Diskussion

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Die Peritonealdialyse gehört zu den etabilierten und im Vergleich zur Hämodialyse - unter Beachtung der Indikationen und Kontraindikationen - gleichwertigen Nierenersatzverfahren. Für den erfolgreichen Einsatz der Peritonealdialyse ist die Erhaltung der funktionellen Integrität der Peritonealmembran der entscheidende Faktor. Neben seinen reinen Transporteigenschaften beinhaltet die Rolle des Peritoneums ebenfalls vielschichtige weitere Funktionen wie etwa bei der peritonealen Infektabwehr sowie bei Synthese und Remodelling der extrazellulären Matrix. Bei der Peritonealdialyse ist das Peritoneum jedoch dauerhaft einer unphysiologischen Umgebung ausgesetzt, welche in erster Linie durch die instillierten Peritonealdialyselösungen (PDL) definiert ist. In diesem Kontext wurden durch die verschiedensten Arbeitsgruppen zunächst die Akuteffekte von Azidität und Hyperosmolalität der PDL auf die intraperitoneale Homöostase untersucht und ihre Bioinkompatibilität durch eine Vielzahl experimenteller Untersuchungen u.a. unserer Arbeitsgruppe belegt. In jüngerer Zeit rücken darüber hinaus mögliche Langzeiteffekte der PDL auf die Morphologie und Funktion der Peritonealmembran in den Blickpunkt. Insbesondere die dauerhafte Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von Glukose und Glukosedegradationsprodukten (GDP), die während der Hitzesterilisation enstehen, werden zunehmend mit chronischen Veränderungen des Peritoneum in Verbindung gebracht, dies sowohl bezogen auf direkte toxische Effekte, aber auch basierend auf indirekte Schädigungsmechanismen wie etwa der Bildung und Akkumulation von AGE (advanced glycation end products) in der Peritonealmembran.

5.1  Ergebnisdiskussion

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Es folgt die Diskussion der Ergebnisse dieser Studie mit denen anderer Arbeitsgruppen. Diese ist untergliedert in den Vergleich von herkömmlichen mit alternativen glukosehaltigen PDL und den Vergleich herkömmlicher PDL mit PDL mit alternativen osmotischen Agenzien (aminosäurenhaltige und icodextrinhaltige PDL) jeweils in ihren akuten und chronischen Effekten.

5.1.1  Glukose als osmotisches Agenz

In vitro akut nachweisbare Effekte auf die Integrität der residenten peritonealen Zellen üben die bekannten Faktoren, wie das osmotisches Agenz (Glukose, Aminosäuren, Icodextrin), der pH-Wert in Verbindung mit der verwendeten Puffersubstanz (Laktat, Bikarbonat oder Pyruvat) und die Osmolalität aus. Die durch den pH-Wert verursachte akute Toxizität wurde durch Einstellung des pH-Wertes aller verwendeten Peritonealdialyselösungen auf einen pH um 7.4 reduziert, um die PDL bezüglich anderer toxischer Bestandteile bzw. Eigenschaften besser miteinander vergleichen zu können.

5.1.1.1  Akute Effekte von glukosehaltigen Peritonealdialyselösungen:

Glukose ist als osmotisches Agenz in Peritonealdialyselösungen bislang nicht ersetzbar. Zwar gibt es alternative osmotisches Agenzien, deren Vor- und Nachteile im weiteren noch diskutiert werden, doch sind diese Alternativen aus den schon in der Einleitung erwähnten Gründen nur für einen Beutelwechsel am Tag zu verwenden. Da der Ersatz dieses im Prinzip sehr sicheren und effektiven osmotischen Agenz nicht absehbar ist, wurden Strategien entwickelt, um die Toxizität der fertigen PDL zu mindern. Im Gegensatz zu den herkömmlichen Lösungen, die aufgrund ihrer Produktion und Sterilisation einen niedrigen pH-Wert und hohe GDP-Konzentrationen enthalten, sind die neueren Lösungen aufgrund der Verwendung von zwei getrennten Kammern in einem Beutel (während der Sterilisation, siehe Einleitung) bei Verwendung pH-neutral und enthalten sehr wenige GDP. Filtersterilisierte Glukoselösungen enthalten nahezu keine GDP (eine geringe Konzentration lässt sich durch die spontane Degradierung von Glukose in wässriger Lösung nicht vermeiden), daher müssten sie bezüglich der Zellvitalität und –synthesefunktion bessere Ergebnisse bieten als eine identisch zusammengesetzte hitzesterilisierte PDL. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass bereits während einer einstündigen Präinkubation mit diesen beiden unverdünnten PDL ein besseres Überleben der Zellen mit den filtersterilisierten Lösungen ermöglicht wird. Nach vierstündiger Präinkubation wird dieser Vitälitätsunterschied signifikant im Vergleich zur Kontrolle. Allerdings findet sich nach dieser Zeit auch ein signifkanter Unterschied der filtersteriliserten Lösung mit hohem Glukoseanteil (4.5%) im Vergleich zur Kontrolle. Dies liegt ursächlich vermutlich an der hohen Osmolalität der Lösungen mit hohem Glukoseanteil. Die Zellsynthesefunktion wurde überprüft, indem die Zellen auf die Fähigkeit untersucht wurden, auf einen inflammatorischen Reiz, in diesem Fall IL-1β, mit der Produktion von IL-6 zu reagieren. Wir fanden hier ähnliche Ergebnisse wie für die Zellvitalität: Die filtersteriliserten PDL konnten die Zellsynthesefunktion tendenziell besser erhalten als die hitzesterilisierten PDL. Bereits nach einer Stunde konnte ein signifikanter Unterschied für die hitzersterilisierte PDL mit hohem Glukoseanteil im Vergleich zur Kontrolle gefunden werden. Allerdings war die Zellsynthesefunktion nach vierstündiger Inkubation sowohl mit den hitze- als auch filtersterilisierten PDL mit niedrigem und hohem Glukoseanteil im Vergleich zur Kontrolle signifikant gemindert. Nicht komplett geklärt werden konnte, warum sich die alternativ sterilisierten PDL (Balance), die sich in ihren Eigenschaften, nämlich den sehr geringen Anteil an GDP, von den filtersterilisierten Lösungen nicht wesentlich unterscheiden, zu nahezu keiner Minderung der Vitalität und Funktion der mit ihnen inkubierten Zellen führten. Auch nach vierstündiger Inkubation mit diesen PDL - selbst mit hohem Glukoseanteil - wurde die Vitalität und Funktion der Zellen kaum gemindert, dies im Kontrast zu den filtersterilisierten Lösungen. Eine Vermutung ist, dass der pH-Wert der kommerziell hergestellten alternativen PDL aufgrund eines ausgeglicheneren Puffersystems stabiler als bei den selbsthergestellten Lösungen war. Der pH-Wert der selbsthergestellten Lösungen wurde zwar vor jedem Versuch nachgemessen und nachjustiert, doch fiel hier bereits auf, dass sich der pH-Wert stärker unter gleichen Lagerungsbedingungen änderte, als bei den alternativen kommerziell erwerblichen Lösungen. Um die prolongierte Wirkung von PDL, die insbesondere durch die Glukosedegradationsprodukte verursacht wird, zu untersuchen, wurde das chronische Inkubationsmodell entwickelt. Dieses ermöglicht aufgrund der repetitiven Anwendung der PDL unter gleichzeitiger Reduktion der Osmolalität und besseren pH-Wert-Kontrolle durch Mischung mit Zellkulturmedium eine isoliertere Betrachtung der Wirkung der GDP. Die weitere Diskussion der glukosehaltigen Lösungen erfolgt im nächsten Abschnitt unter dem Gesichtspunkt der chronisch repetitiven Anwendung.

5.1.1.2 Chronische Effekte von glukosehaltigen Peritonealdialyselösungen

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Wie bereits erwähnt hat die Betrachtung der akuten Effekte der unverdünnten PDL einige Nachteile. So spielte sowohl die Osmolalität als auch die exakte pH-Wert-Einstellung eine zu große Bedeutung. Aus diesem Grund wurden in einem nächsten Schritt die chronischen Auswirkungen verschiedener PDL auf HPMC untersucht. Dabei kommt die in dieser Arbeit gewählte Versuchsanordnung dem Geschehen in vivo wesentlich näher: Dort ist die Peritonealmembran den verwendeten PDL über große Zeiträume (in der Regel viele Jahre) repetitiv ausgesetzt. Die Grundvoraussetzungen für biokompatiblere PDL sind, wie bereits mehrfach beschrieben, ein physiologischer pH-Wert und eine Osmolalität, die nicht zu hoch sein darf. Weniger wusste man bislang über die Wirkung von Glukosedegradationsprodukten, die bei der Hitzesterilisation von glukosehaltigen PDL entstehen, auf die Integrität der Peritonealmembran. Glukosedegradationsprodukte sind vermutlich für einen großen Anteil der negativen Eigenschaften der PDL verantwortlich: Bereits früh machten Wieslander et al. [86] auf die mögliche Bedeutung von GDP für die Stärke des Einlaufschmerzes beim Patienten, die Häufigkeit von Peritonitiden durch negative Beeinflussung der Infektabwehr und den Verlust der Ultrafiltrationseigenschaften des Peritoneums entweder durch direkte toxische Wirkung auf die Peritonealzellen und/oder durch die Bildung von erweiterten glykosilierten Proteinen (advanced glycation end products – AGE) aufmerksam. So konnten Lamb et al. [87] die Bildung dieser „advanced glycation end products“ in Peritonealdialyselösungen nachweisen: Sowohl Patientendialysate, als auch frische PDL, denen jeweils Albumin zugesetzt wurde, glykosilierten dieses in Abhängigkeit von der Zeit. Nach dreiwöchiger Inkubation unterschieden sich die PDL in ihrer Glykosilierungswirkung (in Abhängigkeit von der Glukosekonzentration) nicht von gepufferten Phosphatlösungen, die als Kontrollen eingesetzt wurden und denen gleiche Mengen an Albumin und Glukose zugesetzt waren, so dass Lamb et al. davon ausgingen, dass die PDL keine anderen Promotoren oder Inhibitoren dieser frühen Glykosilierungsreaktionen (Maillard-Reaktion) als Glukose und dessen Degradationsprodukte enthielten. Auch die möglicherweise relevanteren späten Glykosilierungsreaktionen, die für die Entwicklung von peritonealen Pathologien verantwortlich sein dürften, fanden nach mehrwöchiger Inkubation in vitro statt [87]. Dabei sind diese Reaktionen, d.h. die AGE-Bildung, in Patientendialysaten weder von der Glukosekonzentration noch von der prozentualen Glykosilierung des Albumin abhängig, obwohl diese Beziehung für die frühen Reaktionen gefunden werden konnte. Lamb et al. vermuteten, dass andere, auch inhibitorische Faktoren für die AGE-Bildung in den Dialysaten verantwortlich sind. Zeier et al. [88] konnten wiederum zeigen, dass GDP vom Dialysat vermutlich in den systemischen Kreislauf aufgenommen werden. Das GDP Methylglyoxal war bereits nach zwei Stunden intraperitonealer Verweildauer im Dialysat nicht mehr nachweisbar. Sie konnten weiter nachweisen, dass sowohl Vorstufen der AGE-Bildung (Amadori-Produkte) als auch AGE vermehrt im systemischen Kreislauf der Patienten gefunden werden konnten, die mit konventionellen im Vergleich zu GDP-armen PDL behandelt worden waren.

Betrachtet man die Vorstufen dieser AGE, die Glukosedegradationsprodukte, so ist inzwischen bekannt, dass diese in den Konzentrationen, wie sie in den kommerziell erhältlichen PDL vorhanden sind, eine nur geringe akut toxische Wirkung auf die Zellen haben [61]. Witowski et al. verwendeten einen GDP-Mix, der nur in sehr hohen Konzentrationen einen akut toxischen Effekt auf die Zellen hatte. Allerdings fehlte in diesem Mix das erst kürzlich entdeckte 3,4-DGE, welches vermutlich den stärksten toxischen Effekt auf die Peritonealzellen hat [59,89]. Aufgrund der trotz allem geringen akut toxischen Wirkungen von GDP war die Entwicklung eines Zellkulturmodels erforderlich, das Rückschlüsse über die chronischen Effekte von PDL und deren unterschiedlich hohen GDP-Konzentrationen zu lässt. So wurden in dieser Arbeit im Labor hergestellte laktatgepufferte Glukose-PDL, die entweder hitze- oder filtersterilisiert wurden, sowohl miteinander als auch mit alternativ sterilisierten kommerziellen laktatgepufferten Glukose-PDL ( Balance) verglichen.

Bereits 1991 veröffentlichten Wieslander et al. [49] Untersuchungen bezüglich der Wirkung von Glukosedegradationsprodukten an der Fibroblastenlinie L-929 (siehe Einleitung). Dabei kamen sie zu dem Schluss, dass der Prozess der Sterilisation einen Einfluss auf die Toxizität von Peritonealdialyselösungen haben muss. Seither sind eine Vielzahl von Untersuchungen veröffentlicht, die sich mit der Bildung von Glukosedegradationsprodukten und ihrer Wirkung auf die verschiedenen peritonealen Zellsysteme beschäftigen. Mit zunehmender Erkenntnis über die Bedeutung von GDP beschäftigten sich viele Autoren zwangsläufig auch mit der Frage nach der Vermeidung dieser bei der Hitzesterilisation von Glukose-PDL entstehenden Degradationsprodukten. So konnte die Gruppe um Wieslander [90] zeigen, dass PDL (pH 6.3 bis 6.4), die zum Zwecke der Reduzierung von GDP in zweikammrigen Beuteln sterilisiert wurden, im Vergleich zu ansonsten nahezu identischen herkömmlichen Glukose-PDL (pH 5.3-5.4) in einkammrigen Beuteln, sowohl eine geringere Zytotoxizität als auch besser erhaltene Funktion im Sinne der höheren stimulierten Ausschüttung von IL-1β durch humane mononukleäre Zellen in vitro aufwiesen. Dabei waren nachweislich weniger GDP in der Zweikammer-PDL enthalten. Das gleiche Prinzip liegt den von uns getesteten alternativ sterilisierten PDL (Balance, Fresenius) zugrunde, die wir in ihrer Wirkung auf humane peritoneale Mesothelzellen im Vergleich mit hitze- und filtersterilisierten PDL einsetzten. Das Prinzip der Zweikammerbeutel beruht wie bereits in der Einleitung ausführlich erläutert darauf, dass man Glukose und Elektrolyte vom verwendeten Puffer (Laktat und/oder Bikarbonat) getrennt hitzesterilisiert. Dabei wird die Entstehung von GDP nachweislich (siehe Tabelle 5, Referenz [91]) dadurch reduziert, dass die Glukose und Elektrolyte bei einem niedrigem pH-Wert von 2.8-3.1 vom Puffer getrennt hitzesterilisiert werden kann. In der zweiten Kammer wird der Puffer Laktat bei einem pH-Wert zwischen 8.0 und 8.6 sterilisiert. Nach Mischung der beiden Kammern kurz vor Anwendung durch den Patienten, weist die endgültige Lösung einen nahezu neutralen pH zwischen 6.8 und 7.4 auf. Gleichzeitig verhindert man auch die Bildung von Degradationsprodukten, die während längerer Lagerzeit der (auch filtersterilisierten) PDL entstehen würden.

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Tabelle 5: Vergleich des Inhaltes einiger GDP in Balance low/high versus CAPD2/3

PDL:

3-Deoxyglucoson (μmol/l)

Methylglyoxal (μmol/l)

Acetataldehyd (μmol/l)

Formaldehyd (μmol/l)

CAPD2

172

6

152

7

Balance low

42

<1*

<2*

<3*

CAPD3

324

10

182

13

Balance high

60

<1*

<2*

<3*

* kennzeichnet untere Nachweisgrenze in der HPLC [91]

Nach sieben Tagen für die 1.5%- und nach bereits vier Tagen für die 4.25%-Glukose-PDL konnten wir nach „chronischer“ Inkubation der HPMC eine signifikante Minderung der Vitalität der Zellen, die mit den hitzesterilisierten PDL behandelt wurden, feststellen. Hingegen verursachte weder die filtersterilisierte noch die alternativ sterilisierte PDL einen signifikanten Unterschied im Vergleich zur Kontrolle. Ein ähnliches Ergebnis fanden wir für die Synthesefunktion der Zellen ausgedrückt durch die IL-1β-stimulierte IL-6-Freisetzung: Hier wurde die Synthesefunktion der Zellen für die hitzesterilisierte 1.5%-Glukose PDL ab Tag zehn und für die hitzesterilisierte 4.25%-Glukose PDL bereits ab Tag vier im Vergleich zur Kontrolle signifikant gemindert. Hingegen blieb die Funktion der Zellen bis Tag zehn für die filtersterilisierten und kommerziellen Zweikammerlösungen voll erhalten.

Auch für eine mischgepufferte Bikarbonat/Laktat-PDL (G3.86%, pH 7.3), die in einem Zweikammerbeutel sterilisiert wurde, konnte gezeigt werden (Cooker et al. [92]), dass sie weniger GDP enthält und das Zellwachstum von L929-Fibroblasten weniger stark beeinträchtigt als laktatgepufferte Glukose-PDL (G3.86%, pH 5.2 ⇒ vor Versuch angeglichen auf neutrale Werte) ähnlichen Inhaltes in einkammrigen Beuteln. Durch Cooker et al. konnten keine signifikanten Unterschiede im Zellwachstum der L929-Fibroblasten zwischen hitzesterilisierten G1.36% bzw. G2.27% und ihren filtersterilisierten Pendant beobachtet werden.

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Neben der Sterilisierung von Glukose (in einer separaten Kammer) mit niedrigem pH gelingt die Reduzierung von GDP auch durch Verkürzung der Sterilisationsdauer unter Erhöhung der Temperatur. Kjellstrand et al. [44] konnten zeigen, dass durch Erhöhung der Sterilisationstemperatur unter gleichzeitiger Senkung der Dauer des Sterilisationsprozesses das Zellwachstum von L929-Fibroblasten nach Behandlung mit solch einer Lösung weniger stark supprimiert wurde.

Im Tierexperiment der Ratte über zehn Wochen Dauer verusachte eine laktatgepufferte und hitzesterilisierte Glukose-PDL (pH 5.2, Glukose 3.86%) im Vergleich zu der gleichen aber filtersterilisierten PDL eine zusätzliche Induktion von milchspritzerähnlichen Veränderungen am Omentum sowie einen starken Mesothelzellschaden [93].

Die klinische Relevanz der Reduzierung der GDP in Peritonealdialyselösungen kommt in Ansätzen in einer kürzlich veröffentlichten Studie von Rippe et al. [94] zum Ausdruck. Rippe und Mitarbeiter setzten über einen Zeitraum von zwei Jahren bei 80 CAPD-Patienten entweder herkömmliche Glukose-PDL (1.5%, 4.25%) in Einkammerbeuteln (pH 5.3 - 5.43) oder Glukose-PDL (1.5%, 4.25%) in Zweikammerbeuteln (pH 6.26 – 6.43) mit nachweislich reduzierten GDP ein. Dabei konnten sie keinen Nachteil der neuen Lösungen bezüglich des peritonealen Flüssigkeits- oder Stofftransportes im Vergleich zu den herkömmlichen PDL finden. Im Gegensatz zu den herkömmlichen PDL konnte in den Dialysaten der Patienten, die mit den neuen Lösungen behandelt wurden, bereits nach einem Monat verbesserte Biokompatibilitätsparameter bzw. ein geringerer mesothelialer und interstitieller Schaden (CA125, Hyaluronon, Procollagen-1-C-terminales-Peptid, Procollagen-3-N-terminales-Peptid) gefunden werden. Für den Biokompatibilitätsvorteil der neuen Lösung sind sowohl erhöhter pH, als auch reduzierte GDP verantwortlich (der in den Lösungen enthaltende Puffer wurde nicht angegeben). In einer weiteren Studie von Jonasson et al. [95] wurden insgesamt 22 Patienten entweder mit einer GDP-armen PDL mit nahezu neutralem pH-Wert (n=10, Gambrosol Trio, Gambro) behandelt oder mit einer konventionellen PDL mit hohem GDP-Gehalt und niedrigem pH-Wert (n=12, konventionelle PDL, Gambro). Das Effluat wurde nach einem nächtlichen Wechsel gesammelt und die darin enthaltenden Leukozyten auf ihre Morphologie und Chemilumineszensfähigkeit untersucht: Dabei enthielten die Leukozyten der Patienten, die mit der GDP-armen PDL behandelt wurden, einen signifikant höheren Makrophagenanteil und hatten eine tendenziell bessere Chemilumineszensaktivität nach Stimulation mit opsonisiertem Zymosan. Desweiteren kam es in der konventionellen Gruppe zu signifikant erhöhter Nekrose der Leukozyten.

5.1.2 Akute und chronische Effekte von aminosäurenhaltigen Peritonealdialyselösungen:

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Die bikarbonatgepufferete aminosäurenhaltige Lösung Aminobic ist wie bereits erläutert (siehe Einleitung) aus nutritiven Erwägungen entwickelt worden. Sie ist in Kombination mit dem Puffer Bikarbonat pH-neutral und hat eine nur mäßig hohe Osmolalität (369 mOsm/kg).

Wir konnten zeigen, dass die aminosäurenhaltige Lösung weder die Vitalität noch die Funktion von HPMC beeinflusst. Dies gilt sowohl für kurze Präinkubationszeiten von ein und vier Stunden (Abb.17-18), als auch für die repititve Anwendung über einen Zeitraum von bis zu zehn Tagen (Abb.19-20).

Für periphere monunukleäre Leukozyten (PBMC) konnten Jörres et al. [20] keinen Unterschied bezüglich der Zytokin-mRNA-Expression und Synthesefunktion bis zu zwei Stunden Inkubationsdauer mit der aminosäurenhaltigen PDL (Aminobic) im Vergleich zum Kontrollmedium finden. Somit scheint der relativ hohe Anteil an Aminosäuren in Aminobic keinen intrinsischen Effekt auf die Zytokinproduktion der genannten Zellen zu besitzen.

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Im Vergleich zu laktatgepufferten Standardglukoselösungen (pH5.2, Glucose: 1,36%, 2,27%, 3,86%) fanden Brulez et al. [96] eine verbesserte (in vitro) Phagozytoseaktivität gegen Bakterien (Staphylococcus) und eine erhöhte Vitalität von Spendergranulozyten (PMN), nachdem diese für 30 Minuten mit einer 1.1% Aminosäuren-PDL (pH 6.7, laktatgepuffert) behandelt wurden im Vergleich zu den Zellen, die mit den laktatgepufferten Glukose-PDL inkubiert wurden. Allerdings waren die Unterschiede in der Phagozytoseaktivität der Zellen nach Angleichung des pH-Wertes aller PDL auf 7.3 zum größten Teil nicht mehr signifikant. Dies unterstreicht noch einmal die Bedeutung des pH-Wertes für die Biokompatibilität.

Weiter fanden Brulez et al. eine signifikant schlechtere Antwort der PMN (Peritonealmakrophagen) in Aminosäuren-PDL (angeglichen auf pH-Wert 7.3) im Chemilumineszenstest (Aussage über metabolisch-oxidative-Antwort von Peritonealmakrophagen) als die PMN in 1.36% Glukose-PDL (ebenfalls angeglichen auf pH-Wert 7.3). Sie vermuteten einen negativen Effekt von einer oder mehrerer Aminosäuren und/oder einen negativen Einfluss der leicht höheren Osmolalität der Aminosäuren-PDL (365 vs. 347 mOsmol/L der 1.36% Glukose-PDL). Im Hinblick auf die Synthesefunktion (IL-6-Produktion) konnte bei den in dieser Arbeit beschriebenen Versuchen im Gegensatz zu denen von Brulez et al. durchgeführten Experimenten ein Biokombatibilitätsvorteil der Aminosäurenlösung gefunden werden. Da die Osmolalitäten sich ähnlich verhielten (siehe Tabelle 4), erklärt vermutlich die andere Zusammensetzung der von ihm verwendeteten Aminosäurenlösung den Effekt im Chemilumineszenstest.

Die gleichen Autoren konnten später [97] in einer Studie mit peritonealen Makrophagen von zehn CAPD-Patienten signifikant bessere Phagozytosekapazitäten der Zellen nachweisen, die mit der 1.1% Aminosäurenlösung im Vergleich zu denjenigen Makrophagen, die mit 2.27% glukosebasierter PDL behandelt worden waren. Weiterhin wurde eine nach LPS-Stimulation signifkant höhere IL-1β- und IL-8-Produktion der peritonealen Makrophagen gefunden, die mit 2.27% glukosebasierter-PDL im Vergleich zu den Zellen die mit 1.1% Aminoäurelösung behandelt worden waren. Die Autoren vermuteten als Ursache der erhöhten Interleukinproduktion eine stärkere intraabdominelle Aktivierung der Makrophagen, die mit Glukose-PDL in Kontakt kamen, das möglicherweise das stärkere chemisch inflammatorische Agenz als Aminosäuren-PDL war.

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Plum et al. (9) verglichen die in vivo und in vitro Effekte von bikarbonatgepepufferter Aminosäurenlösung und Glukoselösung mit denen einer herkömmlichen 1.5% laktatgepufferten Glukoselösung. So konnten sie an mononukleären Leukozyten in vitro eine weniger starke Supprimierung der Interleukinausschüttung IL-6 und IL-1β nach LPS-Stimulation bei den neutralen (pH7.4) und bikarbonatgepufferten PDL im Vergleich zu der herkömmlichen laktatgepufferten Glukoselösung finden. Dabei waren bei Patienten in vivo keine Unterschiede bezüglich der Ultrafiltrationsraten zwischen den drei PDL feststellbar. Gleiches fanden Plum et al. auch für die Harnstoff- und Kreatininclearance.

Jörres et al. [20] verglichen eine aminosäurenhaltige PDL mit herkömmlichen glukosehaltigen PDL, die entweder laktat- oder bikarbonatgepuffert waren, in ihrer Wirkung auf periphere mononukleäre Leukozyten (PBMC) als Vorstufe der Peritonealmakrophagen. Nach 10, 20 oder 30 Minuten Präinkubation mit der jeweiligen PDL folgte eine zweistündige LPS-Stimulation der Zellen in dem Zellkulturmedium RPMI. Dann wurde im ELISA TNFα und IL-6 gemessen. Es konnte bis 30 Minuten Präinkubation im Vergleich zur Kontrolle (RPMI-Medium) keine signifikante Minderung der TNFα-Ausschüttung der Zellen gefunden werden, die mit Aminobic oder der bikarbonatgepufferten Glukoselösung (1.5% Glukose, pH7.4) inkubiert wurden. Aber bereits ab 10 Minuten Präinkubation mit CAPD2 (pH5.5) oder ab 20 Minuten für die hochprozentige bikarbonatgepufferte Lösung (4.25% Glukose, pH7.4) war die TNFα-Ausschüttung im Vergleich zur Kontrolle signifikant gemindert. IL-6 war für die mit Aminobic präinkubierten Zellen erst ab 30 Minuten signifikant zur Kontrolle gemindert. Im Gegenteil dazu war IL-6 für die Präinkubation mit CAPD2 und der bikarbonatgepufferten G4.25%-Lösung bereits ab 10 Minuten und für die bikarbonatgepufferte G1.5%-Lösung ab 20 Minuten gemindert. Aus den Ergebnissen dieser Studie lässt sich auf eine bessere Biokompatibilität von aminosäurenhaltigen PDL (hier Aminobic) im Vergleich zu glukosehaltigen laktat- oder bikarbonatgepufferten PDL schließen. Dabei hat natürlich neben den unterschiedlich hohen pH-Wert und GDP-Gehalt der getesteten laktat- und bikarbonatgepufferten Glukose-PDL auch die deutlich höhere Osmolalität von 4.25% Glukose enthaltender bikarbonatgepufferter PDL einen negativen Effekt auf die PBMC. Da in vivo der Ausgleich der Hyperosmolalität länger als der pH-Ausgleich dauert, scheint die Hyperosmolalität und natürlich die in den laktatgepufferten konventionellen CAPD2/3-Lösungen vermehrt enthaltenden GDP eine größere Rolle zu spielen.

Erste in-vivo-Experimente mit einer 1.1%igen laktatgepufferten Aminosäurenlösung (Baxter) im Vergleich zu herkömmlichen glukosehaltigen PDL (1.36% und 3.86% Glukose, Baxter) und ihrer Wirkung auf histologische Veränderungen beim Kaninchen wurden von Garosi et al. [98] durchgeführt. Die Kaninchen wurden für 60 Tage täglich mit je zwei Wechseln von je 30 ml/kg Körpergewicht der jeweiligen PDL behandelt. Dann wurde das Peritoneum in vivo fixiert, histologisch aufgearbeitet und licht- und elektronenmikrospisch untersucht. Kriterien der Untersuchung waren: mesothelialer Schaden, submesotheliales Ödem, submesotheliale Zellinfiltration, submesotheliale Fibrose und vaskuläre Veränderungen. Im Vergleich zu den histologischen Präparaten der Kontrollkaninchen konnte bei den mit der Aminosäurenlösung behandelten Tieren kein mesothelialer Schaden (flaches kontinuierliches Mesothel) nachgewiesen werden. Hingegen wiesen die Tiere, die mit 1.36% bzw. 3.86% Glukose-PDL behandelt wurden, mittlere (kubisches, aber kontinuierliches Mesothel) bzw. schwere (kubisches und diskontinuierliches Mesothel) Schäden auf. Das Auftreten von submesothelialem Ödem zeigte eine zunehmende Tendenz von der Aminosäuren-PDL über die 1.36% Glukose-PDL bis zur 3.86% Glukose-PDL. Die submesotheliale Zellinfiltration war in allen Gruppen gleich und submesotheliale Fibrose oder vaskuläre Veränderungen wurden nicht beobachtet. Die einzige bedeutende Veränderung in der Aminosäuren-PDL-Gruppe war ein Verlust an Mikrovilli in der elektronenmikroskopischen Darstellung. Zusammenfassend konnte (erstmals) gezeigt werden, dass die mangelnde Biokompatibilität der glukosehaltigen laktatgepufferten Glukose-PDL (pH5.0-5.5) ein histologisches Korrelat in vivo zeigten und histologische Veränderungen durch die Aminosäurenlösung im Vergleich zu Kontrollen in vivo nicht nachweisbar waren.

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In einer kürzlich von Chan et al. veröffentlichten Arbeit [99] wurden die verschiedenen Effekte von Patientendialysat nach vierstündiger Verweildauer untersucht. Die Patienten wurden dabei mit einer 1.1%igen aminsosäurehaltigen PDL (Nutrineal, Baxter, Illinois) im Vergleich zu einer 1.5%igen glukosehaltigen PDL (Dianeal, Baxter, Illinois) behandelt. Das Dialysat wurde in seiner Wirkung auf die Ultrastruktur und Funktion von Mestothelzellen untersucht. Die Inkubation der Zellen mit dem Dialysat der Patienten, die mit der glukosehaltigen PDL behandelt wurden, führte zur signifikant reduzierten Zellproliferation, Proteinsynthese, IL-6-Ausschüttung, Zellhaftung und Vitalität (LDH-Ausschüttung erhöht). Außerdem erhöhte dieses Dialysat die Zeit bis zur Verdopplung der Zellzahl während einer 24-stündigen Erholungszeit. Im Gegensatz dazu führte die Inkubation der Zellen mit dem Dialysat der Patienten, welche die aminosäurenhaltige Lösung für den Wechsel benutzten, zu einer weniger stark reduzierten Zellproliferation, einer höheren IL-6-Ausschüttung (höher als Kontrolle) und einer im Vergleich zur Kontrolle unveränderten Zellhaftung, Vitalität (LDH-Ausschüttung), Proteinsynthese und Zellverdopplungszeit. Bei der Betrachtung der Ultrastruktur der mit den unterschiedlichen Dialysaten behandelten Zellen wurde eine Zellabflachung, eine erhöhte Zelloberfläche, eine reduzierte Anzahl an Mikrovilli und intrazellulären Organellen, die vermutlich in der Funktion gestörte Mitochondrien darstellen, für die mit dem Glukosedialysat behandelten Zellen gefunden. Im Gegensatz dazu war die Ultrastruktur der Zellen, die mit dem Aminosäurendialysat behandelt wurden, nahezu intakt im Vergleich zu den Kontrollzellen. Zusammenfassend schließen Chan et al., dass die Behandlung der Zellen mit dem Aminosäurendialysat eine verbesserte Ultrastruktur, Vitalität und Proteinsynthese im Vergleich zur Behandlung mit Glukosedialysat gewährleistet. Warum die IL-6-Ausschüttung der mit Aminosäurendialysat behandelten Zellen höher als die mit der Kontrolllösung behandelten Zellen war, ist unklar und bedarf weiterer Untersuchungen.

5.1.3 Akute und chronische Effekte von icodextrinhaltigen Peritonealdialyselösungen:

Die im folgenden diskutierte PDL ist eine Polyglukoselösung (ausführliche Beschreibung siehe Frampton et al. [100]) bei der Icodextrin als alternatives osmotisches Agenz anstelle von Glukose eingesetzt wird. Die Hauptvorteile dieser Lösung sind seine normale Osmolalität, die Ermöglichung von Ultrafiltration über lange Austauschperioden und die Vermeidung der metabolischen Risiken, die Glukose als Agenz mit sich bringt. Inzwischen werden Glukosepolymere in vivo eingesetzt, und erste Erfahrungen im Einsatz beim Patienten sind gesammelt (siehe Einleitung).

Eine der ersten in vitro Experimente mit Glukosepolymeren stammen von Liberek et al. [101] und de Fijter et al. [102]: Liberek et al. untersuchten die Wirkung von einem Glukosepolymer (7.5%; pH 5.2; laktatgepuffert) im Vergleich zu zwei glukosehaltigen PDL (1.36% und 3.86%, pH5.2, laktatgepuffert; Dianeal, Baxter) auf verschiedene für die Abwehrfunktion wichtige Faktoren (Vitalität, Phagozytose, Leukotrien B4-Synthese, „respiratory burst“-Aktivität) an peripheren Neutrophilen und humanen peritonealen Mesothelzellen. Dabei konnten sie zusammenfassend keine signifikanten Unterschiede zwischen den glukosehaltigen PDL und dem Glukose-Polymer bezüglich der getesteten Parameter des peritonealen Abwehrmechanismus feststellen, wobei die Zellvitalität erniedrigt und bakterielles Überleben in dem Glukosepolymer tendenziell erhöht zu sein schien.

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De Fijter et al. [102] konnten bei der Untersuchung eines Glukosepolymers (7.5%, pH 5.3, laktatgepuffert; Polyneal, ML Laboratories PLC) signifikant bessere Phagozytoseraten von Spendergranulozyten und –monozyten nach Inkubation in dem Glukosepolymer im Vergleich zur Inkubation in einer 3.86% glukosehaltigen PDL (Dianeal, Baxter) finden. Auch die Chemilumineszenz (oxidativer Metabolismus) der Zellen war besser in dem Glukosepolymer verglichen mit 2.27% und 3.86% Glukose-PDL. Peritoneale Patientenmakrophagen wiesen in dem Glukosepolymer eine signifkant bessere Phagozytosekapazität für S. epidermidis und E. coli als in den getesteten Glukose-PDL (1.3%, 2.27%, 3.86%) auf. Hingegen war für die Zellvitalität von humanen peritonealen Mesothelzellen nach 4-stündiger Inkubation in dem Glukosepolymer im Vergleich zu den Glukose-PDL kein signifikanter Unterschied feststellbar.

Jörres et al. [37] untersuchten ebenfalls die Wirkung einer icodextrinhaltigen PDL (Fresenius, pH5.5) im Vergleich zu glukosehaltigen bikarbonatgepufferten (G1.5% und G4.25%, pH7.4) und einer laktatgepufferten PDL (G1.5%) auf die Funktion (IL-6- und TNFα-Ausschüttung) von peripheren mononukleären Leukozyten (PBMC), die je zwei Stunden mit Staph. epidermidis und E. coli LPS stimuliert wurden. Sie fanden bei den mit Staph. epidermidis und E. coli LPS stimulierten PBMC eine signifikant erniedrigte IL-6- und TNFα-Auschüttung gegenüber der Kontrolle (Medium) bei der G1.5%-PDL, bikabonatgepufferten G4.25%-PDL und icodextrinhaltigen PDL (pH5.5). Dabei stieg die Interleukinausschüttung der mit Icodextrin behandelten Zellen bei Angleich des pH-Wertes dieser Lösung auf 7.4, und ein signifikanter Unterschied zur Kontrolle war nach Angleichung des pH-Wertes nicht mehr registrierbar. Für die bikarbonatgepufferte G1.5%-PDL konnte kein signifkanter Unterschied zur Kontrolle gefunden werden. Interessanterweise fanden sie für die IL-6/α-Actin-Ratio in der PCR weder für die neutralisierte noch für nicht neutralisierte icodextrinhaltige PDL einen Unterschied zur Kontrolle, so dass Jörres et al. vermuten, dass Icodextrin 7.5% möglicherweise nur einen posttranskriptionellen Effekt bezüglich der IL-6-Ausschüttung auf die PBMC hat.

Rooney et al.. [103] hingegen konnten keinen Unterschied zwischen laktatgepufferten Glukose-PDL (1.36%, 3.86% pH5.4) und einem Glukosepolymer (7.5%, pH5.4) in ihrer Wirkung auf humane peritoneale Mesothelzellen bezüglich Vitalität (MTT-Assay), IL-6- und Prostazyklinsekretion finden, nachdem die jeweiligen PDL nach Instillation in die Peritonealhöhle von je drei Patienten sofort wieder entfernt und die HPMC für 30 Minuten mit diesen Überständen inkubiert wurden. Alle drei Lösungen waren „gleich“ toxisch für die HPMC im Vergleich zur Kontrolle (signifikant). Interessanterweise war der toxische Effekt auf die HPMC aller drei getesteter PDL nach 15-minütiger intraperitonealer Verweildauer im Vergleich zur Kontrolle in vitro nicht mehr nachweisbar. Trotz dieser raschen in vivo Neutralisation der PDL-Toxizität vermuten die Autoren einen mesothelialen Schaden und eine Inhibiton des peritonealen Abwehrmechanismus, da die frühe und beim chronischen Einsatz repetitive Wirkung der PDL auf die Zellen möglicherweise eine Zytokinkaskade in Gang setzt, welche ihre optimale Funktion beeinträchtigt.

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Cooker et al. [104] veröffentlichten Daten, nach denen für pH-neutrale Icodextrinlösungen (7.5%, Extraneal, pH-neutral nach Mischung mit Zellkulturmedium), die hitze- oder filtersterilisiert waren, kein Unterschied im Wachstum von Fibroblasten der Maus im Vergleich zu Kontrollfibroblasten in Zellkulturmedium festzustellen war. Hingegen führte die Inkubation mit hitzesterilisierter 4.25% Glukose-PDL (Dianeal, Baxter) zur signifikanten Reduktion des Zellwachstums im Vergleich zur Kontrolle. Diese verbesserte Biokompatibilität des Glukose-Polymers führten die Autoren auf eine niedrigere Konzentration an Glukosedegradationsprodukten bei nachweisbar niedrigerer Konzentration des Glukosedegradationsproduktes Acetaldehyd im Vergleich zu den 2.5% und 4.25% Glukose-PDL zurück.

Einen günstigen Effekt von Icodextrin in Vergleich zu konventionellen Glukoselösungen bezüglich Zellvitalität und Funktion von HPMC konnte in dieser Arbeit nicht bestätigt werden. Vielmehr war Icodextrin im Vergleich zu Standardglukoselösungen unter kontrollierten Bedingungen, d.h. pH angeglichen auf nahezu neutrale Werte (pH um 7.4), in seiner Toxizität vergleichbar einer konventionellen hitzesterilisierten G4.25% Glukose-PDL. Nach vierstündiger Präinkubation mit dieser Lösung war die Vitalität von HPMC signifikant gemindert - die Funktion der Zellen bereits nach einstündiger Präinkubation. In der chronischen Versuchsanordnung nahmen sowohl Vitalität als auch Funktion der HPMC vom ersten bis zum zehnten Tag vergleichbar der G4.25%-Standardlösung ab. Dies wurde am zehnten Tag im Vergleich zur Kontrolllösung (Zellkulturmedium) signifikant.

Aktuell wurden auch von anderen Arbeitesgruppen Zweifel an der Biokompatibilität und Sicherheit von Polyglukoselösungen geäußert. Die Arbeitsgruppe Gotloib et al. [105] konnten die Beeinflussung des Zelllebenszyklusses von mesothelialen Mauszellpopulationen in vivo nach Exposition mit Glukose- und Polyglukose-PDL nachweisen. Dabei war die Vitalität dieser Zellen nach Exposition mit Polyglukose-PDL stärker herabgesetzt als nach Inkubation mit 4.25% Glukose-PDL. Im Gegensatz zu den meisten bereits zitierten in vitro Untersuchungen waren die Veränderungen unabhängig vom niedrigen pH-Wert, hoher Osmolalität und der Verwendung von Laktat oder Bikarbonat als Puffer. Eine wichtigere Rolle schien nach Gotloib et al. das verwendete osmotische Agenz zu spielen. Die Hypothese der Arbeitsgruppe war, dass die Polyglukose unter anderem Radikalfänger reduziert und damit die Generation von reaktiven Oxidantien erhöht. Diese führen dann zur Blockierung der Zellproliferation, bewirken damit die vorzeitige Zellalterung und setzen Apotosemechanismen in Gang. Dabei sah die Arbeitsgruppe die besondere Gefahr von Polyglukoselösungen in einem möglichen dysplastischen Effekt auf die damit behandelten Zellen. So konnten sie in Mauszellen, die mit dieser Lösung behandelt wurden, ein erhöhtes Kern/Zytoplasmaverhältnis im Vergleich zu den mit Glukose-PDL behandelten Zellen feststellen, wobei eine Ursache des erhöhten Kern/Zytoplasmaverhältnisses möglicherweise in einem dysplastischen Effekt auf die mit dem Glukosepolymer exponierten Zellen begründet liegt.

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In zwei weiteren Studien konnte die gleiche Arbeitsgruppe die negative Wirkung von Icodextrin auf Mesothelzellen bestätigen. So wiesen die Mesothelzellen von Mäusen nach 60 Tagen Inkubationszeit mit Icodextrin und z.T. auch noch nach 60 Tagen Erholungszeit eine signifikant reduzierte Zelldichte, erhöhte Zellgröße, einen erhöhten Kern/Plasmaindex, eine erhöhte Anzahl an heterogenen Nukleoli, eine stark verminderte Mitoserate, atypische Mitose, Mikrozellkerne, eine verminderte Zellvitalität und eine signifikant erhöhte Apoptoserate auf. Mit Icodextrin behandelte Ratten wiesen außerdem eine erhöhte Fettperoxidation auf [106]. Die dreißigtägige Inkubation von peritonealem Mesothel mit Icodextrin führte zu einer depopulierten Zellschicht bestehend aus überalterten Zellen mit atypischen Kernveränderungen und atypischer Mitose. Gleichzeitig mit diesen Veränderungen führte die Inkubation zur Fettperoxidation unmittelbar nach Einbringen der Lösung in die abdominelle Höhle von Ratten [107].

5.2  Methodenkritik - Grenzen des in vitro Zellkulturmodells

Aus den in dieser Studie dargestellten und den diskutierten (in vitro) Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen, ist nicht ohne weiteres auf die beim Menschen in vivo geltenden Verhältnisse zu schließen:

Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimente wurden ausschließlich mit Zellen der ersten drei Passagen durchgeführt, da gezeigt werden konnte, dass spätere Subkulturen zu viele alternde Zellen enthielten [28,29]. Trotzdem kann nicht ausgeschlossen werden, dass während der Zellgewinnung oder Passagierung nur die widerstandsfähigsten Zellen überlebten und für die Zellpopulation in vivo weniger repräsentativ sind. Oft sind die kultivierten Zellen allerdings auch dedifferenziert und dadurch vulnerabler als Zellen in vivo. Es wurden daher alle Experimente mit mindestens 5 Zelllinien verschiedener Patienten wiederholt.

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Das Ausgangsmaterial für die HPMC, die Omentum majus Resektate, stammten ausschließlich von nierengesunden Patienten. Bei CAPD-Patienten sind die Peritonealzellen aber zumeist für viele Jahre einem urämischen Milieu ausgesetzt, welches Einfluss auf die Zusammensetzung, Vitalität und Funktion dieser Zellen haben könnte. Dabei ist eine weitere Frage, ob gerade die Zellen des Omentum majus für das gesamte Peritoneum repräsentativ sind.

Bei dem Zellkulturmodell, das den Untersuchungen dieser Arbeit zugrunde lag, handelt es sich um ein zweidimensionales System, welches uns eine Aussage über die direkten potenziellen Interaktionen (z.B. Interleukinausschüttungen) zwischen HPMC und den verwendeten PDL treffen lässt. Allerdings gibt es Hinweise darauf, dass in vivo einige Funktionen der peritonealen Zellen, insbesondere von Fibroblasten, durch die Matrix, in der die Zellen wachsen, beeinflusst werden [36]. Beavis et al. [108] haben daher ein dreidimensionales Zellkulturmodell entwickelt, in dem die peritonealen Fibroblasten in einer Kollagenmatrix wachsen. Es bleibt abzuwarten, ob dieses relativ komplexe Modell neue Erkenntnisse über die Interaktion der Zellen bei der Inflammationsreaktion liefert. Zum anderen wären auch Zellkulturmodelle denkbar, welche die Untersuchung der Interaktionen zwischen Mesothelzellen und Fibroblasten ermöglichen.

Der CAPD-Zyklus in vivo ist ein dynamischer Prozess. In vitro Experimente, bei denen frische PDL benutzt werden, können die wichtigen Veränderungen in der Zusammensetzung des Dialysats während der Verweildauer in vivo nicht berücksichtigen.

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In vivo erfolgt zum einen nach relativ kurzer Zeit (15 bis 30 Minuten [35]) ein pH-Ausgleich und zum anderen auch eine kontinuierliche Equilibration der Hyperosmolalität (ca. 4h) und Glukosekonzentration der PDL in der Peritonealhöhle [109].

Erste Untersuchungen Richtung Equilibration in vitro führten Witowski et al. [110] durch, indem sie während der Inkubationszeit von HPMC mit PDL schrittweise die PDL durch Patienteneffluat austauschten.

Seit Jahren sind Hunderte von Patienten mit „bioinkompatiblen“ PDL behandelt worden, aber die Quote der Patienten, die wegen Membranversagens die CAPD aufgeben mussten, ist nicht so hoch, wie man aufgrund der in vitro Ergebnisse vermuten könnte; allerdings immerhin ungefähr 50% in fünf Jahren.

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Trotz all dieser Kritikpunkte erlauben uns die in vitro Modelle gerade in Bezug auf die maximale Toxizität einer Lösung eine Aussage zu treffen, da in vitro unter reproduzierbaren und kontrollierten Bedingungen, wie pH-Wert, Osmolalität und osmotisches Agenz gearbeitet werden kann.


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11.12.2006