyzerolgefrierkulturen

    • 3.2.2 Anzucht von A549 Lungenepithelzell-, U937 Makrophagen- und Acanthamoeba- Zellkulturen

    • 3.2.3 Isolierung von Nukleinsäuren

      • 3.2.3.1 Isolierung von chromosomaler DNA aus Lungengewebe

      • 3.2.3.2 Isolierung von chromosomaler DNA aus P. pastoris

      • 3.2.3.3 Isolierung von extrachromosomaler DNA

      • 3.2.3.4 RNA-Isolierung

    • 3.2.4 Fällung von Nukleinsäuren mittels EtOH

    • 3.2.5 Nukleinsäure-Gelelektrophorese

    • 3.2.6 Modifikation von Nukleinsäuren

      • 3.2.6.1 Verdau mit Restriktionsendonukleasen/Dephosphorylierung

      • 3.2.6.2 Ligation von DNA Fragmenten

      • 3.2.6.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR)

      • 3.2.6.4 Einfügen von Punktmutationen mittels „Combined Chain Reaction“ (CCR)

      • 3.2.6.5 Real-time Polymerase Kettenreaktion

      • 3.2.6.6 Reverse Transkriptase –Polymerase Kettenreaktion

      • 3.2.6.7 Sequenzierung-Polymerase Kettenreaktion

    • 3.2.7 Herstellung und Transformation von elektrokompetenten Zellen

      • 3.2.7.1 Herstellung elektrokompetenter E. coli

      • 3.2.7.2 Herstellung elektrokompetenter L. pneumophila

      • 3.2.7.3 Herstellung elektrokompetenter P. pastoris

      • 3.2.7.4 Transformation von DNA

    • 3.2.8 Transfektion von A549 Zellen

    • 3.2.9 Test auf bakterizide Eigenschaften von PlaB

    • 3.2.10 Proteinanalytik

      • 3.2.10.1 Fällung von Proteinen mittels TCA-EtOH

      • 3.2.10.2 Bestimmung der Proteinkonzentration

      • 3.2.10.3 Eindimensionale (1D) - SDS-PAGE

      • 3.2.10.4 Western Blot und Immundetektion

    • 3.2.11 Expression und Reinigung von Proteinen

      • 3.2.11.1 Proteinexpression in E. coli

      • 3.2.11.2 Proteinexpression in P. pastoris

      • 3.2.11.3  In vitro Translation

      • 3.2.11.4 Reinigung mittels Ionentausch- und Affinitätschromatographie

      • 3.2.11.5 Reinigung und Solubilisierung von „inclusion bodies“

      • 3.2.11.6 Rückfaltung von PlaB

    • 3.2.12 Nachweis von Phospholipaseaktivität

      • 3.2.12.1 Gewinnung von Zellpelletlysaten und Kulturüberständen

      • 3.2.12.2 Gewinnung von U937 Zelllysaten und Überständen

      • 3.2.12.3 Verdau von Lipidsubstraten

      • 3.2.12.4 Bestimmung der Menge an freien Fettsäuren

      • 3.2.12.5 Lipidextraktion und Dünnschichtchromatographie

      • 3.2.12.6 Hämolyseassay

    • 3.2.13 Extraktion von Lipopolysaccharid (LPS)

    • 3.2.14 Koinfektion von A. castellanii Amöben, A549 Lungenepithelzellen und U937 Makrophagen mit L. pneumophila  Corby

      • 3.2.14.1 Test der intrazellulären Vermehrungsfähigkeit in A. castellanii

      • 3.2.14.2 Infektion von U937 Makrophagenzellen

      • 3.2.14.3 Infektion von A549 Lungenepithelzellen zur Bestimmung der Zytokinsekretion

    • 3.2.15 Infektion von Meerschweinchenlungen

    • 3.2.16 Bestimmung der Zytokinsekretion von infizierten A549 Zellen

      • 3.2.16.1  Screening auf Zytokinsekretion mittels des „Human I nflammation Antibody Array 3“

      • 3.2.16.2 Quantifizierung der Zytokinsekretion mittels ELISA

    • 3.2.17 Immunfluoreszenzmikroskopie

    • 3.2.18 FT-IR Spektroskopie

• 4 Ergebnisse

  • 4.1 Biochemische Analyse von L. pneumophila PlaB

    • 4.1.1 Biochemische Eigenschaften von PlaB

      • 4.1.1.1 Das PlaB-Protein

      • 4.1.1.2 Konstruktion des Komplementationsvektors pJB04

      • 4.1.1.3 Lipidhydrolyse-Profil von PlaB

      • 4.1.1.4 Selektivität gegenüber Variationen in der Fettsäurekettenlänge

    • 4.1.2 Sequenzhomologie von PlaB und PlaB-ähnlichen Proteinen

    • 4.1.3 Bestimmung der katalytisch relevanten Aminosäuren von PlaB

      • 4.1.3.1 ‚Site-directed mutagenesis’ von PlaB

      • 4.1.3.2 Lipolytische Aktivität von PlaB-Mutanten

      • 4.1.3.3 Hämolytische Aktivität von PlaB-Mutanten

    • 4.1.4 Relevanz des C-Terminus

    • 4.1.5 Expression und Reinigung von PlaB

      • 4.1.5.1 Expression in L. pneumophila

      • 4.1.5.2 Expression in E.coli

      • 4.1.5.3 Expression in P. pastoris

      • 4.1.5.4  In vitro Translation und Transfektion

  • 4.2 Verbreitung von PlaB

    • 4.2.1 Lipolytische Aktivität klinischer Isolate von L.  pneumophila

    • 4.2.2 Vorkommen von PlaB-Enzymen in nicht-pneumophila Legionellenstämmen

      • 4.2.2.1  plaB-Gene im Genom von L. gormanii und L. spiritensis 

      • 4.2.2.2 Lipolytische und hämolytische Aktivität von L. spiritensis PlaB

  • 4.3 Funktionelle Analyse von PlaB

    • 4.3.1 Beeinflussung der Viabilität von L. pneumophila durch PlaB-Aktivität

    • 4.3.2 Untersuchungen zur LPS-Zusammensetzung

    • 4.3.3 PlaB als Bakteriozin

    • 4.3.4 Untersuchung der intrazellulären Vermehrung und lipolytischer Aktivität von L.   pneumophila plaB Mutanten in Zellkultur

    • 4.3.5 Untersuchung zur intrazellulären Vermehrung der L.   pneumophila plaB Mutante nach Meerschweincheninfektion 

      • 4.3.5.1 Bestimmung der Bakterienlast in Meerschweinchenlungen und Milz

      • 4.3.5.2 Untersuchungen zur veränderten Lipidzusammensetzung der Lungenproben nach Legionelleninfektion

    • 4.3.6 Beeinflussung der Zytokinexpression durch PlaB

      • 4.3.6.1  „ Screening “ auf veränderte Zytokinexpression nach Infektion von A549 Lungenepithelzellen

      • 4.3.6.2 Quantifizierung der Zytokinsekretion mittels „Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)“

      • 4.3.6.3 Untersuchung zum Einfluss von PlaB auf die Flagellenexpression

• 5 Diskussion

  • 5.1 Identifizierung wichtiger Aminosäuren und Proteindomänen für die lipolytische Aktivität von PlaB

    • 5.1.1 PlaB und Homologe, eine neue Familie von Phospholipasen

    • 5.1.2 Hydrolyse von Phosphatidylcholin als wichtiger Bestandteil der Virulenz

  • 5.2 Die Bedeutung von PlaB für Legionella pneumophila

    • 5.2.1 PlaB als Werkzeug für verbesserte Umgebungs- und/oder Wirtsadaptation

    • 5.2.2 Veränderung der zellulären Immunantwort als Mechanismus für gesteigerte Virulenz

    • 5.2.3 PlaB als Bakteriozin?

• 6 Ausblick

• Selbstständigkeitserklärung

• Danksagung

• Abkürzungsverzeichnis

• 7 Literaturverzeichnis

• 8 Anhang

• Tabelle 3.1: Auflistung der verwendeten Geräte

• Tabelle 3.2: Auflistung spezieller Materialien

• Tabelle 3.3: Auflistung der verwendeten Chemikalien

• Tabelle 3.4: Auflistung der verwendeten Lipidsubstrate

• Tabelle 3.5: Auflistung der verwendeten Puffer und Lösungen

• Tabelle 3.6: Auflistung verwendeter Enzyme, Standards und Antikörper

• Tabelle 3.7: Auflistung der verwendeten Analyse-Kits

• Tabelle 3.8: Auflistung erworbener Plasmide

• Tabelle 3.9: Auflistung erzeugter Plasmide

• Tabelle 3.10: Auflistung verwendeter Oligonukleotide und Sonden (K=Klonierung)

• Tabelle 3.11: Auflistung verwendeter Bakterienstämme, Hefen, Zelllinien und Versuchstiere

• Tabelle 3.12: Auflistung verwendeter und erzeugter gentechnisch veränderter Organismen (GVO)

• Tabelle 3.13: Auflistung verwendeter Nährmedien zur Anzucht von L. pneumophila

• Tabelle 3.14: Auflistung der Nährmedien zur Anzucht von E. coli

• Tabelle 3.15: Auflistung der Nährmedien zur Anzucht von P. pastoris

• Tabelle 3.16: Auflistung verwendeter Nährmedien zur Anzucht von A. castellanii und zur Infektion der Amöben mit L. pneumophila

• Tabelle 3.17: Auflistung des Nährmediums für die Kultivierung und Infektion von U937 Makrophagen und A549 Lungenepithelzellen

• Tabelle 3.18: Auflistung verwendeter Antibiotika und deren Endkonzentration im Medium

• Tabelle 3.19: Verwendete Software und Internet-Datenbanken

• Tabelle 3.20: Reaktionsansatz für eine Standard- und Kolonie-PCR

• Tabelle 3.21: Programm für eine Standard-und Kolonie-PCR

• Tabelle 3.22: Reaktionsansatz für eine „Combined Chain Reaction“ (CCR)

• Tabelle 3.23: PCR-Programm für eine CCR-Reaktion

• Tabelle 3.24: Reaktionsansatz für eine real-time PCR

• Tablle 3.25: Programm für eine real-time PCR:

• Tabelle 3.26: Reaktionsansatz für eine RT-PCR

• Tabelle 3.27: Programm für eine Einschritt-RT-PCR

• Tabelle 3.28: Reaktionsansatz für eine Sequenzierungs-PCR

• Tabelle 3.29: PCR-Programm für eine Sequenzierungs-Reaktion

• Abbildung 2.1: Übersicht des intrazellulären Infektionszyklus’ von Legionellen.

• Abbildung 2.2: Strukturelle Eigenschaften eines Glyzerophospholipids und die Angriffsorte der Phospholipasen A-D:

• Abbildung 2.3: Angriffspunkt einer Lysophospholipase im Lipidmolekül. 

• Abbildung 2.4: Übersicht der drei essentiellen Aminosäuren der katalytischen Triade und Darstellung der Position des „nucleophilic elbow“[245].

• Abbildung 2.5: Übersicht der möglichen Wirkmechanismen von Phospholipasen während der Infektion von Wirtszellen.

• Abbildung 2.6: Genomische Situation am offenen Leserahmen (ORF) von plaB in sequenzierten L. pneumophila Stämmen.

• Abbildung 3.1: Übersicht der 40, auf der Membran des „Human Inflammation Antibody Array 3“ der Firma RayBio®, enthaltenen Entzündungsfaktoren.

• Abbildung 4.1: Lipidhydrolyseprofil von L. pneumophila Corby PlaB.

• Abbildung 4.2: Selektivität von PlaB gegenüber Fettsäurekettenlängen in Lysophospholipidsubstraten.

• Abbildung 4.3: Sequenzmotive von putativ katalytisch wichtigen Aminosäuren in L. pneumophila Corby PlaB und ihre Lokalisation im Protein.

• Abbildung 4.4.: Lipidhydrolyseprofile von PlaB-Mutanten mit Auswirkung auf die lipolytische Aktivität des Enzyms.

• Abbildung 4.5: Lipidhydrolyse von mutierten PlaB-Enzymen ohne gravierende Auswirkung auf die lipolytischen Eigenschaften.

• Abbildung 4.6: Sequenzvergleich und resultierende Konsensussequenz der katalytischen Triade von L. pneumophila Corby PlaB und PlaB-Homologen.

• Abbildung 4.7: Bedeutung der Aminosäure Threonin-83 im Konsensusmotiv THSTG des aktiven Serinrestes Ser-85.

• Abbildung 4.8: Lipidhydrolyse der „loss of function“ Mutanten des PlaB-Enzyms.

• Abbildung 4.9: Verteilung der katalytisch wichtigen Aminosäuren innerhalb des PlaB-Proteins.

• Abbildung 4.10: Hämolytische Aktivität der PlaB-Mutanten.

• Abbildung 4.11: Relevanz des C-Terminus für die lipolytische Aktivität von PlaB.

• Abbildung 4.12: Reduzierende SDS-PAGE nach Affinitätschromatographie von GST-PlaB.

• Abbildung 4.13: Reinigung von PlaB mittels Anionentauschchromatographie.

• Abbildung 4.14: Anti-GST Western Blot der PlaB-Solubilisierungsversuche.

• Abbildung 4.15: Expression von plaB in P. pastoris.

• Abbildung 4.16: Etablierung der Transfektion von A549 Lungenepithelzellen mit dem plaB-exprimierenden Plasmid pJB43 Klon 2.

• Abbildung 4.17: Expression von plaB in transfizierten A549 Lungenepithelzellen.

• Abbildung 4.18: Lipidhydrolyse klinischer Isolate und eines Umweltisolates von L. pneumophila und Expression von plaB-ähnlichen Genen.

• Abbildung 4.19: Zell-assoziierte Lipidhydrolyse von nicht-pneumophila Legionellen im Vergleich zu L. pneumophila 130b.

• Abbildung 4.20: Lipidhydrolyse- und Hämolyseeigenschaften von L. spiritensis PlaB.

• Abbildung 4.21: Wuchsverhalten von L. pneumophila Corby Wildtyp und plaB Mutante bei verschiedenen Temperaturen.

• Abbildung 4.22: FT-IR Spektroskopie der Legionellenmembran.

• Abbildung 4.23: Wuchsverhalten von L. pneumophila Corby oder 130b und der isogenen plaB Mutanten bei pH6.5.

• Abbildung 4.24: Wuchsverhalten von L. pneumophila Wildtypen und plaB Mutanten bei pH6.0.

• Abbildung 4.25: Polare Dünnschichtchromatographie extrahierter Lipide aus der Legionellenmembran, nach Wachstum bei pH6.0.

• Abbildung 4.26: Wuchsverhalten von L. pneumophila Wildtyp und plaB Mutante nach Reduktion an Nährstoffen oder Phosphat.

• Abbildung 4.27: Wachstum von L. pneumophila Corby Wildtyp und plaB Mutante in Anwesenheit des Zytotoxins MPLPC.

• Abbildung 4.28: Untersuchung der bakteriziden Eigenschaften von PlaB.

• Abbildung 4.29: Bestimmung der lipolytischen Aktivität und der Expression von plaB während einer Makrophageninfektion.

• Abbildung 4.30: Bestimmung der Bakterienlast in Meerschweinchenlungen mittels CFU-Zählung und real-time PCR.

• Abbildung 4.31: Dünschichtchromatographische Analyse der extrahierten Lipide aus infizierten Meerschweinchen-lungen.

• Abbildung 4.32: Bestimmung der freien Fettsäuren aus der Meerschweinchenlunge im Vergleich zu dokumentierten CFU-Werten.

• Abbildung 4.33: Sekretion von Entzündungsmediatoren nach Legionelleninfektion.

• Abbildung 4.34: Kinetik der Legionellen-induzierten IL-8 Sekretion.

• Abbildung 4.35: IL-8 Sekretion in Abhängigkeit der katalytischen Aktivität von PlaB und der Lysophospholipide MPLPC und MPLPG.