Aus der Klinik für Allgemein-, Visceral-, Gefäß- und Thoraxchirurgie der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Regulation der Stabilität der proangiogenen
Transkriptionsfaktoren c-Jun, Id1 und Id3
durch das COP9-Signalosom

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité –
Universitätsmedizin Berlin

von
Matthias Berse
aus Cottbus

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. W. Dubiel
2. Prof. Dr. M. Naumann
3. Prof. Dr. rer. nat. R. Schäfer

eingereicht: 10.05.2005

Datum der Promotion: 30.01.2006

Zusammenfassung

Für die Progression des Wachstums maligner Tumoren und ihre Metastasierung ist die Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden, eine essentielle Voraussetzung. Innerhalb dieses Prozesses spielen Transkriptionsfaktoren eine bedeutende Rolle.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass drei proangiogene Transkriptionsfaktoren, c-Jun, Id1 und Id3, in ihrer Stabilität gegenüber dem Ubiquitin/26S-Proteasom-System, der wichtigsten zellulären Proteinabbaumaschinerie, durch das COP9-Signalosom (CSN) kontrolliert werden. Das COP9-Signalosom bildet einen multimeren Proteinkomplex, der eine deutliche Sequenz- und Strukturhomologie mit dem Lid, einem Subkomplex des 26S-Proteasoms, aufweist. In Immunpräzipitationen, Dichtegradientenzentrifugationen, Far-Western-Blots und Pulldown-Experimenten konnte die Bindung sowohl von c-Jun als auch von Id3 an die Untereinheit CSN5 demonstriert werden. Id3 interagiert zusätzlich mit CSN7.

Rekombinantes c-Jun, ein bekanntes Substrat der CSN-assoziierten Kinasen CK2 und PKD, wird in einem Ubiquitinierungs-Assay durch Curcumin, einen potenten Hemmstoff dieser Kinasen, deutlich destabilisiert. Daneben induziert Curcumin in diesem in vitro-System hochmolekulare Formen von c-Jun. Auch in HeLa-Zellen akkumulieren in Gegenwart von Curcumin hochmolekulare c-Jun-Abkömmlinge, bei denen es sich höchstwahrscheinlich um Ubiquitin-Konjugate handelt. Ferner beschleunigt Curcumin, ebenso wie die CK2- und PKD-Inhibitoren Emdodin, DRB und Resveratrol, in HeLa-Zellen den proteasomalen Abbau von c-Jun. Die c-Jun-abhängige Produktion von VEGF, dem potentesten angiogenen Wachstumsfaktor, wird durch alle vier Kinase-Hemmstoffe signifikant reduziert. Verstärkt wird dieser Effekt noch durch den proteasomalen Inhibitor MG-132, der auch allein die Synthese von VEGF supprimiert, obwohl er c-Jun stabilisiert.

Im Gegensatz zu c-Jun wird Id3 nicht von den CSN-assoziierten Kinasen phosphoryliert. Allerdings hemmt es in einem Kinase-Assay die Phosphorylierung von c-Jun, ICSBP und CSN2. Die Kinase-Inhibitoren Curcumin und Emodin regen in HeLa-Zellen die Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau von transient exprimiertem Id3 an. Die Proteolyse von endogenem Id1 durch das 26S-Proteasom wird in HeLa-Zellen ebenfalls in Anwesenheit dieser beiden Hemmstoffe stimuliert. Mittels Kotransfektion der cDNAs von Id3 und His10-markiertem Ubiquitin in HeLa-Zellen konnte die Ubiquitinierung von Id3 direkt nachgewiesen werden. Curcumin fördert die Bildung von Id3-Ubiquitin-Konjugaten, was durch Western Blots und His-Pull-down-Versuche bestätigt werden konnte. Außerdem wird Id3 durch die Überexpression von CSN2 stabilisiert.

Auf diesen Daten basiert die Schlussfolgerung, dass die CSN-abhängige Phosphorylierung den Abbau von c-Jun und der beiden Id-Proteine über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System inhibiert und dadurch ein interessantes neues Ziel einer antiangiogenen Tumortherapie repräsentiert.

Eigene Schlagworte: COP9-Signalosom; c-Jun; Id1; Id3; Ubiquitinierung; Proteasom; VEGF; Angiogenese.

Summary

Angiogenesis, the formation of new blood vessels from the existing vasculature, is a prerequisite for the progression of solid tumor growth and metastasis. Transcription factors play an important role in this process.

In this study it is shown that the COP9 signalosome (CSN) regulates the stability of the three angiogenic transcription factors c-Jun, Id1 and Id3 towards the ubiquitin/26S proteasome system, the most important protein degradation machinery in cells. The COP9 signalosome constitutes a multimeric protein complex that shares sequence homology and structural similarities with the 26S proteasome lid complex. Immunoprecipitations, separations by density gradients, far Western blots and pull-down experiments revealed that both cJun and Id3 physically interact with the CSN subunit CSN5. In addition, Id3 can bind to CSN7.

In an in vitro ubiquitination assay recombinant c-Jun, a substrate of the CSN-associated kinases CK2 und PKD, is destabilized by curcumin, a potent inhibitor of these two kinases. Furthermore, curcumin induces high molecular weight (HMW) cJun species. The curcumin-induced accumulation of HMW-c-Jun species, most likely ubiquitin conjugates, could be verified in HeLa cells. All tested inhibitors of the CK2 and PKD, emodin, DRB, resveratrol, as well as curcumin accelerate the degradation of c-Jun by the 26S proteasome in HeLa cells. The cJun-dependent expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), the most potent angiogenic factor, is significantly reduced by the four kinase inhibitors. Although it stabilizes c-Jun, MG132, an inhibitor of the 26S proteasome, diminishes the production of VEGF and increases the suppressive effects of the kinase inhibitors.

In contrast to c-Jun, recombinant Id3 is not phosphorylated by the CSN-associated kinases CK2 and PKD. However, it inhibits c-Jun, ICSBP and CSN2 phosphorylation by the isolated CSN complex and by the recombinant CK2. The inhibitors of CSN associated kinases, curcumin and emodin, significantly induce ubiquitination and proteasome-dependent degradation of transiently expressed Id3 in HeLa cells. Proteasome-dependent degradation of endogenous Id1 in HeLa cells is also stimulated by treatment with curcumin or emodin. Ubiquitination of Id3 is shown directly by cotransfection of HeLa cells with the cDNA of Id3 and His10tagged ubiquitin. Curcumin increases Id3-ubiquitin conjugate formation, as shown by Western blotting and His-pull-downs. In addition, overexpression of CSN2 leads to stabilization of Id3 protein.

On the basis of these data it is concluded that CSN-mediated phosphorylation inhibits ubiquitination and proteasome-dependent degradation of c-Jun, Id1 and Id3. The COP9 signalosome thus represents an interesting new target for antiangiogenic tumor therapy.

Keywords: COP9 signalosome; c-Jun; Id1; Id3; ubiquitination; proteasome; VEGF; angiogenesis.

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20.03.2006