Math. -Nat. Fakultät I
Institut für Biologie
Biochemie der Pflanzen
Invalidenstraße 42
Humboldt-Universität zu Berlin
10115 Berlin

Dissertation

Untersuchungen zu Funktion und Struktur der Cyanophycin-Synthetase von Anabaena variabilis ATCC 29413

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Diplom-Chemiker Holger Berg

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Wolfgang Lockau
2. PD Dr. Rainer Zocher
3. Prof. Dr. Elfriede Pistorius

eingereicht: 10.04.2003

Datum der Promotion:11.07.2003

Zusammenfassung

Diese Arbeit befasst sich mit dem bisher noch nicht untersuchten Mechanismus der Cyanophycinbiosynthese. Hierzu wurden verschiedene kurze Cyanophycinmoleküle chemisch synthetisiert, die als definierte Primer in in vitro Experimenten verwendet wurden. Die Verwendung dieser Primer ermöglichte erstmals die Richtung der Verlängerung des Cyanophycinmoleküls aufzuklären. Die durchgeführten Experimente zeigten, dass der Einbau der konstituierenden Aminosäuren sukzessiv vom Carboxyterminus aus erfolgt. Weiterhin wurde gezeigt, dass auch die nicht proteinogenen Aminosäuren Ornithin und Citrullin vom Enzym eingebaut werden. Mittels ortsgerichteter Mutagenese wurde zudem eine Zuordnung unterschiedlicher Abschnitte der Cyanophycin-Synthetase zu den verschiedenen vom Enzym katalysierten Teilreaktionen versucht. Mutationen im N-terminalen Bereich der Cyanophycin-Synthetase aus Anabaena variabilis ATCC 29413 führten dazu, dass Aspartat nicht mehr in Cyanophycin eingebaut wurde, eine Mutation im C-terminalen Bereich bewirkte, dass Arginin nicht mehr mit Cyanophycin verknüpft werden konnte. Als Reaktionsmechanismus wird für die Bindung beider Aminosäuren jeweils eine Phosphorylierung des C-terminalen Aspartatrestes von Cyanophycin als Acylphosphat vorgeschlagen, wobei die Phosphorylierung der β-Carboxylgruppe mittels γ-[³²P]-ATP nachgewiesen werden konnte, die Phosphorylierung der α-Carboxylgruppe jedoch nicht. Durch Vergleiche mit Enzymen ähnlicher Aminosäuresequenz und bekannter Raumstruktur wird eine mögliche Begründung für diese unterschiedlichen Befunde gegeben.

Eigene Schlagworte: Cyanophycin, Cyanophycin-Synthetase, Nichtribosomale Peptidsynthese, Cyanobakterien

Summary

This work is occupied with the till now not investigated mechanism of the biosynthesis of cyanophycin. Therefore different short cyanophycin molecules were synthesized chemically, which were employed as defined primers in in vitro experiments. The usage of these primers made it possible to clear up the direction of the elongation of the cyanophycin molecule for the first time. The carried out experiments showed, that the incorporation of the constituent amino acids happens successively starting from the carboxy-terminus. Further it was shown that the non-proteinogenic amino-acids ornithine and citrulline are incorporated by the enzyme. Using site-directed mutagenesis an assignment between segments of the cyanophycin synthetase to different parts of the reactions catalyzed by the enzyme was carried out. Mutations in the N-terminal part of cyanophycin synthetase of Anabaena variabilis ATCC 29413 lead to the finding, that aspartate was not incorporated into cyanophycin anymore. A mutation in the C-terminal part resulted in the disability of the enzyme to incorporate arginine into cyanophycin. As reaction mechanism for the attachment of both of the amino acids a phosphorylation of the C-terminal aspartate as an acylphosphate was proposed. The phosphorylation of the beta-carboxylic-group could be shown by using gamma-[³²P]-ATP, the phosphorylation of the alpha-carboxylic group could not be shown. By comparison with enzymes with a similar amino acid sequence and known three-dimensional structure a possible explanation was given.

Eigene Schlagworte: Cyanophycin, cyanophycin synthetase, nonribosomal peptide synthesis, cyanobacteria

„Es giebt wohl kaum ein Plasmagebilde höherer Pflanzen,
mit dem nicht schon die Cyanophycinkörner
für identisch erklärt worden sind“ (Hegler 1901).




„Diese Versuche ergaben, dass die Kristalloide
als typische Reservestoffe aufzufassen sind,..." (Hegler 1901)

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
  • 1.1. Cyanophycin – einleitende Bemerkungen
  • 1.2. Eigenschaften von Cyanophycin
  • 1.3.  Cyanophycinmetabolismus
  • 1.4. Bedingungen für das Auftreten der Cyanophycin-Granula
    • 1.4.1. Cyanophycin-Akkumulation und Stickstoffhaushalt der Zelle
    • 1.4.2. Cyanophycin-Akkumulation und Akineten
    • 1.4.3. Cyanophycin-Akkumulation unter Stressbedingungen
    • 1.4.4. Andere mögliche Funktionen von Cyanophycin
  • 1.5.  Übereinstimmende Merkmale der Organismen, die Cyanophycin synthetisieren
  • 1.6. Strategien der nichtribosomalen Peptidsynthese
  • 1.7.  Die Cyanophycin-Synthetase
  • 1.8.  Verbreitung der Cyanophycin-Synthetase
  • 1.9.  Primärsequenz und strukturelle Merkmale der Cyanophycin-Synthetase
• 2.  Material und Methoden
  • 2.1. Material
    • 2.1.1. Chemikalien
    • 2.1.2. Radiochemikalien
    • 2.1.3. Enzyme:
    • 2.1.4. Säulen-Material
    • 2.1.5. Kits
    • 2.1.6.  Nucleinsäuren
    • 2.1.7. Filter, Röntgenfilme, sonstiges Material
    • 2.1.8. Technische Geräte
    • 2.1.9. Biologisches Material
      • 2.1.9.1. Bakterienstämme
      • 2.1.9.2. Plasmide
  • 2.2. Methoden
    • 2.2.1. Anzuchtbedingungen, Zellernte und Zellaufbruch
      • 2.2.1.1. Anzuchtbedingungen
      • 2.2.1.2. Zellernte
      • 2.2.1.3. Zellaufbruch und Herstellung des Rohextraktes
    • 2.2.2. Reinigung der Proteine
      • 2.2.2.1. Reinigung des Wildtyp-Enzyms und der mutierten Cyanophycin-Synthetasen an BlueSepharose CL-6B
      • 2.2.2.2.  Reinigung von Cyanophycin-Synthetase/His10-tag-Fusionsproteinen an Ni-NTA-Agarose
      • 2.2.2.3.  Trennung an Hi load Superdex-200
    • 2.2.3. Synthese verschiedener Peptide
      • 2.2.3.1. Synthese der Cyanophycinprimer
      • 2.2.3.2. Synthese von β-Asp-Arg
    • 2.2.4. Analytische Verfahren
      • 2.2.4.1. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
      • 2.2.4.2. Coomassie-Färbung
      • 2.2.4.3. Immunblot
      • 2.2.4.4. MALDI-TOF-Massenspektroskopie
      • 2.2.4.5. Quantitative Proteinbestimmung
    • 2.2.5. Biochemische Untersuchungen
      • 2.2.5.1. Reaktionsbedingungen für den Einbau von [³H]-markierten Substraten
      • 2.2.5.2. Reaktionsbedingungen für die Produktanalyse über SDS-PAGE
      • 2.2.5.3. Bedingungen für die Produktanalyse mittels MALDI-TOF-Massenspektroskopie
      • 2.2.5.4. Bestimmung der Phosphorylierung von Cyanophycin durch die Cyanophycin-Synthetase
        • 2.2.5.4.1. Bestimmung der Phosphorylierung von Cyanophycin
        • 2.2.5.4.2. Bestimmung der Stabilität des gebildeten Phosphats
      • 2.2.5.5. Trennung von Reaktionsprodukten durch Größenausschluss-Chromatographie an einer P2-Säule und Nachweis der Kalibranden
    • 2.2.6. Gentechnische Arbeiten
      • 2.2.6.1. Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli
      • 2.2.6.2. Agarosegelelektrophorese von DNA
      • 2.2.6.3. Elution von DNA aus Agarosegelen
      • 2.2.6.4.  Verdau von DNA mit Restriktionsendonucleasen
      • 2.2.6.5. Ligation von DNA-Fragmenten
      • 2.2.6.6. Transformation von E. coli
      • 2.2.6.7. Sequenzierungen
      • 2.2.6.8. Herstellung verschiedener cphA-Konstrukte
        • 2.2.6.8.1. Ortsgerichtete Mutagenesen
        • 2.2.6.8.2. Umklonierung von cphA in den Vektor pET-19b
        • 2.2.6.8.3. Konstruktion und Expression von separat exprimierten cphA‑Bereichen
        • 2.2.6.8.4. Konstruktion einer Deletion im N-Bereich (ΔN)
        • 2.2.6.8.5. Konstruktion einer Deletion im C-Bereich (ΔC)
• 3.  Ergebnisse
  • 3.1. Fragestellung und Lösungsansätze
    • 3.1.1.  In vitro-Synthese von Cyanophycin
  • 3.2. Versuche, die CphA-Anreicherung zu optimieren
  • 3.3.  In vitro-Elongation mit Hilfe synthetischer Primer
  • 3.4. Test verschiedener Peptide als Aminosäuresubstrat bzw. Primer
  • 3.5. Abfolge des Einbaus der Aminosäuresubstrate
  • 3.6.  Substratspezifität der Cyanophycin-Synthetase
  • 3.7.  Struktur der Cyanophycin-Synthetase
  • 3.8. Komplementierungsversuche mit verschieden mutierten Synthetasen
    • 3.8.1. Deletionsmutanten und separat exprimierte Bereiche
  • 3.9.  Mechanismus der Cyanophycin-Synthese
    • 3.9.1.  Hypothese 1: Die α-Carboxylgruppe der Cyanophycin-Präparation liegt immer phosphoryliert vor
    • 3.9.2. Hypothese 2: Der Anteil des „stumpfen" Cyanophycins, d.h. des Cyanophycins ohne überhängenden Aspartatrest, ist relativ gering
    • 3.9.3. Hypothese 3: Cyanophycin-Synthetase katalysiert eine schnelle Dephosphorylierung des α-Acylphosphates
    • 3.9.4. Hypothese 4: Die Phosphorylierung der α-Carboxylgruppe ist mechanistisch an die Bindung eines Aspartatrestes gekoppelt.
• 4.  Diskussion
  • 4.1. Reaktionsmechanismus der Cyanophycin-Synthetase
    • 4.1.1. Aktivität des C-Bereiches der Cyanophycin-Synthetase
      • 4.1.1.1. Reihenfolge der Substratbindung durch den C-Bereich
      • 4.1.1.2. Aspartat verringert eine nachweisbare Phosphorylierung
    • 4.1.2. Aktivität des N-Bereiches der Cyanophycin-Synthetase
      • 4.1.2.1.  Möglicherweise ist der Anteil „stumpfen" Cyanophycins gering
      • 4.1.2.2. Die Phosphorylierung der α-Carboxylgruppe könnte mechanistisch an die Bindung eines Aspartatrestes gekoppelt sein
      • 4.1.2.3. Zusammenfassung der Experimente zur Phosphorylierung von Cyanophycin durch den N-Bereich der Cyanophycin-Synthetase
    • 4.1.3. Aktivitäten der Bereiche im Vergleich
  • 4.2. Komplementierungsversuche
  • 4.3. Alternative Teilstrukturen von Cyanophycin
    • 4.3.1. Diskussion der Abbildung 22B
    • 4.3.2.  Diskussion der Abbildung 22C
    • 4.3.3. Diskussion der Abbildung 22D
  • 4.4. Löslichkeit und Struktur von Cyanophycin
  • 4.5. Keine in vitro-Cyanophycin-Synthese ohne Primer
  • 4.6. Diskussion der Substratspezifität
  • 4.7. Physiologische Bedeutung von Cyanophycin
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Anhang
  • Berechnete mittlere Molmassen
  • Dokumentation der MALDI-Massenspektren
  • Erläuterung und Diskussion der MALDI-Massenspektren
  • Allgemeines
  • Erläuterung der Spektren:
  • Proteinsequenzvergleich
  • Proteinsequenzvergleich zwischen CphA aus A.variabilis und anderen Cyanobakterien
  • Proteinsequenzvergleich zwischen CphA aus A.variabilis und ähnlichen Sequenzen aus nichtcyanobakteriellen Bakterien
  • Legende zu Sequenzvergleichen
  • Verschiedene als Substrat untersuchte Verbindungen
  • Publikationen
• Erklärung
• Danksagung

Tabellen

• Tabelle 1: Beispiele für Zusammenhang von Cyanophycin-Akkumulation und Phosphathaushalt der Zelle
• Tabelle 2: Heterologe Expression von Cyanophycin-Synthetasen
• Tabelle 3: Eingesetzte Primer
• Tabelle 4: Nachweis mit Ninhydrin
• Tabelle 5: Dokumentation der Orte der Mutagenesen, der verwendeten Abschnitte des Gens cphA sowie der verwendeten Primer
• Tabelle 6: Daten zur Konstruktion der N- bzw. C-Bereichen. Primersequenzen gehen aus Tabelle 3 hervor
• Tabelle 7: Daten zur Konstruktion deletierter Cyanophycin-Synthetasen
• Tabelle 8: Zusammenfassung der Ergebnisse zur Aufklärung der Elongations-richtung: Reaktionsansätze mit verschiedenen Primern
• Tabelle 9: Zusammenfassung der Ergebnisse zur Substratspezifität
• Tabelle 10: Punktmutationen und Lage der Aminosäurereste im aktiven Zentrum verwandter Enzyme, bei denen die räumliche Struktur aufgeklärt wurde
• Tabelle 11: verwendete Primer und Ergebnisse der Mutagenesen
• Tabelle 12: Aktivitätstest der punktmutierten Synthetasen
• Tabelle 13: (nach Duclos et al. 1991): Chemische Stabilität verschiedener phosphorylierter Aminosäuren
• Tabelle 14:

Bilder

• Abbildung 1: Elektronenmikroskopische Aufnahme von Anabaena variabilis ATCC 29413
• Abbildung 2: Struktur von Cyanophycin
• Abbildung 3: Darstellung des Cyanophycinmetabolismus
• Abbildung 4: Polkörperchen am Septum zwischen Heterocyste und vegetativer Zelle> ATCC 29413
• Abbildung 5: synthetische Primer
• Abbildung 6: Test des Peptides (DR)3 als Primer, SDS-PAGE (15% Acrylamid)
• Abbildung 7: Elongationsansätze unter Verwendung C- oder N-terminal blockierter Peptide als Primer, SDS-PAGE (15% Acrylamid)
• Abbildung 8: Test des Primers (DR)3-D und Test des Dipeptides β-Asp-Arg als Primer und als Substrat, SDS-PAGE (15% Acrylamid)
• Abbildung 9: Test des Dipeptids β-Asp-Arg als Aminosäuresubstrat, SDS-PAGE (15% Acrylamid)
• Abbildung 10: Test verschiedener Dipeptide und hoher Synthetasekonzentrationen, SDS-PAGE (15% Acrylamid)
• Abbildung 11: Exemplarische Darstellung der Analysen mittels P2-Säule und MALDI-MS
• Abbildung 12: In vitro-Elongationsansätze mit den anstelle von Arginin eingesetzten Aminosäuren Lysin, Ornithin, und Citrullin, SDS-PAGE (15% Acrylamid)
• Abbildung 13: Stark schematisierter Sequenzvergleich zwischen Cyanophycin-Synthetase (A. variabilis) mit anderen Proteinsequenzen
• Abbildung 14: In vitro-Cyanophycin-Synthese mit Kombinationen verschieden mutierter Synthetasen, SDS-PAGE (15% Acrylamid)
• Abbildung 15: In vivo-Elongationsansätze unter Verwendung separat exprimierter Bereiche, SDS-PAGE (15% Acrylamid)
• Abbildung 16: Existenz und Stabilität des phosphorylierten Cyanophycins, SDS‑PAGE (15% Acrylamid)
• Abbildung 17: Phosphorylierungsexperimente, SDS-PAGE (15% Acrylamid) A: Autoradiographie; B: Acrylamidgel, mit Coomassie gefärbt
• Abbildung 18: Relative Menge eingebauter Aminosäuren nach Vorbehandlung des Cyanophycins unter verschiedenen Bedingungen
• Abbildung 19: Phosphorylierung vorbehandelten Cyanophycins. SDS-PAGE (15% Acrylamid)
• Abbildung 20: Zusätzlich eingeführte Reaktion zur Beseitigung von entstehendem ADP
• Abbildung 21: Elongationsmechanismus: alternierende Abfolge von Phosphorylierung und Kondensationsreaktion
• Abbildung 22: Variationen der Struktur von Cyanophycin
• Spektrum 1: Edukt (Ahx) 2 -(DR) 3
• Spektrum 2: (Ahx) 2 -(DR) 3 +Asp
• Spektrum 3: Edukt (DR) 3 -(Ahx) 2
• Spektrum 4: (DR) 3 -(Ahx) 2 +Asp
• Spektrum 5: Edukt (DR) 3
• Spektrum 6: (DR) 3 +Asp
• Spektrum 7: (DR) 3 -D+Asp
• Spektrum 8: (DR) 3 -D+Arg
• Spektrum 9: (DR) 3 -D kein Substrat
• Spektrum 10: (DR) 3 +Glu
• Spektrum 11: (DR) 3 -D-Lys+Asp
• Spektrum 12: (DR) 3 -D+Orn
• Spektrum 13: (DR) 3 -D+Cit
• Spektrum 14: (DR) 3 -D-Cit+D
• Spektrum 15: (DR)3+Asp+Arg
• Proteinsequenzvergleich zwischen CphA aus A.variabilis und anderen Cyanobakterien
• Proteinsequenzvergleich zwischen CphA aus A.variabilis und anderen Cyanobakterien
• Proteinsequenzvergleich zwischen CphA aus A.variabilis und ähnlichen Sequenzen aus nichtcyanobakteriellen Bakterien
• Proteinsequenzvergleich zwischen CphA aus A.variabilis und ähnlichen Sequenzen aus nichtcyanobakteriellen Bakterien
• Verschiedene als Substrat untersuchte Verbindungen