Material und Methoden

↓22

3.1  Material

Alle Chemikalien wurden, soweit nicht anders angegeben, von der Firma Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Deutschland) bezogen. Die Zellkulturflaschen und sonstigen Zellkulturplastikmaterialien waren von Falcon (Lincoln Park, NJ, USA). Als Zellkulturmedium für die Mesothelzellen diente M199 (ICN/Flow, Meckenheim, Deutschland). Diesem wurde L-Glutamin (2 mmol/l) (Biochrom KG, Berlin, Deutschland), Insulin (0.5 μg/ml), Transferrin (0.5 μg/ml), Penicillin (100 U/ml)/Streptomycin (100 μg/ml) (Biochrom KG, Berlin, Deutschland) und Hydrocortison (40 μg/ml) zugesetzt. Vor Gebrauch des Zellkulturmediums wurde diesem bis zu 10% fetales Kälberserum (FKS) (Gibco BRL, Berlin, Deutschland) hinzugefügt, das für alle Experimente dieser Arbeit derselben Charge entstammte. Die Trypsin/EDTA-Lösung (0.05%/0.025% in PBS ohne Ca++ und Mg++) und das PBS kamen von der Firma Biochrom KG (Berlin, Deutschland). Die Peritonealdialyselösungen CAPD2/3, Balance low/high und Aminobic bezogen wir von der Firma Fresenius Medical Care (Bad Homburg, Deutschland) und die PDL Extraneal (Icodextrin 7.5%) bezogen wir von der Firma Baxter (Illinois, USA). Für die Untersuchung der Wirkung von hitzesterilisierten versus filtersterilisierten PDL wurden die Testlösungen analog der Rezeptur für CAPD2/3 im Labor hergestellt. Ein Teil der Lösungen wurde wie die kommerziell erhältlichen hitzesterilisiert (H) und der andere Teil filtersterilisiert (F). Die Zusammensetzung der Lösungen ist in Tabelle 4 angegeben. Die Hitzesterilisation der im Labor hergestellten glukosehaltigen und hitzesterilisierten PDL erfolgte für 20 Minuten bei 121°C und einem Druck von 0.2MPa. Die Filtersterilisation der parallelen Testlösungen erfolgte mittels Filtration durch einen Filter mit einer Porengröße von 0.2μm (Nalgene, Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA).

Alle Zellkulturarbeiten wurden unter sterilem Procedere im Lamina-Air-Flow durchgeführt.

↓23

Tabelle 4: Zusammensetzung der Testlösungen

CAPD2 (PD2K)+

CAPD3 (PD3K) +

Extraneal (Icodextrin 7.5%)

Na+ (mmol/l)

134

134

133

Cl- (mmol/l)

103.5

103.5

97

Ca++ (mmol/l)

1.75

1.75

1.75

Mg++ (mmol/l)

0.5

0.5

0.25

Laktat (mmol/l)

35

35

40

HCO3 - (mmol/l)

-

-

-

Glukose (g/l)

15

42.5

-

Glukosepolymer (g/l)

-

-

75

Aminosäuren* (g/l)

-

-

-

pH

5.2-5.5#

5.2-5.5#

5.5#

Osmolalität (mosmol/kg)

358

511

285

Balance low

Balance high

Aminobic

Na+ (mmol/l)

134

134

137

Cl- (mmol/l)

103.5

103.5

103.5

Ca++ (mmol/l)

1.75

1.75

1.25

Mg++ (mmol/l)

0.5

0.5

0.5

Laktat (mmol/l)

35

35

-

HCO3 - (mmol/l)

-

-

34

Glukose (g/L)

15

42.5

-

Aminosäuren* (g/L)

-

-

10

pH

7.2-7.6

7.2-7.6

7.2-7.6

Osmolalität (mosmol/kg)

358

511

369

+ Die im Labor hergestellten und hitze- bzw. filtersterilisierten PDL heißen im Text/Abb. PD2H bzw. PD2F.
# Diese PDL wurden vor Versuchsbeginn mittels NaOH auf einen pH-Wert von 7.4 eingestellt.
* Amimosäurenkomponenten von Aminobic:

Essentielle Aminosäuren

Nicht-essentielle Aminosäuren:

L-Histidin

3.222 mmol/l

L-Alanin

6.73 mmol/l

L-Isoleucin

5.72 mmol/l

L-Arginin

2.698 mmol/l

L-Leucin

8.61 mmol/l

L-Glycin

5.99 mmol/l

L-Lysin

7.18 mmol/l

Prolin

3.91 mmol/l

L-Methionin

2.681 mmol/l

L-Serin

4.76 mmol/l

L-Phenylalanin

3.33 mmol/l

L-Taurin

0.799 mmol/l

L-Threonin

7.05 mmol/l

L-Tyrosin

0.552 mmol/l

L-Tryptophan

2.01 mmol/l

L-Valin

14.51 mmol/l

3.2 Peritoneale Zellkultur:

3.2.1  Präparation von humanem Omentum Majus und Gewinnung von humanen peritonealen Mesothelzellen (HPMC):

Humane peritoneale Mesothelzellen (HPMC) wurden, wie von Stylianou et al. [28] beschrieben, gewonnen: Etwa 10-20 cm3 große Anteile von OP-Präparaten des humanen Omentum Majus von Patienten, die sich einem elektiven abdominalchirurgischen Eingriff unterzogen, dienten als Ausgangsmaterial. Diese wurden dreimal in phosphatgepufferter Lösung (PBS, Biochrom, Berlin, Deutschland) gewaschen und in 15 ml Trypsin/EDTA-Lösung (0,05%/ 0,025%) für 20 Minuten bei 37°C unter ständiger Durchmischung inkubiert. Die resultierende Suspension wurde dann für 5 Minuten bei 4°C und 180*g zentrifugiert. Das verbleibende Gewebe und die Trypsin/EDTA-Lösung wurden zurückgewonnen und das Pellet zweimal in Zellkulturmedium, das zur Inhibition der Trypsinaktivität 10% FKS enthielt, gewaschen und jeweils bei 180*g und 4°C für 5 Minuten zentrifugiert. Die Tryspsin/EDTA-Andauung wurde noch einmal für 20 Minuten wiederholt. Das jeweils verbliebende und gewaschene Pellet wurde in 5 ml Zellkulturlösung mit 10% FKS resuspendiert und in 25 cm2 große Zellkulturflaschen überführt. Diese enzymatische Lösung der Zellen aus dem Omentum Majus erzeugte in den ersten 20 Minuten ein homogenes und in den zweiten 20 Minuten noch ein nahezu homogenes zum Teil aber bereits mit Fibroblasten vermischtes Mesothelzellbild. Die gewonnenen Mesothelzellen wurden für 24 Stunden in angefeuchteter Atmosphäre mit 5% CO2/95% Luft und bei 37°C in M199-Medium mit 10% FKS kultiviert. Dann erfolgte ein Mediumwechsel. Weitere Wechsel des Nährmediums erfolgten jeden dritten Tag, bis die Zellen konfluent gewachsen waren. Kontrolliert wurde das Wachstum der Zellen im Lichtmikroskop.

↓24

Das Medium M199 enthielt als Zusätze: Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml), L-Glutamin (2 mM), Insulin (0,5 μg/ml), Transferrin (0,5 μg/ml) und Hydrocortison (0,4 μg/ml).

3.2.2 Passagierung der konfluenten Zellen

Konfluente Zellen wurden nach Entfernung des Zellkulturmediums einmal mit PBS gewaschen und dann mit Trypsin/EDTA-Lösung (0,05%/0,025%) für 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Ablösung der Zellen vom Boden der Zellkulturflaschen wurde im Lichtmikroskop kontrolliert. Dann wurden die Zellen zur Inhibition der Trypsinaktivität zweimal in FKS-haltigem (10%) Zellkulturmedium gewaschen, nach Zentrifugation für 5 Minuten bei 4°C und 180*g im Pellet resuspendiert und im Verhältnis 1:2 bis 1:3 in neue Zellkulturflaschen überführt.

Für die Inkubationsexperimente mit humanen peritonealen Mesothelzellen (HPMC) wurden die Zellen nach Ablösung und zweimaliger Waschung in 24-Loch-Platten überführt. Nach konfluentem Wachstum der Zellen in den Platten wurden diese zweimal mit Zellkulturmedium ohne FKS gewaschen und für 48 Stunden in ein Ruhemedium überführt. Das Ruhemedium enthielt für die akuten Experimente 0.1%iges und für die chronischen Experimente 0.3%iges FKS. Frühere Experimente [29,28] haben gezeigt, dass unter diesen Kulturbedingungen HPMC für mehr als 72 Stunden überleben, aber nicht proliferieren. Für 0.3% FKS-haltiges Nährmedium, welches bei den chronischen Versuchen mit HPMC eingesetzt wurde, konnte ein nicht proliferatives Überleben der Zellen bis zu 36 Tagen gezeigt werden [62]. In Abbildung 3 erkennt man nach 36 Tagen eine deutliche Zunahme des Zellproteins der Zellen, die mit 10% FKS inkubiert wurden. Die dazugehörige Phasenkontrastmikroskopie zeigt HPMC, die sich nicht mehr als konfluenter Monolayer wie in der mittleren Abbildung darstellen, sondern sehr dichte Zellen, die teilweise bereits übereinander gewachsen sind. Ohne FKS nimmt die Zellproteinmenge bis zum Tag 36 kontinuierlich ab und in der Phasenkontrastmikroskopie sind nur noch vereinzelte vitale Zellen erkennbar. Nur die HPMC, die mit 0.3% FKS behandelt wurden, zeigen bis zum Tag 36 einen gleichmäßigen Zellproteingehalt und einen konfluenten Monolayer in der Phasenkontrastmikroskopie. Für alle Experimente dieser Arbeit wurde die gleiche Anzahl an Zellen pro Loch benutzt. Die korrespondierende Menge an Zellprotein war für HPMC: 2.1±1.0*103 Zellen/μg Zellprotein (Mittelwert ± Standardabweichung, n=16 Zelllinien).

↓25

Abbildung 3: Einfluss unterschiedlicher FKS-Konzentrationen auf die Morphologie und den Zellproteingehalt von HPMC nach bis zu 36 Tagen.

3.2.3 Charakterisierung von humanen peritonealen Mesothelzellen (HPMC):

Die morphologische Identifizierung der peritonealen Mesothelzellen (HPMC) erfolgte in der Phasenkontrast-Mikroskopie. Die Kulturen wurden bei jedem Procedere zuvor auf Wachstum und Kontamination mit Bakterien oder Pilzen lichtmikroskopisch durchgesehen. Die HPMC (Beispiele von normalen konfluenten HPMC siehe in der Mitte der Abbildung 3) wurden als polygonale und bei Konfluenz in pflastersteinähnlicher Anordnung wachsende Zellen identifiziert. Die weitere Charakterisierung der Zellen erfolgte - wie von Stylianou et al. [28] beschrieben - mittels indirekter Immunfluoreszenz. Die verwendeten primären monoklonalen Antikörper waren:

Antikörper

Verdünnung

anti-Zytokeratin-18

1:800

anti-Vimentin

1:200

anti-Faktor VIII

1:50

anti-Desmin

1:50

↓26

Die primären Antikörper bezogen wir von Dako Ltd., Bucks, United Kingdom. Der sekundäre Antikörper war ein Kaninchen-anti-Maus-FITC-Konjugat (Sigma, Deisenhofen) – dieser wurde in einer Verdünnung von 1:500 eingesetzt.

Zur Durchführung der indirekten Immunfluoreszenz wurden die Mesothelzellen in 8-Loch-Platten (Nunc, Wiesbaden) ausgesät, nach Erreichen der Konfluenz mit eiskaltem Methanol/Acetongemisch (1:1) für 10 Minuten fixiert und in PBS-Puffer mit 0.1% bovinem Serumalbumin gewaschen. Die Zellen wurden dann mit 50μl des jeweiligen primären Antikörpers verdünnt in PBS/BSA und in einer feuchten Kammer für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem Waschzyklus erfolgte anschließend die Inkubation mit dem sekundären Antikörper (50μl der Verdünnung des Antikörpers in PBS/BSA) in ebenfalls feuchter Atmosphäre für 60 Minuten bei Raumtemperatur. Jetzt erfolgte ein weiterer intensiver Waschzyklus, dem schließlich die Übertragung auf einen Objekträger (mittels Tris gepuffertem 10%Glycerol) und die Untersuchung unter UV-Licht folgte. HPMC sind positiv für Zytokeratin und Vimentin und negativ für Desmin und Faktor VIII.

3.2.4 Inkubationsexperimente mit Peritonealdialyselösungen (PDL)

Für alle Versuche wurden die zu testenden sauren PDL mittels NaOH auf einen pH-Wert um pH 7.4 eingestellt.

3.2.4.1  Glukose als osmotisches Agenz – alternativ sterilisierte Glukose-PDL im Vergleich mit Standard-Glukose-PDL – Präinkubationsexperimente für ein und vier Stunden

↓27

HPMC Monolayer wurden in 24-Loch-Kulturplatten bis zur Konfluenz kultiviert und anschließend durch Inkubation (48h) in Ruhemedium (0.1% FKS) in ein nicht-proliferierendes Stadium überführt. Nach zwei Waschzyklen mit Ruhemedium wurden die Zellen für ein und vier Stunden mit den zu testenden unverdünnten Peritonealdialyselösungen präinkubiert. Im Anschluss folgte der Austausch der PDL gegen das Kulturmedium und die Inkubation ohne und Inkubation mit Stimulation der Zellen mit 100 pg/ml IL-1β für 24 Stunden. Nach den 24 Stunden wurden für die unstimulierten Zellen ein Vitalitätsassay (MTT-Assay) durchgeführt. Der Überstand der stimulierten Zellen wurde in ein frisches Probengefäß pipetiert und bis zur IL-6-Analyse mittels ELISA bei –80°C aufbewahrt. Die Zellen selbst wurden mittels 0.1N NaOH-Lösung von dem Plastikmaterial gelöst und bis zur Proteinbestimmung bei -80°C eingefroren. Die Versuchsdurchführung erfolgte dabei gemäß Abbildung 4.

Abbildung 4: Versuchsanordnung für die Präinkubationsexperimente mit glukosehaltigen PDL.

3.2.4.2 Glukose als osmotisches Agenz – alternativ sterilisierte Glukose-PDL im Vergleich mit Standard-Glukose-PDL – Chronische Inkubation für bis zu zehn Tage

Konfluente, nicht proliferative HPMC (24-Loch-Platten) wurden für ein bis zehn Tage mit den zu testenden Peritoneldialyselösungen bei 37°C inkubiert. Die PDL wurden im Verhältnis 1:1 mit Zellkulturmedium gemischt, um die akute Toxizität der PDL zu mindern (pH-Wert zwischen 7.2 und 7.6 für alle PDL). Diese Mischung enthielt 0.3% FKS (Begründung siehe oben) und wurde alle zwei bis drei Tage und dabei immer 24 Stunden vor dem zu untersuchenden Tag erneuert. Die letzten 24 Stunden vor Pipetieren des Überstandes wurden die Zellen zur Hälfte mit 1000pg/ml rekombinant hergestelltem IL-1β stimuliert. Die andere Hälfte wurde ohne Stimulation inkubiert. Der Überstand der stimulierten Zellen wurde dann bei –80°C bis zur IL-6-Analyse mittels ELISA aufbewahrt. Dabei.wurden die Zellen mittels 0.1N NaOH-Lösung von dem Plastikmaterial gelöst und bis zur Proteinbestimmung bei -80°C eingefroren. Mit den unstimuliertem Zellen wurde 24 Stunden nach dem letzten Medium/PDL-Wechsel der MTT-Assay durchgeführt. Die untersuchten Tage waren: 1. Tag, 4. Tag, 7. Tag, und 10. Tag. Die Versuchsdurchführung erfolgte dabei gemäß Abbildung 5.

↓28

Abbildung 5: Versuchsanordnung für die chronischen Experimente mit glukosehaltigen PDL.

3.2.4.3 Alternative osmotische Agenzien im Vergleich mit Standard-Glukose-PDL – Präinkubationsexperimente für 1 und 4 Stunden

Die Versuche wurden analog zu E2.4.1 durchgeführt. Bei den verwendeten PDL handelte es sich allerdings neben konventionellen hitzesterilisierten Glukose-PDL um PDL mit den alternativen osmotischen Agenzien Icodextrin (Extraneal) und Aminosäuren-PDL (Aminobic). Die Versuchsanordnung ist in Abbildung 6 beschrieben.

Abbildung 6: Versuchsanordnung für die Präinkubationsexperimente mit glukosehaltigen versus alternativen PDL.

3.2.4.4 Alternative osmotische Agenzien im Vergleich mit Standard-Glukose-PDL – Chronische Inkubation für bis zu zehn Tage

↓29

Auch diese Versuche wurden analog zu der unter E2.4.2 beschriebenen chronischen Versuchsanordnung durchgeführt. Dabei wurden wiederum konventionelle hitzesterilisierte Glukose-PDL im Vergleich zu Extraneal und Aminobic verwendet. Die Versuchsanordnung ist in Abbildung 7 schematisiert.

Abbildung 7: Versuchsanordnung für die chronischen Experimente mit glukosehaltigen versus alternativen PDL.

3.3 Enzymimmunoassay (ELISA) für Interleukin-6

Interleukin-6 (IL-6) im Zellkulturüberstand von HPMC wurde mit Hilfe eines spezifischen Enzymimmunassays quantifiziert [84]: Der Enzymimmunoassay wurde auf Microtiterstreifen (Nunc, Wiesbaden, Deutschland) durchgeführt, die mit einem polyklonalen anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen (Dakopatts, Hamburg, Deutschland) beschichtet wurden. Im Anschluss erfolgte die Beschichtung mit einem monoklonalem anti-IL-6-Antikörper von der Maus (Serva, Heidelberg, Deutschland). An diesem bindet das IL-6 in den Proben und Standards spezifisch. Die Menge des gebundenen IL-6 in den Proben und in den Standards wurde durch folgende Inkubationssequenz nachgewiesen:

↓30

1. ein polyklonaler anti-IL-6-Antikörper (Ziege) gekoppelt an Biotin (R&D Systems, Minneapolis, Min., USA);

2. Meerrettich-Peroxidase-Streptavidin (Calbiochem, Frankfurt, Deutschland) und

3. Tetramethyl-benzidin Substratpuffer für die Farbentwicklung (Fluka, Buchs, Schweiz).

↓31

Der IL-6-Gehalt in den Proben wurde nach einer Standardkurve berechnet, für die wir einen rekombinanten menschlichen IL-6-Standard (Janssen Beerse, Belgien) in Konzentrationen von 20 bis 2000 pg/ml verwendeten. Die untere Nachweisgrenze von IL-6 in den Proben lag bei 20 pg/ml. Das Fehlen von Kreuzreaktivität mit TNFα, TNFβ, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3 oder IL-4 wurde mittels Zugabe dieser Zytokine zu leeren Proben in Konzentrationen über 50 ng/ml gezeigt. Rekombinante Zytokine wurden bezogen von British Biotechnology, Oxford, Großbritannien.

3.3.1  Herstellung des IL-6 Standards:

Für die Herstellung des IL-6-Standards wurde 10fach-PBS, die Stammlösung und der Assaypuffer benötigt und wie folgt angefertigt:

10fach PBS bestand aus 82.2 g/l Na2HPO4 (Merck, Darmstadt, Deutschland) und 17.5 g/l NaH2PO4 H2O (Merck, Darmstadt, Deutschland) und wurde mit NaOH auf pH7.4 eingestellt.

↓32

Für die Stammlösung wurden 1 ml der Originallösung des Antikörpers mit 1 ml Ethylenglycol gemischt (Merck, Darmstadt, Deutschland) (IL-6 Konzentration: 1*106 pg/ml).

Der Assaypuffer bestand aus 10 ml des 10fach PBS, 50ml NaCl 0.9% (Merck, Darmstadt, Deutschland), 5 ml Lammserum (Gibco, Berlin, Deutschland), 50 μl Tween 20 und wurde mittels Aqua bidest. auf 100 ml aufgefüllt.

Die einzelnen Standardwerte (2000 pg/ml, 200 pg/ml, 600 pg/ml, 60 pg/ml und 20 pg/ml) wurden dann durch entsprechende Verdünnung mit dem Assaypuffer erreicht.

3.3.2 Herstellung des polyklonalen Ziege-anti-human-IL-6-Antikörper gekoppelt an Biotin:

↓33

4 μl Biotin (5 mg in 1 ml Aqua bidest.) wurden in 100 μl anti-human IL-6 Antikörper gelöst und ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach ein bis zwei Tagen Lagerung bei 4°C erfolgte die Zugabe von 104 μl Ethylenglycol (1:50 verdünnt). Dieser gekoppelte Antikörper wurde bei -20°C gelagert und vor Gebrauch auf 1:500 in Tween 20 verdünnt.

3.3.3 Herstellung der TMB-Substratlösung:

Ein Teil der TMB(3,3`-5,5`-Tetramethylbenzidin)-Stammlösung (240 mg TMB [Fluka, Buchs, Schweiz] in 5 ml DMSO [Merck, Darmstadt, Deutschland] und 5 ml Ethanol) wurden unmittelbar vor Gebrauch mit 100 Teilen Gallati-Puffer gemischt. Dabei wurden für den Gallati-Puffer 8.4 g Zitronensäure [Merck, Darmstadt, Deutschland] in 160 ml Aqua bidest. gelöst und mit KOH [Merck, Darmstadt, Deutschland] auf einen pH von 3.95 eingestellt, dann mit Aqua bidest. auf 200 ml aufgefüllt und 68 μl 30% H2O2 (Aldrich) hinzugefügt.

3.3.4 Herstellung des Beschichtungspuffers

Zur Herstellung des Beschichtungspuffer wurden ein Teil 10fach PBS und neun Teile Aqua bidest. gemischt.

3.3.5 Praktische Durchführung des ELISA für IL-6

↓34

Die Mikrotiterstreifen wurden zunächst mit polyklonalem Kaninchen anti-Maus-IgG (je 100 μL) (Antikörper 1:250 in Beschichtungspuffer verdünnt) eine Stunde bei Raumtemparatur inkubiert. Danach wurden die einzelnen Löcher der Streifen je dreimal mit Waschpuffer (200 ml 10fach PBS + 1800 ml Aqua bidest. + 1 ml Tween 20) und einmal mit Aqua bidest. gewaschen. Dann wurden die Proben bzw. Standards mit je 50 μl in die Löcher pipetiert und nach Zugabe des monoklonalem Maus-anti-human-IL-6 Antikörper (1:200 in Assaypuffer) mit ebenfalls 50 μl pro Probe bzw. Standard unter gleichmäßiger Bewegung bei 30°C für zwei Stunden inkubiert. Im Anschluss erfolgte eine weitere Stunde Inkubation bei 30°C unter ebenfalls kontinuierlicher Bewegung mit je 50μl Ziege-anti-Mensch-IL-6-Antikörper pro Probe bzw. Standard, der schließlich die Inkubation mit je 100 μl Streptavidin-Peroxidase (1:400 Verdünnung der Stammlösung [2.5μl Avidin und 22.5μl Assaypuffer] mit Assaypuffer) pro Probe bzw. Standard für weitere 30 Minuten unter gleichen Bedingungen (Bewegung bei 30°C) folgte. Dann wurden die Platten wieder dreimal mit Waschpuffer gewaschen und im Anschluss restliche Flüssigkeit entfernt. Die Farbreaktion wurde durch 150 μl TMB pro Probe bzw. Standard initiiert und nach zehnminütiger Inkubation in Dunkelheit durch Zugabe von 50 μl 4N H2SO4 pro Probe bzw. Standard gestoppt. Jetzt konnte die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 630 nm gemessen und schließlich durch Berechnung der Standardkurve die IL-6 Konzentration ermittelt werden.

3.4 MTT-Assay

Der MTT-Assay wird normalerweise zur Messung der Zellproliferation verwendet. Da die metabolische Umwandlung des MTT-Salzes (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-Diphenyltetrazolinumbromid) durch aktive mitochondriale Dehydrogenase von lebenden Zellen vermittelt wird, kann der Test auch indirekt für die Beurteilung der Zellvitalität verwendet werden [85]. Nach Exposition der HPMC mit den zu testenden PDL wurden die Zellen mit MTT in einer Konzentration von 1.25 mg/ml in Kulturmedium für vier Stunden bei 37°C inkubiert. Das sich bildende Formazanprodukt wurde nach vier Stunden durch Hinzufügung von Lysepuffer, der aus 10% Sodiumdodecylsulfat und 50% N,N-Dimethylformamid besteht, gelöst. Die Absorption der Farbumwandlung wurde dann nach Inkubation in lichtgeschützer Umgebung über Nacht im Spektralphotometer bei 595 nm mit einer Referenzwellenlänge von 690 nm gemessen.

3.4.1  Herstellung der MTT-Lösung

5 mg MTT der Firma Sigma wurden in 100 ml PBS gelöst (5 mg/ml) und dann sterilfiltriert. Diese Lösung wurde lichtgeschützt bei 4°C aufbewahrt.

3.4.2 Herstellung des Lysepuffers

↓35

Der Lysepuffer bestand aus 20 g SDS, 50 ml N-N-Dimethylformamid und 50 ml Aqua bidest. und wurde mittels eines Säuregemisches (80 ml Azetonsäureglucial, 2.5ml 1N HCl und 17.5ml Aqua bidest.) auf einen pH-Wert von 4.7 eingestellt.

3.5 Proteinbestimmung

Mittels Erstellung einer Verdünnungsreihe aus dem Proteinstandard des bovinen Serum Albumin (Biorad, Richmond, USA) wurde eine Standardkurve erstellt. Diese diente als Vergleich zu den zu messenden Proben, dessen optische Dichte nach Zusatz einer unverdünnten Farbreagenz (Biorad, Richmond, USA) im Spektralphotometer bei 595 nm Wellenlänge gemessen wurden.

3.6 Statistische Analysen

Die statistische Auswertung sämtlicher Daten erfolgte mit Hilfe von GraphPad Prism 3.03 der FirmaGraphPad Software auf einer Pentium-Workstation der Firma Lifetech. Es wurden nicht-parametrische ANOVA-Modelle (Friedman-Test mit Dunns Posttest) eingesetzt. Ein zweiseitiger p-Wert von <0.05 wurde als statistisches Signifikanzniveau angesehen. Ein * (Stern) in den Abbildungen 8 bis 20 kennzeichnet einen signifikanten (p<0.05) Unterschied im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle.


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11.12.2006