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4.  Diskussion

4.1. Reaktionsmechanismus der Cyanophycin-Synthetase

Durch den Einsatz synthetischer N- bzw. C-terminal blockierter Primer konnte mittels MALDI-Massenspektroskopie, SDS-PAGE und Gelfiltration gezeigt werden, dass sich die Elongation von Cyanophycin vom C-Terminus aus vollzieht. Ferner wurde festgestellt, dass die Aminosäuren Aspartat und Arginin einzeln und sukzessiv von der Cyanophycin-Synthetase mit synthetischen Primern oder Cyanophycin verknüpft werden. Der Mechanismus für die Ausbildung der Peptidbindung bzw. der Isopeptidbindung beinhaltet vermutlich jeweils eine Phosphorylierung der Carboxylgruppen des C-terminalen Aspartatrestes des Cyanophycin-Primers. Dabei ist die Bildung der Peptidbindung vom N-Bereich, die der Isopeptidbindung vom C-Bereich der Synthetase abhängig.
Die Reaktionen, die zur Verlängerung eines Cyanophycin-Moleküls um zwei Aminosäuren, also um ein β-Aspartyl-Arginin-Strukturelement führen, können in Phosphorylierungsschritte und Elongationsschritte eingeteilt werden. Die Reihenfolge dieser Schritte sowie eine möglicherweise feste Abfolge der verschiedenen Enzym-Substrat-Bindungen und möglicher Änderungen der Konformation der Cyanophycin-Synthetase in Abhängigkeit der Substrate bleibt ungeklärt. Vorstellungen dazu werden aber im weiteren Verlauf dieses Abschnittes diskutiert. Die Bildung des β-Acylphosphates konnte über Autoradiographie gezeigt werden, die des entsprechenden α-Acylphosphates jedoch nicht.
Abbildung 21 zeigt eine Modellvorstellung für einen Elongationszyklus, bei dem jeweils eine Aktivierung als Acylphosphat und eine Kondensation (Verknüpfung der Aminosäuren durch nucleophile Substitution) des zu addierenden Substrats alternieren:


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Abbildung 21: Elongationsmechanismus: alternierende Abfolge von Phosphorylierung und Kondensationsreaktion

Das nicht nachgewiesene „stumpfe“ α-Phospho-Cyanophycin (rechte Formel in Abb. 21) ist in Klammern gezeigt. Das β-Asp-Arg-Strukturelement mit der Anzahl x ist umrahmt gezeigt. Jeweils innerhalb eines vollständigen Elongationszyklus erhöht sich die Größe x auf x+1, in dieser Grafik nach Abschluss der 2. Kondensationsreaktion.


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Es muss angenommen werden, dass das nicht nachgewiesene α-Acylphosphat intermediär existiert, da die Struktur von Cyanophycin eine gesicherte Erkenntnis ist (Simon & Weathers 1976, Steinbüchel et al. 1997, Hejazi et al. 2002) und während der Gesamtreaktion ATP zu ADP und Pi hydrolisiert wird (Ziegler et al. 1998).

4.1.1. Aktivität des C-Bereiches der Cyanophycin-Synthetase

Für die Planung von ortsgerichteten Mutagenesen wurden durch Sequenzvergleiche Aminosäuren mit möglicher Nucleotid-Bindungs-Funktion ermittelt (Tab. 10, Abschnitt 3.7.). Es wurden ortsgerichtete Mutagenesen an vier in allen Cyanophycin-Synthetasen konservierten Positionen durchgeführt (Sequenzvergleiche in Abschnitt 6.3.1.). Die im N-Bereich durchgeführten Mutationen K261G, E298A und N392D bewirkten, dass ein Einbau von [³H]-Asp nicht mehr stattfand, Arginin jedoch eingebaut werden konnte (Tab. 12, Abschnitt 3.7.).
Die in Abbildung 21 (Abschnitt 4.1.) dargestellte "2. Phosphorylierungs-reaktion" von Cyanophycin konnte mit dem Wildtyp-Enzym, den Varianten K261G, E298A und N392D, sowie mit „nativem“ und „spitzem“ Cyanophycin nachgewiesen werden (Abb. 17 und 19, Abschnitt 3.9.). Die Anwesenheit von 0,2 mM Arginin in einem Reaktionsansatz mit Wildtyp-Enzym bewirkte, dass keine Phosphorylierung mehr zu detektieren war (Abb. 19, Spuren 4 und 14). Zusammen mit dem Befund, dass ein [³H]-Arg-Einbau durch das Wildtyp-Enzym oder die Varianten K261G, E298A oder N392D weiterhin katalysiert wurde, ergibt sich die Vermutung, dass die Anwesenheit von Arginin im Reaktionsansatz eine Dephosphorylierung des β-Acylphosphates bei gleichzeitiger Verknüpfung des Cyanophycin-Primers mit Arginin bewirkte (siehe "2. Kondensationsreaktion", Abb. 21).

4.1.1.1. Reihenfolge der Substratbindung durch den C-Bereich

Die strukturelle Ähnlichkeit des C-Bereiches der Cyanophycin-Synthetase zu einer Superfamilie von Ligasen, der mehrere Murein bildende Ligasen angehören (siehe Abschnitt 3.7.), lässt Spekulationen über die Reihenfolge der Substratbindung zu.
Der Lysinrest K497 als Teil des hoch konservierten P-loops (Sequenz-vergleiche in Abschnitt 6.3.) hat möglicherweise die Funktion der Fixierung des β-Phosphats des Substrats ATP im aktiven Zentrum zur Arginin-Bindung (Tab. 10, Abschnitt 3.7.). Analog zu der von mir erzeugten Mutation K497A von CphA aus A. variabilis existiert eine Studie, in der die Mutante K130A von MurC (UDP-MurNAc:L-


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Alanin Ligase) aus E. coli untersucht wurde (Bouhss et al. 1997). Diese MurC-Mutante weist eine auf 1/1000 verringerte Aktivität und einen stark erhöhten KM-Wert für ATP und das Substrat UDP-MurNAc (UMA) auf. Es wurde vorgeschlagen, dass die UMA-Bindung ATP-abhängig ist und dass die Substratbindung durch MurC in der Reihenfolge ATP, UMA und zuletzt Alanin erfolgt (Bouhss et al. 1997). Eine Untersuchung der analogen Mutante in MurD ergab das gleiche Ergebnis (Bouhss et al. 1999, Bertrand et al. 2000). Eine entsprechende Reihenfolge der Substratbindung wurde für MurF aus E. coli aufgrund kinetischer Daten von Anderson et al. (1996) vorgeschlagen.
Übertragen auf den C-terminalen Bereich der Cyanophycin-Synthetase lässt sich deshalb folgende Reihenfolge der Substratbindung vermuten: Zuerst würde ATP, anschließend der „spitze" Cyanophycinprimer und zuletzt Arginin gebunden. Das β-Acylphosphat würde ausgebildet und Arginin mit dem Primer kondensiert werden.

4.1.1.2. Aspartat verringert eine nachweisbare Phosphorylierung

Abbildung 19 zeigt, dass Aspartat eine deutliche Abschwächung der Phosphorylierung des „nativen" Cyanophycins (Abb. 19, Spur 3) und eine geringe Verringerung für das „spitze" Cyanophycin bewirkte (Abb. 19, Spur 13). Da „stumpfes", d.h. α-Phospho-Cyanophycin nicht gefunden wurde (Abb. 19, Spur 8) trat also vermutlich eine Hydrolyse des β-Acylphosphates ohne Ausbildung einer Amidbindung ein, denn das β-Acylphosphat, das detektiert werden konnte, reagiert nach Abbildung 21 nicht mit Aspartat, sondern nur mit basischen Aminosäuren. Diese Reaktion führt also möglicherweise zu einem Verlust an ATP.
Möglich ist, dass durch die Aspartatbindung des Wildtyp-Enzyms eine Konformationsänderung ausgelöst wurde, die entweder die „2. Phosphorylierungsreaktion" (Abb. 21) blockierte oder eine sofortige Hydrolyse des β-Acylphosphates auslöste. Eine mögliche Dephosphorylierung des β-Acylphosphates könnte durch eine geringe Substratspezifität für das „spitze" Cyanophycin verursacht worden sein, denn beide Acylphosphate haben, vom Cα-Atom des C-terminalen Aspartatrestes gerechnet, lediglich eine um eine CH2-Gruppe unterschiedliche Entfernung zum Phosphorylierungs-Ort innerhalb des C-terminalen Bereiches der Cyanophycin-Synthetase. Im Vergleich zu allen anderen


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beteiligten Substraten, insbesondere Cyanophycin, ist dies eine geringe molekulare Differenz.

4.1.2. Aktivität des N-Bereiches der Cyanophycin-Synthetase

Der N-Bereich der Cyanophycin-Synthetase ist maßgeblich an der Katalyse der Peptidbindung, d.h. der Verknüpfung von Cyanophycin mit Aspartat beteiligt, da das Enzym K497A, bei dem eine Mutagenese im C-Bereich durchgeführt wurde, die Fähigkeit besitzt, [³H]-Aspartat in das Polymer zu inkorporieren, [³H]-Arginin aber nicht mehr mit Cyanophycin verknüpfen kann (Tab. 12).
Vermutlich ist der Reaktionsmechanismus für den N-Bereich der gleiche wie der für den C-Bereich: Die α-Carboxylgruppe des „stumpfen" Cyanophycins wird als Acylphosphat aktiviert, ein nucleophiler Angriff der α-Aminogruppe eines Aspartatmoleküls führt zur Bildung der Peptidbindung. Das postulierte, während dieser Reaktion intermediär entstehende Zwischenprodukt (das „stumpfe" Phospho-Cyanophycin), konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden (Abb. 19, Spur 7).
Gestützt wird die Annahme, dass a-Acylphosphat während der Reaktion mit Aspartat entsteht, durch die Sequenzvergleiche, die eine Homologie mit den relativ gut charakterisierten Enzymen der ATP-grasp-Superfamilie nahelegen (Berg et al. 2000).
Die einzige Alternative zur intermediären Existenz eines Acylphosphates wäre eine Phosphorylierung der anderen beteiligten funktionellen Gruppe, der a-Aminogruppe von Aspartat. N-Phosphorylierungen von a-Aminogruppen sind meines Wissens in der Literatur nicht beschrieben. In Abschnitt 3.9. wurden vier Hypothesen zur Erklärung des Befundes eingeführt, dass "stumpfes" Phospho-Cyanophycin sowie eine Phosphorylierungsreaktion durch die Enzymmodifikation K497A nicht nachgewiesen werden konnte. Sowohl für die „Hypothese 1", dass die Cyanophycin-Präparationen bereits als a-Acylphosphat vorlagen (Abschnitt 3.9.1.) als auch für die „Hypothese 3" (Abschnitt 3.9.3.) einer schnellen Rückreaktion des postulierten a-Acylphosphates in Gegenwart von ADP, konnten experimentell keine Anhaltspunkte gefunden werden. Die verbliebenen zwei Hypothesen werden im Folgenden erörtert.


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4.1.2.1.  Möglicherweise ist der Anteil „stumpfen" Cyanophycins gering

Das mutierte Enzym K497A kann nur die Aminosäure Aspartat einbauen (Tab. 12), es benötigt als Substrat ein mit Arginin gesättigtes, d.h. „stumpfes“ Cyanophycinmolekül, da nach meinen Ergebnissen keine Verlängerung eines „spitzen“ Cyanophycinmoleküls mit Aspartat stattfindet (Massenspektren 6 und 7, Abschnitt 6.2.1.). Die von K497A katalysierte Reaktion zwischen „stumpfem“ Cyanophycin und Aspartat verläuft vermutlich über eine intermediäre Phosphorylierung der α-Carboxylgruppe des Cyanophycins, wie in Abbildung 21 dargestellt ist. Ein geringerer Anteil „stumpfen“ Cyanophycins (Hypothese 2, Abschnitt 3.9.2.) könnte zu einer geringen Menge an α-Acylphosphat führen. Da die gezeigten Autoradiographien keine Information über Mengen gebildeten Phospho-Cyanophycins liefert, könnte ein Detektionsproblem vorliegen, d.h. die Menge gebildeten „stumpfen“ Phospho-Cyanophycins wäre nicht nachweisbar.
Abbildung 18 zeigt, dass die Mengen eingebauten [³H]-Arginins bei mit Aspartat vorinkubiertem „spitzen“ Cyanophycin ebenso wie bei dem nicht vorinkubierten „nativen“ Cyanophycin höher sind, als die für [³H]-Aspartat. Dies ist ein weiteres Indiz dafür, dass „natives" Cyanophycin aus E. coli nach seiner Isolierung überwiegend in der spitzen Form vorkommen könnte oder dass ein höherer Anteil „spitzen" Cyanophycins durch die Isolierungsmethode, d.h. Lösung in 0,1 N HCl und Ausfällung bei neutralem pH-Wert, verursacht worden sein könnte.
Gesichert ist aber die Erkenntnis, dass beide Cyanophycin-Formen, d.h. „stumpfes“ und „spitzes“ Cyanophycin, Bestandteile der Cyanophycinpräparation sind, da beide Aminosäuren unabhängig voneinander in Cyanophycin inkorporiert werden können (Tab. 12).
Massenspektrum 15 (Abschnitt 6.2.) zeigt demgegenüber ausschließlich „stumpfes“ Cyanophycin. Ursache dafür könnte sein, dass die Verlängerung der Cyanophycin-Primer mit Arginin bei Einsatz beider konstituierender Aminosäuren ungleich schneller als die mit Aspartat abläuft.

4.1.2.2. Die Phosphorylierung der α-Carboxylgruppe könnte mechanistisch an die Bindung eines Aspartatrestes gekoppelt sein

Es ist weiterhin möglich, dass die Phosphorylierung der α-Carboxylgruppe mechanistisch an die Bindung von Aspartat gekoppelt ist.


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Die strukturell verwandten Enzyme der ATP-grasp-Superfamilie (Abschnitt 1.9.) weisen meistens eine aus drei Domänen bestehende Struktur auf. Alle Strukturvergleiche von mit und ohne Substrat (bzw. Substrat-Analogen) kristallisierten Proteinen zeigen eine deutliche Bewegung der B-Domäne in Richtung auf die C-Domäne. Die Substrate liegen dazwischen (Thoden et al. 2000).
Ein Mitglied der ATP-grasp-Ligase-Superfamilie ist die Biotin-Carboxylase, die ein Teil des Acetyl-CoenzymA-Carboxylase-Komplexes ist, der eine Carboxylgruppe eines Hydrogencarbonat-Ions auf Acetyl-CoenzymA überträgt. Thoden et al. (2000) beschreiben die B-Domäne der Biotin-Carboxylase aus E. coli als eine Art Deckel, der die gebundenen Substrate in der Bindungstasche fixiert. Blanchard et al. (1999) und Sloane et al. (2001) untersuchten die Kinetik der Substratbindung durch die Biotin-Carboxylase bzw. mehrerer punktmutierter Varianten und stellten einen substratinduzierten Synergismus fest: ATP kommt erst nach der Bindung von Biotin in eine für die ATP-Hydrolyse bzw. Phosphorylierung des Carbonates passende Position, weil die Biotin-Carboxylase erst nach der Bindung von Biotin eine energetisch günstige Konformation, eine sogenannte „near attack conformation" (Bruice & Lightstone 1999), einnimmt. Die Reihenfolge der Substratbindung durch die Biotin-Carboxylase ist folgende: Zuerst wird ATP gebunden, was relativ zu den anderen Teilreaktionen die bedeutendste Konformationsänderung des Enzyms auslöst, anschließend wird Bicarbonat und zuletzt Biotin gebunden.
Übertragen auf die Reaktion des N-Bereiches der Cyanophycin-Synthetase würde das für die Reihenfolge der Substratbindung bedeuten, dass zuerst ATP, anschließend „stumpfes" Cyanophycin (entspricht Hydrogencarbonat bei der Reaktion der Biotin-Carboxylase) und zuletzt Aspartat (entspricht Biotin) vom N‑Bereich gebunden würde. Die Bindung von Aspartat würde sowohl die ATP-Hydrolyse und die Phosphorylierung von „stumpfem" Cyanophycin aber auch die Verknüpfung von Aspartat mit Phospho-Cyanophycin induzieren. Dies könnte die Ursache für das nie gefundene „stumpfe" Phospho-Cyanophycin sein (Abb. 19, Spur 7), sowie außerdem für die nicht gefundene Phosphorylierung von Cyanophycin durch die im C-terminalen Bereich mutierte Synthetase K497A (Abb. 17). Bildlich vorstellen lässt sich dieser Zusammenhang als „Deckelwirkung" einer spekulativen B-Domäne des N-Bereiches der Cyanophycin-Synthetase. Dieser „Deckel" könnte so lange geschlossen bleiben, bis die Ausbildung der Peptidbindung abgeschlossen ist.


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Diese Hypothese könnte überprüft werden durch kinetische Untersuchungen in Verbindung mit der Erzeugung verschiedener Mutanten oder den Einsatz eines Substrats, das wie Aspartat vom Enzym gebunden wird, aber keine α-Aminogruppe besitzt. Im zweiten Fall würde die Peptidbindung nicht ausgebildet, das postulierte Acylphosphat sollte aber bestehen bleiben können. Für kinetische Untersuchungen der Cyanophycinbindung wären allerdings größere Mengen einheitlichen Cyanophycins notwendig, da eine uneinheitliche Primär- und Sekundärstruktur des Cyanophycins immer verschiedene Interpretationen der Ergebnisse zulässt. Cyanophycin aus biologischen Quellen hat dafür keine ausreichende Homogenität.

4.1.2.3. Zusammenfassung der Experimente zur Phosphorylierung von Cyanophycin durch den N-Bereich der Cyanophycin-Synthetase

Der N-Bereich der Cyanophycin-Synthetase katalysiert den Einbau von Aspartat (Abschnitt 3.7.). Es muss angenommen werden, dass die gesamten Schwärzungen der Autoradiographien in den Abbildungen 17 und 19 (Abschnitt 3.9.) von [³²P]-markierten β-Acyl-Phosphaten verursacht sind und das α-Acylphosphat nicht detektiert wurde (Abschnitt 4.1.).
Die einzige ohne Widersprüche auskommende Erklärung dafür, dass das a-Phospho-Cyanophycin nicht nachgewiesen werden konnte, ist die Hypothese, dass die Phosphorylierung erst nach Bindung von Aspartat durch die Cyanophycin-Synthetase eintritt, sodass keine ATP-Hydrolyse ohne Kondensation von Aspartat und Cyanophycin geschieht (Abschnitt 4.1.2.2.). Aufgrund der in Abschnitt 4.1.2. dargelegten Vergleiche vermute ich die Bindungsreihenfolge ATP, „stumpfes" Cyanophycin und zuletzt Aspartat.

4.1.3. Aktivitäten der Bereiche im Vergleich

Sowohl „stumpfes“ als auch „natives“ Cyanophycin sind in der Präparation enthalten, da sowohl [³H]-Asp als auch [³H]-Arg ohne Anwesenheit der komplementären Aminosäure mit Cyanophycin verknüpft werden konnten (Tab. 12, Spalte „nativ“). Dass die vermutete Dephosphorylierung bei Anwesenheit von Arginin vollständig ablief, kann damit erklärt werden, dass das α-Acylphosphat in dieser Arbeit nie detektiert werden konnte, also vermutlich ausschließlich β-Phospho-Cyanophycin zu detektieren war.


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Die Reihenfolge der Substratbindung durch beide aktive Zentren der Cyanophycin-Synthetase könnte, wie anhand von Vergleichen mit verwandten Enzymen (Abschnitte 4.1.1.1. und 4.1.2.2.) beschrieben, gleich sein: Zuerst würde ATP, anschließend Cyanophycin und zuletzt das Aminosäuresubstrat gebunden. Diese Reihenfolge könnte unkoordiniert oder koordiniert und evtl. in den C- und N-terminalen Bereichen der Synthetase zeitlich verschränkt erfolgen. Im Verlauf der Phosphorylierungsreaktionen unterscheiden sich die Aktivitäten beider Bereiche aber offenbar. Eine abschließende Klärung der Wechselwirkungen zwischen Substraten und Cyanophycin-Synthetase kann nur durch kinetische Untersuchungen oder durch Aufklärung der dreidimensionalen Struktur der Cyanophycin-Synthetase erfolgen.

4.2. Komplementierungsversuche

Sämtliche Kombinationen von jeweils in N- oder C-Bereich mutierten Synthetasen komplementierten sich, sie bildeten bei vollständigem in vitro-Reaktionsansatz über Nacht färbbare Mengen Polymer (Abschnitt 3.8., Abb. 14). Es ergab sich der auffällige Befund, dass die Funktion von E298A nicht nur mit dem im C-Bereich mutierten Enzym K497A komplementiert werden kann, sondern auch mit beiden anderen ebenfalls im N-Bereich veränderten Mutanten K261G und N392D. Wie Tabelle 10 zeigt, ist E298A möglicherweise als einzige der im N-Bereich mutierten Aminosäuren nicht an der Phosphatgruppenbindung des ATP beteiligt. Räumlich etwas entfernt könnte E298 die Funktion haben, den Adeninrest zu koordinieren.
Die Katalyse von Amidbindungen durch die Cyanophycin-Synthetase besteht aus zwei Teilreaktionen: Zuerst wird ein Acylphosphat gebildet, anschließend folgt eine Kondensation mit einer der Aminosäuren (dargestellt in Abb. 21). Es ergeben sich zwei Spekulationen, wie die beobachtete Ergänzung von Teilfunktionen im N-Bereich der Synthetase zustande kommen kann:


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Sämtliche im N-Bereich mutierten Synthetasen konnten „spitzes" Cyanophycin an der β-Carboxylgruppe des überhängenden Aspartatrestes phosphorylieren (Abb. 17) und anschließend mit Arginin verknüpfen (Tab. 12). Die Enzym-Varianten K261G und N392D haben möglicherweise die gleiche Teilfunktion verloren, denn eine Kombination aus K261G und N392D (Abb. 14, Spur 12) führt im Gegensatz zu den beiden anderen Kombinationen von N-Bereich-Mutanten nicht zur Bildung des Polymers.
Eine Mutante könnte also eventuell das Acylphosphat bilden, anschließend könnte das Phospho-Cyanophycin zu einer anders mutierten Synthetase diffundieren, durch die dann die Bildung der Peptidbindung katalysiert würde. Das β-Acylphosphat besitzt eine gewisse Stabilität bei neutralem pH-Wert, denn es konnte als Autoradiographie sichtbar gemacht werden (Abb. 16). Es erscheint also möglich, dass diese Stabilität ausreicht, um eine (ungerichtete) Diffusion zu einer anders mutierten Synthetase zu überdauern.
Eine Interpretation ist also, dass eine N-Bereich-Mutante kein Acylphosphat ausbilden kann, die andere N-Bereich-Mutante aber in der Funktion des nucleophilen Angriffs und damit dem zweiten Schritt der Ausbildung einer Peptidbindung deaktiviert ist.
Eine andere mögliche Deutung für die Befunde ist, dass die komplette Funktion zur Bildung von Cyanophycin nur von einem Di- oder höheren Oligomer der Synthetase ausgeführt werden kann. Diese Erklärung würde ohne Annahme einer Diffusion des großen und sterisch anspruchsvollen Phospho-Cyanophycinmoleküls und eines stabilen Zwischenproduktes, dem Acylphosphat, auskommen. Auch native Cyanophycin-Synthetase aus Anabaena variabilis könnte als Homodimer vorliegen, wie auch von Ziegler et al. (1998) anhand der Retentionszeit an einer kalibrierten Größenausschlusschromatographiesäule vermutet wurde.
Voraussetzung für die Hypothese der Wechselwirkung zweier verschiedener Synthetasemutanten müsste eine räumliche Nähe der funktionellen Reste sein, die möglicherweise auch im Homodimer des Wildtyp-Enzyms eine Funktion hat. Eine solche räumliche Nähe zwischen den sich in der Funktion ergänzenden N-Bereichen von K261G und E298A, bzw. E298A und N392D, könnte auch bedeuten, dass für eine Funktion des Wildtyp-Enzyms ein Dimer vorhanden sein muss oder kann. Im Wildtyp-Enzym könnte über ein kontrolliertes Monomer-Dimer-Gleichgewicht eine Regulation der Aktivität erfolgen. Wenn diese Deutung zutreffend sein sollte, wäre


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Cyanophycin-Synthetase als Dimer oder höheres Oligomer aktiv. Es kann zur Zeit keine sinnvolle Aussage über mögliche Kontakte zwischen jeweiligen N-Bereichen oder zwischen C- und N-Bereichen (Kopf-Schwanzkontakt) getroffen werden.
Da Cyanophycin wegen seiner verzweigten Struktur ein sterisch anspruchsvolles Molekül darstellt, ergibt sich die Frage, ob es evtl. einen Transportmechanismus gibt, sodass das Cyanophycinmolekül nicht durch ungerichtete Diffusion in die Position für eine neue Runde des Elongationszyklus kommen muss.

4.3. Alternative Teilstrukturen von Cyanophycin

Die Existenz eines α-verknüpften Polyaspartatrückgrates ist gesichert, weil nach partieller alkalischer Hydrolyse der Isopeptidbindungen Poly-α-Aspartat entstand (Steinbüchel et al. 1997), und durch Dünnschichtelektrophorese das durch Cyanophycinase gebildete Abbauprodukt von Cyanophycin als α-Asp-Arg identifiziert wurde (Hejazi 2002).
Die Befunde von Ziegler et al. (1998) und Stephan (2000), dass teilweise ein höherer molarer Anteil basischer Aminosäuren als Aspartat im Polymer vorhanden ist, lassen sich aber nicht mit der regulären Struktur von Cyanophycin (Abb. 2) erklären. Cyanophycin aus Cyanobakterien weist ferner eine andere Größenverteilung und teilweise eine andere Aminosäurezusammensetzung als das von heterolog exprimierten Synthetasen gebildete Polymer auf (Abschnitt 1.2.). Außerdem existiert eine Untersuchung über ein Polymer als Produkt eines heterolog in E. coli exprimierten Proteins aus Desulfitobacterium hafniense mit erheblicher Sequenzähnlichkeit zu CphA, das anders als das cyanobakterielle Cyanophycin in Wasser sehr gut löslich ist, obwohl es einen weitgehend identischen Aufbau besitzt (Ziegler et al. 2002).
Es wird deshalb in diesem Abschnitt erörtert, welche alternativen Teilstrukturen mit diesen Befunden korreliert sein könnten, ohne aber die Struktur (Abb. 2) grundsätzlich in Frage zu stellen.
Unterschiedliche Lysin/Arginin-Verhältnisse könnten durch unterschiedliche cytoplasmatische Konzentrationen der Aminosäuresubstrate in den verschiedenen Cyanobakterien und E. coli verursacht sein. Wie diese Arbeit zeigt, können Cyanophycin-Synthetasen anstelle von Arginin andere Aminosäuren, wie Lysin, Citrullin oder Ornithin inkorporieren. Unbekannt sind aber die zu unterschiedlichen


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Wachstumsbedingungen vorhandenen Substratkonzentrationen in den jeweiligen Organismen.
Cyanophycin besitzt, je nachdem, ob zuletzt Aspartat oder Arginin gebunden wurde, neben den Guanidinogruppen der Argininreste und dem Aminoterminus, zwei oder drei verschiedene freie Carboxylgruppen als einzige funktionelle Gruppen, die für eine Polymerverlängerung in Frage kommen (Abb. 22A).

Abbildung 22: Variationen der Struktur von Cyanophycin

4.3.1. Diskussion der Abbildung 22B

Abbildung 22B zeigt die Struktur nach Bildung einer Amidbindung zwischen der freien Carboxylgruppe des regulären Argininrestes und der α-Aminogruppe eines weiteren Argininrestes. Die Entfernungen zwischen dem in Abbildung 22A gekennzeichneten Cα-Atom des vorletzten Aspartats und den freien Carboxylgruppen von Arginin oder der β-Carboxylgruppe des C-terminalen Aspartatrestes sind gleich groß. Dies könnte die Ursache für eine zusätzliche Verknüpfung mit Arginin sein, wie sie in Abbildung 22B dargestellt ist.
Ein Beleg für eine solche Reaktion wurde nicht gefunden. Es existieren aber Messungen, nach denen das Verhältnis Arg/Asp bis zu 1,3 sein kann (Stephan 2000, Synechocystis PCC 6803 unter Phosphatlimitierung auf NO3 - als einziger Stickstoffquelle) oder das Verhältnis Asp:Arg:Lys entsprechend 1 : 1,15 : 0,07 (Ziegler et al. 1998, heterolog in E. coli exprimierte Cyanophycinsynthetase aus A. variabilis), was nur mit einer Verknüpfung vereinbar ist, wie sie in Abbildung 22B gezeigt ist.


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4.3.2.  Diskussion der Abbildung 22C

Eine in Abbildung 22C gezeigte Bindung von Arginin an die α- anstelle der β-Carboxylgruppe ist ebenso vorstellbar. Es würde hier im Vergleich zur regulären Struktur eine Differenz im Abstand von der Länge einer Methylengruppe existieren. Würde die Reaktion der Kettenverlängerung anschließend, wie in Abbildung 22C angedeutet, fortgesetzt, entstünde ein gemischtes α,β-Polyaspartatrückgrat des Polymers, das molare Verhältnis Arg:Asp wäre unverändert 1. Ein einmaliger Einbau von Arginin und ein anschließender Abbruch der Kettenverlängerung würde das Mengenverhältnis von Arginin zu Aspartat nur geringfügig erhöhen (1% bei einer Polymerlänge von 100 Dipeptid-Strukturelementen, entspricht einer Molmasse von 27 kDa).
Eine solche Reaktion könnte durch spontane Umlagerung erfolgen, wenn eine Carboxylgruppe des Aspartatrestes frei ist (Aswad et al. 2000) oder möglicherweise durch die Cyanophycin-Synthetase katalysiert werden. Diese hypothetische Teilstruktur wird auch gestützt durch den Befund von Aboulmagd et al. (2001), dass α,β-D-L-Polyaspartat für heterolog in E. coli exprimierter Cyanophycin-Synthetase aus Synechocystis PCC 6308 eine Primerwirkung besitzt.

4.3.3. Diskussion der Abbildung 22D

Die Strukturvariation mit der möglicherweise größten physikalischen und biologischen Auswirkung ist in Abbildung 22D dargestellt. Nach Bindung eines Aspartatrestes an die Carboxylgruppe von Arginin könnte ein verzweigtes Polymer entstehen. Wie bei der Struktur in Abbildung 22C wäre hier eine Differenz im Abstand vom asymetrischen C-Atom des Aspartatrestes vorhanden.
Für die Überprüfung der genannten alternativen Reaktionen wären synthetische Primer, denen manche funktionelle Gruppen fehlen, geeignete Instrumente.

4.4. Löslichkeit und Struktur von Cyanophycin

Sämtliche synthetisierten Peptide mit cyanophycinartiger Struktur, wie auch die Aminosäuren Aspartat und Arginin, sind in Wasser gut löslich. Das Polymer Cyanophycin ist in Wasser unlöslich und liegt in den Zellen als Granulum vor. Die Größenverteilung und Menge löslichen Cyanophycins in Cyanobakterien ist unbekannt, da lösliches Cyanophycin weder mikroskopisch, noch durch die von


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Simon entwickelte Isolierungsmethode, die auf der Unlöslichkeit bei neutralem pH-Wert beruht, erfasst wird. Nicht bekannt ist ferner, ab welcher Kettenlänge das Polymer unlöslich wird. Falls ab einem Molekulargewicht von ca. 25 kDa eine Unlöslichkeit einträte, stellt sich mir die Frage, wie Cyanophycin-Synthetase dieses Substrat in das aktive Zentrum gelangen lässt. Ich vermute, dass das C-terminale Ende des Cyanophycins nicht als ungelöst gelten kann, sondern beweglich im Cytoplasma vorliegt, sodass sowohl Cyanophycin-Synthetase als auch das abbauende Enzym Cyanophycinase angreifen können. In elektronen-mikroskopischen Aufnahmen von Cyanophycingranula (Abb. 1) sind teilweise radiale Kanäle sichtbar. Ob in solchen Kanälen für die Bewegung der Cyanophycin metabolisierenden Enzyme Raum vorhanden ist und dort die reaktiven C-Termini der Cyanophycinmoleküle zugänglich sind, bleibt Spekulation.
Es ist sowohl denkbar, dass jeder Cyanophycinstrang bis zu einer maximalen Kettenlänge synthetisiert wird, als auch dass die Strangsynthesen wiederholt abbrechen und gegebenenfalls wieder aufgenommen werden. Simon (1976) untersuchte an zellfreien Extrakten aus Anabaena cylindrica die Größenverteilung und Reaktivität des gesamten aus A. cylindrica isolierten Cyanophycins als Substrat der Cyanophycin-Synthetase. Er fand bei allen Cyanophycin-Massen einen Einbau von [³H]-Arginin, d.h. auch bei Cyanophycin mit einer Masse von mehr als 100 kDa. Eine systematische Untersuchung dieser Frage wurde mit gereinigter Synthetase noch nicht durchgeführt.
Ferner ist unbekannt, warum es eine sehr große Varianz der Größe des Polymers gibt. Bei heterolog exprimierten Synthetasen entsteht in allen bekannten Fällen ein Polymer mit der Größe zwischen 25 und 30 kDa, in Cyanobakterien beträgt die Größe zwischen 25 und bis zu 130 kDa (Simon 1976, Anabaena cylindrica, Hai et al. 1999, Synechococcus MA19). Unterhalb dieser Molmasse ist Cyanopyhcin möglicherweise löslich. Das Löslichkeitsverhalten von Cyanophycin könnte aus mehreren Gründen variabel sein:


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Ab einer Kettenlänge von 25 kDa ist zumindest ein Teil des aus verschiedenen Organismen gewonnenen Cyanophycins unlöslich, denn es wurde als in Säure löslicher und bei neutralem pH-Wert unlöslicher Stoff isoliert. Es findet aber teilweise eine Elongation bis zu einer Masse von 30 kDa statt. Warum endet die Elongation dann aber teilweise bei einer Moleküllänge von 25 kDa wegen möglicher Unlöslichkeit von Cyanophycin, während andere Moleküle bis zu einer Größe von 30 kDa verlängert werden? Die einfachste Erklärung für die entstehende Molekülgröße ist, dass Cyanophycin, zumindest im Bereich seiner Synthese, als löslich betrachtet werden darf. Zum Ende der Synthese könnten sich Synthetase und Polymer aus unbekannten Gründen voneinander trennen, das Polymer könnte durch langsame Faltung ausfallen. Die Existenz von Cyanophycin mit größerem, „natürlichem" Molekulargewicht in Cyanobakterien könnte durch zelluläre Faktoren, die die Trennung von Synthetase und Polymer verhindern, verursacht werden. Eine systematische Untersuchung dieser Frage, wie z.B. auch ein denkbarer Einfluss der Ionenstärke, wurde von mir nicht durchgeführt.
Das von Ziegler et al. (2002) untersuchte, dem Cyanophycin sehr ähnliche Polymer, das von einer heterolog exprimierten Synthetase aus D. hafniense in E. coli gebildet wurde, ist im Gegensatz zu Cyanophycin sehr gut in Wasser löslich. Der relativ hohe Lysingehalt dieses Polymers (ca. 10% der basischen Aminosäuren) kann nicht allein als Erklärung für die gute Wasserlöslichkeit dienen, denn es existieren Aminosäureanalysen von Cyanophycin, die einen ebenso hohen Lysingehalt, aber klassisches (Un-) Löslichkeitsverhalten belegen (Krehenbrink et al. 2002, heterolog in E. coli exprimierte Cyanophycin-Synthetase aus Synechocystis PCC 6308). Die Struktur des von der Synthetase aus D. hafniense synthetisierten Polymers ist dem prinzipiellen Modell (Abb. 2) sehr ähnlich. Ziegler et al. fanden neben dem relativ hohen Lysinanteil nach Verdau des Polymers mit Cyanophycinase aus A. variabilis ATCC 29413 ein Tetrapeptid Asp2Arg2. Ziegler et al. schlugen deshalb als mögliche Erklärung der veränderten Löslichkeitseigenschaften eine teilweise verzweigte Struktur analog Abbildung 22D (Abschnitt 4.3.) vor.

4.5. Keine in vitro-Cyanophycin-Synthese ohne Primer

In vivo kann Cyanophycin von verschiedenen Organismen de novo synthetisiert werden. In vitro gelang lediglich eine Elongationsreaktion zugesetzter Primer. Die Existenz eines in vivo für eine Elongation notwendigen Primers und seine spekulative


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Struktur wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht aufgeklärt. Der Fakt, dass Cyanophycin von verschiedenen Prokaryoten bei heterologer Expression der Cyanophycin-Synthetase gebildet werden kann, legt die Vermutung nahe, dass es in vivo keinen spezifischen Primer gibt, da er sowohl in allen untersuchten Cyanobakterien als auch in den für die heterologen Expressionen verwendeten Wirts-Organismen vorhanden sein müsste.
Hai et al. (2001) erzielten bei ihren Versuchen zur Substratspezifität der Cyanophycin-Synthetase aus Synechococcus sp. strain MA 19 teilweise andere Ergebnisse. Im Gegensatz zu mir (Abb. 10, Spur 12) erzielten sie mit dem Dipeptid α-Arg-Asp eine in vitro-Primerwirkung, d.h. es fand eine zumindest durch den Einbau radiomarkierten Arginins gemessene Synthese von Cyanophycin statt. Mit α-Arg-Asp einer anderen Charge hingegen wurde keine Synthese beobachtet. Außerdem fanden sie eine Primerwirkung bei gleichzeitiger Verwendung von Cyanophycin-Synthetase als Rohextrakt zusammen mit Membranbestandteilen aus Synechococcus PCC 7942 oder einem Polyaspartanteile enthaltenden Exo-Protein aus Klebsiella, was allerdings mit gereinigtem Enzym nicht bestätigt werden konnte. Die Autoren schlugen deshalb vor, dass strukturbildende Moleküle als eine Art „Kristallisationskeim" für die in vitro-Synthese von Cyanophycin dienen könnten.
Möglich wäre auch, dass eine in vitro-Synthese von Cyanophycin, besonders bei der Verknüpfung der ersten Aminosäuren, entweder unbekannte Reaktionsbedingungen erfordert oder am Anfang sehr langsam erfolgt. Verkürzte synthetische Primer wie (DR)-D, (DR)2 oder (DR)2-D könnten Aufschluss über die minimale Struktur von in vitro aktiven Primern geben. Sie wurden im Verlauf dieser Arbeit nicht synthetisiert.

4.6. Diskussion der Substratspezifität

Nur α-Aminosäuren mit basischer Funktion der Seitenkette werden, soweit mir bekannt, als Substrat ersatzweise für Arginin akzeptiert. Die Aminosäurezusammensetzung von Cyanophycin in Cyanobakterien ist stark abhängig von den verwendeten Kultivierungsbedingungen (Stephan et al. 2000, persönliche Mitteilung von Martin Krehenbrink), dem eingesetzten Vektorsystem (Krehenbrink et al. 2002), der Herkunft des Gens, sowie dem Bakterienstamm, in dem diese Vektoren zur Expression gebracht werden.


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Die Aminosäuren Lysin, Citrullin und Ornithin konnten zwar anstelle der Aminosäure Arginin eingebaut werden (Abschnitt 6.2.1., Spektren 11 bis 15), es entstand aber keine für eine Färbung mit Coomassie ausreichende Menge Polymer (Abb. 12, Abschnitt 3.6.). Für Lysin enthaltende Peptide wurde eine weitere Reaktion mit Aspartat nachgewiesen (Abschnitt 6.2.1., Spektrum 11), für ein Citrullin enthaltendes Peptid konnte keine weitere Verlängerung gefunden werden (Abschnitt 6.2.1., Spektrum 14).
Die Ergebnisse von Merritt et al. (1994) und Wingard et al. (2002), dass Glutamat in Synechocystis PCC 6308 und Synechococcus sp. strain G2.1 ein Bestandteil von Cyanophycin sein kann, konnten innerhalb dieser Arbeit für das von der Cyanophycin-Synthetase aus A. variabilis produzierte Polymer nicht bestätigt werden.

4.7. Physiologische Bedeutung von Cyanophycin

Die physiologische Funktion von Cyanophycin ist bis heute nicht gut charakterisiert.
Der Fakt, dass sehr viele Cyanobakterien unter ATP-Verbrauch Cyanophycin produzieren können, legt die Vermutung nahe, dass die Produktion von Cyanophycin diesen Arten einen Vorteil verschafft. Der Befund von Ziegler et al. (2001), dass eine ΔCphA-Mutante von Anabaena variabilis unter gewöhnlichen Laborbedingungen keine signifikanten Unterschiede zum Wildtyp zeigt, lässt keine eindeutigen Schlüsse über die physiologische Relevanz zu. Unterschiede im Wachstum wurden lediglich unter Hochlichtbedingungen gefunden (250 µE m‑2 s-1), die aber auch durch Einstrahlung des Sonnenlichtes erreicht werden können. Unter den gleichen Anzuchtbedingungen wies eine ΔPsbO-Mutante in Synechocystis PCC 6803, bei der die Wasserspaltung des Photosystems II reduziert ist, ein Wachstum auf Arginin als alleiniger Stickstoffquelle auf (Stephan 2000 & Stephan et al. 2000), wohingegen Wildtyp-Synechocystis nicht dauerhaft überlebensfähig war. Dieser Effekt wurde durch Wachstum auf zusätzlich angebotenem NO3 - aufgehoben. Die phänotypischen Befunde der Untersuchungen der ΔCphA-Mutante bzw. der ΔPsbO-Mutante ließen die Autoren deshalb einen Zusammenhang zwischen Cyanophycin-Akkumulation und Photosynthese oder Redoxzustand der Zelle vermuten. In Laborkulturen wird Cyanophycin im allgemeinen in der stationären Wachstumsphase gefunden, also bei unter limitierenden Bedingungen wachsenden Kulturen. Licht könnte hier ein limitierender Faktor sein.


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Bockholt et al. (1996) stellten fest, dass die kein Cyanophycin produzierenden Stämme Synechococcus PCC 6301 und 7942 eine starke L-Aminosäure-Oxidase-Aktivität mit hoher Spezifität für Arginin haben. Die Cyanophycin produzierende Art Synechocystis PCC 6803 baut Arginin demgegenüber hauptsächlich über den Arginaseweg ab (Quintero et al. 2000). Stephan (2000) schlug vor, dass einen starke Akkumulation von Cyanophycin eintritt, wenn eine hohe intrazelluläre Argininkonzentration im Verhältnis zu einer niedrigen gesamten Stickstoffmenge in der Zelle vorliegt. Die Cyanophycin-Synthese könnte also einer Arginin-Entgiftung dienen.
Für eine einfache Deutung der Regulation des Cyanophycin- bzw. des gesamten Stickstoffhaushaltes von Cyanobakterien mangelt es noch an Untersuchungen, die die verschiedenen Ergebnisse korrelieren. Eine Möglichkeit für eine Regulation der Cyanophycin-Akkumulation erhielt im Rahmen dieser Arbeit eine leichte Stützung: Cyanophycinsynthetase ist eventuell als Dimer aktiv, wie die Komplementierungsversuche (Abschnitt 4.2.) zeigten.
Weiteren Aufschluss über Expression der Cyanophycin metabolisierenden Enzyme, sowie über die Regulation des Metabolismus von Stickstoff enthaltenden Verbindungen könnten automatisierte Methoden geben, bei denen die Veränderungen im Proteom von Wildtyp-Kulturen, sowie das von ausgewählten mutierten Organismen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen, quantitativ untersucht würden. Notwendig wäre zudem Kenntnisse der Regulation der um die Substrate und ihre Vorläufer konkurrierenden Reaktionen und der jeweiligen Substratkonzentrationen.
Möglicherweise könnten die Konzentrationen der Substrate der Cyanophycin-Synthetase sowie ihrer Vorläufer eine ausreichende Erklärung für das nicht verstandene Auftreten der Cyanophycingranula bieten.


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03.11.2003