Math. -Nat. Fakultät I
Institut für Biologie
Biochemie der Pflanzen
Invalidenstraße 42
Humboldt-Universität zu Berlin
10115 Berlin

Dissertation

Untersuchungen zu Funktion und Struktur der Cyanophycin-Synthetase von Anabaena variabilis ATCC 29413

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Diplom-Chemiker Holger Berg

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Wolfgang Lockau
2. PD Dr. Rainer Zocher
3. Prof. Dr. Elfriede Pistorius

eingereicht: 10.04.2003

Datum der Promotion:11.07.2003

Zusammenfassung

Diese Arbeit befasst sich mit dem bisher noch nicht untersuchten Mechanismus der Cyanophycinbiosynthese. Hierzu wurden verschiedene kurze Cyanophycinmoleküle chemisch synthetisiert, die als definierte Primer in in vitro Experimenten verwendet wurden. Die Verwendung dieser Primer ermöglichte erstmals die Richtung der Verlängerung des Cyanophycinmoleküls aufzuklären. Die durchgeführten Experimente zeigten, dass der Einbau der konstituierenden Aminosäuren sukzessiv vom Carboxyterminus aus erfolgt. Weiterhin wurde gezeigt, dass auch die nicht proteinogenen Aminosäuren Ornithin und Citrullin vom Enzym eingebaut werden. Mittels ortsgerichteter Mutagenese wurde zudem eine Zuordnung unterschiedlicher Abschnitte der Cyanophycin-Synthetase zu den verschiedenen vom Enzym katalysierten Teilreaktionen versucht. Mutationen im N-terminalen Bereich der Cyanophycin-Synthetase aus Anabaena variabilis ATCC 29413 führten dazu, dass Aspartat nicht mehr in Cyanophycin eingebaut wurde, eine Mutation im C-terminalen Bereich bewirkte, dass Arginin nicht mehr mit Cyanophycin verknüpft werden konnte. Als Reaktionsmechanismus wird für die Bindung beider Aminosäuren jeweils eine Phosphorylierung des C-terminalen Aspartatrestes von Cyanophycin als Acylphosphat vorgeschlagen, wobei die Phosphorylierung der β-Carboxylgruppe mittels γ-[³²P]-ATP nachgewiesen werden konnte, die Phosphorylierung der α-Carboxylgruppe jedoch nicht. Durch Vergleiche mit Enzymen ähnlicher Aminosäuresequenz und bekannter Raumstruktur wird eine mögliche Begründung für diese unterschiedlichen Befunde gegeben.

Eigene Schlagworte: Cyanophycin, Cyanophycin-Synthetase, Nichtribosomale Peptidsynthese, Cyanobakterien

Summary

This work is occupied with the till now not investigated mechanism of the biosynthesis of cyanophycin. Therefore different short cyanophycin molecules were synthesized chemically, which were employed as defined primers in in vitro experiments. The usage of these primers made it possible to clear up the direction of the elongation of the cyanophycin molecule for the first time. The carried out experiments showed, that the incorporation of the constituent amino acids happens successively starting from the carboxy-terminus. Further it was shown that the non-proteinogenic amino-acids ornithine and citrulline are incorporated by the enzyme. Using site-directed mutagenesis an assignment between segments of the cyanophycin synthetase to different parts of the reactions catalyzed by the enzyme was carried out. Mutations in the N-terminal part of cyanophycin synthetase of Anabaena variabilis ATCC 29413 lead to the finding, that aspartate was not incorporated into cyanophycin anymore. A mutation in the C-terminal part resulted in the disability of the enzyme to incorporate arginine into cyanophycin. As reaction mechanism for the attachment of both of the amino acids a phosphorylation of the C-terminal aspartate as an acylphosphate was proposed. The phosphorylation of the beta-carboxylic-group could be shown by using gamma-[³²P]-ATP, the phosphorylation of the alpha-carboxylic group could not be shown. By comparison with enzymes with a similar amino acid sequence and known three-dimensional structure a possible explanation was given.

Eigene Schlagworte: Cyanophycin, cyanophycin synthetase, nonribosomal peptide synthesis, cyanobacteria






„Es giebt wohl kaum ein Plasmagebilde höherer Pflanzen,
mit dem nicht schon die Cyanophycinkörner
für identisch erklärt worden sind“ (Hegler 1901).




„Diese Versuche ergaben, dass die Kristalloide
als typische Reservestoffe aufzufassen sind,..." (Hegler 1901)

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03.11.2003