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1.  Einleitung

1.1. Cyanophycin – einleitende Bemerkungen

Cyanophycin ist ein nichtribosomal gebildetes Polypeptid (Simon 1973), das in Form von unlöslichen Granula im Cytoplasma von Cyanobakterien vorkommt (Abb. 1, Granula der mittleren Zelle mit „Cy" gekennzeichnet).

Abbildung 1: Elektronenmikroskopische Aufnahme von Anabaena variabilis ATCC 29413

Zellen angezogen in phosphatreduziertem Medium (0,01 mM PO4 3-), mit freundlicher Genehmigung von Dirk P. Stephan, Universität Bielefeld. Die dunklen Einschlüsse sind Cyanophycingranula.

1887 wurden diese Granula von Borzi erstmals beschrieben und das Wort „cianoficina" geprägt. Simon isolierte 1970 als erster Cyanophycin, indem er die Löslichkeit in verdünnten Säuren, sowie die Unlöslichkeit bei neutralem pH-Wert ausnutzte. Dieses Polymer hat eine Molmasse zwischen 25 und 100 kDa. Es besteht aus einem Poly-α-Aspartat-Rückgrat, dessen β-Carboxylgruppen jeweils mit der α-Aminogruppe eines Argininrestes verbunden sind (Abb. 2, vorgeschlagen von Simon et al. 1976 & 1980, Hejazi 2002, Beschreibung der Eigenschaften in Abschnitt 1.2.).


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Abbildung 2: Struktur von Cyanophycin

Das Dipeptid β-Asp-Arg kann als Strukturelement von Cyanophycin aufgefasst werden.

n: Anzahl der β-Asp-Arg-Elemente
≍ 90 - 110 bei Expression in E. coli
≍ 90 - 360 in Anabaena variabilis

1.2. Eigenschaften von Cyanophycin

Cyanobakterien können morphologisch grundsätzlich in zwei Formen unterteilt werden: Es gibt einzellige, coccale Organismen (z.B. Synechocystis, Synechococcus) oder solche, die fädig organisiert sind (z.B. Nostoc, Anabaena). Teilweise können sie sich aus regulären, d.h. vegetativen Zellen, zu spezialisierten Zelltypen differenzieren: Manche Arten bilden z.B. Dauerformen, sogenannte Akineten, für die Fixierung von Luftstickstoff spezialisierte Zellen, die Heterocysten (übersetzt: „andere" Cysten) oder bewegliche Zellfäden (Hormogonien).
Als vorwiegend photoautotroph lebende Organismen kommen Cyanobakterien auf der Erde nahezu überall vor, wo Licht vorhanden ist. In Gewässern, vor allem den Ozeanen, produzierten sie vermutlich als erste Lebewesen den für viele heterotrophe Organismen lebenswichtigen Sauerstoff. Sie können in Symbiose mit und in Pflanzen, wie z.B. dem tropischen Wasserfarn Azolla oder z.B. als Flechte, d.h. in Symbiose mit einem Pilz, vorkommen. Viele Arten können Cyanophycin synthetisieren (siehe Abschnitt 1.8.). Cyanophycin-Akkumulation kann also in sehr unterschiedlichen Habitaten bzw. unter sehr unterschiedlichen Wachstums-bedingungen auftreten.


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Borzi (1887) hat die Eigenschaften der durch Lichtmikroskopie identifizierten Cyanophycin-Granula in den Blaualgenzellen wie folgt beschrieben: „Die Substanz der Körner ist homogen, nicht geschichtet; in H2SO4, HCl, HNO3 quellen die Körner auf und verschwinden. Ebenso quellen sie in KOH“ (zitiert nach Hegler, 1901).
Mittels Sakaguchi-Reagenz gelang der Nachweis eines hohen Arginingehalts (Fogg 1951). Robert Simon hat 1971 Cyanophycin aus Anabaena cylindrica durch differentielle Zentrifugation erstmalig isoliert und seine typische Aminosäure-Zusammensetzung, sowie seine Größenverteilung beschrieben. Es ist ein Copolymer, bestehend aus L-Aspartat und L-Arginin im Verhältnis 1:1 mit einem Molekulargewicht zwischen 25 und 100 kDa. Die von Simon vorgeschlagene Struktur eines verzweigten Peptides mit einem Poly-α-Aspartat als Rückgrat an dessen β-Carboxylgruppen jeweils Argininreste gebunden sind, hat sich bestätigt (Simon & Weathers 1976, Hejazi 2002, Obst et al. 2002). Cyanophycin aus Anabaena cylindrica besitzt zwei isolelektrische Punkte: Ca. 90% des Materials wird bei isoelektrischer Fokussierung in einem 6,0 M Harnstoffgel bei einem pH-Wert von 4,75 und der Rest bei einem pH-Wert von 6,10 gefunden (Simon & Weathers 1976).
Cyanophycin wird von der Cyanophycin-Synthetase gebildet, die in den meisten Cyanobakterien vorkommt (siehe Abschnitte 1.8.). Substrate der von der Cyanophycin-Synthetase katalysierten Reaktionen sind die Aminosäuren Aspartat und Arginin sowie ATP. Für die Aktivität der Cyanophycinsynthetase sind KCl, MgCl2, sowie ein Sufhydrylreagenz wie Mercaptoethanol oder Dithiothreitol notwendig (Simon 1976).
Es wurde mehrfach von einer abweichenden Aminosäurezusammensetzung berichtet: Glutamat wurde in Cyanophycin aus Synechocystis PCC 6308 und Synechococcus sp. strain G2.1 gefunden (Merritt et al. 1994, Wingard et al. 2002). Das Verhältnis von Aspartat und Arginin, bzw. Aspartat und basischer Aminosäure ist nach Hai et al. (1999, Synechococcus MA 19) 1:0,9, nach Frey et al. (2002, Synechocystis PCC 6803, heterolog exprimiert in E. coli) zwischen 1:0,79 und 1: 0,93 sowie nach Stephan (2000, unter Phosphatlimitierung gewachsene Synechocystis PCC 6803) 1:1,3. In E. coli exprimierte Cyanophycin-Synthetase aus A. variabilis bildete Cyanophycin, das aus den Aminosäuren Aspartat, Arginin und Lysin im Verhältnis von 1 : 1,15 : 0,07 (Asp:Arg:Lys) bestand (Ziegler et al. 1998).
Ein höherer Anteil an Arginin, bzw. Arginin und Lysin im Vergleich zu Aspartat lässt sich nicht mit dem Modell des Cyanophycinmoleküls (Abb. 2) in


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Einklang bringen. Zudem gibt es viele verschiedene Angaben über die Aminosäurezusammensetzung, die in verschiedenen Anzuchtbedingungen, Wachstumsphasen, artabhängigen Enzymvariabilitäten, sowie bei heterolog exprimierten Synthetasen in verschiedenen Wirtsorganismen und Anzuchtmedien begründet sein könnten. In der Anwendung verschiedener Cyanophycinextraktions- und Nachweisverfahren, sowie einer vermutlich stark unterschiedlichen Extrahierbarkeit verschieden aufgebauter oder verschieden gefalteter Cyanophycinmoleküle lassen sich weitere Ursachen für unterschiedliche Ergebnisse vermuten.
Aufgrund seiner verzweigten Struktur ist Cyanophycin nicht abbaubar durch einige Proteasen (Trypsin, Pepsin, Carboxypeptidase A und Leucin-Amino-Peptidase). Ein chemischer Abbau nach Edman führte nicht zur Bildung von Arginin- oder Aspartat-phenylthiohydantoin, wie es bei Peptidbindungen der Fall wäre (Simon & Weathers 1976). Messungen durch Zirkulardichroismus- und Laser Raman Spektroskopie lassen vermuten, dass das Polymer bei neutralem pH-Wert und auch in schwach saurer Lösung teilweise β-Faltblattstruktur besitzt, in alkalischer Lösung jedoch keine geordnete Sekundärstruktur aufweist (Simon et al. 1980). Vermutete Modifikationen, wie z.B. durch Glykosylierung (Baumgärtel 1920) oder eine Bindung von Ionen wie K+ (zitiert nach Fogg 1951) oder eine Bindung von DNA (Baumgärtel 1920, Bielinska et al. 1999) wurden nicht ausreichend untersucht, sind also noch nicht bestätigt worden.
Ziegler et al. (2002) klonierten ein Protein aus dem grampositiven, sporenbildenden, anaeroben Organismus Desulfitobacterium hafniense mit erheblicher Sequenzähnlichkeit zur cyanobakteriellen Cyanophycin-Synthetase. In E. coli bildete diese Synthetase ein dem Cyanophycin ähnliches Produkt, das ähnliche Aminosäurezusammensetzung, molekulare Masse und Proteasestabilität aufwies. Allerdings ist es im Gegensatz zu Cyanophycin bei neutralem pH-Wert sehr gut in Wasser löslich. Die Ähnlichkeit zu Cyanophycin wurde mittels Aminosäureanalyse, Abbauversuchen durch Cyanophycinase (siehe Abschnitt 1.3.) und Analyse der Abbauprodukte durch Dünnschichtelektrophorese und MALDI-MS bestätigt (Hejazi 2002, Ziegler et al. 2002). Ziegler et al. (2002) geben als mögliche Ursache der radikal veränderten Löslichkeitseigenschaften eine teilweise anders verzweigte Struktur an.


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1.3.  Cyanophycinmetabolismus

Es sind nur drei Cyanophycin metabolisierende Enzyme bekannt:

Abbildung 3: Darstellung des Cyanophycinmetabolismus

Strukturelement im Kasten: β-Asp-Arg
n: Anzahl der β-Asp-Arg-Elemente


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Cyanophycin wird von Cyanobakterien nach heutigem Stand ausschließlich durch die Cyanophycinase (CphB) abgebaut. Obst et al. (2002) isolierten elf Bakterienarten, die in der Lage waren, Cyanophycin als einzige Quelle von Kohlenstoff und Stickstoff zu nutzen. Sie klonierten und charakterisierten eine extrazellulär vorliegende Cyanophycinase aus Pseudomonas anguilliseptica. Produkt dieser Peptidase ist das gleiche wie das des cyanobakteriellen Enzyms, das Dipeptid β-Asp-Arg. Es ist anzunehmen, dass viele andere Organismen, z.B. Fressfeinde von Cyanobakterien, eine abbauende Aktivität besitzen.
Wie von Hejazi (2002) untersucht, wird β-Asp-Arg durch eine Pflanzentyp-Asparaginase hydrolysiert. Soche Asparaginasen sind aus ganz verschiedenen Organismen bekannt, die untersuchten Cyanobakterien besitzen allerdings ein Enzym mit relativ hoher Affinität zu Isoaspartyldipeptiden mit basischer Aminosäure in der β-Position wie β-Asp-Arg und β-Asp-Lys.

1.4. Bedingungen für das Auftreten der Cyanophycin-Granula

Cyanophycin wird eine Funktion als Stickstoffspeicher zugeschrieben (Allen 1984, Simon 1987). Diese Vermutung wird dadurch gestützt, dass Cyanophycin ein sehr stickstoffreiches Polymer ist, das in der logarithmischen Wachstumsphase einer Kultur nur in geringen Mengen vorhanden ist, in älteren Kulturen und Akineten aber mehr als 5% der Trockenmasse ausmachen kann.
Allgemein gilt für einen Reservestoff, dass er in der Zelle fixiert wird. Anderenfalls würde er hinausdiffundieren oder müsste permanent, vermutlich unter Energieverlust, wieder importiert werden. Beides wird durch die physikalischen Eigenschaften von Cyanophycin gewährleistet, denn Cyanophycin ist unlöslich, ein Export oder eine Diffusion in das Medium wurde nie beobachtet. Parnas & Cohen (1976) stellten anhand theoretischer Überlegungen fest, dass für eine möglichst hohe Überlebenschance eines Organismus eine sinkende Konzentration an Nährstoffen ein Signal zur Bildung des entsprechenden Reservestoffs darstellen sollte. Die Synthese sollte also im Übergang zur stationären Phase und nicht bei Überschuss des entsprechenden Stoffes stattfinden. Dies trifft für mehrere der auf diese Frage hin untersuchten Cyanobakterien zu. So ist bei verschiedenen limitierenden Wachstumsbedingungen, d.h. z.B. in der stationären Phase einer Kultur, Cyanophycin in der Regel in hoher Menge, d.h. in Form vieler und großer Granula vorhanden (Hegler 1901, Tischer 1957, Stephan et al. 2000, Stephan 2000). Bei


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weiterem Mangel an Stickstoff im Medium werden zuerst Phycobiliproteine, die wichtige Antennenpigmente für die Photosynthese darstellen, und erst später die Cyanophycingranula abgebaut.
Schon vor hundert Jahren wurde durch lichtmikroskopische Untersuchungen eine heute noch weitgehend gültige Beschreibung der Umstände, die zu einer Akkumulation führen können, gegeben: „Was zunächst ihre [Cyanophycinkörner] Bildung anlangt, so findet dieselbe vorzugsweise dort statt, wo eine Anhäufung von Reservestoffen ohne gleichzeitigen Consum zum Zweck des späteren Verbrauchs eintritt, also bei allen Formen mit Dauerzellen in den jugendlichen oder heranwachsenden Sporen; diese sind bei allen Formen im reifen Zustand nahezu völlig davon erfüllt. Sodann sieht man bei denjenigen Formen, welche keinen besonderen Dauerzellen besitzen, wie die Chroococcaceen und Oscillariaceen die Cyanophycinkörnerbildung in besonderem Maasse dann einsetzen, wenn die Vegetationsperiode sich ihrem Ende nähert, wenn Zelltheilungen und Entstehung neuer Individuen seltener werden und die Zellverbände in das Ruhestadium treten.
Dagegen findet man bei kräftigem Wachstum und lebhafter Theilung, wie das zu Anfang der Vegetationsperiode der Fall ist, in den theilenden und wachsenden Zellen entweder gar keine Eiweisskrystalloide [gemeint sind Cyanophycingranula] oder nur wenige ganz kleine. Es gilt dies sowohl für die isocysten als heterocysten Arten. Bei letzteren kann man beobachten, dass in Fäden mit lebhafter Theilung auch die Heterocysten frei davon sind, die sonst gewöhnlich an den Porenkanälen Krystalloide besitzen" (Hegler 1901).
Die unter Cyanobakterien weit verbreitete Möglichkeit, eine Stickstoffreserve wie Cyanophycin zu bilden, könnte, vor allem in Biotopen mit wechselnden Konzentrationen gebundenen Stickstoffs, einen Vorteil für den Bestand nicht Luftstickstoff fixierender Arten darstellen. Bei Synechocystis PCC 6308 wird die Bildung von Cyanophycin hauptsächlich am Anfang der stationären Wachstumsphase einer Kultur beobachtet. Die enzymatische Aktivität sowohl von Cyanophycin-Synthetase als auch Cyanophycinase ist jedoch konstitutiv (Mackerras et al. 1990). Ferner kommt es bei Phosphatmangel (Stevens & Paone 1981 über Agmenellum quadruplicatum, siehe auch Abschnitt 1.5.) oder Sulfatlimitierung (Arino et al. 1995 über Gloeothece PCC 6909), der Zugabe von Kupfer- oder Cadmiumionen in das Medium (Surosz & Palinska 2000 über Phormidium OI 75), oder nach Zugabe der Aminosäuren Arginin, Asparagin (Stephan 2000 & Stephan et


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al. (2000) über Synechocystis PCC 6803) oder Aspartat (Lawry & Simon 1982 über Anabaena cylindrica) zu einer starken Akkumulation. Von Art zu Art gibt es jedoch große Unterschiede in der Fähigkeit, stickstoffhaltige Verbindungen aus dem Medium in das Cytoplasma zu transportieren, sodass keine allgemein gültige Angabe über die Umstände gegeben werden kann, die zu einer Cyanophycin-Akkumulation in Abhängigkeit der im Medium enthaltenen stickstoffhaltigen Verbindungen führen.

1.4.1. Cyanophycin-Akkumulation und Stickstoffhaushalt der Zelle

Eine vermutete Signalfunktion des Cyanophycins oder seiner Abbauprodukte auf die Ausbildung von Heterocysten (Wolk et al. 1994) konnte widerlegt werden, denn eine Mutante von A. variabilis, in der die Cyanophycin-Synthetase deaktiviert wurde (ΔCphA), bildet funktionsfähige Heterocysten, wenn auch mit einer geringfügig erhöhten Frequenz (Ziegler et al. 2002). Ein zwingender Zusammenhang zwischen Heterocystenbildung und der Fähigkeit, Cyanophycin zu bilden, ist also nicht vorhanden. Dennoch ist der mögliche Zusammenhang zwischen der Fixierung von Luftstickstoff und gebundenem Stickstoff und seiner Speicherung eine Erörterung wert. Einige Cyanobakterien können N2 der Luft fixieren, indem sie ihn durch Nitrogenase zu Ammonium reduzieren, welches anschließend durch Einbau in Kohlenstoffverbindungen dem weiteren Stickstoffmetabolismus der Zelle zugeführt werden kann.
Wie jeder enzymatische Prozess ist die Cyanophycin-Synthese durch die Verfügbarkeit der Substrate reguliert. Es existieren einige Untersuchungen, die die zeitliche und räumliche Verteilung des Auftretens von Cyanophycin-Granula und der N2-Fixierung beschreiben:

Innerhalb der Heterocysten wurde Cyanophycin speziell am Septum zwischen Heterocysten und vegetativen Zellen als Bestandteil der Polkörperchen gefunden (engl.: polar plugs, Fogg 1951, Lang 1972, Sherman et al. 2000, Ziegler et al. 2001, Abb. 4).


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Abbildung 4: Polkörperchen am Septum zwischen Heterocyste und vegetativer Zelle> ATCC 29413

Anabaena variabilis ATCC 29413, 3 Tage auf stickstofffreiem Medium angezogen, mit freundlicher Genehmigung von Dirk P. Stephan, Universität Bielefeld.

1.4.2. Cyanophycin-Akkumulation und Akineten

Bei Differenzierung von Cyanobakterien findet man Cyanophycingranula verstärkt in Akineten (Braune & Döhler 1996, Herdman 1988). Ein notwendiger Zusammenhang zwischen Cyanophycinbildung und der Bildung bzw. der Keimung von Akineten ist aber nicht auszumachen, denn Akineten von Cyanospira spp. enthalten kein Cyanophycin (Sili et al. 1994). Nostoc ellipsosporum mit einer Mutation im biosynthetischen Gen argL bildet Akineten, aber kein Cyanophycin (Leganes et al. 1998). Diese Akineten können allerdings nicht keimen. Akineten von Anabaena cylindrica, die in Gegenwart des Argininanalogons Canavanin gezogen wurden, haben oft keine Cyanophycingranula (Nichols et al. 1980).

1.4.3. Cyanophycin-Akkumulation unter Stressbedingungen

Surosz & Palinska (2000) stellten bei Phormidium OI 75 ein stark vermehrtes Auftreten von Cyanophycingranula nach Zugabe von Cu2+ oder Cd2+ fest. Gleichzeitig wurde eine verstärkte Bildung von Polyphosphatgranula festgestellt.


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Eine durch Cyanophycin verursachte Entgiftung durch Bindung von Schwermetallionen oder ein Einfluss auf die Löslichkeit von Salzen im Cytoplasma wurde nicht untersucht. Fernández-Piñas et al. (1995) beobachteten, dass nach Schwermetallionenexposition eine verstärkte Bildung von Polyphosphaten eintritt und diese möglicherweise Cu2+ oder Cd2+-Ionen binden. Dadurch könnte ein Phosphatmangel eintreten, der zu erhöhter Cyanophycin-Akkumulation führt. In A. cylindrica wurde allerdings bei Exposition mit Pb2+ oder Hg2+ keine Veränderung der Cyanophycin-Akkumulation festgestellt (Lawry & Simon 1982).

1.4.4. Andere mögliche Funktionen von Cyanophycin

Außer der Abwesenheit von Cyanophycin zeigen weder die nicht Cyanophycin bildenden Arten, noch die ΔCphA-Mutante von Ziegler et al. (2001) eine auffällige Morphologie. Cyanophycin enthaltende Polkörperchen besitzen keine essentielle Funktion, denn die Heterocysten dieser ΔCphA-Mutante sind funktionsfähig.
Eine andere mögliche Funktion von Cyanophycin könnte sein, dass es eine Energiereserve darstellt, da die Argininanteile über den Arginin-Deiminase-Weg zu ATP, CO2, NH4 + und Ornithin abgebaut werden können, indem Arginin zu Citrullin und Citrullin zu Ornithin umgewandelt wird, wobei Carbamoylphosphat entsteht, das als ATP-Äquivalent genutzt werden kann (Stanier & Cohen-Bazire 1977, Weathers et al. 1978). Dieser Reaktionsweg wurde in einigen Cyanobakterien nachgewiesen, es ist aber unsicher, ob alle Cyanophycin produzierenden Arten entsprechende Enzyme besitzen.
Eine extrazelluläres Auftreten von Cyanophycin, außer bei Lyse der Zellen, wurde noch nie beobachtet. Ebenso gibt es keine Berichte über eine mögliche toxische oder abschreckende Wirkung des Cyanophycins z.B. gegenüber Fressfeinden.
Bei der Regulation von Auf- und Abtrieb während des Tages bei Trichodesmium tenue hat Cyanophycin offenbar ebenfalls keine Funktion (Romans et al. 1994).


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1.5.  Übereinstimmende Merkmale der Organismen, die Cyanophycin synthetisieren

Ein bisher übereinstimmender Befund ist, dass alle Cyanophycin produzierenden Cyanobakterien unter Phosphatmangel Cyanophycin akkumulieren. Acinetobacter sp. strain ADP1 (Krehenbrink et al. 2002), der bisher einzige nichtcyanobakterielle Organismus, bei dem die Cyanophycinbildung untersucht wurde, weist die gleiche Regulation auf. Tabelle 1 zeigt Beispiele für diesen Befund.

Tabelle 1: Beispiele für Zusammenhang von Cyanophycin-Akkumulation und Phosphathaushalt der Zelle

Organismus

Bemerkungen

Autor/Autorin

Acinetobacter DSM 587

Ohne Phosphatlimitierung nur sehr geringe Polymer-Akkumulation

Krehenbrink et al. (2002)

Agmenellum quadr.

Cyanophycin-Akkumulation bei Phosphatmangel

Stevens & Paone (1981)

Anabaena cylindrica

Sowohl Polyphosphat- als auch Cyanophycingranula in den gleichen Zellen gefunden. Anzuchtbedingungen wurden nicht beschrieben. Identifizierung der Polyphosphate aufgrund elektronenmikroskopischer Aufnahmen

Lang (1972)

Anabaena var. Kützing

Cyanophycin-Akkumulation bei Phosphatmangel

Lawry & Simon (1982)

Gloeocapsa alpicola

Cyanophycin-Akkumulation bei Phosphatmangel

Lawry & Simon (1982)

Nostoc UAM 208

Gleichzeitiges Auftreten von Cyanophycin- und Polyphosphatgranula bei Cd2+ Exposition

Fernandez-Pinas et al. (1995)

Nostoc sp.

In symbiontisch in Gunnera mannicata lebenden Zellen wurden sehr große Cyanophycingranula gefunden, aber keine Polyphosphatgranula, in frei lebenden Zellen wurde das Gegenteil gemessen (ESI/EELS-Messungen)

Jäger et al. (1996)

Nostoc musc. Agardh

Cyanophycin-Akkumulation bei Phosphatmangel

Lawry & Simon (1982)

Oscillatoria prolifera

Cyanophycin-Akkumulation bei Phosphatmangel

Lawry & Simon (1982)

Phormidium OI75

Gleichzeitiges Auftreten von Cyanophycin- und Polyphosphatgranula bei Cd2+ Exposition

Surosz & Palinska (2000)

Phormidium luridum

Cyanophycin-Akkumulation bei Phosphatmangel

Lawry & Simon (1982)

Plectonema 594

Cyanophycin-Akkumulation bei Phosphatmangel

Lawry & Simon (1982)

Synechocystis PCC 6803

Cyanophycin-Akkumulation bei Phosphatmangel

Stephan (2000) und Stephan et al. (2000)

Vollständige Bezeichnungen der Organismen werden auf der folgenden Seite gegeben.

Ein gleichzeitiges Auffinden von Cyanophycin- und Polyphosphatgranula steht nicht in Widerspruch zu einem Phosphatmangel der Zelle. Möglicherweise verringert eine verstärkte Bildung von Polyphosphat die Menge des löslichen und damit verfügbaren Orthophosphates.
Eine andere Deutung für eine möglicherweise allgemein gültige physiologische Funktion der Cyanophycin-Synthetase wurde von Stephan (2000) gegeben: In Synechocystis PCC 6803 zeigten Zellen, die für drei Tage auf Arginin als einziger Stickstoffquelle gezogen wurden, einen erheblichen Abbau der Thylakoidmembranen und eine im Vergleich zur Anzucht auf Nitrat gezogenen Zellen eine geringe L-Arginin abbauende Aktivität. Synechocystis PCC 6803war nicht auf Dauer auf Arginin als alleiniger Stickstoffquelle lebensfähig. Die nicht Cyanophycin bildenden Arten Synechococcus PCC 6301 und PCC 7942 dagegen bauen Arginin über eine, in diesen Organismen sehr aktive, L-Arginin-Oxidase/Dehydrogenase ab. Eine hohe Arginininkonzentration könnte also toxische Effekte haben.

1.6. Strategien der nichtribosomalen Peptidsynthese

Neben der ribosomalen Peptidsynthese sind aus der Natur zwei Synthesewege für Peptide bekannt:
Der Thiotemplate-Mechanismus umfasst die Adenylierung der Carboxylgruppe von z.B. Amino- oder Hydroxysäuren, die anschließend kovalent an eine 4‘‑Phosphopantetheingruppe des entsprechenden Enzyms gebunden werden (Thiolierung). Bei dieser Reaktion wird ATP zu AMP und Pyrophosphat hydrolysiert. Dieses gebundene Substrat wird mit einem weiteren auf gleiche Weise kovalent


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gebundenen Substrat kondensiert (von Döhren et al. 1997, Dittmann et al. 2001). Peptidsynthetasen, die diesen Mechanismus nutzen, zeichnen sich durch eine charakteristische modulare Struktur aus. Bestimmte Mollusken, Pilze oder Cyanobakterien bilden über diesen Mechanismus einen oder mehrere Sekundärmetaboliten. So bildet ein Multienzymkomplex in Microcystis aeruginosa das hepatotoxische cyclische Heptapeptid Microcystin.
Der andere nichtribosomale Peptidsyntheseweg beinhaltet eine Phosphorylierung von Carboxylgruppen und, soweit bekannt, keine intermediäre kovalente Verknüpfung der Substrate mit der Synthetase. Ein nucleophiler Angriff des freien Elektronenpaares der α-Aminogruppe eines Aminosäuresubstrates auf das positiv polarisierte Kohlenstoffatom des Acylphosphates führt anschließend zur Ausbildung der Amidbindung. Die bisher bekannten natürlich vorkommenden Polyamide ε-Poly-L-Lysin, Poly-γ-D-Glutamat und Cyanophycin werden alle über diesen Mechanismus synthetisiert (Oppermann-Sanio & Steinbüchel 2001).
Die physiologischen, ökologischen und physikalischen Eigenschaften dieser Polyamide sind völlig verschieden: ε-Polylysin wird von Streptomyces albulus gebildet und sekretiert. Es scheint eine antimikrobielle Funktion zu haben. Poly-γ-Glutamat wird extrazellulär bei verschiedenen Bacillus-Arten sowie in den Nesselzellen von Hydra gefunden und ist allgemein nicht toxisch (Kunioka 1997, Yoon et al. 2000, Szczepanek et al. 2001). Beide Polymere sind in Wasser sehr gut löslich.
Das hier untersuchte Cyanophycin wird bei lebenden Kulturen nicht im Medium gefunden. Es ist unter physiologischen Bedingungen (pH-Wert und Ionenstärke) in Wasser unlöslich und bildet in den Zellen Granula. Cyanophycin wird nichtribosomal von der Cyanophycin-Synthetase (CphA) gebildet (Simon 1976). Seine Funktion wird in einer dynamischen Kohlenstoff- und Stickstoffreserve vermutet (siehe Abschnitt 1.4.1., Carr 1984).
Allen diesen enzymatisch gebildeten Homopolymeren, bzw. dem Copolymer Cyanophycin ist gemeinsam, dass sie keine einheitliche Größe haben, sondern ihre molekulare Masse dispers ist.


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1.7.  Die Cyanophycin-Synthetase

Cyanophycin-Synthetasen aus Anabaena cylindrica (Simon 1976), Synechocystis PCC 6803 (Ziegler et al. 1998), A. variabilis ATCC 29413 (Ziegler et al. 1998, Berg et al. 2000), Synechococcus sp. MA 19 (Hai et al. 1999), Synechocystis PCC 6308 (Aboulmagd et al. 2000), Synechococcus elongatus (Ebert 2001), Acinetobacter sp. strain DSM 587 (Krehenbrink et al. 2002) und Desulfitobacterium hafniense (Ziegler et al. 2002) wurden charakterisiert. Zumindest für Synechocystis sp. PCC 6803 und Anabaena variabilis ATCC 29413 ist Cyanophycin nicht essentiell (Li et al. 2001, Ziegler et al. 2001).
Cyanophycin-Synthetasen aus verschiedenen Cyanobakterienarten konnten in anderen Bakterien aktiv exprimiert werden (Tab. 2). Alle beschriebenen heterolog exprimierten Synthetasen bildeten Cyanophycin mit einem Molekulargewicht zwischen 25 und 30 kDa. Im Gegensatz dazu liegt das Molekulargewicht des von Cyanobakterien produzierten Polymers zwischen 25 und 100 kDa (Ziegler et al. 1998).
Die Aminosäure Lysin als Bestandteil von Cyanophycin wurde bisher ausschließlich bei heterologer Expression von CphA aus Anabaena variabilis (Ziegler et al. 1998) und Synechocystis PCC 6308 in E. coli (Krehenbrink et al. 2002) gefunden, sowie in dem Polymer, das bei heterologer Expression von der CphA-ähnlichen Synthetase aus Desulfitobacterium hafniense strain DCB-2 (Ziegler et al. 2002) gebildet wird.

Tabelle 2: Heterologe Expression von Cyanophycin-Synthetasen

CphA aus:

exprimiert in:

Autor (Zitat)

A. variabilis ATCC 29413

Escherichia coli

Ziegler et al. 1998

Synechocystis PCC 6803

Escherichia coli

Ziegler et al. 1998

Synechococcus MA19

Escherichia coli

Hai et al. 1999

Synechococcus elongatus

Escherichia coli

Ebert 2001

Synechocystis PCC 6308

Escherichia coli

Krehenbrink et al. 2002

Synechocystis PCC 6308

E. coli, Corynebacterium glutamicum, Ralstonia eutropha, Pseudomonas putida

Aboulmagd et al. 2001

Für die in vitro-Synthese von Cyanophycin sind die konstituierenden Aminosäuren Aspartat und Arginin, Cyanophycin als Primer, Mg-ATP, K+, sowie ein Thiolreagenz


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wie Dithiothreitol oder Mercaptoethanol notwendig (Simon 1976, Ziegler et al. 1998). Im Laufe der Reaktion wird ATP zu ADP und Pi hydrolisiert. Eine Bildung von AMP wurde nicht beobachtet (Ziegler et al. 1998). Die apparente molekulare Masse der Synthetase aus Anabaena variabilis beträgt nach Abschätzung an einer kalibrierten Größenausschlusschromatografiesäule 230 ± 30 kDa, in der SDS-PAGE beträgt die Masse ca. 100 kDa, in Übereinstimmung mit der berechneten Masse der aus der Sequenz des Gens cphA abgeleiteten Aminosäuresequenz (Ziegler et al. 1998). Die Massendifferenz zwischen der Molmasse, die in der denaturierenden SDS-PAGE gemessen wird, und der Abschätzung aufgrund des Laufverhaltens an der kalibrierten Größenausschlusschromatografiesäule lässt vermuten, dass Cyanophycin-Synthetase aus A. variabilis in Lösung als Homodimer vorliegt.
Die Substratspezifität von Cyanophycin-Synthetasen unterschiedlicher Organismen, d.h. ihre Aktivität sowohl mit verschiedenen Aminosäurederivaten wie auch mit verschiedenen synthetischen Primern, wurden in den letzten Jahren mehrfach untersucht (Übersicht der als Aminosäuresubstrat oder Analogen untersuchten Verbindungen in Abschnitt 6.4.).
Ein Einbau von Canavanin, Ornithin und Lysin anstelle von Arginin, sowie ein Einbau von Aspartat-β-Methylester (Aboulmagd et al. 2001) und β-Hydroxy-L-Aspartat anstelle von Aspartat (Strukturformeln im Anhang 6.4.) konnte nachgewiesen werden (diese Arbeit zu A. variabilis, Aboulmagd et al. 2001 zu Synechocystis PCC 6308, Hai et al. 2002 zu Synechococcus MA19). Argininmethylester und Argininamid führten zu einer Hemmung des Einbaus jeglicher Aminosäuresubstrate bei CphA aus Synechocystis PCC 6308 (Aboulmagd et al. 2001).
Bei Versuchen mit CphA aus Synechococcus sp. strain MA 19 zeigten Poly-α,β-D,L-Asparaginsäure, N‑Acetylglucosamin, eine Membranfraktion von Synechococcus sp. strain PCC 7942 und Aspartatreiches Exopolymer aus Klebsiella sp. Aktivität als Primer. Die Primer-Wirkungen wurden allerdings, mit Ausnahme einer speziellen Charge Poly-αβ-D,L-Asparaginsäure, nur mit ungereinigter Synthetase gemessen, sodass andere im E. coli-Rohextrakt enthaltene Stoffe (es wurde heterolog in E. coli exprimierte Cyanophycin-Synthetase verwendet) eine Rolle spielen könnten (Hai et al. 2002, heterolog exprimierte Cyanophycin-Synthetase von Synechococcus sp. strain MA 19).


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1.8.  Verbreitung der Cyanophycin-Synthetase

Von den potentiellen Cyanophycin-Synthetase-Genen, die in nicht-cyanobakteriellen Organismen gefunden wurden (Sequenzen im Anhang), wurden cphA aus Acinetobacter sp. strain ADP-1 (Krehenbrink et al. 2002) und Desulfitobacterium hafniense strain DCB-2 (Ziegler et al. 2002) in E. coli exprimiert. Beide Synthetasen bildeten einen dem Cyanophycin ähnlichen Stoff, jedoch ist das von der Synthetase aus D. hafniense gebildete Polymer bei neutralem pH-Wert sehr gut wasserlöslich.
Möglicherweise bilden mehr Organismen als bisher angenommen ein solches dem Cyanophycin ähnliches Polymer. Darauf deuten DNA-Datenbankabgleiche hin, bei denen Gene mit hoher Homologie zu Cyanophycin-Synthetase-Genen in etwa 10% der Eubakteriengenome gefunden wurden. Weitergehende Untersuchungen fehlen jedoch.
Unter den Cyanobakterien sind bis heute nur acht Arten bekannt, die keine Cyanophycingranula bilden. Unter diesen Arten gehören sechs zu der Gattung Synechococcus, sowie zwei Arten zur Gattung Prochlorococcus, bei denen das Genom vollständig sequenziert ist und kein die Cyanophycin-Synthetase codierendes Gen gefunden wurde (Prochlorococcus marinus MIT 9313 und Stamm MED 4). Unter den Synechococcus-Arten ohne Cyanophycin-Synthetase sind sowohl ozeanische als auch Frischwasserarten (Lawry & Simon 1982, Newman et al. 1987, Görl et al. 1998, Ziegler et al. 1998).
Ein durch Insertionsmutagenese bewirktes Ausschalten der Funktion des Gens cphA in Synechocystis sp. PCC 6803 (Li et al. 2001) oder entsprechend in Anabaena variabilis (Ziegler et al. 2001) führte erwartungsgemäß dazu, dass kein Cyanophycin mehr gebildet wurde. In beiden Fällen scheint also die einzige funktionale Cyanophycin-Synthetase der Organismen zerstört worden zu sein. Beide Mutanten waren lebensfähig, die ΔcphA-Mutante von Anabaena variabilis wächst aber auf N2 als einziger Stickstoffquelle bei hoher Lichtintensität viel langsamer (Ziegler et al. 2001). Das nicht erwartete Ausbleiben der Akkumulation von Cyanophycin bei einer knock-out-Mutante, bei der das Cyanophycin-hydrolysierende Enzym Cyanophycinase (CphB) in Synechocystis PCC 6803 zerstört wurde (ΔCphB), muss mit Kotransskription der im Genom benachbarten Gene, unbekannten sekundären Effekten oder einer Regulation der Enzymaktivität erklärt werden (Li et al. 2001).


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1.9.  Primärsequenz und strukturelle Merkmale der Cyanophycin-Synthetase

Cyanophycin-Synthetasen katalysieren die Ausbildung zweier verschiedener Amidbindungen, einer Peptid- und einer Isopeptidbindung. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der cyanobakteriellen Cyanophycin-Synthetasen CphA haben untereinander eine große Ähnlichkeit. Sequenzidentitäten reichen von 99,2% (Anabaena 29413 vs. Anabaena 7120) bis 65,6% Identität (Nostoc punctiforme vs. Synechocystis 6308). Die Größe der Synthetasen liegt zwischen 872 und 901 Aminosäureresten (Cyanothece ATCC 51142 bzw. A. variabilis, siehe Abschnitt 6.3.1. und Berg et al. 2000).
Die Aminosäuresequenz der Cyanophycin-Synthetasen lässt sich in zwei Bereiche teilen, die jeweils deutliche Homologien zu anderen Enzymen aufweisen (Ziegler et al. 1998). Die C-terminale Region hat Ähnlichkeit zu einer gut charakterisierten Superfamilie, der z.B. an der Biosynthese des Mureins beteiligte Enzyme (MurC, MurD, MurE und MurF) und die Folyl-poly-γ-Glutamat-Ligase angehören. Konserviert und charakteristisch für diese Enzyme ist ein abgewandeltes „P‑loop"-Motiv (Saraste et al. 1990, in Abschnitt 6.3. gekennzeichnet), das an der Nucleotidbindung beteiligt ist. Es gibt Röntgen-Kristallstrukturanalysen von MurD (Bertrand et al. 1997, 1999, 2000) und MurF (Yan et al. 2000). In Studien zu konservierten Bereichen innerhalb der MurD-Sequenzen konnten vier konservierte Regionen identifiziert werden (Eveland et al. 1997). Mittels biochemischer Untersuchungen an ortsgerichtet mutierten MurD-Proteinen (Bouhss et al. 1997, 1999) wurde die katalytische Funktion einiger Aminosäurereste geklärt.
Der N-terminale Bereich der Cyanophycin-Synthetase hat Ähnlichkeit zu einer anderen Ligase-Superfamilie, der verschiedene Carboxylat-Amin- und Carboxylat-Thiol-Ligasen angehören. Charakteristisch für diese Enzymfamilie ist eine ATP-Bindungsstelle, die durch den sogenannten „ATP-grasp-fold“ gekennzeichnet ist. Obwohl die Aminosäuresequenzähnlichkeit innerhalb dieser Superfamilie gering ist, existiert eine ähnliche dreidimensionale Proteinstruktur (Murzin 1996, Galperin & Koonin 1997). Charakteristische und teilweise konservierte Motive sind „B-loop“ und „J-loop“ (siehe Abschnitt 6.3.).
Für die Planung von ortsgerichteten Mutagenesen, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, diente die Ähnlichkeit der Cyanophycin-Synthetase zu Proteinen bekannter Kristallstruktur als Leitfaden.


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Ziel dieser Arbeit war es, zur Aufklärung des Reaktionsmechanismus der Cyanophycin-Synthetase aus Anabaena variabilis beizutragen. Es wurden qualitative biochemische Untersuchungen zu Syntheserichtung, zum Ablauf der Aminosäureinkorporation und zur Substratspezifität durchgeführt. Durch gentechnische Modifikationen der Cyanophycin-Synthetase sollte eine Zuordnung der aktiven Zentren der Synthetase zu Einzelschritten der Gesamtreaktion ermöglicht werden.


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03.11.2003