3.  Material und Methoden

3.1. Material

3.1.1. Kits

▼ 20 (fortgesetzt)

Endofree Maxi Plasmidkit

Qiagen

Mini Plasmidkit

Qiagen

VEGF ELISA

PromoKine

3.1.2. Plasmide

▼ 21 

Id3 (pcDNA3.1)

B. Christy, University of Texas,
San Antonio

HIS10-Ubiquitin (pEGFP-N3)

M. Seeger, Charité Berlin

3.1.3. Proteine und Enzyme

Ubiquitin

Sigma

CSN

S. Uhle, Charité Berlin

c-Jun

D. Bech-Otschir, Charité Berlin

CK2

Calbiochem

PKD

Calbiochem

Restriktionsenzyme

New England Biolabs

3.1.4. Antikörper

Anti-c-Jun (polyklonal, Kaninchen)

Oncogene

Anti-Id1 (polyklonal, Kaninchen)

Santa Cruz Biotechnology

Anti-Id3 (polyklonal, Kaninchen)

Santa Cruz Biotechnology

Anti-GST (polyklonal, Kaninchen)

Santa Cruz Biotechnology

Anti-RGS-His6 (monoklonal, Maus)

Qiagen

Anti-CSN3 (polyklonal, Kaninchen)

R. Schade, Charité Berlin

Anti-CSN5 (monoklonal, Maus)

B. Christy, University of Texas,
San Antonio

Anti-CSN8 (polyklonal, Kaninchen)

Biomol

Anti-Ubiquitin (polyklonal, Kaninchen)

Daco

Anti-Maus/Kaninchen (Peroxidase-gekoppelt)

Seramun

3.1.5. Kinase- und 26S-Proteasom-Inhibitoren

▼ 22 

Curcumin

Sigma

Emodin

Calbiochem

Resveratrol

Calbiochem

DRB

Calbiochem

MG-132

Biomol

3.1.6. Sonstiges

3MM Filterpapier

Whatman

Acrylamid 30 %, 29:1

Roth

Aprotinin

AppliChem

[γ-32P]-ATP

ICN

Bacto-Agar

DIFCO

Bacto-Trypton

DIFCO

β-Mercaptoethanol

Serva

Centricon

Amicon/Millipore

Coomassie Brilliant Blue R250

Serva

DMSO

Fluka

Dynabeads® M-280-Tosylactivated

Dynal Biotech

ECL Western Blotting Detection Reagents

Amersham Biosciences

Elektroporationsküvetten

Peqlab

FCS

Seromed

Fluorogene Proteasom Substrate

Bachem Biochemica

Glutathion-Agarose

Sigma

Hefe-Extrakt

DIFCO

IgG-Standard

New England Biolabs

L-Glutamin

Seromed

Lipofectamine™ 2000

Invitrogen

Mikroliterspritze

Hamilton

Molekulargewichtsstandard, DNA

Gibco BRL

Molekulargewichtsstandard, Protein

Amersham Biosciences

Ni-NTA magnetic agarose beads

Qiagen

Nitrocellulose Membran

Schleicher&Schuell

pcDNA3.1 Vektor

Invitrogen

Penicillin/Streptomycin

Seromed

PMSF

Sigma

Ponceau S

AppliChem

Protein-A-Sepharose

Amersham Biosciences

Röntgenfilme (X-Omat DS, Biomax XR)

Kodak

Schwarze Mikrotiter-Platten

Dynatec

Steriles Plastikmaterial für die Zellkultur

Falcon

Sterilfilter

Microgen

TEMED

Serva

Trypanblau-Lösung

Sigma

Trypsin-EDTA

Gibco BRL

Zellkultur-Medien

Seromed

3.1.7. Geräte

Agarosegelkammer Geltray

Renner

Eismaschine AF-10

Scotsman

Elektroporationsgerät

Peqlab

Feinwaage MC1

Satorius

Fluorimeter Fluostar Reader

SLT

French Press

SIM-AMINCO

Geltrockner Drystar

Hölzel

Heizblock

Eppendorf

Inverses Mikroskop DMI

Leica

Kühlzentrifuge 5417R

Eppendorf

Kühlzentrifuge Avanti J-25

Beckman

Kühlzentrifuge RC24

Sorvall

Magnetrührer

Heidolph

Medifuge

Heraeus

Membranvakuumpumpe

Vacuumbrand

Mikrowelle

Moulinex

MilliQ-Anlage

Millipore

Mixer 5432

Eppendorf

PCR Thermocycler UNO Block

Biometra

Phast Gel System

Pharmacia

Photometer

Shimadzu

Pipetten

Gilson

Pipettus-Akku

Hirschmann

Röntgenfilmentwickler Hyperprocessor

Amersham

Rotor SS34

Sorvall

Rotor SW40

Beckman

Rotor JA-14

Beckman

Schüttlerwasserbad

GFL

SDS-PAGE-System

Biorad

Sterilbank

Baker

Stickstofftank

Taylor-Wharton

Tischultrazentrifuge Optima TLX

Beckman

Ultrazentrifuge Ultra Pro 80

Sorvall

Vakuumtrockner

Labcono

Mischer Vortex VF2

Janke & Kunkel

Waage BP2100S

Sartorius

Wasserbad U3

Julabo

Zellkultur-Inkubator BB4220CV

Heraeus

3.2. Methoden

3.2.1. Anzucht von Escherichia coli (E. coli)-Stämmen

▼ 23 

Die E. coli -Kulturen wurden bei 37°C und 180 rpm bis zu einer optischen Dichte von 0,5-1,0 bei 600 nm (OD600) inkubiert.

Glycerolkultur: 1 ml einer E. coli-Übernachtkultur wurde mit 1 ml sterilem 99%-igen Glycerol gemischt und bei -80°C aufbewahrt.

3.2.2. Herstellung kompetenter E. coli-Bakterien

▼ 24 

100 ml LB-Medium wurden mit 2 ml einer Übernacht-Kultur des E. coli-Stammes DH5α beimpft und bis zu einer OD600 von 0,5 inkubiert. Die Zellen wurden 5 min auf Eis gestellt und nachfolgend für 10 min bei 3900 rpm und 4°C herunterzentrifugiert. Das Pellet wurde in 30 ml eiskaltem Transformationspuffer 1 resuspendiert und anschließend 5 min auf Eis inkubiert. Danach wurde mit 3900 rpm bei 4°C für 10 min zentrifugiert und die Zellen in 4 ml eiskaltem Transformationspuffer 2 aufgenommen. Die kompetenten Zellen wurden in 200 µl-Aliquoten bei -70°C gelagert.

3.2.3. Transformation kompetenter E. colimit Plasmid-DNA

Die Zellen wurden auf Eis aufgetaut. Nach Zugabe von 100 ng der die Id3- oder Flag-Sequenz enthaltenden Plasmid-DNA (pcDNA3.1) wurde der Transformationsansatz 15 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz für 90 s einem Hitzeschock bei 42°C ausgesetzt, wonach die Zellen nochmals 2 min auf Eis gekühlt wurden. Es folgten die Zugabe von 1 ml auf 37°C vorgewärmtem LB-Medium und das leichte Schütteln der Zellen für eine Stunde bei 37°C. Danach wurden die Zellen bei 13000 rpm für 1 min zentrifugiert und das Pellet mit 200 µl LB-Medium resuspendiert, wovon schließlich ein Volumen von 50 µl auf LB-Amp-Agarplatten ausplattiert wurde.

3.2.4. Plasmidisolierung („Mini-Präp“ und „Maxi-Präp“)

▼ 25 

Zur Analyse der Klone wurden von der LB-Amp-Agarplatte Einzelkolonien abgenommen und über Nacht in 3 ml LB-Amp-Medium bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Plasmidisolierung erfolgte nach dem Protokoll der Firma Qiagen. Von dem Eluat, welches im letzten Schritt der „Mini-Präp“ gewonnen werden konnte, wurden 5 µl für die Analyse im Restriktionsenzymverdau eingesetzt. Die Verdaue wurden auf ein 1%-iges Agarosegel aufgetragen.

Für die Vermehrung der Vektor-DNA wurde nach entsprechender Transformation eine Einzelkolonie in 5 ml LB-Amp-Medium über Nacht bei 37°C geschüttelt.
200 ml LB-Amp-Medium wurden mit 1 ml der Übernachtkultur beimpft und nochmals über Nacht bei 37°C geschüttelt. Die Isolation der Plasmid-DNA erfolgte mit dem „Endofree Maxiprep Plasmid Kit“ der Firma Qiagen gemäß dem vorgegebenen Protokoll. Die Konzentration des gewonnenen Plasmids wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt.

3.2.5. Verdau von DNA mit Restriktionsenzymen

Der Restriktionsenzymverdau der zu analysierenden Plasmid-DNA erfolgte mit den entsprechenden Enzymen und 10xPuffern der Firma New England Biolabs. Eine Enzymeinheit verdaut unter optimalen Temperatur- und Pufferbedingungen
1 µg DNA in 1–3 Stunden.

3.2.6. Agarosegele

▼ 26 

Die DNA-Fragmente wurden in 0,8–1,6%-igen Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt. Nach dem Abkühlen der aufgekochten Agarose wurde Ethidiumbromid zugegeben, so dass seine Konzentration im Gel 0,75 µg/ml betrug. Die Elektrophorese erfolgte mit 5 V/cm. Zur Skalierung lief ein DNA-Molekulargewichtsstandard mit. Die gewünschte Bande wurde unter UV-Licht nachgewiesen.

3.2.7. Zellkultur

▼ 27 

Die HeLa-Zellen wurden im angegebenen Medium bei 37°C unter 5% CO2 kultiviert. Waren die Zellen konfluent, wurden sie nach einmaligem Waschen mit 1xPBS mit Trypsin/EDTA-Lösung abgelöst und neu ausplattiert. Die Zentrifugationsschritte erfolgten bei 200 x g für 5 min.

Für die Behandlung nicht transfizierter Zellen mit Inhibitoren der Proteinkinasen CK2 und PKD sowie dem 26S-Proteasom-Inhibitor MG-132 wurden 1,5x106 Zellen pro 60 mm-Kulturschale ausgesät. Nach 18 Stunden wurden nach Mediumwechsel die entsprechenden Inhibitoren für weitere 2–6 Stunden hinzugegeben.

3.2.8. Transiente Transfektion von Id3 oder c-Jun durch Elektroporation

In der exponentiellen Phase ihres Wachstums wurden die HeLa-Zellen nach einmaligem Waschen mit 1xPBS mit Trypsin/EDTA-Lösung von den Kulturschalen abgelöst, in der Neubauer-Zählkammer ausgezählt und anschließend zu 3x107 Zellen/ml im oben beschriebenen Medium (s. Abschnitt 3.2.7) resuspendiert. Zur Transfektion wurden 300 µl dieser Suspension sowie 30 µg Id3- oder Flag-c-Jun-cDNA, welche jeweils in einen pcDNA3.1-Vektor inkorporiert waren, eingesetzt. Der Ansatz enthielt weiterhin noch 1,25% DMSO. Die Elektroporation wurde bei einer Spannung von 210 V, einer Kapazität von 975 µF und einem Widerstand von 0 Ω durchgeführt. Danach wurden alle Ansätze in einem 50 ml-Eppendorf-Röhrchen, welches frisches Medium mit 1,25% DMSO enthielt, aufgenommen und auf 60 mm-Kulturschalen verteilt, so dass jede Schale 3 ml Medium mit annähernd 3x106 Zellen und 10 µg DNA beinhaltete. Folglich richteten sich die Anzahl der Elektroporationsansätze und das Mediumvolumen in dem 50 ml-Eppendorf-Röhrchen nach der Zahl der eingesetzten Kulturschalen. 18 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium gewechselt und die Inkubation unter Zusatz der entsprechenden Inhibitoren für weitere 2–6 Stunden fortgesetzt.

3.2.9. Transiente Kotransfektion von Id3 und Ubiquitin und
transiente Transfektion von CSN2 durch Lipofektion

▼ 28 

Exponentiell wachsende HeLa-Zellen wurden einen Tag vor der Transfektion zu 0,5x106 Zellen pro Segment einer 6-well-Kulturschale ausgesät. Für eine Reaktion wurden 1x106 HeLa-Zellen, 3 µg Id3-cDNA (pcDNA3.1-Vektor), 3 µg His10-Ubiquitin-cDNA (pEGFP-N3-Vektor) und 12 µl Lipofectamine™ 2000 unter Einhaltung des Protokolls der Firma Invitrogen eingesetzt. Nach vier Stunden wurden das Medium erneuert und die Zellen für weitere 18 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Für vier Stunden wurden wahlweise 50 µM Curcumin zugegeben.

Analog wurden für die Überexpression von CSN2 1x106 HeLa-Zellen, 5 µg Flag-CSN2-cDNA (pcDNA3.1-Vektor) und 10 µl Lipofectamine™ 2000 entsprechend dem Firmenprotokoll verwendet.

3.2.10. Lyse der Zellen

▼ 29 

Vor der Lyse wurden die Zellen mit 1xPBS gewaschen, mit Trypsin/EDTA von den Kulturschalen abgelöst, bei 1000 rpm und 4°C für 4 min zentrifugiert, in 1xPBS resuspendiert und nochmals für 4 min bei 2500 rpm und 4°C zentrifugiert. Den gewonnenen Pellets wurden 100 µl eiskalter Lysepuffer zugegeben. Zur Auflösung der Zellmembranen wurde die Suspension zusätzlich zehnmal mit einer 21-gauge Nadel angesaugt, bevor sie anschließend 10 min bei 13000 rpm und 4°C zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde sofort der SDS-PAGE zugeführt oder zusammen mit 4xProbenpuffer (SDS-PAGE) 5 min bei 95°C aufgekocht und bei 4°C aufbewahrt.

3.2.11. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die Proteine wurden entsprechend ihrer molekularen Masse unter denaturierenden Bedingungen in SDS-Gelen (8%, 10%, 12,5% oder 15%) aufgetrennt. Je zwei 0,75 mm dicke Gele wurden nach folgendem Schema gegossen:

▼ 30 

Die Proben wurden in 4xProbenpuffer aufgenommen, 5 min im Heizblock einer Temperatur von 95°C ausgesetzt und anschließend 1 min bei 14000 rpm zentri fugiert. Um die Proteinmengen anzugleichen, erfolgte zuvor über die photo metrische Absorptionsmessung bei 280 nm die Bestimmung der Proteinkonzen trationen. Für die Passage durch das Sammelgel wurde eine Spannung von 90 V angelegt. Nach dem Eintritt der Proteine in das Trenngel wurde die Spannung auf 140 V erhöht. Die gesamte Elektrophorese dauerte, in Abhängigkeit der Gelkon zentration, 1–1½ Stunden.

3.2.12. Coomassie-Färbung von Polyacrylamidgelen

▼ 31 

Nach der Elektrophorese wurden die Gele für 10–30 min in die Färbelösung gege ben und danach etwa eine Stunde entfärbt. Die Gele wurden auf Whatman-Filter papier bei 80°C für 60-90 min getrocknet.

3.2.13. Proteintransfer mittels Western Blot und Ponceau S-Färbung

Nach der SDS-PAGE wurden die aufgetrennten Proteine im elektrischen Feld auf Nitrocellulose übertragen. Der Western Blot wurde zwischen vier Lagen Filter papier bei konstanter Stromstärke von 250 mA für zwei Stunden bei Raumtem peratur oder bei 120 mA und 4°C über Nacht durchgeführt. Die Membran wurde nach dem Transfer zuerst mit Ponceau S für ca. 5 min gefärbt und danach mit 5% Milch-PBST eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht im Kühlraum bei 4°C blockiert.

3.2.14. Immundetektion

▼ 32 

Die Inkubation mit den primären Antikörpern, welche in 5% Milch-PBST in einem Verhältnis von 1:1000 bis 1:10000 gelöst waren, erfolgte für zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht im Kühlraum. Vor der Zugabe des sekundären Antikörpers wurden die Membranen dreimal für 10 min mit PBST gewaschen. Nach der einstündigen Behandlung mit dem sekundären Antikörper, der sich entweder gegen das Fc-Fragment der Maus oder des Kaninchens richtete, in einem Verhältnis von 1:2000 in 5% Milch-PBST gelöst und mit Peroxidase gekop pelt war, wurden die Membranen abermals dreimal für 10 min mit PBST gewa schen. Mit einem Lumineszenzverfahren (Enhanced Chemiluminescence [ECL] entsprechend der Firmenvorschrift) wurden die gebundenen Antikörper nachge wiesen. Die belichteten Röntgenfilme wurden entweder per Hand oder im Auto maten entwickelt.

3.2.15. Expression und Aufreinigung des GST-Id3-Fusionsproteins

Nach der Hitzeschocktransformation (s. Abschnitt 3.2.3) von 1 µg eines pGEX-2T-Vektors, der für das GST-Id3-Fusionsprotein (GST-Id3) kodiert, in 100 µl kompetente E.coli-Bakterien (DH5α) wurden diese auf LB-Amp-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Zu drei Kolonien wurden je 2 ml LB-Amp-Medium hinzugegeben und erneut bei 37°C über Nacht inkubiert. Mittels Mini-Präp von 1,5 ml dieser Übernachkultur, Restriktionsenzymverdau und DNA-Auftrennung im Agarosegel wurde die korrekte Inkorporation der GST-Id3-DNA im Vektor überprüft. Die restlichen 0,5 ml der Übernachtkultur wurden mit 5 ml LB-Amp-Medium versetzt und für acht Stunden bei 37°C leicht geschüttelt (100 rpm), bevor 250 µl dieser Kultur in 25 ml LB-Amp-Medium, welches zur Verminderung der basalen Expression 500 µl 50%-iger Glucose enthielt, über Nacht bei 37°C inkubiert wurden.

▼ 33 

5 ml dieses Ansatzes wurden zu 300 ml LB-Amp-Medium, das wiederum 2% (v/v) 50%-iger Glucose beinhaltete, gegeben und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,6–0,8 geschüttelt. Nun wurde die Proteinexpression durch Zugabe von 300 µl IPTG (1 M) induziert. Nachfolgend wurde die Kultur für vier Stunden bei 300 rpm und 37°C geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für 15 min bei 4000 rpm und 4°C in der Sorvall-Zentrifuge (GS-3 Rotor) geerntet. Das Zellpellet wurde in
20 ml eiskaltem 1xPBS resuspendiert und durch dreimaligen Einsatz der French Press bei 800-1000 psi aufgeschlossen. Nach Zentrifugation für 15 min bei
14000 rpm und 4°C (SS-34 Rotor) wurde der Überstand auf eine Säule aus 600 µl Glutathion-Agarose, die nach einstündigem Quellen der Agarose in Wasser gegossen und mit 1xPBS äquilibriert wurde, überführt. Die Säule wurde langsam dreimal mit 1xPBS gewaschen. Danach wurde das Säulenvolumen mit 1xPBS im Verhältnis 1:1 vermischt, 1 ml Elutionspuffer dazugegeben und für 10 min bei Raumtemperatur unter Rotation inkubiert. Anschließend wurde das Eluat abgelassen, die Proteinkonzentration photometrisch bei 280 nm bestimmt und das gewonnene Protein bei -70°C gelagert.

3.2.16. GST-Id3-Pull-down (Fällung von GST-Id3)

Zur Untersuchung der Bindung von Id3 an das COP9-Signalosom wurde GST-Id3 an eine Glutathion-Agarose-Säule gebunden, um danach den gereinigten CSN-Komplex oder die Untereinheiten CSN5 und CSN7 hinzuzugeben.

Zuerst wurden 100 µl Glutathion-Agarose mit 35 µg GST-Id3 in einer Säule bei 4°C unter Rotation inkubiert. Im folgenden Schritt wurde die Säule dreimal mit 1xPBS gewaschen. Als Nächstes wurde die Säule mit 20 µg CSN beladen und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Nach dem erneuten Waschen wurde die Säule geöffnet und die Agarose in ein Eppendorf-Röhrchen dekantiert. Durch Zugabe von 4xProbenpuffer (SDS-PAGE) und Erhitzen der Agarose für 5 min auf 95°C wurden die gebundenen Proteine von der Glutathion-Agarose abgelöst, bevor nach ihrer Auftrennung in der SDS-PAGE und dem Transfer durch Western Blot der immunologische Nachweis erfolgte.

▼ 34 

In einem zweiten Ansatz wurden bei sonst analogem Ablauf statt des gesamten CSN-Komplexes 10 µg His6-markiertes CSN5 bzw. CSN7 zu 10 µg an Glutathion-Agarose gebundenem GST-Id3 bzw. GST (Kontrolle) gegeben.

3.2.17. Far-Western Blot-Analyse (Filterbindungs-Assay)

Je 1 µg der entsprechenden rekombinanten Untereinheiten des COP9-Signalosoms wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet. Die Membranen wurden mit Ponceau S gefärbt und anschließend mit 5% Milch-PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur geblockt. Die immobilisierten Untereinheiten wurden mit rekombinantem GST-Id3 oder GST (Kontrolle), welche in einer Konzentration von 1,5 µg/ml in PBS gelöst waren, für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurden die Membranen mit dem anti-GST-Antikörper (primärer Antikörper) für zwei Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Die dreimal mit PBST gewaschenen Membranen wurden nun eine Stunde bei Raumtemperatur mit einem anti-Kaninchen-Antikörper (sekundärer Antikörper) inkubiert, bevor nach dem finalen Waschzyklus der enzymchemische Bindungsnachweis mit Hilfe der ECL-Technik erfolgte. Zur Kontrolle wurden die gebundenen Proteine anschließend durch die Behandlung der Membranen mit Stripping-Puffer (62,5 mM Tris-HCl [pH=6,7], 1% [w/v] SDS, 100 mM
β-Mercaptoethanol) von den Membranen abgelöst. Danach wurden die Membranen nochmals mit den gleichen Antikörpern untersucht.

3.2.18. His-Pull-down (Fällung His-markierter Proteine) mit Ni-Partikeln

▼ 35 

His-Pull-down-Experimente wurden mit magnetischen Ni-NTA-Agarosepartikeln (Ni-Partikel), die His-markierte Proteine binden, durchgeführt. Dazu wurden jeweils 50 µl der Ni-Partikel-Lösung mit dem Lysat der mit His10-Ubiquitin und Id3 kotransfizierten HeLa-Zellen über Nacht bei 4°C unter Rotation inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen wurden den Ansätzen je 30 µl Elutionspuffer und 10 µl 4xProbenpuffer (SDS-PAGE) zugegeben. Die Proben wurden danach für 5 min auf 95°C erhitzt, in der SDS-PAGE aufgetrennt und geblottet. Anschließend wurden die transferierten Proteine immunologisch nachgewiesen.

3.2.19. Pull-down mit Dynabeads® M-280-Tosylactivated

Nach dem initialen Waschen mit Puffer A wurden pro Ansatz 50 µl Partikellösung mit 40 µl rekombinantem His6-markierten CSN5 (1 µg/µl) oder 40 µl 1 M Harnstoff, da CSN5 in 1 M Harnstoff gelöst war, und 100 µl Puffer A für 30 Stunden bei 37°C und zwölf Stunden bei 4°C inkubiert. Die Proben wurden zweimal für 5 min mit Puffer D bei 4°C und anschließend für 24 Stunden mit Puffer E bei Raumtemperatur gewaschen. Bevor den Ansätzen 90 µl Lysat von 2x106 HeLa-Zellen zugegeben wurde, erfolgte nochmals ein Waschvorgang mit Puffer D für 5 min bei 4°C. Die nachfolgende Inkubation fand für 20 Stunden bei 4°C unter Rotation statt. Danach wurden die Überstände abgenommen und aufbewahrt. Die Pellets wurden dreimal für 5 min mit RIPA-Puffer gewaschen und mit 30 µl RIPA-Puffer und 10 µl 4xProbenpuffer (SDS-PAGE) aufgefüllt. Auch 30 µl Überstand wurden 10 µl 4xProbenpuffer (SDS-PAGE) hinzugegeben. Die Proben wurden bei 95°C für
5 min gekocht. Abschließend wurden die Proteine elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und immunologisch auf mittels CSN5 präzipitiertes c-Jun untersucht.

3.2.20. Immunpräzipitation (IP)

▼ 36 

C-Jun und der CSN-Komplex wurden immunpräzipitiert. Im ersten Fall wurden zuerst 5x106-HeLa-Zellen mit 10 µg Flag-markierter c-Jun-cDNA (pcDNA3.1-Vektor) transient transfiziert (s. Abschnitt 3.2.8) und nach 18 Stunden lysiert (s. Abschnitt3.2.10). Für die IP des CSN-Komplexes wurde untransfiziertes Lysat eingesetzt. Beide IPs wurden mit Protein-A-Sepharose durchgeführt.

Die IP begann mit der einstündigen Vorinkubation von 80 µl Lysat, 420 µl RIPA-Puffer und 30 µl in RIPA-Puffer gelöster Protein-A-Sepharose bei 4°C. Nach der Zentrifugation für 1 min bei 13000 rpm wurden die Überstände abgenommen und zusammen mit 5 µl anti-Flag- bzw. anti-CSN7-Antikörper für zwei Stunden bei 4°C unter Rotation inkubiert. Die Negativkontrolle enthielt keinen Antikörper. Im letzten Schritt wurden jedem Ansatz 60 µl Protein-A-Sepharose für weitere zwei Stunden zugegeben. Danach wurden die Proben 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert und die Überstände abgenommen. Die Pellets wurden viermal mit RIPA-Puffer gewaschen, bevor sie abschließend in 24 µl RIPA-Puffer und 8 µl 4xProbenpuffer (SDS-PAGE) aufgenommen wurden. Von den Überständen wurden ebenfalls
24 µl entnommen und mit 8 µl 4xProbenpuffer (SDS-PAGE) versetzt. Präzipitate und Überstände wurden bei 95°C für 5 min gekocht, in der SDS-PAGE aufgetrennt, geblottet und mit den entsprechenden Antikörpern auf Proteine untersucht, die an c-Jun bzw. CSN7 gebunden waren.

3.2.21. Dichtegradientenzentrifugation (Glycerolgradient)

▼ 37 

Die 10%-ige und 40%-ige Glycerollösung wurden in GG-Puffer hergestellt. Mit einem Gradientenmischer wurde ein kontinuierlicher Gradient von 10–40% Glycerol in Zentrifugenröhrchen gegossen (je 38 ml). Der Gradient wurde mit dem Lysat von 1x108 HeLa-Zellen überschichtet und bei 27000 rpm für 24 h bei 4°C zentrifugiert (Rotor SW28). 21 Fraktionen zu je 2 ml wurden gesammelt, in der SDS-PAGE aufgetrennt, geblottet und mit Antikörpern gegen CSN3 und CSN5 getestet.

3.2.22. Kinase-Assay

Für die Kinase-Assays wurden entweder der gereinigte CSN-Komplex (1 µg) oder die rekombinanten Kinasen CK2 (α2β2) und PKD eingesetzt. Als Substrate wurden rekombinantes c-Jun (1,5 µg), ICSPB (1,5 µg) und GST-Id3 (0,8 µg) dazugegeben. Nach Zusatz von [γ-32P]-ATP (0,2 MBq) wurden die Proben in einem Endvolumen von 20 µl für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 7 µl 4xProbenpuffer (SDS-PAGE) gestoppt. Die Ansätze wurden für
5 min auf 95°C erhitzt und die Proteine in der SDS-PAGE getrennt. Abschließend wurden die Gele mit Coomassie gefärbt, getrocknet und mittels Autoradiographie ausgewertet.

3.2.23. Ubiquitinierungs-Assay

▼ 38 

In dem in vitro-Ubiquitinierungs-Assay wurden als Substrate 0,2 µg rekombinantes GST-Id3 oder 0,4 µg rekombinantes c-Jun eingesetzt. Als Lieferant der ubiquitinierenden Enzyme diente das Lysat von ca. 5x105 HeLa-Zellen. Neben 6 µg Ubiquitin enthielten die 50 µl Probenvolumen 25 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 3 mM Dithiothreitol (DTT) und 2 mM ATP. Weiterhin beinhaltete der Ansatz entweder 50 µM Curcumin oder 0,25% reines DMSO zur Gewährleistung identischer DMSO-Konzentrationen. Während der achtstündigen Inkubation bei 37°C wurden zu definierten Zeiten Aliquote von 13 µl entnommen, mit 4,3 µl 4xProbenpuffer (SDS-PAGE) versetzt und für 5 min auf 95°C erhitzt. Die weitere Analyse erfolgte mittels SDS-PAGE, Western Blot und immunologischem Proteinnachweis.

3.2.24. VEGF-ELISA

Von den Medien der mit den Kinase-Hemmstoffen Curcumin, DRB, Emodin und Resveratrol sowie dem 26S-Proteasom-Hemmstoff MG-132 behandeltem HeLa-Zellen (s. Abschnitt 3.2.7) wurde nach sechs Stunden Inkubation 1 ml zellfreier Überstand abgenommen und bei -70°C gelagert. Insgesamt wurden von acht solcher Versuchsserien Zellüberstände gewonnen. Mit einem VEGF-ELISA-Kit wurde in ihnen gemäß der Firmenvorschrift die VEGF-Konzentration bestimmt. Die in den Überstanden der unbehandelten Zellen gemessenen VEGF-Konzentrationen wurden jeweils als 100% normiert. Dazu wurden die VEGF-Konzentrationen in den Überständen der mit den jeweiligen Hemmstoffen inkubierten Zellen in Relation gesetzt. Die Signifikanz der prozentualen Abweichung der VEGF-Konzentrationen wurde unter Verwendung eines t-Testes für verbundene Stichproben unter der Annahme einer Normalverteilung ermittelt.


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20.03.2006