1. Einleitung

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Die Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden, ist eine essentielle Voraussetzung für die Progression des Wachstums maligner Tumoren. Eine wichtige Rolle in diesem Prozess spielen Wachstumsfaktoren wie VEGF, deren Expression von verschiedenen Transkriptionsfaktoren kontrolliert wird. Drei derartige proangiogene Faktoren sind c-Jun, Id1 und Id3. Ihre Aktivität wird auf verschiedenen Ebenen reguliert. Dabei kommt der Steuerung ihres Abbaus über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System eine große Bedeutung zu. In diesen Vorgang ist ein weiterer Proteinkomplex, das COP9-Signalosom, involviert.

Im folgenden sollen die hier skizzierten Vorgänge sowie die beteiligten Proteine und Komplexe vorgestellt werden.

1.1. Angiogenese

Angiogenese beschreibt den Prozess der Entwicklung neuer Blutgefäße aus bereits bestehenden. Eine komplexe Wechselwirkung zwischen Zellen, löslichen Faktoren und der extrazellulären Matrix bildet die Voraussetzung für den koordinierten Ablauf einer solchen Gefäßneubildung. Diese kann grob in eine Phase der Aktivierung und eine Phase der Konsolidierung unterteilt werden. Die Aktivierungsphase, die das Aussprossen eines neuen Gefäßes beschreibt, beginnt mit einer erhöhten Gefäßwandpermeabilität und der extravasalen Ablagerung von Fibrin. Es folgen die Auflösung der Gefäßwand und der Abbau der Basalmembran. Anschließend migrieren Endothelzellen in das Interstitium und dringen in die extrazelluläre Matrix ein. Endothelzellen beginnen, an der Migrationsfront zu proliferieren. Den Abschluss der Aktivierungsphase stellt die Ausbildung eines Gefäßlumens dar. Die Phase der Konsolidierung beinhaltet die Beendigung der Endothelzellproliferation und -migration, die Wiederherstellung der Basalmembran und das Einwandern von Perizyten in die Gefäßwand (Abbildung 1). Schließlich kommt es zum Blutfluss in dem neu gebildeten Gefäß (Bussolino et al., 1997; Gupta & Qin, 2003).

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Um zu migrieren, zu proliferieren und die Basalmembran sowie die extrazelluläre Matrix abzubauen, verändern Endothelzellen die Struktur ihres Zytoskelettes, exprimieren spezifische Oberflächenmoleküle und bilden proteolytische Enzyme (Gupta & Qin, 2003; Kalebic et al., 1983). Des weiteren trägt auch die Rekrutierung aus dem Knochenmark stammender endothelialer und hämatopoetischer Vorläuferzellen zur Angiogenese bei (Lyden et al., 2001).

Diese Vorgänge werden durch eine Vielzahl pro- und antiangiogener Faktoren stimuliert bzw. inhibiert. Dem Gleichgewicht zwischen diesen entgegengesetzt agierenden Faktoren kommt somit die entscheidende Bedeutung bei der Regulation der Angiogenese zu (Folkman & Klagsbrun, 1987). Es ist dafür verantwortlich, dass im gesunden erwachsenen Organismus nur wenig neue Gefäße gebildet werden. Eine verstärkte Angiogenese kann unter physiologischen Bedingungen im Rahmen der Wundheilung, der Follikelreifung mit der sich anschließenden Entstehung des Corpus luteum und der Embryonalentwicklung beobachtet werden. Dagegen tritt eine pathologisch gesteigerte Angiogenese bei Psoriasis, rheumatoider Arthritis, diabetischer Retinopathie und seniler Makuladegeneration auf (Longo et al., 2002). Neben diesen nicht neoplastischen Prozessen spielt der Vorgang der Angiogenese eine überragende Rolle beim Tumorwachstum jenseits einer Größe von 2-3 mm³ und bei der Metastasierung maligner Tumoren (Gupta & Qin, 2003).

Abbildung 1: Angiogenese – die Bildung neuer Blutgefäße. (A) Endothelzellen werden durch proangiogene Wachstumsfaktoren wie VEGF aktiviert. (B) Proteinasen (Kollagenasen, Plasminogen-Aktivator) bauen die Basalmembran des Blutgefäßes ab. (C) Migration und Proliferation der Endothelzellen in Richtung des angiogenen Stimulus. (D) Umhüllung der noch unreifen Blutgefäße mit einer Basalmembran und Perizyten. (modifiziert nach Wernert et al., 1999).

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Bis zum heutigen Zeitpunkt wurden eine große Anzahl sowohl pro- als auch antiangiogener Faktoren entdeckt oder das pro- bzw. antiangiogene Potential bekannter Biomoleküle nachgewiesen. Zu den die Angiogenese stimulierenden Faktoren gehören Wachstumsfaktoren wie VEGF (vascular endothelial growth factor), FGF (fibroblast growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor) oder TGF-β (transforming growth factor β), Angiopoetine sowie Proteasen, die die extrazelluläre Matrix und Basalmembran abbauen. Interleukine (IL-1,-6,-8,-15), TNF-α (tumour necrosis factor α) sowie den Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakt vermittelnde Adhäsionsmoleküle wie beispielsweise Integrin αvβ3 stellen ebenfalls proangiogene Proteine dar. Antiangiogene Eigenschaften besitzen dagegen die proteolytischen Fragmente des Plasminogen und Kollagen XVIII, bezeichnet als Angiostatin und Endostatin, TIMPs (tissue inhibitors of metalloproteinases), Interferone und die Interleukine 4, 10 und 12 (Gupta & Qin, 2003; Folkman & Klagsbrun, 1987; McNamara et al., 1998).

VEGF, der potenteste proangiogene Wachstumsfaktor (Ferrara, 2002), soll im folgenden Abschnitt im Hinblick auf seine biologische Wirkung, seine Signaltransduktion und seine Regulation beschrieben werden. In der Struktur und Komplexität dieser Prozesse steht er gleichzeitig stellvertretend für die Fülle der angiogenen Faktoren.

1.2. Der angiogene Wachstumsfaktor VEGF

1.2.1. Die Biologie von VEGF

Der 1989 identifizierte und sequenzierte Wachstumsfaktor, der ein spezifisches Mitogen für Endothelzellen repräsentiert und daher als VEGF bezeichnet wurde (Ferrara & Henzel, 1989), zeigte sich identisch mit dem sechs Jahre zuvor beschriebenen, die Permeabilität von Endothelzellen erhöhenden Protein VPF (vascular permeability factor) (Senger et al., 1983).

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VEGF stimuliert die Gefäßneubildung, indem es die Migration und Proliferation der Endothelzellen aktiviert und gleichzeitig als Überlebensfaktor für diese Zellen in den neu formierten Gefäßen, die noch nicht mit Perizyten umhüllt sind, agiert (Ferrara, 2001). Ein weiterer wichtiger Aspekt seiner biologischen Wirkung besteht in der Fähigkeit, durch die Fenestrierung der Endothelzellen und die Lockerung der Zellkontakte die Gefäßpermeabilität zu erhöhen, was die extravasale Bildung eines Fibringels ermöglicht, das eine Matrix für die Migration von Endothel- und Stromazellen darstellt (Neufeld et al., 1999). Daneben übt VEGF auch Effekte auf andere Zelltypen aus, wie beispielsweise die Stimulation der Surfactantproduktion durch Alveolarepithelzellen Typ II oder die Anregung der Chemotaxis von Monozyten (Ferrara et al., 2003).

VEGF gehört zu einer Genfamilie, die neben VEGF (=VEGFA) noch VEGFB, PlGF (placental growth factor) sowie die die Lymphangiogenese regulierenden Faktoren VEGFC und VEGFD beinhaltet (Neufeld et al., 1999). Durch alternatives Splicing werden aus dem VEGF-Gen die Isoformen VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206 und die weniger häufigen VEGF145 und VEGF183 generiert (Ferrara et al., 2003), wobei die nachgestellte Zahl jeweils die Anzahl der Aminosäuren angibt. Von den prädominanten Isoformen VEGF121, VEGF165 und VEGF189 besitzt VEGF165 die höchste biologische Wirksamkeit (Ferrara, 2001). Kürzlich gelang es, mit der Entdeckung von EG-VEGF (endocrine gland-derived VEGF) die VEGF-Familie um den ersten gewebsspezifischen Wachstumsfaktor – sowohl hinsichtlich seiner Expression als auch bezüglich der von ihm stimulierten Endothelzellen – zu erweitern (LeCouter et al., 2001).

Seine biologische Wirkung entfaltet VEGF über zwei Tyrosinkinase-Rezeptoren, VEGFR-1 (Flt-1) und VEGFR-2 (KDR/Flk-1), die sich vorrangig auf Endothelzellen befinden. Nach der Bindung eines VEGF-Dimers vollziehen zwei Rezeptoren eine Homo- oder Heterodimerisierung. Im nächsten Schritt werden zytoplasmatische Tyrosinreste autophosphoryliert. Die dadurch aktivierten intrazellulären Signalkaskaden führen schließlich zur Bildung von Proteasen, die die Basalmembran und die extrazelluläre Matrix abbauen, zur Expression von Integrinen, zur Aktivierung antiapoptotischer Signalwege und letztlich zur Proliferation und Migration der Zellen (Neufeld et al., 1999).

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Um ihre VEGF-Sekretion zu regulieren, bedient sich die Zelle vielfältiger Mechanismen. Eine Schlüsselrolle spielt dabei die Induktion der Transkription des VEGF-Gens durch Hypoxie (Shweiki et al., 1992), die hauptsächlich über die Stabilisierung des Transkriptionsfaktors HIF-1 (hypoxia-inducible factor 1) vermittelt wird (Levy et al., 1995). Weitere externe Stimulatoren der VEGF-Produktion sind die Wachstumsfaktoren EGF (epidermal growth factor), KGF (keratinocyte growth factor), IGF-1 (insulin-like growth factor 1), FGF und PDGF oder die Zytokine
TNF-α (tumour necrosis factor α), IL-1(β) und IL-6 (Neufeld et al., 1999). Ebenso können Mutationen verschiedener Onkogene, beispielsweise von Ras und Bcl2, zu einer vermehrten VEGF-Bildung führen (Ferrara et al., 2003). Am Ende der intrazellulären Signalübertragung steht jeweils die verstärkte Aktivität der Transkriptionsfaktoren AP-1, AP-2 oder SP-1 (Pollmann et al., 2001). Das Tumorsuppressorprotein p53 unterdrückt auf vielfältige Weise die Angiogenese und die Expression von VEGF. Eine in vielen Tumoren zu beobachtende Reduktion von p53 ist daher neben der Entstehung auch für die Wachstumsprogression und Metastasierung von Malignomen verantwortlich (Kerbel & Folkman, 2002).

1.2.2. VEGF als Angriffspunkt antiangiogener Medikamente

Das tiefere Verständnis der molekularen Grundlagen der Angiogenese im Allgemeinen und der Biologie von VEGF im Speziellen ermöglichte es, neue therapeutische Strategien zur Bekämpfung maligner Tumoren und anderer pathologischer Prozesse, in denen die Angiogenese eine bedeutende pathogenetische Rolle spielt, zu entwickeln. Diese Konzepte besitzen gegenüber der konventionellen Chemotherapie den Vorteil, als Angriffspunkt zirkulatorisch gut erreichbare Endothelzellen zu besitzen, die genetisch stabil sind und deshalb nur mit geringer Wahrscheinlichkeit Mutationen akkumulieren, die zur Resistenz gegenüber den verwendeten Medikamenten führen (Kerbel & Folkman, 2002). Hinzu kommt, dass sich das Tumorendothel strukturell, in Bezug auf die Expression bestimmter Oberflächenmoleküle und hinsichtlich seiner Aktivität, die sich in einer fünfzigfach höheren Teilungsrate ausdrückt, von normalem Endothel unterscheidet. Diese Differenz kann zu einer erwünschten relativen Spezifität antiangiogener Wirkstoffe beitragen (Longo et al., 2002).

Folgende den Wirkmechanismus von VEGF beeinflussende Ansätze werden gegenwärtig in klinischen Untersuchungen getestet: monoklonale Antikörper gegen VEGF oder VEGF-Rezeptoren, die Signaltransduktion von VEGF unterdrückende Inhibitoren der VEGFR-Tyrosinkinasen, Antisenseoligonukleotide und gegen die mRNA der VEGF-Rezeptoren gerichtete Ribozyme (Longo et al., 2002). Beispielsweise konnte für Bevacizumab, einen monoklonalen Antikörper gegen VEGF, in einer prospektiven randomisierten doppelblinden placebokontrollierten Studie der Phase II – der ersten derartigen Untersuchung für einen Inhibitor der Angiogenese – für Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom eine Verlangsamung der Tumorprogression bei minimaler Toxizität nachgewiesen werden (Yang et al., 2003). Kürzlich wurde Bevacizumab von der US-amerikanischen Arzneimittelbehörde FDA (Food and Drug Administration) für die Behandlung metastasierter Kolon- und Rektumkarzinome in Kombination mit einer auf Fluorouracil basierten Chemotherapie zugelassen (Sobrero & Bruzzi, 2005). Daneben stellen auch nicht neoplastische Erkrankungen, wie zum Beispiel die senile Makuladegeneration, ein vielversprechendes Einsatzgebiet für VEGF-Inhibitoren dar (Krzystolik et al., 2002).

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Mit dem entgegengesetzten Ziel, nämlich der Stimulierung der Angiogenese, wird versucht, das Gefäßwachstum fördernde Potential von VEGF zur Therapie koronarer und Gliedmaßenischämie (Henry et al., 2003; Makinen et al., 2002) sowie zur Beschleunigung der Revaskularisierung von schlecht heilenden Frakturen (Street et al., 2002) zu nutzen.

1.3. Das Onkoprotein c-Jun

1.3.1. Struktur und Wirkmechanismus

C-Jun konnte vor über 15 Jahren als zelluläres Homolog des viralen Onkoproteins v-Jun, welches vom avian sarcoma virus 17 (ASV 17) kodiert wird, identifiziert werden (Angel et al., 1987; Lee et al., 1987a,b). Das 334 Aminosäuren umfassende und 39 kDa große Protein ist die häufigste monomere Komponente des dimeren Transkriptionsfaktors AP-1 (activating protein-1). Dieser umfasst c-Jun-Homodimere ebenso wie Heterodimere, die sich aus Vertretern der Jun- (c-Jun, JunB, JunD), Fos-, ATF (activating transcription factor)- und Maf (musculoaponeurotic fibrosarcoma)-Familie bilden. Alle Mitglieder dieser Proteinfamilien gehören wie c-Jun zur Klasse der basischen Leuzinzipper (bZIP), die über eine leuzinreiche Region dimerisieren, über ein gleichfalls C-terminal gelegenes basisches Motiv die DNA binden und mittels einer N-terminalen Domäne die Transkription aktivieren (Shaulian & Karin, 2001). AP-1 Proteine binden hauptsächlich an die als TRE (phorbol 12-O-tetradecanoate-13-acetate [TPA] response element) bezeichnete DNA-Sequenz (Angel et al., 1987). Daneben existieren noch weitere Sequenzen, wie beispielsweise CRE (cAMP response element), die analog den TREs von verschiedenen AP-1 Proteinen mit unterschiedlicher Affinität gebunden werden (Eferl & Wagner, 2003).

1.3.2. Physiologische Bedeutung der AP-1-Aktivität

AP-1 trägt zur Aufrechterhaltung der basalen Genexpression bei. Daneben kann seine Aktivität durch diverse Stimuli induziert werden. Als ein solcher Stimulator konnte zuerst der Phorbolester TPA beschrieben werden, doch auch Serum, Wachstumsfaktoren, Onkoproteine (v-Src oder Ha-Ras), Zytokine (TNF-α und IL1) sowie Neurotransmitter und Hormone bewirken eine Steigerung der AP-1-Aktivität (Angel et al., 1987; Shaulian & Karin, 2001). Darüber hinaus führt genotoxischer Stress, insbesondere kurzwellige UV-Strahlung, zu einer verstärkten Expression von c-jun und c-fos (Devary et al., 1991).

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Auf verschiedenen Wegen der Mapk (mitogen-activated protein kinase)-Signaltransduktionskaskade werden die extra- und auch intrazellulären Stimuli weitergeleitet und so in eine Zunahme der AP-1-Aktivität übersetzt (Abbildung 2). Die deregulierte Expression von Onkogenen wie Ha-ras entkoppelt durch die anhaltende Stimulation bestimmter Kinasen der MAPK-Familie die Induktion von AP-1 von extrazellulären Signalen (Shaulian & Karin, 2002). Einen weiteren wichtigen Mechanismus zur Potenzierung der AP-1-Aktivität stellt die Phosphorylierung seiner Komponenten dar (Musti et al., 1997).

Abbildung 2: Transkriptionale und posttranslationale Aktivierung von AP-1. Die AP-1-Aktivität wird durch ein komplexes Netzwerk von Signalwegen stimuliert. Wachstumsfaktoren und Phorbolester führen über vorgeschaltete Kinasestufen zu einer Aktivierung der MAPK-Untergruppe ERK (extracellular signal-regulated kinase), deren Mitglieder ihrerseits TCFs (ternary complex factors) phosphorylieren (Hill et al., 1994) und auf diese Weise eine gesteigerte Transkription von c-fos bewirken. Das neu synthetisierte c-Fos interagiert mit c-Jun und erzeugt über AP-1-Bindungsstellen im c-jun-Promoter auch eine erhöhte c-jun-Transkription (Angel et al., 1988). Zytokine und UV-Strahlung hingegen bedienen sich für ihre Signaltransduktion zweier anderer MAP-Kinasen, p38 und JNK (c-Jun N-terminal kinase). Ihre Substrate, ATF2, MEF2c (monocyte-specific enhancer binder factor 2c) und c-Jun, induzieren auf direktem Weg die Expression von c-jun (Karin, 1995). Posttranslational wird die AP-1-Aktivität durch verschiedene Kinasen reguliert. Ihre Phosphorylierung verändert das Transaktivierungspotential, die DNA-Affinität und die Proteinstabilität von AP-1. Abkürzungen, die nicht im Text vorkommen: CKII=casein kinase 2, GSK-3β=glycogen synthase kinase 3β, MAPKK=MAPK kinase, RSK2=ribosomal S6 kinase 2, SRE=serum response element (aus Eferl & Wagner, 2003)

Die Verwandtschaft von c-Jun mit dem viralen Onkoprotein v-Jun sowie seine Aktivierung durch Wachstumsfaktoren und zelluläre Onkoproteine führte frühzeitig zu der Annahme, dass c-Jun eine wichtige Rolle im Prozess der Zellproliferation und -transformation spielen könnte. C-Jun ist in der Lage, immortalisierte Nager-Fibroblasten zu transformieren und bei der Transformation von embryonalen Fibroblasten mit Ha-ras zu kooperieren. Mittels Antikörper-Mikroinjektion und antisense-RNA konnte die Abhängigkeit der Zellzyklusprogression und Zellproliferation von einer intakten c-Jun-Funktion gezeigt werden (Shaulian & Karin, 2001).

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Daneben scheint c-Jun aber auch den entgegengesetzten Prozess, die Apoptose, zu steuern. Beispielsweise erfordert die Einleitung der Apoptose von Nervenzellen oder die Induktion des programmierten Zelltodes durch UV-Strahlung eine regelrechte c-Jun-Aktivität. Die gesteigerte Apoptoserate von c-jun -/--Fibroblasten und von Hepatozyten in c-Jun -/--Mäusen belegt andererseits die antiapoptotischen Eigenschaften von c-Jun (Shaulian & Karin, 2001).

Wichtige Effektorproteine, die die proliferationsfördernden und apoptoseregulierenden Eigenschaften von c-Jun vermitteln und deren Expression von c-Jun stimuliert wird, sind Cyclin D1, ein Aktivator der cyclinabhängigen Kinase CDK4 (cyclin dependent kinase 4), die Wachstumsfaktoren GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) und KGF (keratinocyte growth factor), die proapoptotischen Proteine Fas-Ligand (FasL) und BIM sowie ihr antiapoptotischer Gegenspieler Bcl3 (Shaulian & Karin, 2001). Andererseits besitzt c-Jun auch die Fähigkeit, die Transkription bestimmter Gene zu hemmen – ein als Transrepression bezeichneter Prozess. Dazu zählen die Gene des Tumorsuppressorproteins p53, des von p53 induzierten CDK-Inhibitors (CDKI) p21cip1/waf1, des CDKI p16INK4a und des Apoptosestimulators Fas (Shaulian et al., 2000; Shaulian & Karin, 2002).

1.3.3. Die Rolle von c-Jun in der Tumor- und Angiogenese

Beachtet man die Bedeutung von c-Jun für die Proliferation, Transformation und Apoptose von Zellen, erklärt sich auch sein Einfluss auf die Initiation, Progression und Angiogenese maligner Tumoren. Obwohl, wie bereits angeführt, c-Jun in der Lage ist, Zellen zu transformieren, entwickeln transgene, c-Jun überexprimierende Mäuse keine Tumoren. Dagegen geht die verstärkte Expression von c-Fos, Fra1 oder Fra2 mit einer erhöhten Inzidenz von Osteosarkomen, Lungen- bzw. epithelialen Tumoren einher (Dunn et al., 2002; Eferl & Wagner, 2003). Wahrscheinlich spielt aber auch in diesen Fällen c-Jun eine entscheidende Rolle, da Fos-Proteine untereinander keine stabilen Dimere bilden (Shaulian & Karin, 2001). Insbesondere hängt die Entstehung von Lebertumoren und chemisch induzierten Papillomen von einer intakten c-Jun-Funktion ab (Eferl & Wagner, 2003).

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Die Wichtigkeit von c-Jun und anderen AP-1-Proteinen für die Tumor- und Angiogenese lassen auch die von ihnen kontrollierten Gene erkennen. Neben den oben bereits beschriebenen kontrolliert c-Jun die Gene von HB-EGF (heparin-binding epidermal growth factor) und EGFR (EGF receptor), die Gene der die Tumorinvasion regulierenden Proteine MMP1 (matrix metalloproteinase 1), MMP3 und CD44 sowie die Gene der proangiogenen Faktoren VEGF, uPA (urokinase plasminogen activator), uPAR (uPA receptor) und Proliferin. Dabei scheint c-Jun vorrangig für die Steuerung der Proliferation und Apoptose verantwortlich zu sein, indes die Fos-Proteine eher für die Tumorinvasion und Angiogenese erforderlich sind, allerdings wiederum im dimeren Verbund mit c-Jun (Eferl & Wagner, 2003).

1.3.4. Regulation der AP-1-Aktivität

Für die Anpassung der biologischen Wirkung von c-Jun an den zellulären Kontext ist seine korrekte Regulation von größter Bedeutung. Sie vollzieht sich auf mehreren Ebenen. Zum Einen bestimmen die Dimerisierungspartner von c-Jun die Funktion des resultierenden AP-1-Komplexes. So kann beispielsweise die durch cJun initiierte Zelltransformation unterteilt werden in eine durch c-Jun-ATF2-Heterodimere geregelte, Wachstumsfaktor-unabhängige Proliferation und in ein von c-Jun-c-Fos-Dimeren gesteuertes, Verankerungs-unabhängiges Wachstum (van Dam & Castellazzi, 2001). Einen zweiten Regulationsmechanismus stellt die Induktion der c-Jun-Transkription durch die geschilderten MAPK-Signalkaskaden dar (Abbildung 2), wobei im Rahmen der Tumorgenese dem ERK-Signalweg die Rolle eines positiven Regulators zukommt, p38 aber hauptsächlich von tumorsuppressiven Signalen aktiviert wird. Die MAP-Kinasen der JNK-Familie sind in beide Prozesse involviert. Gerade für die Zelltransformation und Tumorgenese ist ein dritter Zusammenhang bedeutsam: die Interaktion von c-Jun mit Onkoproteinen wie Ha-Ras. Viertens können nukleäre Rezeptoren durch Transrepression die Transkription von AP-1-Zielgenen hemmen (Eferl & Wagner, 2003).

Als Fünftes repräsentiert die posttranslationale Modifizierung durch Phosphorylierung einen ebenfalls sehr einflussreichen Regulationsvorgang. Die Phosphorylierung von c-Jun durch eine der drei Isoformen der JNK bewirkt einerseits eine verstärkte Bindung von Koaktivatoren wie p300/CBP und damit eine Erhöhung der Transkriptionsaktivität (Dunn et al., 2002). Auf der anderen Seite aber hemmt sie auch die Ubiquitinierung von c-Jun und verzögert dadurch seinen Abbau über das 26S-Proteasom (Musti et al., 1997; Treier et al., 1994). Hier nun greift auch das weiter unten vorgestellte COP9-Signalosom (s. Abschnitt 1.6) in die Kontrolle der c-Jun-Stabilität ein. Die mit ihm assoziierten Kinasen CK2 und PKD phosphorylieren ebenfalls c-Jun und stabilisieren es auf diese Weise gegenüber dem Ubiquitin/26S-Proteasom-System (Seeger et al., 1998; Uhle et al., 2003).

1.4. Die proangiogenen Faktoren Id1 und Id3

1.4.1. Struktur und Wirkmechanismus

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Die Id-Proteine, in der Reihenfolge ihrer Entdeckung Id1 bis Id4 benannt, gehören zu der weit mehr als 200 Mitglieder umfassenden Familie der helix-loop-helix (HLH)-Transkriptionsfaktoren (Benezra et al., 1990; Christy et al., 1991; Riechmann et al., 1994; Sun et al., 1991). Nahezu alle HLH-Proteine besitzen neben der aus zwei α-Helices und einer dazwischen liegenden Schleife aufgebauten HLH-Domäne eine benachbarte basische Region (bHLH-Proteine). Die ubiquitär exprimierten E-Proteine E12, E47, E2-2 und HEB bilden über ihre HLH-Domänen untereinander oder mit den für bestimmte Zelllinien spezifischen bHLH-Proteinen Homo- bzw. Heterodimere, die daraufhin vermittels der beiden basischen Regionen charakteristische DNA-Sequenzen, welche als E-Box (CANNTG) oder N-Box (CACNAG) bezeichnet werden, binden und die Transkription von Genen der Zelldifferenzierung aktivieren. Id-Proteine sind ebenfalls in der Lage, mit bHLH-Proteinen Heterodimere zu formen, jedoch fehlt ihnen die basische DNA-bindende Region, wodurch die Id-bHLH-Dimere nicht mehr als Transkriptionsaktivatoren wirken können. Deshalb agieren Id-Proteine als negativ dominante Regulatoren der bHLH-Proteine. Der Name Id steht sowohl für „inhibitor of DNA binding“ als auch für „inhibitor of differentiation“ und beschreibt einerseits den Wirkmechanismus sowie andererseits die biologischen Konsequenzen dieser Wirkung (Benezra et al., 1990; Norton et al., 1998; Norton, 2000).

1.4.2. Physiologische Bedeutung der Id-Proteine

Ausgehend von der Tatsache, dass Id-Proteine die Funktion der die Zelldifferenzierung steuernden bHLH antagonisieren, erklärt sich die Beobachtung, dass die Differenzierung einer Vielzahl von Zelllinien von einem Absinken der Id-Proteine begleitet wird und dass im Gegenzug die Überexpression von Id-Proteinen
zu einer Blockade der Differenzierung führt (Lasorella et al., 2001;
Ruzinova & Benezra, 2003; Sikder et al., 2003). Id-Proteine nehmen auch Einfluss auf die Richtung der Differenzierung von multipotenten Vorläuferzellen. Beispielsweise ist die Entwicklung von natürlichen Killerzellen und T-Zellen aus bipotenten Ursprungszellen in Id2-Knock-out-Mäusen in Richtung der T-Zellen verschoben (Yokota et al., 1999).

Während der Embryogenese zeigen Id1, Id2 und Id3 ein Transkriptionsmuster, das weitgehende zeitliche und gewebsbezogene Überlappungen aufweist, sich aber deutlich von dem von Id4 unterscheidet (Norton et al., 1998). Diese Redundanz spiegelt sich auch in Knock-out-Mäusen für ein oder zwei Id-Gene wieder. Besitzen Tiere, in denen nur ein Gen ausgeschaltet wurde, einen relativ moderaten Phänotyp, so sterben Id1-Id3-Doppel-Knock-out-Mäuse bereits vor der Geburt (Lyden et al., 1999; Sikder et al., 2003).

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Als Inhibitoren der Zelldifferenzierung agieren Id-Proteine erwartungsgemäß auch als positive Regulatoren der Zellproliferation und spielen eine wichtige Rolle in der Kontrolle des Zellzyklus. Ruhende Zellen exprimieren nur äußerst geringe Mengen an Id-Proteinen, jedoch steigen ihre Spiegel nach Stimulation der Mitose stark an (Hara et al., 1994). Id3 wurde ursprünglich auch als ein solches „mitogen-induced early response gene“ identifiziert (Christy et al., 1991). Durch Experimente, die zeigten, dass Id-Antisense-Oligonukleotide und die Mikroinjektion von Anti-Id-Antikörpern die Progression des Zellzyklus hemmen, konnte die Einbettung der Id-Proteine in die Steuerung des Zellzyklus weiter bekräftigt werden (Norton et al., 1998).

Id2 und Id4, aber nicht Id1 und Id3, sind in der Lage, das Retinoblastomprotein (pRB) zu binden (Iavarone et al., 1994). Diese Interaktion führt einerseits zur Freisetzung des an das pRB gebundenen Transkriptionsfaktors E2F, der die Transkription von S-Phase-Genen reguliert. Andererseits wird Id2 infolge diese Bindung von der Wechselwirkung mit seinen Zielproteinen zurückgehalten (Lasorella et al., 2000). Durch die Antagonisierung der Funktion von E-Proteinen können Id-Proteine die E2A-abhängige Expression des CDKI p21Cip1/Waf1, eines negativen Regulators des Zellzyklus, unterdrücken (Prabhu et al., 1997). Id-Proteine binden und hemmen auch die ETS-domänehaltigen Proteine SAP-1 und ELK-1, die als Komponenten des TCF die „immediate early genes“ c-fos und egr-1 aktivieren (Yates et al., 1999). Da Id1 und wahrscheinlich auch Id3 andererseits durch EGR-1 stimuliert werden (Tournay & Benezra, 1996), entsteht so eine negative Rückkopplungsschleife (Abbildung 3).

Abbildung 3: Funktion der Id-Proteine im Zellzyklus. Während der G1-Phase aktivieren mitogene Signale cyclinabhängige Kinasen (CDK). Diese phosphorylieren sequentiell das Tumorsuppressorprotein pRB, das daraufhin Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie freigibt, die die Expression von S-Phase-Genen induzieren. Id2 und Id4 interagieren mit pRB und bewirken auf diesem Weg die Freisetzung der E2F-Transkriptionsfaktoren. Die Phosphorylierung von Id2, Id3 und Id4 durch die CDK2 verändert ihre Affinität gegenüber verschiedenen bHLH. Durch die Antagonisierung der bHLH-Funktion verhindern die Id-Proteine die Transkription von CDK-Inhibitoren wie p21Cip1/Waf1. In einer negativen Rückkopplungsschleife hemmen Id-Proteine Komponenten des TCF, der „immediate early genes“ wie egr-1 aktiviert, das seinerseits die Expression der Id-Gene stimuliert (aus Norton, 2000).

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Id1 inhibiert auch die DNA-Bindung von Ets1 und Ets2, woraus eine verminderte Expression des CDK-Inhibitors p16INK4a resultiert (Ohtani et al., 2001). Interessanterweise sind Id2, Id3 und Id4 selbst Substrate der CDK2 am Übergang von der G1- zur S-Phase (Deed et al., 1997; Hara et al., 1997). Diese Phosphorylierung verändert ihre Aktivität und die Bindungsspezifität gegenüber verschiedenen bHLH-Proteinen und ist für die Zellzyklusprogression von entscheidender Bedeutung (Abbildung 3).

1.4.3. Onkogene und angiogene Eigenschaften

Auf der Basis der proliferationsfördernden Eigenschaften der Id-Proteine im physiologischen Kontext lässt sich nun verstehen, dass ihre deregulierte Expression zur Tumorentstehung und -progression beitragen kann. In primären Keratinozyten führt die Überexpression von Id1 über eine Aktivierung der Telomerase sowie die Inhibition von p16INK4a und pRB zur Immortalisierung der Zellen (Alani et al., 1999). Dagegen kann Id3 embryonale Fibroblasten nur nach Kotransfektion mit den antiapoptotischen Genen Bcl2 oder BclX L immortalisieren (Norton & Atherton, 1998). Dies weist gleichzeitig auf das proapoptotische Potential der Id-Proteine hin und schlägt eine Brücke zu Onkoproteinen wie Myc, die ebenfalls die Apoptose einleiten können (Sikder et al., 2003). In einer Vielzahl maligner Tumoren konnte eine verstärkte Expression einer oder mehrerer Id-Proteine nachgewiesen werden. Darüber hinaus zeigte sich für bestimmte Tumorentitäten eine positive Korrelation zwischen der Höhe der Id-Expression und dem Verlust des histologischen Differenzierungsgrades. Außerdem gelang es, in transgenen Mäusen durch gewebsspezifische Überexpression von Id1 oder Id2 T- und B-Zell-Lymphome sowie intestinale Adenome zu induzieren (Sikder et al., 2003). Die exogene Überexpression von Id1 bewirkt nicht nur, dass Brustdrüsenepithelzellen die Basalmembran durchbrechen, sondern auch, dass eine nicht aggressive Mammakarzinomzelllinie einen aggressiveren Phänotyp annimmt (Desprez et al., 1998; Lin et al., 2000).

Neben ihrer Bedeutung für die Tumorzellen selbst konnte von Lyden et al. erstmals auch die Stellung der Id-Proteine im Prozess der Tumorangiogense genauer bestimmt werden. Knock-out-Mäuse, denen nur ein Allel des Id1- oder Id3-Genes fehlte, wiesen bereits eine dramatische Reduktion der Vaskularisierung subkutan implantierter Tumoren auf, wodurch letztendlich das Wachstum und die Metastasierung dieser Tumoren deutlich beeinträchtigt wurden (Lyden et al., 1999). Da diese Defekte durch die Transplantation gesunden Knochenmarks aufgehoben werden konnten, ließ sich als Ursache der gestörten Tumorangiogense eine eingeschränkte VEGF-abhängige Rekrutierung hämatopoetischer Stammzellen und Endothelvorläuferzellen aus dem Knochenmark Id1- bzw. Id3-defizienter Mäuse identifizieren (Lyden et al., 2001). Anders stellt sich jedoch die Situation für autochthon wachsende Tumoren dar. In einem Id-defizienten Umfeld entstehen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen mit ähnlicher Häufigkeit Malignome, die nur bei bestimmten Tumorentitäten einen veränderten Phänotyp, vermehrt abnormale Gefäße oder im Fall HER2-abhängiger Mammakarzinome auch eine deutlich erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Hsp90-Inhbitoren besitzen (de Candia et al., 2003; Li et al., 2004; Ruzinova et al., 2003). Somit scheinen im Kontext orthotop entstehender Tumoren aus dem Knochenmark stammende endotheliale Vorläuferzellen nur einen geringen Betrag zur Tumorangiogenese zu leisten. Als von Id1 regulierte proangiogene Proteine konnten das Integrin α6β4, der FGF-Rezeptor-1 und die MMP-2 nachgewiesen werden (Ruzinova et al., 2003). Gleichzeitig supprimiert es auch die Expression des antiangiogenen Faktors Thrombospondin-1 (Volpert et al., 2002).

1.4.4. Regulation der Id-Proteine

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Neben der Stimulation der Id-Transkription durch extrazelluläre Mitogene, die vornehmlich den MAPK-Signalweg aktivieren, und der Hemmung der Id-Expression durch antiproliferative Signale wie TGF-β spielen für die Regulation der Id-Proteine auch posttranslationale Mechanismen eine entscheidende Rolle (Lasorella et al., 2001; Ruzinova & Benezra, 2003). Id-Proteine werden über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System abgebaut und haben eine Halbwertszeit von ca. 60 min (Bounpheng et al., 1999). Die Heterodimerisierung mit bHLH-Proteinen verzögert einerseits den Abbau der Id-Proteine und nimmt andererseits auch Einfluss auf ihre subzelluläre Lokalisation (Bounpheng et al., 1999; Deed et al., 1996).

1.5. Das Ubiquitin/26S-Proteasom-System

Wie im Fall der Transkriptionsfaktoren c-Jun, Id1 und Id3 angedeutet wurde, stellt der koordinierte Proteinabbau ein wichtiges Werkzeug zur Regulation der biologischen Wirkung dieser Proteine dar. Ebenso kann durch den kontrollierten Abbau anderer Transkriptionsfaktoren, wie NF-κB, p53, c-Fos, c-Myc und HIF1α, die von diesen Faktoren abhängige Genexpression beeinflusst werden (Almond & Cohen, 2002; Ciechanover, 1994). Der äußerst dynamische Prozess der Zellzyklusprogression wird durch die synchronisierte Proteolyse der Cycline und der Inhibitoren der cyclinabhängigen Kinasen erst ermöglicht (Hershko, 1997). Aber auch falsch synthetisierte, nicht korrekt gefaltete oder posttranslational beschädigte Proteine werden durch die intrazelluläre Proteinabbaumaschinerie umgehend eliminiert, um die Entstehung zelltoxischer Proteinakkumulate zu verhindern (Goldberg, 2003).

1.5.1. Architektur des 26S-Proteasoms

In den skizzierten Szenarien des intrazellulären Proteinabbaus spielt das Ubiquitin/26S-Proteasom-System die zentrale Rolle (Brooks et al., 2000). Dabei werden die entsprechenden Proteine durch eine Polyubiquitinkette für den Abbau markiert und anschließend über das 26S-Proteasom abgebaut.

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Das 26S-Proteasom ist ein ca. 2000 kDa großer multimeren Proteinkomplex. Sein katalytischer Kern, bezeichnet als 20S-Proteasom, besteht aus vier heptameren Ringen, die durch ihre stapelförmige Anordnung dem 20S-Proteasom die Form eines Zylinders verleihen. Die zwei inneren Ringe setzen sich aus sieben
β-Untereinheiten, die zwei äußeren aus sieben α-Untereinheiten zusammen. Jeweils drei der sieben β-Untereinheiten besitzen die für den Proteinabbau notwendige proteolytische Aktivität (Almond & Cohen, 2002; Ciechanover, 1994). Abzubauende Proteine erhalten nur über einen engen Kanal im Zentrum der
α-Ringe Zutritt zum katalytischen Zentrum des 20S-Proteasoms. Dieser Kanal ist normalerweise verschlossen, kann aber durch den 19S-Regulator (PA700), der an einem oder beiden Enden an den 20S-Zylinder bindet und so gemeinsam mit dem 20S-Proteasom das 26S-Proteasom formt, geöffnet werden (Abbildung 4).

Abbildung 4: Das 26S-Proteasom und seine Subkomplexe. Das 26S-Proteasom setzt sich aus dem 20S-Proteasom und dem 19S-Regulator, der auf einer oder auf beiden Seiten an das 20S-Proteasom bindet, zusammen. Das zylinderförmige 20S-Proteasom besteht aus zwei äußeren und zwei inneren Ringen, den α- bzw. β-Ringen, die jeweils aus sieben Untereinheiten aufgebaut sind. Der 19S-Regulator kann in zwei weitere Subkomplexe untergliedert werden – die als Base bezeichnete Basis und die Lid genannte Kappe.

Der 19S-Regulator ist seinerseits aus zwei Subkomplexen aufgebaut – der mit dem α-Ring in Verbindung stehenden Basis (Base) und der darauf aufsitzenden Kappe (Lid) (Abbildung 4). Neben der beschriebenen Kanalöffnung kommt dabei dem Base die Aufgabe zu, die nativen, polyubiquitinierten Substratproteine zu erkennen und zu entfalten, damit sie durch die Pore im α-Ring dem Abbau zugeführt werden können. Der Lid trennt die Polyubiquitinkette vom Substrat ab und spaltet sie in ihre monomeren Bestandteile auf, die als freie Ubiquitinproteine für die Markierung weiterer Substratproteine bereitstehen (Goldberg, 2003).

1.5.2. Die Ubiquitinierung von Substratproteinen

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Die Substratmarkierung mit einer Polyubiquitinkette vollzieht sich in einer Kaskade enzymatisch gesteuerter Reaktionen, in deren Verlauf Ubiquitin, ein 76 Aminosäuren großes Protein, zuerst über eine Peptidbindung mit seinem carboxyterminalen Glycin an die ε-Aminogruppe eines Lysins des Substratproteins gebunden wird. Nachfolgend werden weitere Ubiquitinmonomere an die ε-Aminogruppe eines Lysinrestes eines schon konjugierten Ubiquitins geknüpft – vornehmlich an Lys48. Durch das fortgesetzte Anfügen weiterer Ubiquitinproteine entsteht letztendlich eine Polyubiquitinkette am Substrat, die, um vom 26S-Proteasom erkannt zu werden, aus mindestens vier Ubiquitinmonomeren bestehen muss (Hershko & Ciechanover, 1998; Pickart, 2001).

Abbildung 5: Die Multi-Enzym-Kaskade der Ubiquitinierung eines Substratproteins. Das E1 katalysiert die Aktivierung von Ubiquitin und dessen kovalente Bindung an ein Cystein des E1. Im nächsten Schritt wird Ubiquitin aus dieser Thioesterbindung auf ein Cystein des E2 übertragen. Schließlich überführt ein E3 es aus dieser zweiten Thioesterbindung auf das Substratprotein. Weitere Ubiquitinmonomere werden an Lys48 (K48) des jeweils letzten Ubiquitins der so entstehenden Polyubiquitinkette geknüpft. Das auf diese Weise markierte Substrat wird vom 26S-Proteasom erkannt und abgebaut (aus Pray et al., 2002).

Im ersten enzymatischen Schritt dieser Reaktionskette werden die Monomere durch das Ubiquitin-aktivierende Enzym E1 unter ATP-Verbrauch und Bildung eines Ubiquitinadenylates (Ub-AMP) aktiviert und anschließend über eine Thioesterbindung an das E1 selbst gebunden. In einer Transesterifizierungsreaktion wird Ubiquitin von dem E1 auf eines der ca. 50 verschiedenen Ubiquitin-konjugierenden Enzyme (E2s) übertragen, um dann aus dieser zweiten Thioesterbindung unter Katalyse einer Ubiquitinligase (E3) auf das Substratprotein transferiert zu werden (Abbildung 5). (Hershko & Ciechanover, 1998; Pickart, 2001; Pray et al., 2002).

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Der entgegengesetzte Vorgang, die Abspaltung einzelner Monomere von der Polyubiquitinkette, wird als Deubiquitinierung bezeichnet. Diese Reaktion wird von deubiquitinierenden Enzymen, DUBs (deubiquitinating enzymes) oder Ubiquitin-Isopeptidasen genannt, katalysiert (Kim et al., 2003).

1.6. Das COP9-Signalosom

1.6.1. Aufbau

Das COP9 (Constitutive photomorphogenesis 9)-Signalosom (CSN) ist ein Proteinkomplex, der vor ca. 10 Jahren als ein Gegenspieler der Photomorphogenese, der lichtabhängigen Pflanzenentwicklung, von Arabidopsis thaliana-Keimlingen identifiziert wurde (Wei et al., 1994, Wei & Deng, 1999). Nachfolgend konnte der CSN-Komplex in verschiedenen Eukaryoten – angefangen bei der Spalthefe (Mundt et al., 1999), über Drosophila melanogaster (Freilich et al., 1999) bis hin zu menschlichen Zellen (Seeger et al., 1998; Wei et al., 1998) – nachgewiesen werden.

Abbildung 6: Struktur des COP9-Signalosoms. (A) 2D-Elektronenmikroskopische Aufnahmen des CSN- und Lid-Komplexes. Eine mögliche Anordnung der CSN-Untereinheiten konnte anhand der Interaktionsstudien zwischen den Untereinheiten vorgenommen werden (Kapelari et al., 2000). Die Anordnung der Untereinheiten im Lid-Komplex wurde aus der Homologie zu den CSN-Untereinheiten abgeleitet. Der Pfeil markiert die zentrale Furche der Komplexe. (B) Modell des CSN-Komplexes basierend auf den elektronenmikroskopischen Aufnahmen (A) und den Studien zur Untereinheiteninteraktion (Kapelari et al., 2000). Die Phosphorylierung (P) von CSN2 und CSN7 ist angegeben (Modifiziert nach Bech-Otschir et al., 2002)

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Der 450 kDa große Proteinkomplex setzt sich aus den acht Untereinheiten CSN1–CSN8 zusammen, zu denen auch das thyroid hormone receptor-interacting protein TRIP15 (CSN2) und das Jun activation domain-binding protein JAB1 (CSN5) gehören (Seeger et al., 1998; Wei et al., 1998). Im Zuge der Klonierung und Sequenzierung der Untereinheiten zeigte sich eine deutliche Sequenzhomologie der CSN-Untereinheiten mit den acht Untereinheiten des Lid-Subkomplexes des 19S-Regulators (s. Abschnitt 1.5) (Glickman et al., 1998; Henke et al., 1999; Seeger et al., 1998; Wei et al., 1998). Elektronenmikroskopisch konnte dann eine, wenn auch nicht identische, so doch relativ ähnliche Architektur beider Komplexe dokumentiert werden (Abbildung 6) (Kapelari et al., 2000).

1.6.2. Intrinsische und assoziierte Aktivitäten

1.6.2.1.  Die Kinaseaktivität

Mit dem COP9-Signalosom sind drei biochemische Aktivitäten assoziiert – eine Proteinkinase, eine Deneddylase und eine Ubiquitin-Isopeptidase. Bereits bei der ursprünglichen Isolierung des COP9-Signalosoms aus humanen Erythrozyten ließ sich eine Kinaseaktivität gegenüber c-Jun, IκBα und p105, dem Vorläuferprotein der NF-κB Untereinheit p50, nachweisen (Seeger et al., 1998), die effektiv durch Curcumin, dem gelben Pigment im Curry, gehemmt werden kann (Henke et al., 1999). Von den Proteinen, die mit dem COP9-Signalosom interagieren und in ihrer Mehrzahl an CSN5 binden, sind ICSBP (interferon consensus sequence-binding protein) (Cohen et al., 2000), der Tumorsuppressor p53 (Bech-Otschir et al., 2001) und der Inhibitor der cyclinabhängigen Kinasen p27Kip1 (Huang et al., unveröffentlicht) ebenfalls Substrate dieser Kinaseaktivität. Da die Untereinheiten des CSN-Komplexes selbst keine Kinaseaktivität besitzen, wird die Substratphosphorylierung durch CSN-assoziierte Kinasen katalysiert. Als eine solche Kinase konnte zuerst die Inositol-1,3,4-triphosphat-5/6-Kinase (IP-5/6-Kinase) identifiziert werden. Sie bindet an CSN1, phosphoryliert c-Jun und ist durch Curcumin hemmbar (Sun et al., 2002; Wilson et al., 2001). Kürzlich wurden mit der Caseinkinase 2 (CK2) und der Proteinkinase D (PKD) zwei weitere Kinasen beschrieben, die das COP9-Signalosom über CSN3 (CK2 und PKD) und CSN7 (CK2) binden, neben den Substraten c-Jun und p53 auch die Untereinheiten CSN2 (CK2) und CSN7 (CK2 und PKD) phosphorylieren und in ihrer Aktivität ebenfalls durch Curcumin gehemmt werden können (Uhle et al., 2003).

Die CSN-assoziierten Kinasen phosphorylieren c-Jun an den Aminosäuren Ser63 und Ser73, die im Bereich der N-terminalen Aktivierungsdomäne liegen (Seeger et al., 1998) und ebenfalls Angriffsorte der JNK sind (s. Abschnitt 1.3). Ihre Phosphorylierung durch die JNK führt über eine verminderte Ubiquitinierung zu einem verlangsamten Abbau von c-Jun durch das 26S-Proteasom. Daraus resultiert letztlich eine erhöhte AP-1-Aktivität (Musti et al., 1997). Analog konnte auch für die CSN-abhängige Phosphorylierung eine Stabilisierung von c-Jun beobachtet werden, höchstwahrscheinlich wiederum als Folge einer verringerten Empfindlichkeit gegenüber dem Ubiquitin/26S-Proteasom-System (Seeger et al., 1998). Eine zusätzliche Steigerung der c-Jun-Stabilität sowie der damit verbundenen AP-1-Aktivität konnte durch die Überexpression der Untereinheit CSN2 erreicht werden, die eine de novo-Assemblierung des CSN-Komplexes bewirkt (Naumann et al., 1999).

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Indessen wird die Stabilität von p53 durch die CSN-abhängige Phosphorylierung in umgekehrter Richtung beeinflusst. Die Phosphorylierung von p53 an Ser149, Thr150 und vornehmlich Thr155 induziert, vermutlich infolge einer erhöhten Affinität des phosphorylierten p53 gegenüber seiner Ubiquitinligase Mdm2, einen beschleunigten Abbau des Tumorsuppressorproteins über das 26S-Proteasom (Bech-Otschir et al., 2001). Wie c-Jun bindet auch p53 über CSN5 an den CSN-Komplex. Eine Kompetition um diese Bindungsstelle erklärt möglicherweise, warum c-Jun in vitro die Phosphorylierung von p53 hemmen kann (Pollmann et al., 2001). Somit scheint das COP9-Signalosom im Verbund mit dem Ubiquitin/26S-Proteasom-System an der Steuerung der Balance zwischen c-Jun und p53 beteiligt zu sein. Dieses Gleichgewicht ist in vielen Tumorzellen gestört. Beispielsweise ist in Zervixkarzinomzellen der p53-Abbau durch das Papillomavirusprotein E6, welches die p53-spezifische Ubiquitinligase E6-AP aktiviert, gesteigert (Scheffner et al., 1993). Als Konsequenz kann in diesen Zellen ein erhöhter c-Jun-Spiegel nachgewiesen werden, der auch für eine verstärkte VEGF-Produktion verantwortlich ist. Die Hemmung der CSN-abhängigen Phosphorylierung durch Curcumin verschiebt nun das Gleichgewicht in Richtung von p53 und lässt im Zuge des vermehrten c-Jun-Abbaus die VEGF-Synthese wieder sinken (Pollmann et al., 2001).

1.6.2.2. Deneddylase- und Ubiquitin-Isopeptidase-Aktivität

Eine weitere Verbindung zwischen dem COP9-Signalosom und dem Ubiquitin/
26S-Proteasom-System entsteht durch seine Wechselwirkung mit Cullin-haltigen Ubiquitinligasen, wie z.B. SCF-Komplexen (Wolf et al., 2003). Die Cullin-haltigen E3s setzen sich aus dem RING-Domänen-Protein Rbx1/ROC1/Hrt1, einem Adapterprotein, einem Gerüstprotein (Cullin) und einem, die Substratbindung gewährleistenden F-Box-Protein zusammen. Im Fall der SCF-Komplexe handelt es sich bei dem Adapterprotein um Skp1 und bei dem Gerüstprotein um Cullin1/Cdc53, die gemeinsam mit dem F-Box-Protein namensgebend sind (Deshaies, 1999).

Cullin-haltige E3s können in ihrer Aktivität modifiziert werden. Durch einen Neddylierung genannten Prozess wird das Ubiquitin-ähnliche Protein Nedd8 kovalent an das Cullin gebunden, wodurch sich die Affinität des Cullins gegenüber dem E2 und die E3-Aktivität des Komplexes erhöhen. Daraus resultiert letztendlich ein beschleunigter Abbau der durch SCF-Komplexe ubiquitinierten Substrate, zu denen beispielsweise p27Kip1 und IκBα gehören (Deshaies, 1999; von Arnim, 2003). Über den entgegengesetzten Vorgang, die Dekonjugation des Nedd8 von dem Cullin, was auch als Deneddylierung bezeichnet wird, greift nun das COP9-Signalosom in die Regulation der Ligaseaktivität der Cullin-haltige E3s ein. Am intensivsten ist bisher seine Interaktion mit den SCF-Komplexen untersucht worden. Über seine Untereinheiten CSN1, CSN2 und CSN6 bindet es an die SCF-Proteine ROC1 und Cullin1 (Schwechheimer et al., 2001). Anschließend bewirkt die Deneddylaseaktivität, die dem Zink-bindenden MPN+/JAMM (Mpr1-Pad1-amino-terminal+/JAB1-MPN-domain metalloenzyme)-Motiv in CSN5 zugeschrieben wird, die Abspaltung von Nedd8 von Cullin1 (Cope et al., 2002). Zur Zeit existieren zwei Modelle der Regulation der SCF-Aktivität durch Neddylierung und Deneddylierung. Das „statische Modell“ sieht in der Neddylierung die Aktivierung und in der Deneddylierung die Inaktivierung des SCF-Komplexes. Dagegen geht das „zyklische Modell“ von einer regelmäßigen Abfolge von Neddylierungen und Deneddylierungen aus, die für die Aufrechterhaltung der Ligaseaktivität verantwortlich ist (von Arnim, 2003).

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Kürzlich konnte mit der Deubiquitinierung eine dritte Aktivität des COP9-Signalosoms aufgedeckt werden (Groisman et al., 2003; Zhou et al., 2003). Demnach ist das JAMM-Motiv von CSN5 nicht nur für die Deneddylierung verantwortlich, sondern auch für die Deubiquitinierung und dabei speziell für die Abspaltung des letzten Ubiquitins vom Substrat (Groisman et al., 2003). Als Träger einer Deubiquitinierungsaktivität, die ebenfalls mit dem CSN-Komplex aufgereinigt werden kann, nicht von dem JAMM-Motiv abhängt und vorrangig für die Depolymerisation der Polyubiquitinkette zuständig ist, konnten in Hefe und humanen Zellen die Ubiquitin-Isopeptidasen Ubp12 bzw. USP15 identifiziert werden (Zhou et al., 2003; Hetfeld, eingereicht bei Curr. Biol.). Ihre Hauptaufgabe besteht wahrscheinlich darin, der Autoubiquitinierung von F-Box-Proteinen im SCF-Komplex entgegen zu wirken.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das COP9-Signalosom durch seine Assoziation mit SCF-Komplexen, dem 26S-Proteasom, Proteinkinasen und Substraten eine Plattform darstellt, die zwei bedeutende intrazelluläre Prozesse, die Signaltransduktion und den Proteinabbau, miteinander verbindet (Bech-Otschir et al., 2002; Harari-Steinberg & Chamovitz, 2004; Peng et al., 2003).


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20.03.2006