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2.  Material und Methoden

2.1. Material

2.1.1. Chemikalien

Bachem Biochemicals, Heidelberg:
β-Asp-Ala
α-Asp-Arg
β-Asp-Gly
β-Asp-His
β-Asp-Leu
β-Asp-Lys
β-Asp-Pheα-Arg-Asp
γ-Glu-Leu
Fmoc-Asp-OtBu
H-Arg(Pmc)-OtBu

Becton Dickinson and Company, Microbiology Systems, Sparks, USA:
Bacto Agar
LB-Medium
LB-Agar
Bacto-Trypton
Hefeextrakt

BioRad Laboratories, Richmond, USA:
Tween-20 (Polyoxyethylen(20)-sorbitanmonolaureat)

Feinchemie KG, Sebnitz:
Bromphenolblau

Fluka Chemie, Schweiz:
p-Cumarsäure

Merck GmbH, Darmstadt:
Ethidiumbromid


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Novabiochem, Bad Soden:
Dicyclohexylcarbodiimid/N-hydroxybenzotriazol
Fmoc-Asp-Oall
Fmoc-6-Aminohexansäure

PeqLab, Erlangen:
Agarose

Rapp Polymere, Tübingen:
Fmoc-Arg(Pmc)-TentaGel-S-PHB Harz
Fmoc-Asp(OtBu)-TentaGel-S-PHB Harz
TentaGel-SRAM Harz

Roche Diagnostics GmbH, Mannheim:
Ampicillin

C. Roth GmbH & Co., Karlsruhe:
Ammoniumsulfat
1,4-Dithiothreitol
EDTA Dinatriumsalz-Dihydrat
Essigsäure
Formamid
Glycerin
Glycin
1N HCl
IPTG
Kaliumchlorid
Laurylsulfat, Natriumsalz (SDS)
Magnesiumchlorid-Hexahydrat
Methanol
1N NaOH
Natriumacetat
Natriumchlorid
Natriumhydroxid


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Natriumthiosulfat
2-Propanol
Proteinstandard prestained
Roti-Phorese (Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung (29:1, w/w), 40%-Lösung (w/v))
Roti-Quant
Roti-Szint, Szintillationscocktail
Saccharose
TEMED (N,N,N‘,N‘-Tetramethyl-1,2-Diaminomethan)
Trichloressigsäure
Tris
Triton X-100
Wasserstoffperoxid
X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactopyranosid)

Serva Feinbiochemika, Heidelberg:
Coomassie Brilliant Blau R-250
Ninhydrin (Feststoff)
Nitrocellulose-Membran NC 45
Proteinstandard Mix 4, Mix 5
Protein A-Peroxidasekonjugat

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen und Steinheim
APS (Ammoniumperoxodisulfat)
L-Asparagin
L-Aspartat
L-Arginin
Citrullin
α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure
Desoxycholsäure
Dimethylformamid
Dinatriumdihydrogenphosphat
Ethylenglykol
L-Glutamat
L-Glutamin


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Imidazol
Luminol (3-Aminophthalsäure-Hydrazid)
L-Lysin
N-Methyl-Anilin
Natriumdihydrogenphosphat
Ninhydrin-Reagenz
Ornithin
Piperidin
Ponceau S
Rinderserum-Albumin (BSA)
Tetrakis-(triphenylphosphin)-Palladium(0)
Triisobutylsilan (TIBS)
Xylencyanol

2.1.2. Radiochemikalien

Amersham Biosciences, Freiburg
L-[2, 3, 4, 5-3H] Arginin (37 MBq/ml); L-[2, 3-3H] Aspartat (37 MBq/ml)

Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig:
γ[ 32 P]-ATP (400 MBq/ml, 110 TBq/mmol)L-[4,5-³H(N)]-Lysin (37 MBq/ml, 1,48TBq/µmol)

2.1.3. Enzyme:

New England BioLabs:
Endonucleasen
Klenow-Fragment (DNA-Polymerase I)
T4-Ligase

2.1.4. Säulen-Material

Amersham Pharmacia Biotec GmbH, Freiburg
BlueSepharose CL-6B
PD-10 Entsalzungssäule, vorgepackt mit Sephadex G-25
Superdex-200-Säule


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Qiagen, Hilden:
Ni-NTA-Agarose

Vydac, Hesparia, CA, USA:
Vydac 201SP54 C-18 column

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen:
Aspartat-Agarose
Arginin-Agarose
DEAE-Cellulose
Octyl-Sepharose CL-4B
Phenyl-Sepharose CL-4B

BioRad Laboratories, Richmond, USA:
BioGel P-2
Hydroxyapatit BioGel HTP
Methyl-Sepharose HIC Cartridge

2.1.5. Kits

Promega Corporation, Madison, USA
GeneEditorTM in vitro Site Directed Mutagenesis System
Qiagen, Hilden
Gel Extraction Kit-150
Taq-Polymerase

Roche Diagnostics GmbH, Mannheim:
High Pure Plasmid Isolation Kit


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2.1.6.  Nucleinsäuren

Die verwendeten Oligonucleotide stammen von der Firma Metabion (Planegg-Martinsried) und wurden als Primer für ortsgerichtete Mutagenesen mit dem GeneEditor Kit (Promega) oder für Polymerasekettenreaktionen eingesetzt.

Tabelle 3: Eingesetzte Primer

Primer

Sequenz

WL 92

5´-CTACTATCGACTCGAGCAAAG-3´

WL 96

5´-CCTATTCATATGAGAATCC-3´

WL 141

5´-CCAACTACTCCATATGGCAGGTTACAC-3´

WL 153

5´-ACCGGCACTAACGGCGCCACCACCACTACC-3´

WL 154

5´-CCGATTGTCATCGGGCCCCTAGATGGC-3´

WL 161

5´-GTCAATCATTGTTGCGCGCTATTACGTTGGGCG-3´

WL 162

5´-TATTTAAGGGCAACTGCAGCCCTGAGTACAGGT-3´

WL 226

5´-CGGCGCAGCCTCGAGTTAGACAATTACACC-3´

2.1.7. Filter, Röntgenfilme, sonstiges Material

Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England
Hyperfilm βmax

Amicon, Bedford, USA:
Centriprep YM-10

C. Roth GmbH & Co., Karlsruhe:
Whatmanpapier

2.1.8. Technische Geräte

Beckman Instruments Inc, Fullerton, USA:
Ultrazentrifuge L70
Szintillationszähler LS 6500
Tischzentrifuge Sorvall GS-15R

Biometra, Göttingen:
Transilluminator


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BioRad Laboratories, Richmond, USA:
Bio-Ice-Cooling Unit
Geltrockner Gel Dryer Model 583
Mini-PROTEANTM-Elektrophoreseeinheit
Stromversorgungsgeräte

Christ, Osterode:
Lyophilisationsanlage Alpha 1-2

Emich Ultraschall GmbH, Berlin:
Ultraschall USD 30

Eppendorf AG, Hamburg:
Centrifuge 5402
Centrifuge 5414C
Thermomixer 5436

Heidolph, Schwabach:
Vortexer Heidolph REAX 2000

Kontron, Eching/München:
HPLC-Pumpe 422
HPLC-Gradient Former 425
HPLC-Detector 430
UVICON Double Beam UV/VIS Spectrophotometer 933

Perkin Elmer, Überlingen:
DNA Thermal Cycler

Sorvall, Albertville, USA:
Sorvall RC 5B plus (Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge)

Uniequip, Martinsried
Rotationsverdampfer 100H


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Vakuubrand, Wertheim:
Membran-Vakuumpumpe

2.1.9. Biologisches Material

2.1.9.1. Bakterienstämme

Die E. coli Stämme DH5α (supE44ΔlacU169 (φ80lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) und BL21[DE3] (hsdS galcIts857 ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7 gene 1)) wurden von der Firma Clontech (Palo Alto, USA) bezogen.

2.1.9.2. Plasmide

Für Klonierungen wurden folgende Plasmide verwendet:
pBluescript II SK(+) (amp; lacZ+) (Stratagene, Heidelberg) für die ortsgerichtete Mutagenesen
pET19b (amp; His10) (Novagen, Madison, USA) als Expressionsvektor
pGEM-T Vektor (Promega Corporation, Madison, USA), für die Klonierungen des separat exprimierten C- bzw. N-Bereiches der Cyanophycin-Synthetase

2.2. Methoden

2.2.1. Anzuchtbedingungen, Zellernte und Zellaufbruch

2.2.1.1. Anzuchtbedingungen

Die Kultivierung von E. coli erfolgte auf LB-Agar-Platten oder in zweifach konzentriertem LB-Medium unter Standardbedingungen (Sambrook et al., 1989). Die Kulturen auf festem Medium und die 5 ml-Kulturen für die Isolierung von Plasmid-DNA wurden über 18h bei 37°C angezogen, für die Isolierung von rekombinanten Enzymen wurden 500 ml-Kulturen (18h, 25°C) ohne Induktion durch IPTG eingesetzt.


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Die Anzuchtmedien wurden wie folgt hergestellt:
LB-Medium (flüssig): 2,0% Trypton (w/v)
1,0% Hefeextrakt (w/v)
1,0% NaCl (w/v)

LB-Medium (fest): 1,0% Trypton (w/v)
0,5% Hefeextrakt (w/v)
1,0% NaCl (w/v)
1,4% Agar (w/v)

Ampicillin wurde zu einer Endkonzentration von 125 µg/ml zugesetzt.

2.2.1.2. Zellernte

E. coli-Zellen wurden durch Zentrifugation (15 min, 6500xg) in einem GSA-Rotor (Sorvall) aus der Kulturflüssigkeit gewonnen. Die pelletierten Zellen wurden einmal mit Aufschlusspuffer (Puffer A) gewaschen und anschließend in Puffer A aufgenommen. Die Zellsuspension wurde entweder sofort weiterverarbeitet oder bei -70°C aufbewahrt.

Puffer A: 50 mM Tris/HCl pH 8,2
20 mM KCl
1 mM EDTA
2,5 mM DTT

2.2.1.3. Zellaufbruch und Herstellung des Rohextraktes

E. coli-Zellen wurden unter Eiskühlung durch Ultraschallbehandlung (USD 30, Emich Ultraschall, Berlin) in 30 ml Puffer A aufgeschlossen. Der Aufschluss durch Ultraschall erfolgte mit einer relativen Amplitude von 25-30, bei 15 s Puls und 15 s Pause, über 5-10 min.
Anschließend wurde die erhaltene Suspension 30 min bei 30000xg und 4°C zentrifugiert, der Überstand abgenommen und in einer Ultrazentrifuge (Beckman L70) im Ti-70-Rotor für 1 h bei 120000xg bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Zugabe einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung auf 30% Sättigung (v/v)


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gebracht und anschließend 15 min bei 30000xg zentrifugiert. Das Pellet wurde in ca. 50 ml Puffer B aufgenommen.

Puffer B: 20 mM Tris/HCl pH 8,2
50 mM KCl
1 mM EDTA
2,5 mM DTT

2.2.2. Reinigung der Proteine

2.2.2.1. Reinigung des Wildtyp-Enzyms und der mutierten Cyanophycin-Synthetasen an BlueSepharose CL-6B

Die Reinigung der Proteine erfolgte bei Raumtemperatur. Die Flussgeschwindigkeit betrug bei Beladung und Elution 1 ml/min, bei den Waschschritten 5 ml/min. Der Rohextrakt wurde auf eine mit Puffer B äquilibrierte Säule mit BlueSepharose CL-6B (Säulengeometrie 5 cm x 2,5 cm) gegeben. Die mit der Synthetase beladene Säule wurde mit je 50 ml Puffer des folgenden Protokolls gewaschen:

Puffer C: 250 mM Natriumphosphat, pH 6,5, 20 mM KCl, 1 mM EDTA, 2,5 mM DTT
Puffer B: siehe oben
Puffer D: 20 mM Tris/HCl pH 8,2, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 2,5 mM DTT, 20% Ethylenglykol (v/v)
Puffer B: siehe oben
Puffer E: 20 mM Tris/HCl pH 8,2, 200 mM KCl, 1 mM EDTA, 2,5 mM DTT
Puffer F: 20 mM Tris/HCl pH 8,2, 200 mM KCl, 1 mM EDTA, 2,5 mM DTT, 50% Ethylenglykol (v/v)

Die mit Puffer F eluierten Fraktionen von jeweils 1 ml wurden mittels SDS-PAGE untersucht und diejenigen mit dem höchsten Synthetasegehalt vereinigt. Anschließend wurde die Lösung auf eine Ammoniumsulfat-Sättigung von 50% (v/v) gebracht. Nach einer Stunde auf Eis wurde das gefällte Protein bei 15 min, 30000xg und 4°C pelletiert, der Überstand dekantiert, das Pellet in 2,5 ml Puffer B aufgenommen und an einer PD-10 Säule (Pharmacia) in Puffer B umgepuffert.


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2.2.2.2.  Reinigung von Cyanophycin-Synthetase/His10-tag-Fusionsproteinen an Ni-NTA-Agarose

Für die Reinigung an der mit Nickel beladenen NTA-Säule (2 cm x 1 cm, Qiagen, Hilden) wurde der mit Ammoniumsulfat gefällte Rohextrakt in ca. 40 ml Binde-Puffer (Puffer G) aufgenommen und anschließend bei 18000 rpm für 10 min bei 4°C zentrifugiert (Sorvall Zentrifuge, SS-34 Rotor).

Puffer G: 20 mM Tris-HCl pH 7,9, 0,5 M NaCl, 0,1% Triton X-100 (v/v), 1 mM Mercaptoethanol

Der gelöste Rohextrakt aus dem Überstand wurde mit einer Flussgeschwindigkeit von ca. 0,5 ml/min an ca. 1,25 ml Ni-NTA-Agarose gebunden. Die Säule wurde anschließend mit ca. 40 ml Wasch-Puffer (Puffer H) bei einer Flussgeschwindigkeit von ca. 3-4 ml/min gewaschen.

Puffer H: 20 mM Tris-HCl pH 7,9, 0,5 M NaCl, 0,1% Triton X-100 (v/v), 1 mM Mercaptoethanol, 20 mM Imidazol

Es wurde mit aufsteigenden Imidazolkonzentrationen mit je 3 ml Puffer I ohne Zugabe von Triton X-100 eluiert.

Puffer I: 20 mM Tris-HCl pH 7,9, 0,5 M NaCl, 1 mM Mercaptoethanol, Imidazolkonzentrationen: 50 mM, 100 mM, 200 mM, 500 mM, 1000 mM Imidazol.

Die letzte Elution wurde mit ca. 40 ml des Elutionspuffers der höchsten Imidazolkonzentration durchgeführt, oder so lange, bis nur noch eine geringe Menge Protein nachweisbar war (Bradfordtest auf Mikrotiterplatte). Die überwiegende Menge des Enzyms eluierte bei Imidazolkonzentrationen von 200 mM und 500 mM Imidazol. Die Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE auf Synthetasegehalt und Verunreinigungen untersucht, die Fraktionen mit dem höchsten Gehalt, bzw. den wenigsten Verunreinigungen, wurden über eine PD-10 Säule in Puffer B umgepuffert.


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2.2.2.3.  Trennung an Hi load Superdex-200

Die Größenausschlusschromatographiesäule Superdex-200 (Pharmacia) wurde an einer HPLC-Anlage (Kontron Instruments) betrieben. Sie hatte ein Gelvolumen von 120 ml und eine Betthöhe von 60 cm. Die Läufe wurden bei einer Flussrate von 1 ml/min und einer Temperatur von 10°C mit Puffer B (Abschnitt 2.2.1.3.) durchgeführt. Das Fraktionsvolumen betrug 2 ml. Fraktionen, die Synthetase enthielten, wurden mittels SDS-PAGE, Immunblot und Aktivitätstest untersucht und anschließend teilweise durch Centripreps (Amicon) konzentriert.

2.2.3. Synthese verschiedener Peptide

2.2.3.1. Synthese der Cyanophycinprimer

Die verzweigten Peptide (β-Asp-Arg)3 (= (DR)3), (β-Asp-Arg)3-Asp (= (DR)3-D), (ε-Ahx)2-(β-Asp-Arg)3 (= (ε-Ahx)2-(DR)3) und (β-Asp-Arg)3-(ε-Ahx)2 (= (DR)3-(ε-Ahx)2) (Abb. 5, Abschnitt 3.3.) wurden an einer festen Phase über die Fmoc/tBu-Chemie synthetisiert. Als Aktivierungsreagenz wurde TBTU verwendet, der Synthesebaustein ist jeweils Fmoc-Asp-[Arg(Pmc)-OtBu]-OH. Dieser Dipeptidbaustein wurde in Lösung über Acylierung von H-Arg(Pmc)-OtBu mit Fmoc-Asp-OAll durch das Aktivierungsreagenz DCCD/N-Hydroxy-Benzotriazol und anschließender Spaltung des Allylesters durch N-Methyl-Anilin und Tetrakis-(Triphenylphosphin)-Palladium(0) hergestellt. Als feste Phase für die Synthese der Peptide (β-Asp-Arg)3 und (ε-Ahx)2-(β-Asp-Arg)3 wurde das mit Arginin beladene Fmoc-Arg(Pmc)-TentaGel-S-PHB-Harz gewählt.
Die Synthese wurde mit der Kopplung von Fmoc-Asp-OtBu an ein Harz, an das Arginin vorgekoppelt ist, begonnen. Produkt war das teilweise geschützte am Harz gebundene Dipeptid β-Asp-Arg. Der Peptidprimer (β-Asp-Arg)3 setzte sich aus dem Koppeln des Dipeptides am Harz und dem zweimaligen Koppeln mit dem Baustein Fmoc-Asp-[Arg(Pmc)-OtBu]-OH zusammen. Der N-terminal blockierte Primer (ε-Ahx)2-(β-Asp-Arg)3 wurde durch zweimaliges weiteres Koppeln des wie oben beschrieben synthetisierten Primers (DR)3 mit jeweils einem Molekül 6-Aminohexansäure synthetisiert. Das Entfernen der Schutzgruppen und die Abspaltung vom Harz wurde durch Behandlung mit 94% TFA (v/v), 1% Phenol (w/v), 2% Wasser (v/v) und 3% TIBS (w/v) durchgeführt. Produkte waren jeweils die freien Säuren (Abb. 5).


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Der C-terminal blockierte Primer (β-Asp-Arg)3-(ε-Ahx)2 wurde am TentaGel-SRAM-Harz durch zweimaliges Koppeln von 6-Aminohexansäure, dreimaliges Koppeln des teilweise geschützen Dipeptidbausteins (s.o.) und Entschützen und Abspaltung (s.o.) erreicht. Produkt war ein Carboxamid (Abb. 5).
Das Peptid (DR)3-D wurde durch dreimaliges Koppeln des Dipeptidbausteins an das mit Aspartat beladene Harz Fmoc-Asp(OtBu)-TentaGel-S-PHB synthetisiert. Entschützung und Abspaltung (s.o.) führte zur freien Säure (Abb. 5).
Alle Produkte wurden mit Hilfe einer hydrophilen C18-Säule (Vydac 201SP54) gereinigt (Gradient: 0 min, 100% H20; 20 min, 95% H2O, 5% Acetonitril (v/v)) und mittels RP-HPLC und MALDI-MS analysiert.

2.2.3.2. Synthese von β-Asp-Arg

Das Dipeptid β-Asp-Arg wurde an dem mit Arginin beladenen Harz Fmoc-Arg(Pmc)-TentaGel-S-PHB ebenfalls mittels Fmoc/tBu-Verfahren hergestellt. Nach der Fmoc-Entschützung mit 20% Piperidin in Dimethylformamid (v/v) wurde das Harz mit einem vierfachen Überschuss Boc-Asp-OtBu und achtfachen Überschuss TBTU in DMF behandelt (zweifache Kopplung, Kopplungszeit 20 min). Das Peptid wurde mit 94% TFA (v/v), 1% Phenol (w/v), 2% Wasser (v/v) und 3% TIBS (w/v) vom Harz abgespalten, mit kaltem t-Butyl-Phenylether gefällt, mit Hilfe einer C18-Säule (Vydac 201SP54) gereinigt und mittels RP-HPLC und MALDI-MS analysiert. Die Primer aus Abbildung 5 wurden für Ansätze wie in Methoden 2.2.5. beschrieben verwendet.

2.2.4. Analytische Verfahren

2.2.4.1. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die Proteinauftrennung erfolgte in der Mini-Protean II Einheit (Bio-Rad) im Puffersystem von Laemmli (1970). Für die Überprüfung der Reinheit der Enzyme wurden Gele mit einem Acrylamidanteil von 12% (w/v) verwendet. Für die Untersuchungen von Cyanophycin wurden Gele mit einem Acrylamidanteil von 15% (w/v) benutzt. In der Regel wurde der Proteinstandard „Mix 4" (Serva) verwendet, bei Versuchen mit [32P]- Markierung wurde der Proteinstandard prestained (Roth) verwendet.


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Zusammensetzung des Sammelgels:
1,83 ml Aqua destillata0,75 ml 0,5 M Tris/HCl-Lösung in H2O, pH 6,8
30 µl 10% SDS-Lösung in H2O (w/v)
0,39 ml 40%-Acrylamid/Bisacrylamidlösung (Roti-Phorese)
3 µl TEMED
30 µl 10% APS (w/v)

Zusammensetzung des Trenngels:
2,5 ml 0,8 MTris/HCl-Lösung in H2O, pH 8,8
0,1 ml 10% SDS-Lösung in H2O (w/v)
0,01 ml TEMED
0,1 ml APS

15%-Gele:
2,34 ml Aqua destillata5,01 ml 40%-Acrylamid/Bisacrylamidlösung (Roti-Phorese)

12%-Gele:
3,35 ml Aqua destillata4 ml 40%-Acrylamid/Bisacrylamidlösung (Roti-Phorese)

Soweit nicht anders angegeben, wurden die Proben für die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese zuerst einer DOC-TCA-Fällung unterzogen und anschließend in den Puffern nach Chua (1982) aufgenommen.

DOC-TCA-Fällung:
Die Probe wurde mit Wasser auf 1 ml aufgefüllt, 25 µl 2% (w/v) Natrium-Desoxycholat dazugegeben und gemischt. Nach 0-15 min auf Eis wurden 30 µl 40% (w/v) Trichloressigsäure dazugegeben, gemischt und 5 min zentrifugiert (Eppendorfzentrifuge, 14000 rpm). Der Überstand wurde sorgfältig abgesaugt, das Pellet in in 3 Volumenteilen Chua-Puffer A aufgenommen, sodass eine klare Lösung entstand.


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PAGE-Probenpuffer nach Chua (1982):

Chua A:
0,1 M Na2CO30,1 M DTT

Anschließend wurden 2 Volumenteile Chua B dazugegeben.
Chua B:
5% (w/v) SDS
30% (w/v) Saccharose
0,1% (w/v) Bromphenolblau

Wenn die Probe nicht blau blieb, wurde mit möglichst wenig 1 M NaOH alkalisiert. Nach kurzem Aufkochen der Mischung erfolgte der Auftrag auf das Gel. Für Phosphorylierungsexperimente oder wenn angegeben wurde 2xSDS-PAGE-Probenpuffer verwendet.

2xSDS-PAGE-Probenpuffer:
62,5 mM Tris/HCl pH 6,8
10% (v/v) Glycerin
2% (w/v) SDS
5% (v/v) β-Mercaptoethanol
0,001% (w/v) Bromphenolblau

2.2.4.2. Coomassie-Färbung

Die Gele wurden mit 0,25% (w/v) Coomassie Blue R-250-Lösung (Serva) in 40% Methanol (v/v), 10% Essigsäure (v/v) gefärbt und danach mit Entfärberlösung (Ethanol:Eisessig:Aqua dest. = 5:1:4) über 2 h entfärbt.

2.2.4.3. Immunblot

Immunblots wurden verwendet, um die Cyanophycin-Synthetase sowie ihre mutagenisierten Varianten nachzuweisen. Nach der SDS-PAGE wurden die aufgetrennten Proteine mit einer Elektro-Blot-Apparatur (Mini Protean II, Bio-Rad) bei einer Stromstärke von 400 mA unter Eiskühlung für 45 min auf eine Nitrocellulosemembran (NC 45, Serva, Heidelberg) transferiert. Das Gel und die Nitrocellulosemembran wurden zuvor für 20 min in Elektrotransfer-Puffer equilibriert.


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Danach erfolgte eine Färbung der Membran mit 0,2% Ponceau S (w/v) in 3% TCA (w/v), um den Proteinstandard zu markieren. Die Membran wurde dann für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C in T-TBS-Puffer (siehe unten) mit 5% Trockenmilch (w/v) geblockt. Danach erfolgte ein dreimaliges fünfminütiges Waschen mit T-TBS und 1% Trockenmilch (w/v). Die Membran wurde für 1-2 h mit den primären polyklonalen Antikörpern (anti-CphA wurde 1:50 verdünnt, Gabe von Dr. Karl Ziegler, siehe Ziegler et al. 2001) in T-TBS und 1% Trockenmilch (w/v) inkubiert. Es folgten erneut dreimal eine fünfminütige und einmal eine fünfzehnminütige Waschprozedur in T-TBS und 1% Trockenmilch (w/v). Nun wurde die Membran für 45 min mit 1:2000 verdünntem Protein A-Peroxidase-Konjugat in T-TBS-Puffer inkubiert und anschließend dreimal für 15 min in T-TBS-Puffer gewaschen. Die Immuno-Detektion erfolgte nach dem ECL-Western-Blot-Protokoll (Amersham/Life Science). Es wurden 22 µl p-Cumarsäure-Lösung (90 mM in DMSO), 50 µl Luminol-Lösung (250 mM 3-Aminophthalsäure-hydrazid in DMSO) und 3 µl Wasserstoffperoxid (30%, v/v) in 10 ml 0,1 M Tris/HCl pH 8,5, gemischt, die Lösung sofort auf die Membran gegeben und für 1 min geschüttelt. Das Auflegen des Röntgenfilms (Hyperfilm, Amersham/Buchler), die Exposition für 5-20 Sekunden, sowie die Entwicklung wurden im Dunkeln durchgeführt.

Elektroblot-Puffer: 25 mM Tris
192 mM Glycin
20% Methanol (v/v)

TBS:
20 mM Tris/HCl pH 7,6
137 mM NaCl

T-TBS 0,1% Tween-20 (v/v)
20 mM Tris/HCl pH 7,6
137 mM NaCl

2.2.4.4. MALDI-TOF-Massenspektroskopie

Identifizierung der Peptide erfolgten mittels MALDI-TOF-Massenspektroskopie (Benchtop II mass spectrometer, PerSeptive Biosystems). Eine weitere Messung erfolgte durch Dr. Jens Mattow (MPI für Infektionsbiologie, Berlin). Matrixsubstanz war jeweils α-Cyano-4-hydroxy-zimtsäure. Andere getestete Matrixsubstanzen führten zu Messungen mit viel geringerer Signalstärke. 1 µl einer gesättigten


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α-Cyano-4-hydroxy-zimtsäure-Lösung in einer Mischung aus 50% Acetonitril und 50% H2O (v/v) wurden auf den Probenträger aufgetragen. Nach dem Verdunsten der Lösungsmittel wurde 1 µl des in H2O gelösten Peptids unter leichtem Kratzen und Mischen in die Matrixschicht eingebracht.

2.2.4.5. Quantitative Proteinbestimmung

Die Proteinbestimmung wurde nach Bradford (1976) durchgeführt. Es wurden Fertigreagenz (Roti-Quant, Roth) und Mikrotiterplatten (Gesamtvolumen 100 µl) verwendet. Die Synthetasekonzentration konnte nach Kalibrierung mit BSA abgeschätzt werden, wenn wenig andere Proteine oder Abbauprodukte vorlagen. Zusätzlich wurde mit BSA als Proteinstandard die Synthetasekonzentration mittels SDS-PAGE evaluiert.

2.2.5. Biochemische Untersuchungen

2.2.5.1. Reaktionsbedingungen für den Einbau von [³H]-markierten Substraten

Die Bestimmung der Cyanophycin-Synthetase-Aktivität wurde auf Grundlage der Arbeit von Simon (1976) mit den von Ziegler et al. (1998) beschriebenen Modifikationen durchgeführt. Das Reaktionsvolumen betrug 125 µl, die Endkonzentrationen der einzelnen Komponenten waren wie folgt:

Ansätze mit [³H]-Arg:50 mM Tris/HCl pH 8,2
50 mM KCl
20 mM MgCl22,5 mM DTT
4 mM ATP
200 µM L-Aspartat
10 µM [3H]-L-Arginin,
14,8 TBq/mol
0,87 mg/ml Cyanophycin
0-50 µl/Ansatz Proteinfraktion

Ansätze mit [³H]-Asp:50 mM Tris/HCl pH 8,2
50 mM KCl
20 mM MgCl22,5 mM DTT
4 mM ATP
200 µM L-Arginin
10 µM [3H]-L-Aspartat,
14,8 TBq/mol
0,87 mg/ml Cyanophycin
0-50 µl/Ansatz Proteinfraktion


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Die Lösungen der unmarkierten Aminosäuren wurden auf pH 8,2 titriert. Cyanophycin wurde in 0,025 M HCl gelöst eingesetzt, um auftretende Pipettierungenauigkeiten des bei pH 8,2 unlöslichen Substrates zu verringern. Zusammen mit einer 5-fach konzentrierten Stammlösung von Tris/HCl, KCl, MgCl2, und DTT, die auf pH 8,5 titriert wurde, ergab sich ein pH-Endwert von pH 8,2 (Modifikation nach Ebert, 2001). Die Ansätze wurden für 30 min bei 28°C unter Schütteln (1000 rpm) im Thermoblock inkubiert und die Reaktion anschließend mit 1 ml kaltem Aqua destillata gestoppt. Die Proben wurden mittels Vakuumvielfachfiltrationseinheit durch Nitrocellulosefilter (Millipore Typ HA, Durchmesser 24 mm, Porengröße 0,45 µm) filtriert. Nach dreimaligem Waschen mit 5 ml Waschlösung (50 mM Tris/HCl, pH 8,2, 2 mM EDTA) wurden die Filter in ein Szintillationsgefäß gelegt, dazu 5 ml Szintillationscocktail Roti-Szint gegeben, dann ca. 15 s bei maximaler Geschwindigkeit gevortext, und 60 min zur Einstellung eines möglichst stabilen Messwerts stehen gelassen. Gemessen wurde im Szintillationszählgerät (Beckman LS 6500 scintillation system). Interne Kalibrierung erfolgte durch Zugabe von in den Ansätzen verwendeten, mit Tritium markierten Aminosäuren. Der unspezifische Hintergrund der Messungen wurde teilweise durch Ansätze ohne ATP und teilweise durch Ansätze mit gekochtem Enzym (5 min) abgeschätzt und abgezogen.

2.2.5.2. Reaktionsbedingungen für die Produktanalyse über SDS-PAGE

Um die Bedingungen für eine mögliche Elongationsreaktion zu untersuchen, wurde bei Raumtemperatur (ca. 22°C) für 10-14 Stunden inkubiert. Das Gesamtvolumen des Ansatzes war 125 µl, die Zusammensetzung war wie folgt:

50 mM Tris/HCl, pH 8,2
4 mM ATP Dinatriumsalz
20 mM MgCl28 mM KCl
1 mM Dithiothreitol
0,8 mM L-Aspartat und 0,4 mM L-Arginin
≥10 µM synthetischer Primer und
3 µg Cyanophycin-Synthetase oder wie angegeben


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Die Proben wurden anschließend mit DOC und TCA gefällt, mit Chua-Puffern versetzt und mittels SDS-PAGE aufgetrennt (Abschnitt 2.2.4.1.).

2.2.5.3. Bedingungen für die Produktanalyse mittels MALDI-TOF-Massenspektroskopie

Für die massenspektrometrischen Analysen wurde flüchtiger Puffer verwendet. Das Gesamtvolumen war wieder 125 µl. Die Ansätze hatten folgende Zusammensetzung:

100 mM NH4HCO3, pH 8,0
4 mM ATP Dinatriumsalz
20 mM MgCl28 mM KCl
2 mM Dithiothreitol
0,2 mM L-Aspartat oder 0,2 mM L-Arginin
³10 µM synthetischer Primer und
3 µg Cyanophycin-Synthetase
Die Proben wurden anschließend lyophilisiert.

2.2.5.4. Bestimmung der Phosphorylierung von Cyanophycin durch die Cyanophycin-Synthetase

2.2.5.4.1. Bestimmung der Phosphorylierung von Cyanophycin

In einem Gesamtvolumen von 20 µl wurden folgende Reaktionsansätze vorbereitet, L-Asp und/oder L-Arg wurden in bestimmten Ansätzen weggelassen:

17,4 µg Cyanophycin, gereinigt, alkalibehandelt (pH 10, 1 h, 40°C), auf pH 8 titriert
4 mM L-Asp
0,2 mM L-Arg
50 mM Tris/HCl pH 8,2
50 mM KCl
20 mM MgCl22,5 mM DTT
1 mM γ-[32P]-ATP, spezifische Aktivität: 6 GBq/mmol
ca. 3 µg Cyanophycin-Synthetase


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Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms gestartet. Die Inkubation erfolgte für 15 min bei 28°C. Die kompletten Reaktionsansätze (s.o.) wurden durch SDS-PAGE (15% Acrylamid) bei 100 V aufgetrennt. Das Gel wurde anschließend 2 x 5 min mit 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8 gewaschen, dann ohne Trocknung zwischen Polyethylenfolien gelegt und danach ein Röntgenfilm für mehrere Minuten bis Stunden aufgelegt. Anschließend wurden die Gele mit Coomassie gefärbt, um die Menge des aufgetragenen Cyanophycins abschätzen zu können (Abschnitt 2.2.4.2.).
Teilweise wurde die Cyanophycinpräparation in Ansätzen mit Cyanophycin-Synthetase und Aspartat bzw. Arginin vorinkubiert. Hierzu wurden die Ansätze, wie in 2.2.5.2. beschrieben, über Nacht bei Raumtemperatur mit nichtradiomarkierten Substraten inkubiert, das Cyanophycin anschließend pelletiert (2 min, 14000 rpm), zweimal mit ca. 1 ml Waschpuffer gewaschen (50 mM Tris/HCl, pH 8, 2 mM EDTA), alkalibehandelt (pH 10, 1 h, 40°C), ausgefällt (pH 8,2) und in Wasser aufgenommen.

2.2.5.4.2. Bestimmung der Stabilität des gebildeten Phosphats

Die Versuche zur Untersuchung der Stabilität des phosphorylierten Cyanophycins wurden mit Hilfe von Jan Ebert (analog Ebert 2001) auf Grundlage von Duclos et al. (1991) durchgeführt.
Cyanophycin wurde in Abwesenheit von Aminosäuren in 5 Ansätzen zu je 20 µl wie in 2.2.5.4.1. phosphoryliert, allerdings wurde das Cyanophycin in höherer Konzentration (69,6 µg pro Ansatz) und gelöst in 0,025M HCl (beschrieben in Abschnitt 2.2.5.1.) verwendet. Die Inkubation wurde für 30 min bei 28°C und maximaler Schüttelgeschwindigkeit im Thermomixer durchgeführt.
Nach Pelletierung und einmaliger Wäsche des Phosphocyanophycins (50 mM Tris/HCl, pH 8, 2 mM EDTA) wurden die Ansätze in Ansatzpuffer (50 mM Tris/HCl pH 8,2, 50 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2,5 mM DTT) oder nach Suspension in Wasser unter folgenden alternativen Bedingungen für 90 min bei 37 °C und maximaler Schüttelgeschwindigkeit (Thermomixer) inkubiert:

0,8 M Hydroxylamin/ 0,1 M Essigsäure, pH 5,2
0,1 M NaOH
0,1 M HCl
0,5 M Tris/HCl pH 8,2


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Anschließend wurde das Cyanophycin erneut pelletiert und mit gleichen Teilen Wasser und 2xSDS-Probenpuffer komplett in die Probentasche des 15%-Acrylamidgels überführt.

2.2.5.5. Trennung von Reaktionsprodukten durch Größenausschluss-Chromatographie an einer P2-Säule und Nachweis der Kalibranden

Um die Reaktionsprodukte der Synthetase und ihrer mutagenisierten Varianten für die Messungen der Massenspektren anzureinigen, wurde Bio-Gel P-2-Säulen-material (Bio-Rad, Säulengeometrie: 1 x 30 cm) verwendet. Laufmittel war 0,1 M Essigsäure. Für die Kalibrierung der Säule wurden die Aminosäure L-Aspartat (MW=133 g/mol), das Dipeptid α-Arg-Asp (MW=289 g/mol), reduziertes Glutathion (MW=307 g/mol), ATP (MW=551 g/mol, Dinatriumsalz) und Cytochrom C (MW=12300 g/mol) verwendet. Kalibrierungsproben mit freier Aminogruppe wurden mittels Ninhydrinnachweis (siehe Tab. 4), Cytochrom C und ATP im Spektrophotometer (bei λ=409 nm bzw. λ=259 nm) detektiert.

Tabelle 4: Nachweis mit Ninhydrin

Ansatz

in µl

Fraktion

100

Na-Acetat-Puffer (100 mM, pH 5,3)

100

Ninhydrin-Reagenz (Sigma Aldrich)

200

Die Ansätze wurden für 15 min bei 100°C inkubiert und danach kurz zentrifugiert. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die Ansätze mit 1 ml 50% Ethanol-Wasser (v/v) versetzt und die Absorption bei 570 nm gemessen.
Bei Reaktionsansätzen mit radiomarkierten Aminosäuren wurden 100 µl der Fraktionen zu 2,5 ml Szintillations-Cocktail gegeben und die Radioaktivität bestimmt.
Das Ziel dieses Verfahrens war die vollständige Entsalzung der Proben. Andere Methoden, wie zum Beispiel Dialyse, hätten zum Verlust der gesuchten kleinen Peptide geführt. Ein nicht gewünschter Effekt dieser Methode war eine Fraktionierung des Reaktionsansatzes, was zur Folge hatte, dass viele Fraktionen jedes Trennungsganges vermessen werden müssen, um einen Überblick über mögliche gebildete Produkte zu bekommen.


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Die Versuche wurden zuerst mit radiomarkierten Substraten durchgeführt, um herauszufinden, ob eine Produktbildung eintrat und somit die Radiomarkierung bei einer geringeren Retentionszeit eluierte.
Für Messungen mittels MALDI-MS wurden entsprechende Chromatographien nichtradioaktiv durchgeführt, die 1 ml-Fraktionen Nummer 27 bis 40 lyophilisiert und vermessen.

2.2.6. Gentechnische Arbeiten

2.2.6.1. Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli

Plasmid-DNA wurde mit Hilfe des High Pure Plasmid Isolation Kits (Roche) dem Protokoll folgend durchgeführt. Die Plasmid-DNA wurde dann in einer entsprechenden Menge TE-Puffer (s.u.) aufgenommen.

2.2.6.2. Agarosegelelektrophorese von DNA

DNA wurde in Agarosegelen nach Sambrook et al. (1989) elektrophoretisch aufgetrennt. Je nach Größe der aufzutrennenden Fragmente wurden 0,8%ige bzw. 1,2%ige Gele (w/v) eingesetzt. Die gelelektrophoretische Auftrennung erfolgte bei 5‑10 V/cm.

Laufpuffer (TE-Puffer):
45 mM Tris-Borat pH 8,5
1,8 mM EDTA

Gelkomposition:
0,8% Agarose in Laufpuffer (s.o.)
0,001% Ethidiumbromid (w/v)

Ladepuffer:
50% Glycerol (v/v)
1 mM EDTA, pH 8,0
0,05% Bromphenolblau (w/v)
0,05% Xylencyanol (w/v)

2.2.6.3. Elution von DNA aus Agarosegelen

DNA-Fragmente wurden aus dem Agarosegelstück mittels QIAEX II Gel Extraktions Kit (Qiagen) eluiert. Bei der Ausführung wurde das Hersteller-Protokoll befolgt.


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2.2.6.4.  Verdau von DNA mit Restriktionsendonucleasen

Die Spaltung von DNA mit Restriktionsendonucleasen erfolgte nach der Herstellervorschrift (BioLabs). Ansätze mit Plasmid-DNA wurden für 1-2 h inkubiert.

2.2.6.5. Ligation von DNA-Fragmenten

Die Ligation von Plasmid-DNA wurde mit T4-DNA-Ligase (BioLabs) bei 16 °C über Nacht durchgeführt. In der Regel wurde ein molares Verhältnis von Vektor zu Insert von 1:3 eingesetzt.

2.2.6.6. Transformation von E. coli

Kompetente E. coli-Zellen (DH5α, BL21[DE3]) wurden nach der CaCl2-Methode (Hanahan, 1983) präpariert. Die Zellen wurden auf Eis aufgetaut. Zu 200 µl Zellen wurde der gesamte Ligationsansatz gegeben und vorsichtig gemischt. Dieser Ansatz wurde 30 Minuten auf Eis inkubiert, anschließend für 1 min 45 s einer Temperatur von 42°C ausgesetzt und erneut für 3 min auf Eis gestellt. Danach wurde 800 µl LB-Medium zugesetzt und zur Ausbildung der Ampicillinresistenz eine Stunde bei 37°C geschüttelt. Die Selektion erfolgte auf LB-Platten mit 125 µg/ml Ampicillin.

2.2.6.7. Sequenzierungen

Die Sequenzierung erfolgte mit dem „Dye Terminator Cycle Sequencing Kit“ (ABI) nach Herstellervorgaben oder durch die Firma AGOWA Gesellschaft für molekularbiologische Technologie mbH (Berlin).

2.2.6.8. Herstellung verschiedener cphA-Konstrukte

2.2.6.8.1. Ortsgerichtete Mutagenesen

Ausgangsstoff aller Klonierungen war das Expressionskonstrukt pRGL23 von Dr. Karl Ziegler. Es wurde wie folgt hergestellt: Das Gen cphA aus Anabaena variabilis ATCC 29413 wurde über angefügte NdeI/XhoI-Schnittstellen in pET 22b(+) (Novagen, USA) kloniert, sodass der C-terminale His6-tag des Vektors hinter dem natürlichen Stoppcodon des Gens liegt und somit nicht exprimiert wird (Berg et al. 2000). Im Bereich jeder ortsgerichteten Mutagenese wurde ein möglichst kleines Stück des Gens cphA herausgeschnitten und in den Vektor pBluescript II SK (+) ligiert. Die ortsgerichtete Mutagenese wurde mit Hilfe des Kits GeneEditorTM in vitro Site Directed Mutagenesis System genau nach dem Herstellerprotokoll der Firma


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Promega durchgeführt. Die Daten zu den Mutationen und verwendete Primer sind in Tabelle 5 zusammengefasst:

Tabelle 5: Dokumentation der Orte der Mutagenesen, der verwendeten Abschnitte des Gens cphA sowie der verwendeten Primer

Mutation

Fragm. pRGL23

Primer

neue Restriktions-site

Lys261Gly

SpeI/KpnI (220 bp)

WL154

ApaI

Glu298Ala

SpeI/KpnI (220 bp)

WL161

BssHII

Asn392Asp

SpeI/EagI (526 bp)

WL162

PstI

Lys497Ala

SnaBI/EagI (826bp)

WL153

NarI

Die Sequenzen der verwendeten Primer sind in Tabelle 3 dokumentiert.
Das mutierte Segment wurde in das Plasmid pRGL23 zurückligiert. Der Erfolg der Mutation wurde in allen Fällen durch Verdau mit Restriktionsendonucleasen und zusätzlicher Sequenzierung des entsprechenden Bereichs bestätigt.

2.2.6.8.2. Umklonierung von cphA in den Vektor pET-19b

Das von Ziegler bezogene Plasmid pRGL 23 (Abschnitt 2.2.6.8.1.) wurde an den angefügten NdeI- und XhoI-Schnittstellen mit entsprechenden Enzymen geschnitten und das gesamte Gen cphA in den Vektor pET-19b (Novagen) ligiert. N-terminal wurde so eine 10 Histidinreste codierende Sequenz über ein Linkerpeptid in den Leserahmen integriert. Das natürliche Stoppcodon des Gens blieb erhalten.

2.2.6.8.3. Konstruktion und Expression von separat exprimierten cphA‑Bereichen

Separat exprimierte N- bzw. C-Bereiche der Cyanophycin-Synthetase wurden wie folgt hergestellt: Beide Bereiche wurden mit Taq-Polymerase über die in Tabelle 6 angegebenen Primer amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und nach Elution aus dem Gel in den Vektor pGEM-T ligiert. Das cphA enthaltende Plasmid wurde in E. coli DH5α transformiert und diese Zellen anschließend auf LB-Agar-Platten (Amp(100µg/ml), Xgal, IPTG) ausplattiert.
Die cphA-pGEM-T-Konstrukte wurden an den in Tabelle 6 angegebenen, teilweise neu eingeführten, Restriktionsschnittstellen mit den entsprechenden Endonucleasen geschnitten. Die Inserts wurden durch Agarosegelelektrophorese


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abgetrennt, aus dem Gel eluiert und in den mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnittenen, ebenfalls gereinigten Expressionsvektor pET-19b ligiert.

Tabelle 6: Daten zur Konstruktion der N- bzw. C-Bereichen. Primersequenzen gehen aus Tabelle 3 hervor

Bereich

Aminosäuren

Benutzte Primer

Restriktionsschnittstellen

N-Bereich

Aminosäure 1-447

WL 96, WL 226

NdeI, XhoI

C-Bereich

Aminosäure 429-901

WL 141, WL 92

NdeI, XhoI

2.2.6.8.4. Konstruktion einer Deletion im N-Bereich (ΔN)

Das Gen cphA in dem Konstrukt pRGL23 (siehe Abschnitt 2.2.6.8.1.) wurde mit den Restriktionsendonucleasen NdeI und XhoI aus dem Vektor geschnitten, gereinigt und in den mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnittenen und anschließend gereinigten Vektor pET-19b ligiert, sodass N-terminal eine His10-tag codierende Sequenz zusätzlich exprimiert wurde. Dieses Konstrukt zur Expression des Wildtyp-Gens und des His10-tags wurde mit KpnI und SpeI geschnitten und das 8,4 kbp große Fragment nach Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Der 3‘-Überhang wurde mit Klenow-Enzym abgeschnitten. Das 5‘-Ende des Fragmentes wurde mit Klenow-Enzym aufgefüllt und beide Enden mit sich selbst ligiert (Tab. 7).

2.2.6.8.5. Konstruktion einer Deletion im C-Bereich (ΔC)

Das wie in 2.2.6.8.3. präparierte His10-Wildtyp-Konstrukt in pET-19b wurde mit den Restriktionsenzymen EagI und SnaBI geschnitten und das erhaltene 7,8 kbp-Fragment nach Agarosegelektrophorese isoliert. Das 5‘-Ende des Fragments wurde mittels Klenow-Enzym aufgefüllt und anschließend beide Enden miteinander ligiert.

Tabelle 7: Daten zur Konstruktion deletierter Cyanophycin-Synthetasen

Deletionsmutante

Deletion

Benutzte Restriktionsenzyme

ΔN-Mutante

Aminosäure 233-307

KpnI/SpeI

ΔC-Mutante

Aminosäure 482-758

EagI/SnaBI


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03.11.2003