4. Ergebnisse

4.1. Das CSN reguliert den Abbau und die Aktivität von c-Jun

4.1.1. c-Jun bindet an das COP9-Signalosom

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Bereits im Rahmen der ersten Aufreinigungen des COP9-Signalosoms konnte c-Jun als Substrat der mit dem CSN-Komplex assoziierten Kinaseaktivität identifiziert werden (Seeger et al., 1998). Obwohl in den nachfolgenden Untersuchungen der enge funktionelle Zusammenhang zwischen c-Jun und der CSN-abhängigen Phosphorylierung immer deutlicher herausgearbeitet werden konnte (Henke et al., 1999; Naumann et al., 1999; Pollmann et al., 2001), wurde der endgültige Beweis für eine Bindung von c-Jun an den CSN-Komplex noch nicht erbracht.

Mit dieser Zielstellung wurden Immunpräzipitationen und Pull-down-Experimente durchgeführt. In einem ersten Versuch sollte geklärt werden, ob sich aus dem Lysat von c-Jun überexprimierenden HeLa-Zellen gemeinsam mit c-Jun die Untereinheit CSN5 präzipitieren lässt. Hierzu wurden zuerst HeLa-Zellen mit Flag-markiertem c-Jun transient transfiziert. In der Immunpräzipitation wurde anschließend aus den Lysaten dieser Zellen das so markierte c-Jun mit einem anti-Flag-Antikörper isoliert. Nach der elektrophoretischen Auftrennung der Präzipitate und dem Proteintransfer mittels Western Blot wurden in der abschließenden Immundetektion das zusammen mit Flag-markiertem c-Jun präzipitierte CSN5 nachgewiesen (Abbildung 7A). In der Negativkontrolle, die keinen präzipitierenden Antikörper enthielt, war erwartungsgemäß kein CSN5 zu detektieren.

Die Bindung von c-Jun an CSN5 wurde in einem Pull-down-Experiment bestätigt. Während in der Immunpräzipitation die Untereinheit CSN5 durch ihre Wechselwirkung mit c-Jun aus dem Zelllysat isoliert werden konnte, sollte nun nach dem umgekehrten Prinzip versucht werden, durch an tosylaktivierte M-280-Dynabeads® gebundenes rekombinantes CSN5 c-Jun zu präzipitieren. Als Quelle für c-Jun diente das Lysat von 2x106 HeLa-Zellen. Abbildung 7B lässt erkennen, dass auch in diesem Fall c-Jun an CSN5 bindet. Wiederum war in der Negativkontrolle keine Interaktion festzustellen. Diese enthielt statt des rekombinanten CSN5 nur an die Dynabeads® gebundenes BSA und das äquivalente Volumen einer 1 M Harnstofflösung, da CSN5 in einer eben solchen gelöst war.

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Abbildung 7: C-Jun bindet an das COP9-Signalosom. (A) CSN5 bindet an c-Jun. Eine Immunpräzipitation wurde mit einem anti-Flag-Antikörper und dem Lysat von HeLa-Zellen, die zuvor mit Flag-markiertem c-Jun transient transfiziert wurden, durchgeführt. Die Präzipitation von c-Jun sowie von an c-Jun gebundenem CSN5 wurde im Western Blot mit den entsprechenden Antikörpern (α c-Jun und α CSN5) nachgewiesen. Zur Bestätigung übereinstimmender Proteinkonzentrationen in beiden Ansätzen wurden auch die Überstände (ÜS) untersucht. (B) C-Jun bindet an CSN5. Mit tosylaktivierten M-280-Dynabeads® und His6-markiertem, rekombinantem CSN5 gelang es, aus HeLa-Zelllysat c-Jun zu präzipitieren. In den Überständen beider Ansätze zeigen sich identische Mengen an c-Jun. (C) CSN5 ist in HeLa-Zellen Bestandteil des CSN-Komplexes. Das Lysat von 1x108 HeLa-Zellen wurde in einem Glycerolgradienten (10–40%) aufgetrennt. CSN5 und zwei weitere CSN-Untereinheiten, CSN3 und CSN8, ko-migrieren mit einem Maximum in den Fraktionen 12 und 13. (D) In einer Immunpräzipitation konnte mit einem anti-CSN7-Antikörper im Lysat von HeLa-Zellen die Bindung von endogenem CSN5 an CSN7 gezeigt werden.

Dass CSN5 auch in HeLa-Zellen vornehmlich dem CSN-Komplexes angehört, wurde in einer Dichtegradientenzentrifugation und einer Immunpräzipitation überprüft. Das Lysat von 1x108 HeLa-Zellen wurde in einem Gradienten von 10–40% Glycerol aufgetrennt. Die 21 Fraktionen wurden nach SDS-PAGE und Western-Blot mit Antikörpern gegen CSN3, CSN5 und CSN8 getestet. Abbildung 7C veranschaulicht, dass CSN5 und die Untereinheiten CSN3 und CSN8 ko-migrieren mit einem Maximum in den Fraktionen 12 und 13. Nur zu einem sehr geringen Teil kommt CSN5 in freier Form vor (Fraktion 20/21). Somit ist in HeLa-Zellen der Großteil des zellulären CSN5 Bestandteil des CSN-Komplexes.

Ein weiteres Indiz für die Integration von CSN5 in den CSN-Komplex ist seine Bindung an die Untereinheit CSN7. Diese Wechselwirkung konnte durch Immunpräzipitation von CSN5 mit einem anti-CSN7-Antikörper im Lysat von HeLa-Zellen nachgewiesen werden (Abbildung 7D).

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Zusammenfassend sprechen diese Ergebnisse dafür, dass c-Jun nicht nur an CSN5 bindet, sondern über diese Untereinheit auch mit dem COP9-Signalosom interagiert.

4.1.2. Curcumin induziert den Abbau und die Bildung
hochmolekularer Formen von c-Jun in vitro

Curcumin, ein sekundärer Pflanzeninhaltsstoff aus der Wurzel von Curcuma longa(Gelbwurzel), das als farbgebender Bestandteil des Currypulvers weite Verbreitung findet, ist ein potenter Hemmstoff der CSN-assoziierten Kinasen (Henke et al., 1999). Da diese Kinasen durch Phosphorylierung c-Jun stabilisieren, hat ihre Hemmung durch Curcumin eine Destabilisierung von c-Jun zur Folge (Haworth & Avkiran, 2001; Naumann et al., 1999).

In einem in vitro-Ubiquitinierungs-System sollte der Mechanismus der Regulation der Stabilität von c-Jun durch Phosphorylierung ausführlicher untersucht werden. Dazu wurde rekombinantes c-Jun zusammen mit Ubiquitin und Lysat aus HeLa-Zellen, das die ubiquitinierenden Enzyme bereitstellte, bis zu acht Stunden in An- oder Abwesenheit von 50 µM Curcumin inkubiert. Dem Kontrollansatz wurde lediglich DMSO zugegeben, um die Konzentrationen des Lösungsmittels von Curcumin anzugleichen. Nach acht Stunden Inkubation bei 37°C konnte im Western Blot in der mit Curcumin behandelten Probe eine klare Reduktion von cJun beobachtet werden (Abbildung 8). Im unbehandelten Ansatz war dagegen keine Verminderung von c-Jun festzustellen. Des Weiteren konnte unter Curcumineinfluss eine deutliche Induktion von hochmolekularen Formen von c-Jun nachgewiesen werden. Diese Abkömmlinge, die als HMW (high molecular weight)-c-Jun bezeichnet wurden, unterschieden sich nicht nur quantitativ, sondern auch in ihrem Muster von denen, die in Abwesenheit von Curcumin zu detektieren waren. Eine prominente Bande unterhalb von 97 kDa fiel besonders auf. Damit entspricht sie ungefähr der doppelten Größe von c-Jun, das eine Molekulargewicht von ca. 40 kDa besitzt.

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Abbildung 8: Curcumin destabilisiert c-Jun und erzeugt hochmolekulare c-Jun-Formen in vitro. In einem Ubiquitinierungs-Assay wurde rekombinantes c-Jun zusammen mit HeLa-Zelllysat, Ubiquitin in An- bzw. Abwesenheit von 50 µM Curcumin für acht Stunden inkubiert. Zu den angegebenen Zeiten wurden Aliquote entnommen. Nach ihrer elektrophoretischen Auftrennung konnten im Western Blot eine durch Curcumin induzierte Destabilisierung von c-Jun und die Bildung von HMW (high molecular weight)-c-Jun mit einem anti-c-Jun-Antikörper (α c-Jun) nachgewiesen werden. Eine Bande unterhalb von 97 kDa trat in Gegenwart von Curcumin besonders intensiv auf.

4.1.3. Curcumin fördert den Ubiquitin-abhängigen Abbau von c-Jun
in HeLa-Zellen

Curcumin destabilisiert c-Jun in HeLa-Zellen (Henke et al., 1999; Pollmann et al., 2001). Um den genauen Wirkmechanismus aufzudecken, wurde der Effekt von Curcumin auf c-Jun in dem folgenden Experiment detaillierter analysiert.

HeLa-Zellen wurden dazu mit Flag-markierter c-Jun-cDNA transient transfiziert. Nach 18 Stunden Inkubation wurden die c-Jun überexprimierenden Zellen mit 1, 5, 25 oder 50 µM Curcumin für weitere vier Stunden behandelt. Ein Ansatz enthielt neben 50 µM Curcumin noch 20 µM des 26S-Proteasom-Hemmstoffes MG-132. Die Zellen der Negativkontrolle erhielten lediglich DMSO, das Lösungsmittel von Curcumin und MG-132. Auch dem Medium der Ansätze, die mit weniger als 50 µM Curcumin inkubiert wurden, wurde zur Gewährleistung identischer Konzentrationen die jeweils fehlende Menge DMSO hinzugegeben. Der vierstündigen Inkubationszeit schlossen sich die Lyse der Zellen, die Auftrennung der Proteine in der SDS-PAGE, der Proteintransfer auf Nitrozellulose im Western Blot sowie die abschließende Untersuchung der Membranen mit verschiedenen Antikörpern an. Für die Analyse der VEGF-Konzentration (s. Abschnitt 4.1.5) wurde jeder Zellkultur vor der Lyse noch 1 ml des Überstandes entnommen.

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Abbildung 9: Curcumin induziert den Ubiquitin-abhängigen Abbau von c-Junin HeLa-Zellen. HeLa-Zellen wurden transient mit Flag-markiertem c-Jun transfiziert und nach 18 Stunden für weitere vier Stunden mit den angegebenen Konzentrationen Curcumin bzw. MG-132 behandelt. Anschließend wurden die Zellen lysiert. Die Proteine wurden elektrophoretisch aufgetrennt und geblottet. (A) Mit einem anti-c-Jun-Antikörper (α c-Jun) konnte die konzentrationsabhängige Destabilisierung von c-Jun sowie die Induktion hochmolekularer c-Jun-Formen (HMW-c-Jun) durch Curcumin sichtbar gemacht werden. Besonders prägnant erschien eine Bande in der Höhe von
97 kDa. Die kombinierte Inkubation mit 20 µM MG-132 verstärkte diese Effekte von Curcumin noch zusätzlich. (B) Ein anti-Flag-Antikörper (α Flag) bestätigte dieses Ergebnis. (C) Durch einen anti-Ubiquitin-Antikörper (α Ubiquitin) ließ sich nach Proteinauftrennung im 8%-igen SDS-Gel im Western Blot die Bildung hochmolekularer Ubiquitin-Konjugate in Abhängigkeit der Curcumin-Konzentration zeigen.

Abbildung 9A veranschaulicht die konzentrationsabhängige Destabilisierung von c-Jun durch Curcumin. Bereits in Anwesenheit von 25 µM Curcumin war ein deutlicher Effekt auf die Stabilität von c-Jun zu erkennen, der sich unter Einfluss von 50 µM Curcumin noch einmal sichtbar steigerte. 5 µM Curcumin waren dagegen noch nicht in der Lage, c-Jun signifikant zu destabilisieren. Parallel zu diesem Rückgang der zellulären c-Jun-Spiegel ließ sich für die Bildung hochmolekularer c-Jun-Formen und für das Auftreten einer intensiven Bande unterhalb von 97 kDa ebenfalls eine konzentrationsabhängige Wirkung von Curcumin beobachten. Diese Effekte Curcumins wurden durch die kombinierte Inkubation mit MG-132 noch einmal verstärkt. Daneben schwächte MG-132 die destabilisierende Wirkung von Curcumin auf c-Jun etwas ab, was sich, verglichen mit der alleinigen Behandlung mit 50 µM Curcumin, in einer Zunahme der c-Jun-Bande wiederspiegelte.

Mit einem anti-Flag-Antikörper konnten diese Resultate verifiziert werden (Abbildung 9B). Von den hochmolekularen c-Jun-Banden reagierten im Unterschied zu dem anti-c-Jun-Antikörper nur die Banden oberhalb von 97 kDa spezifisch mit dem anti-Flag-Antikörper. Die zuvor beschriebene Bande im Bereich von 97 kDa stellte sich auch mit diesem Antikörper sehr ausgeprägt dar. Dass die zusätzliche Behandlung der Zellen mit MG-132 die Bildung von HMW-c-Jun durch Curcumin intensiviert, konnte ebenso gezeigt werden.

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Um die Vermutung zu prüfen, dass es sich bei den hochmolekularen Formen von c-Jun um Konjugate von c-Jun mit Ubiquitin handelt, wurden die gleichen Proben in einem 8%-igen SDS-Gel aufgetrennt, geblottet und mit einem anti-Ubiquitin-Antikörper analysiert. Dabei ließen sich mit steigender Curcumin-Konzentration vermehrt langkettige Ubiquitin-Konjugate jenseits von 220 kDa detektieren (Abbildung 9C). Dies unterstützt die These, dass Curcumin über die Hemmung der CSN-assoziierten Kinasen eine vermehrte Ubiquitinierung von c-Jun induziert und auf diesem Weg seinen Abbau über das 26S-Proteasom initiiert.

Das nächste Experiment verfolgte das Ziel, die Reversibilität der Wirkung von Curcumin auf c-Jun zu überprüfen. Im ersten Schritt wurden HeLa-Zellen mit Flag-markierter c-Jun-cDNA transfiziert und 18 Stunden inkubiert. Daran schloss sich die nur einstündige Behandlung der Zellen mit 50 µM Curcumin an. Nach Ablauf dieser Stunde wurde das Medium gewechselt. Das neue Medium enthielt entweder 20 µM MG-132 oder lediglich DMSO. Daraufhin wurden die Zellen weitere sechs Stunden inkubiert. Der Lyse der Zellen zu den in Abbildung 10 angegebenen Zeiten folgten die elektrophoretische Proteinseparation, der Transfer im Western Blot und die Immundetektion mit den aufgeführten Antikörpern.

Abbildung 10: Die Wirkung von Curcumin auf c-Junin HeLa-Zellen ist reversibel. HeLa-Zellen wurden mit Flag-markierter c-Jun-cDNA (pcDNA3.1-Vektor) transient transfiziert. Nach 18 Stunden Inkubation wurden die Zellen eine Stunde mit 50 µM Curcumin behandelt. Danach wurde das Medium gewechselt und die Zellen mit oder ohne 20 µM MG-132 für weitere sechs Stunden inkubiert. Zu den angegebenen Zeiten erfolgte die Lyse der Zellen. Die Proteine wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend geblottet. (A) Die Untersuchung der Membranen mit einem anti-c-Jun-Antikörper (α c-Jun) veranschaulicht die Induktion hochmolekularer c-Jun-Formen (HMW-c-Jun) durch Curcumin sowie ihren verlangsamten Rückgang unter Einfluss von MG-132. Wieder stellte sich eine Bande in der Höhe von 97 kDa sehr intensiv dar. (B) Etwas deutlicher noch konnten das Auftreten und die zeitabhängige Abnahme von HMW-c-Jun mit einem anti-Flag-Antikörper (α Flag) wiedergegeben werden. (C) Ein anti-Ubiquitin-Antikörper (α Ubiquitin) ließ ein zu HMW-c-Jun analoges Verhalten von langkettigen Ubiquitin-Konjugaten erkennen.

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Abbildung 10A, die die Detektion mit einem anti-c-Jun-Antikörper wiedergibt, zeigt, dass Curcumin nach nur einer Stunde c-Jun zwar nicht nennenswert destabilisieren kann, dafür aber in der Lage ist, hochmolekulare Formen von c-Jun zu induzieren. Diese c-Jun-Formen, unter denen eine kräftige Bande im Bereich von 97 kDa wieder besonders auffällt, verschwinden in den folgenden sechs Stunden ohne Curcumineinwirkung nahezu vollständig. Ihr Rückgang kann jedoch durch MG-132 merklich verlangsamt werden.

Noch klarer konnte dieser Sachverhalt mit einem anti-Flag-Antikörper verdeutlicht werden (Abbildung 10B). Neben den hochmolekularen c-Jun-Abkömmlingen stellte sich wieder eine Bande in der Region von 97 kDa sehr intensiv dar. An ihr ist der verzögerte Abbau der hochmolekularen Formen von c-Jun in Gegenwart von MG-132 sehr gut zu beobachten.

Dass es sich bei den hochmolekularen Formen höchstwahrscheinlich um Ubiquitin-Konjugate von c-Jun handelt, ließ sich aus dem Bindungsmuster des anti-Ubiquitin-Antikörpers schließen (Abbildung 10C). Schon nach der einstündigen Behandlung der Zellen mit 50 µM Curcumin entstanden in großem Umfang Ubiquitin-Konjugate, die, ihrer Wanderungsgeschwindigkeit in der 8%-igen SDS-PAGE zufolge, sehr langkettig sein müssen. Auch diese Konjugate ließen sich genau wie die hochmolekularen c-Jun-Formen durch die Zugabe von MG-132 effektiv stabilisieren. Dagegen erfolgte in Abwesenheit von MG-132 innerhalb von sechs Stunden eine Rückbildung der Ubiquitin-Konjugate auf das Ausgangsniveau.

4.1.4. Inhibitoren der CSN-assoziierten Kinasen induzieren den Abbau
und die Ubiquitinierung von c-Jun

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In Kinase-Assays konnte beobachtet werden, dass sowohl die CK2 als auch die PKD c-Jun in vitro phosphorylieren (Uhle et al., 2003). Diese Phosphorylierung führt zu einer Stabilisierung von c-Jun (Henke et al., 1999; Naumann et al., 1999). Deshalb sollte eine Hemmung der CK2 und der PKD einen beschleunigten Abbau von c-Jun zur Folge haben. Neben Curcumin sind auch DRB und Emodin (Battistutta et al., 2000; Zandomeni, 1989) als Hemmstoffe der CK2 und Resveratrol als Inhibitor der PKD (Haworth & Avkiran, 2001) beschrieben worden.

Um die Wirkung dieser Inhibitoren auf c-Jun in einem zellulären Milieu zu untersuchen, wurden HeLa-Zellen, die nach vorangegangener Transfektion Flag-markiertes c-Jun überexprimierten, für vier Stunden mit 50 µM Curcumin, 200 µM DRB, 200 µM Emodin oder 100 µM Resveratrol behandelt. Zur Hemmung des 26S-Proteasoms wurden 20 µM MG-132 allein oder in Kombination mit einem der Kinase-Inhibitoren eingesetzt. Die Konzentration von DMSO, dem Lösungsmittel aller Hemmstoffe, wurde in jedem Ansatz auf 0,25% (v/v) eingestellt. Unmittelbar nach Beendigung der vierstündigen Inkubation wurden die Zellen lysiert. Jeder Kulturschale wurde zuvor noch 1 ml des Überstandes zur Analyse der VEGF-Konzentration (s. Abschnitt 4.1.5) entnommen. Der Zelllyse folgten die Auftrennung der Proteine in der SDS-PAGE, ihr Transfer auf Nitrozellulose mittels Western Blot und im letzten Schritt die immunologische Proteindetektion.

Mit Hilfe eines anti-c-Jun-Antikörpers konnte demonstriert werden, dass alle vier eingesetzten Kinase-Hemmstoffe c-Jun in HeLa-Zellen destabilisieren (Abbildung 11A). Besonders effektiv zeigten sich in dieser Hinsicht Curcumin und Emodin. Curcumin bewirkte auch eine signifikante Akkumulation hochmolekularer Formen von c-Jun (HMW-c-Jun). Unter ihnen fiel erneut eine stark reagierende Bande im Bereich von 97 kDa auf. Dagegen stabilisierte MG-132 c-Jun. Auch in kombinierter Anwendung mit einem der Kinase-Inhibitoren konnte die destabilisierende Wirkung dieser Substanzen auf c-Jun reduziert werden.

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Das gleiche Resultat lieferte die Analyse der Membranen mit einem anti-Flag-Antikörper (Abbildung 11B). Abermals waren eine Destabilisierung von c-Jun durch alle Kinase-Inhibitoren und seine Stabilisierung in Anwesenheit des proteasomalen Inhibitors MG-132 nachzuweisen. Die Induktion hochmolekularer Formen von c-Jun durch Curcumin und die verstärkte Bildung dieser c-Jun-Abkömmlinge in Gegenwart von MG-132 konnten ebenfalls mit diesem Antikörper bestätigt werden.

Die elektrophoretische Auftrennung der zellulären Proteine in einem 8%-igen SDS-Gel, der darauffolgende Western Blot und die abschließende immunologische Proteindetektion mittels anti-Ubiquitin-Antikörper ergaben, dass im Zuge der vierstündigen Inkubation mit Curcumin begleitend zu den hochmolekularen c-Jun-Formen auch vermehrt langkettige Ubiquitin-Konjugate in den Zellen gebildet wurden (Abbildung 11C). Ein solches Ergebnis steht in Einklang mit der zuvor geäußerten Vermutung, dass die hochmolekularen Formen von c-Jun und die gleichzeitig entstehenden Ubiquitin-Konjugate in Wahrheit ein und dasselbe Substrat, nämlich langkettige c-Jun-Ubiquitin-Konjugate, repräsentieren. Dass auch MG-132 eine Akkumulation von Ubiquitin-Konjugaten bewirkte, war aufgrund der durch diese Substanz hervorgerufenen Blockade des 26S-Proteasoms zu erwarten.

Abbildung 11: Inhibitoren der CSN-assoziierten Kinasen induzieren den Abbau von c-Jun über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System. HeLa-Zellen, die transient mit Flag-markierter c-Jun-cDNA (pcDNA3.1-Vektor) transfiziert wurden, wurden 18 Stunden nach der Transfektion mit 50 µM Curcumin, 200 µM DRB, 200 µM Emodin, 100 µM Resveratrol oder 20 µM MG-132 behandelt. Nach vier Stunden Inkubation wurden die Zellen lysiert. Die Proteine wurden elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit verschiedenen Antikörpern analysiert. (A) Die Untersuchung mit einem anti-c-Jun-Antikörper (α c-Jun) ergab, dass die Kinase-Inhibitoren c-Jun destabilisieren. Dagegen stabilisiert MG-132 c-Jun. Curcumin induziert hochmolekulare c-Jun-Formen (HMW-c-Jun). (x = unbekannte Reaktivität des Antikörpers auf Höhe von 66 kDa) (B) Mit einem anti-Flag-Antikörper (α Flag) konnten diese Resultate bestätigt werden. (C) Die gleichen Proben wurden in einem 8%-igen SDS-Gel elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit einem anti-Ubiquitin-Antikörper (α Ubiquitin) getestet. Die Behandlung mit Curcumin oder MG-132 führte zu einer verstärkten Bildung von langkettigen Ubiquitin-Konjugaten.

4.1.5. Hemmstoffe der CK2 und PKD reduzieren die VEGF-Produktion
in HeLa-Zellen

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In früheren Studien konnte von unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass die Kinaseaktivität des COP9-Signalosom nicht nur an der Stabilisierung von c-Jun beteiligt ist, sondern auch die von diesem Transkriptionsfaktor regulierte Produktion von VEGF, dem bedeutendsten angiogenen Wachstumsfaktor (s. Abschnitt 1.2), beeinflusst (Pollmann et al., 2001). Daher bewirkt die Hemmung der Phosphorylierung von c-Jun durch Curcumin neben der Destabilisierung von c-Jun selbst auch eine Reduktion der Synthese von VEGF. Bisher war nur bekannt, dass Curcumin in HeLa-Zellen die VEGF-Produktion proportional zu seiner Einwirkungszeit supprimiert (Pollmann et al., 2001).

Abbildung 12: Curcumin supprimiert die VEGF-Produktion in HeLa-Zellen konzentrations-abhängig. In dem in Abschnitt 4.1.3 beschriebenen Experiment wurde parallel zu c-Jun auch die VEGF-Konzentration in den Zellüberständen gemessen. Nach der Inkubation der Zellen mit den angegebenen Curcumin-Molaritäten für vier Stunden wurde jedem Ansatz 1 ml Überstand entnommen. Mit einem ELISA wurde darin die VEGF-Konzentration bestimmt. Die einzelnen Konzentrationen wurden zu dem Wert der unbehandelten Kontrolle (=100%) ins Verhältnis gesetzt. Der Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten und die Standardabweichung wurden in einem Säulendiagramm wiedergegeben. Zusätzlich wurde die einer jeden Curcumin-Konzentration entsprechenden c-Jun-Bande angegeben. Dafür wurde ein vergrößerter Ausschnitt aus Abbildung 9 gewählt.

In dem Versuch, wie er in Abschnitt 4.1.3 dargestellt ist (Abbildung 9), wurde neben dem zellulären c-Jun-Spiegel die VEGF-Produktion in Abhängigkeit der verschiedenen Curcumin-Konzentrationen gemessen. Abbildung 12 verdeutlicht, dass eine ähnliche Relation auch zwischen der Konzentration von Curcumin und der Repression der VEGF-Synthese besteht. Nach vierstündiger Behandlung mit Curcumin sank die VEGF-Konzentration im Zellüberstand in Abhängigkeit der eingesetzten Curcumin-Molarität. Waren die Effekte von 1 und 5 µM noch marginal, so reduzierten 25 µM Curcumin die VEGF-Produktion bereits auf 56% des Kontrollwertes. 50 µM Curcumin ließen die VEGF-Konzentration sogar auf 47% absinken.

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Weiterhin sollte der Frage nachgegangen werden, ob auch die anderen Inhibitoren der CSN-assoziierten Kinasen zusätzlich zu ihrer destabilisierenden Wirkung auf c-Jun einen vergleichbaren Effekt auf die VEGF-Produktion haben. Dazu wurde in dem Experiment, das in Abschnitt 4.1.4 beschrieben wurde, unmittelbar vor der Lyse der Zellen 1 ml des zellfreien Mediumüberstandes entnommen. In den Überständen, die während der achtmaligen Durchführung dieses Experiments gewonnen werden konnten, wurden mit einem ELISA die VEGF-Konzentrationen bestimmt. Unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Zellzahlen, die in den einzelnen Versuchen zum Einsatz kamen, wurden die VEGF-Konzentrationen der Hemmstoff-behandelten Proben jeweils zu dem Wert des unbehandelten Ansatzes in Relation gesetzt. Die VEGF-Konzentration der unbehandelten Kontrolle wurde als 100% definiert. Für jeden Hemmstoff wurden die acht Prozentwerte gemittelt und zusammen mit ihrer Standardabweichung in einem Säulendiagramm dargestellt (Abbildung 13). Die Signifikanz der Abweichung vom Kontrollwert wurde für alle Hemmstoffe mit einem t-Test für verbundene Stichproben überprüft. Das Signifikanzniveau war stets kleiner als 0,01. Daneben wurde noch der einem jeden Hemmstoff entsprechende c-Jun-Spiegel angegeben. Stellvertretend wurde dafür ein vergrößerter Ausschnitt der c-Jun-Bande aus Abbildung 11A gewählt.

Abbildung 13 lässt erkennen, dass alle getesteten Inhibitoren der CK2 und PKD begleitend zu der Destabilisierung von c-Jun auch die Produktion von VEGF auf 53–71% des Kontrollwertes reduzierten. Am potentesten wirkten Emodin (53%) und Curcumin (55%). Auch der CK2-Hemmstoff DRB senkte die VEGF-Konzentration auf 57% des Wertes, der in der unbehandelten Proben bestimmt werden konnte. Dagegen war Resveratrol, ein Inhibitor der PKD, mit 71% deutlich schwächer wirksam. Der 26S-Proteasom-Hemmstoff MG-132 verminderte ebenfalls die VEGF-Konzentration, obwohl er im Gegensatz zu den Kinase-Inhibitoren c-Jun stabilisierte. Ebenso reduzierte die Kombination aus MG-132 und einem Kinase-Hemmstoff die VEGF-Synthese deutlich effektiver als die alleinige Behandlung mit dem Kinase-Hemmstoff, obgleich die Stabilität von c-Jun durch die zusätzliche Inkubation mit MG-132 erhöht wurde. Dieser Kombinationseffekt beider Substanzen entspricht ungefähr dem Produkt aus den beiden Einzelwerten. Beispielsweise verringerten Curcumin und MG-132 in der Einzelanwendung die VEGF-Konzentration auf 55 bzw. 70%. Das Produkt dieser beiden Werte beträgt 38,5% und liegt somit unweit der gemessenen 41%.

Abbildung 13: Inhibitoren der CK2 und PKD reduzieren die VEGF-Produktion in HeLa-Zellen. Es wurden acht Experimente nach dem Schema, wie es in Abschnitt 4.1.4 beschrieben und in Abbildung 11 veranschaulicht wurde, durchgeführt. Unmittelbar vor der Lyse der Zellen wurde jeweils 1 ml Überstand entnommen und bei -70°C eingefroren. Mit einem ELISA wurde die VEGF-Konzentration in jedem Überstand der acht unabhängigen Experimente bestimmt. Die einzelnen Konzentrationen wurden zu dem Wert der unbehandelten Kontrolle (=100%) ins Verhältnis gesetzt. Die Mittelwerte und die Standardabweichung wurden errechnet und in einem Säulendiagramm dargestellt. Ebenso wurde nochmals die jedem Hemmstoff entsprechende c-Jun-Bande aus Abbildung 11A angegeben. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde mit einem t-Test für verbundene Stichproben die Signifikanz überprüft. Alle Inhibitoren, einschließlich MG-132, verminderten signifikant die VEGF-Produktion in HeLa-Zellen. Die Kombination von MG-132 und einem der Kinase-Hemmstoffe zeigte diesbezüglich die größte Wirksamkeit.

4.2. Regulation des Ubiquitin-abhängigen Abbaus von Id1 und Id3
durch das COP9-Signalosom

4.2.1. Id3 bindet an das COP9-Signalosom

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Nachdem Bounpheng und Christy zuvor gezeigt hatten, das die Id-Proteine durch das Ubiquitin/26S-Proteasom-System abgebaut werden (Bounpheng et al, 1999), entdeckten sie bei ihrer Suche nach weiteren Bindungspartnern, dass Id3 in einer Two-hybrid-Analyse in Hefezellen möglicherweise mit CSN5 interagiert. Diese Untereinheit des COP9-Signalosoms bildet die zentrale Bindungsstelle für die meisten vom CSN-Komplex regulierten Substrate (Bech-Otschir et al., 2002). In einer weiteren Two-hybrid-Untersuchung in 293-Zellen, humanen embryonalen Nierenzellen, bestätigte sich nicht nur die Bindung von Id3 an CSN5, sondern auch für Id1 konnte eine solche Wechselwirkung mit CSN5 nachgewiesen werden, nicht dagegen aber für Id2 oder Id4 (Berse et al., 2004).

Da CSN5 in Two-hybrid-Assays falsch-positive Ergebnisse liefern kann (Nordgard et al., 2001), wurden zur Bestätigung der Interaktion zwischen Id3 und CSN5 Far-Western Blot-Analysen (Filterbindungs-Assays) und Glutathion-S-Transferase (GST)-Pull-down-Experimente durchgeführt. Für die Far-Western Blots wurden die auf Nitrozellulose immobilisierten Untereinheiten CSN5, CSN6 und CSN7 einge setzt. Anschließend wurden die Membranen mit rekombinantem GST-Id3 inkubiert und mit einem anti-GST-Antikörper untersucht. Abbildung 14A zeigt, dass GST-Id3 an CSN5 bindet. Zusätzlich konnte auch eine Interaktion mit CSN7 festgestellt werden.

In den Pull-down-Experimenten wurden GST und GST-Id3 an eine Glutathion-Agarose-Säule gebunden und mit His6-markiertem CSN5 oder CSN7 inkubiert. Nach dem Waschen der Säule und der Ablösung der an ihr heftenden Proteine durch fünfminütiges Erhitzen auf 95°C wurden die Proteine elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit einem anti-His-Antikörper identifiziert. Auch in diesem Versuch ließ sich eine Bindung von GST-Id3 an CSN5 und CSN7 beobachten. Die unspezifische Wechselwirkung beider Untereinheiten mit GST war dagegen nur schwach (Abbildung 14B, linke Spalte).

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Um auch die Interaktion von Id3 mit dem gesamten COP9-Signalosom zu beweisen, wurde in einer ähnlichen Untersuchung statt der Untereinheiten der aufgereinigte CSN-Komplex eingesetzt. Im immunologischen Proteinnachweis mit einem anti-CSN5-Antikörper war eine deutliche Bindung des Komplexes an GST-Id3 zu detektieren (Abbildung 14B, rechte Spalte).

Abbildung 14: Interaktion von Id3 mit CSN5, CSN7 und dem CSN-Komplex. (A) Far-Western Blot-Experimente wurden mit den rekombinanten Untereinheiten CSN5, CSN6 und CSN7, die auf Nitrozellulose immobilisiert worden waren, durchgeführt. Die Membranen wurden mit GST oder GST-Id3 inkubiert und mit einem anti-GST-Antikörper (α GST) untersucht. GST-Id3 bindet an CSN5 und CSN7. Die Interaktion zwischen GST und den Untereinheiten war dagegen nur schwach. (B) Für die Pull-down-Experimente wurden an Glutathion-Agarose gebundenes GST-Id3 oder GST (als Kontrolle) eingesetzt. His6-markiertes CSN5 und CSN7 (linke Spalte) oder der aufgereinigte CSN-Komplex (rechte Spalte) wurden dazugegeben. Die Western Blots wurden mit anti-His (α His)- oder anti-CSN5 (α CSN5)-Antikörpern untersucht. Wiederum zeigte sich eine Bindung von GST-Id3 an CSN5 und CSN7 sowie an den CSN-Komplex.

4.2.2. Id3 hemmt die CSN-abhängige Phosphorylierung

In vielen Fällen wird ein Protein, das an das COP9-Signalosom bindet, auch von den Kinasen, die mit dem Komplex assoziiert sind, phosphoryliert (Bech-Otschir et al., 2002; Uhle et al., 2003). Deshalb wurde in einem Kinase-Assay untersucht, ob der gereinigte CSN-Komplex oder die mit ihm verknüpften Kinasen CK2 und PKD in der Lage sind, rekombinantes GST-Id3 zu phosphorylieren. Überraschenderweise konnte dabei, wie in Abbildung 15A dargestellt, weder für den Komplex noch für die rekombinanten Kinasen eine Phosphorylierung von GST-Id3 nachgewiesen werden. Allerdings war zu beobachten, dass GST-Id3 die Phosphorylierung von c-Jun hemmt. Besonders die Phosphorylierung durch den CSN-Komplex und die CK2 wurden in Gegenwart von GST-Id3 deutlich reduziert. Die durch die PKD bewirkte Phosphorylierung wurde dagegen bei weitaus geringerem Ausgangsniveau nicht vermindert. Außerdem ist aus Abbildung 15A ersichtlich, dass die Phosphorylierung der zweiten Untereinheit des CSN-Komplexes (CSN2) durch die assoziierten Kinasen nach Zugabe von GST-Id3 ebenfalls vermindert wurde.

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Abbildung 15B zeigt, dass in einem Kinase-Assay auch die Phosphorylierung von ICSBP (interferon consensus sequence-binding protein), das über CSN2 an das COP9-Signalosom bindet (Cohen et al., 2000), durch Id3 sichtlich abgeschwächt wird.

Abbildung 15: Id3 inhibiert die Phosphorylierung von c-Jun durch das COP9-Signalosom. (A) Kinase-Assays wurden, wie unter 3.2.22 beschrieben, mit dem gereinigten CSN-Komplex oder den rekombinanten Kinasen CK2 und PKD sowie rekombinantem c-Jun und GST-Id3 als Substrate durchgeführt. Id3 reduziert signifikant die Phosphorylierung von c-Jun und CSN2 durch den aufgereinigten CSN-Komplex. Die Phosphorylierung durch CK2 war empfindlicher gegenüber Id3 als die durch PKD. (B) Auch in einem Kinase-Assay mit gereinigtem CSN-Komplex, dem rekombinantes ICSBP als Substrat zugefügt wurde, hemmte GST-Id3 die Phosphorylierung des Substratproteins.

4.2.3. Curcumin induziert hochmolekulare Formen von Id3 in vitro

Der Ubiquitin-abhängige Abbau von c-Jun über das 26S-Proteasom wird durch Curcumin beschleunigt (s. Abschnitt 4.1.24.1.4; Henke et al., 1999;
Pollmann et al., 2001). Obwohl nach den bisherigen Ergebnissen Id3 kein Substrat der CSN-assoziierten Kinasen CK2 und PKD ist, wurde der Effekt von Curcumin auf Id3 in einem in vitro-Ubiquitinierungs-System getestet. Hierzu wurde ein Ubiquitinierungs-Assay, wie er bereits für c-Jun beschrieben wurde (s. Abschnitt 4.1.2), in analoger Weise durchgeführt. Lediglich das rekombinante c-Jun wurde durch GST-markiertes Id3 ersetzt. Wiederum wurde ein Ansatz mit 50 µM Curcumin inkubiert, dem zweiten wurde lediglich DMSO in gleicher Endkonzentration zugegeben. Bereits nach vier Stunden waren nach Auftrennung der Proteine in der SDS-PAGE im Western Blot sowohl mit einem anti-Id3-Antikörper als auch mit einem anti-GST-Antikörper deutlich hochmolekulare Formen von Id3 (HMW-Id3) zu erkennen (Abbildung 16). Die GST-Id3 repräsentierende Bande nahm weder in Gegenwart noch in Abwesenheit von Curcumin ab.

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Abbildung 16: Curcumin induziert hochmolekulare Formen von Id3 in vitro. Rekombinantes GST-Id3 wurde mit dem Lysat von HeLa-Zellen, Ubiquitin und mit oder ohne 50 µM Curcumin für acht Stunden inkubiert. Die Bildung von HMW (high molecular weight)-Id3 wurde im Western Blot mit einem anti-Id3 (α Id3)- und einem anti-GST (α GST)-Antikörper nachgewiesen.

4.2.4. Curcumin destabilisiert Id3 in HeLa-Zellen und erzeugt HMW-Id3

Um die Wirkung von Curcumin auf Id3 in einem zellulären Umfeld zu untersuchen, wurde Id3 in HeLa-Zellen überexprimiert. Nach 18-stündiger Inkubation wurden die Zellen für weitere sechs Stunden mit 50 µM Curcumin, 20 µM MG-132 oder beiden Hemmstoffen behandelt. Innerhalb dieser sechs Stunden konnte auch in HeLa-Zellen eine Induktion von hochmolekularen Formen von Id3 beobachtet werden (Abbildung 17, linke Spalte). Ferner fiel eine besonders prominente Bande unterhalb von 30 kDa auf, die in Analogie zu c-Jun (s. Abschnitt 4.1.2) ungefähr dem doppelten Molekulargewicht von Id3 entspricht. Daneben war auch eine Destabilisierung von Id3 durch Curcumin zu erkennen. Die zusätzliche Inkubation mit MG-132 bewirkte eine verstärkte Ansammlung der hochmolekularen Id3-Formen (Abbildung 17, mittlere Spalte). Außerdem wurde das unmodifizierte Id3 stabilisiert. HeLa-Zellen, denen nur MG-132 zugegeben wurde, bildeten vergleichsweise geringe Mengen dieser hochmolekularen Abkömmlinge von Id3 (Abbildung 17, rechte Spalte). In Einklang mit dem bekannten Fakt, dass Id3 durch das 26S-Proteasom abgebaut wird (Bounpheng et al., 1999), war unter der alleinigen Behandlung mit MG-132 die Zunahme des nicht modifizierten Id3s am deutlichsten.

Abbildung 17: Curcumin induziert hochmolekulare Formen von Id3 in HeLa-Zellen. Id3 wurde in einem pcDNA3.1-Vektor transient in HeLa-Zellen transfiziert. Nach 18 Stunden wurden die Zellen für weitere 1–6 Stunden mit 50 µM Curcumin, 20 µM MG-132 oder beiden Hemmstoffen behandelt. Die Bildung von HMW (high molecular weight)-Id3 wurde im Western Blot mit einem anti-Id3-Antikörper (α Id3) nachgewiesen. Diese bildeten sich in Anwesenheit von Curcumin. Zusätzlich erschien in Gegenwart von Curcumin eine sehr deutliche, einer Größe von etwas weniger als 30 kDa entsprechende Bande. Noch klarer waren diese Effekte bei zusätzlicher Inkubation mit MG-132 zu erkennen. Der alleinige Einsatz von MG-132 stabilisierte Id3, ohne nennenswert HMW-Id3 zu erzeugen. (x = unbekannte Reaktivität des Antikörpers zwischen 30 und 45 kDa, dient gleichzeitig als Ladekontrolle)

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In einem weiteren Experiment sollte untersucht werden, ob die Effekte von Curcumin und MG-132 auf Id3 reversibel sind. Id3 wurde zu diesem Zweck abermals in HeLa-Zellen überexprimiert. 18 Stunden nach der Transfektion wurden dem Zellmedium für nur eine Stunde 50 µM Curcumin oder 20 µM MG-132 zugegeben. Danach wurde das Medium gewechselt und die Zellen wurden ohne Zusatz von Curcumin bzw. MG-132 für weitere sechs Stunden inkubiert. Im Rahmen dieser Versuchsanordnung war es möglich zu untersuchen, ob sich die unter der einstündigen Hemmstoffbehandlung eintretenden Veränderungen im Zeitverlauf wieder normalisieren. Nach der Lyse der Zellen und der Proteinseparation in der SDS-PAGE konnte im Western Blot mit einem anti-Id3-Antikörper tatsächlich die Reversibilität der Wirkungen von Curcumin und MG-132 auf Id3 gezeigt werden. Abbildung 18 veranschaulicht, dass Curcumin bereits nach einer Stunde Id3 erkennbar destabilisierte und, was sich allerdings nur schwach darstellt, auch hochmolekulare Formen von Id3 induzierte. Wiederum war eine Bande unmittelbar unterhalb 30 kDa sehr auffällig. Diese Effekte gingen in den folgenden sechs Stunden ohne Curcumineinwirkung wieder auf das Ausgangsniveau zurück. Auch die durch MG-132 erzeugte Stabilisierung von Id3 war nach sechs Stunden wieder vollständig regredient.

Abbildung 18: Die Wirkung von Curcumin und MG-132 auf Id3 ist reversibel. HeLa-Zellen wurden mit Id3-cDNA transient transfiziert. 18 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen für nur eine Stunde entweder mit 50 µM Curcumin oder mit 20 µM MG-132 behandelt. Nach dem Wechsel des Mediums wurden die Zellen für weitere sechs Stunden ohne die jeweiligen Hemmstoffe inkubiert. Im Western Blot konnten mit einem anti-Id3-Antikörper (α Id3) nach einer Stunde Curcuminbehandlung eine Destabilisierung und HMW (high molecular weight)-Formen von Id3 detektiert werden. Eine Bande direkt unterhalb 30 kDa fiel besonders auf. Der 26S-Proteasom-Inhibitor MG-132 stabilisierte dagegen Id3. All diese Effekte normalisierten sich innerhalb der folgenden sechs Stunden ohne Hemmstoffzugabe wieder vollends. (x = unbekannte Reaktivität des Antikörpers zwischen 30 und 45 kDa, dient gleichzeitig als Ladekontrolle)

4.2.5. Hemmstoffe der CSN-assoziierten Kinasen induzieren
die Ubiquitinierung und den Abbau von Id1 und Id3

Ausgehend von den Effekten, die unter dem Einfluss der Kinase-Inhibitoren auf intrazelluläres c-Jun beobachtet werden konnten (s. Abschnitt 4.1.4), sollte untersucht werden, ob diese Substanzen ähnliche Wirkungen auf Id3 entfalten. Des Weiteren sollte die Frage beantwortet werden, ob es sich bei den hochmolekularen Formen von Id3 um unterschiedlich stark ubiquitinierte Varianten dieses Proteins handelt und ob die Hemmung der CSN-assoziierten Kinasen die fragliche Ubiquitinierung von Id3 fördert und dadurch seinen Abbau beschleunigt.

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Dazu wurde Id3 erneut in HeLa-Zellen transient transfiziert. Nach 18 Stunden wurden die Zellen für weitere vier Stunden mit 50 µM Curcumin, 200 µM DRB,
200 µM Emodin oder 100 µM Resveratrol behandelt. Der proteasomale Inhibitor MG-132 wurde allein oder in Kombination mit den genannten Kinase-Hemmstoffen in einer Konzentration von 20 µM eingesetzt. In allen Ansätzen wurde eine konstante DMSO-Konzentration von 0,25% (v/v) gewährleistet. Nach der Zelllyse, wurden die Proteine elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit einem anti-Id3-Antikörper untersucht.

Wie aus Abbildung 19A ersichtlich wird, induzierten alle vier Inhibitoren der CSN-assoziierten Kinasen im Vergleich mit der unbehandelten Kontrolle einen verstärkten Abbau von Id3 (linker unterer Quadrant). Im Gegensatz zu den Wirkungen auf c-Jun, die in einem analogen Versuch dokumentiert werden konnten (s. Abschnitt 4.1.4), besaß diesmal neben Curcumin auch Emodin die Fähigkeit, hochmolekulare Formen von Id3 (HMW-Id3) zu erzeugen (linker oberer Quadrant). Diese beiden Inhibitoren wiesen auch das größte Potential hinsichtlich der Bildung einer Bande unmittelbar unterhalb von 30 kDa auf. In Anwesenheit von MG-132 dagegen wurde Id3 stabilisiert. Auch die Kombination von MG-132 mit einem der Kinase-Hemmstoffe führte im Vergleich mit der alleinigen Kinase-Hemmstoff-Inkubation zu einer geringeren Destabilisierung von Id3 (rechter unterer Quadrant). Ebenso verstärkte MG-132 das Auftreten der hochmolekularen Formen von Id3, welche durch Curcumin und Emodin erzeugt wurden (rechter oberer Quadrant). Die Bande im Bereich von 30 kDa war in Gegenwart von MG-132 und speziell unter Einwirkung der Kombination von MG-132 mit Curcumin oder Emodin besonders intensiv.

Die Auftrennung der Proteine aus dem Lysat der HeLa-Zellen in einem 8%-igen SDS-Gel erbrachte nach darauffolgendem Western Blot und Immundetektion mit einem anti-Ubiquitin-Antikörper den Nachweis, dass unter Curcumin und Emodin vermehrt hochmolekulare Ubiquitin-Konjugate gebildet wurden (Abbildung 19B, linke Spalte). Dieses Ergebnis stützt die Annahme, dass es sich bei den hochmolekularen Id3-Formen um mit Ubiquitin konjugiertes Id3 (Id3-Ubn) handelt. Der Effekt von Emodin konnte durch MG-132 noch gesteigert werden, wobei auch schon MG-132 allein die Bildung der Ubiquitin-Konjugate verstärkte (Abbildung 19B, rechte Spalte).

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Abbildung 19: Inhibitoren der CSN-assoziierten Kinasen induzieren den Ubiquitin- und Proteasom-abhängigen Abbau von Id1 und Id3. (A) HeLa-Zellen wurden transient mit Id3 transfiziert und dann mit 50 µM Curcumin, 200 µM DRB, 200 µM Emodin, 100 µM Resveratrol oder 20 µM MG-132 behandelt. Die Zellen wurden nach vier Stunden Inkubation lysiert, die Proteine in der SDS-PAGE aufgetrennt und im Western-Blot mit einem anti-Id3-Antikörper (α Id3) untersucht. Die Kinase-Inhibitoren destabilisieren, MG-132 stabilisiert Id3 (linker und rechter unterer Quadrant). Curcumin und Emodin lassen hochmolekulare Id3-Formen und eine Bande direkt unterhalb von 30 kDa akkumulieren (linker oberer Quadrant), was durch MG-132 noch verstärkt wird (rechter oberer Quadrant). (x = unbekannte Reaktivität des anti-Id3-Antikörpers, dient gleichzeitig als Ladekontrolle) (B) Die gleichen Proben wurden in einem 8%-igen SDS-Gel elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit einem anti-Ubiquitin-Antikörper (α Ubiquitin) getestet. Besonders die Behandlung mit Curcumin führte zu einer verstärkten Bildung von Ubiquitin-Konjugaten. (C) Die Stabilität von endogenem Id1 wurde unter Einfluss der unter (A) aufgeführten Hemmstoffe beobachtet. Im Western Blot konnten, verglichen mit den Ergebnissen von (A), mit einem anti-Id1-Antikörper (α Id1) ähnliche Auswirkungen der Inhibitoren auf die Stabilität von Id1 nachgewiesen werden.

Analoge Ergebnisse konnten hinsichtlich der Auswirkung der beschriebenen Hemmstoffe auf die Stabilität von endogenem Id1, dem nächsten Verwandten von Id3 innerhalb der Id-Proteinfamilie, erzielt werden. Auf der einen Seite destabilisierten bis auf Resveratrol alle eingesetzten Kinase-Inhibitoren erkennbar das Id1-Protein (Abbildung 19C, linke Spalte). Als Zweites führten Curcumin und Emodin wieder zu einer Akkumulation hochmolekularer Id1-Formen sowie einer der doppelten Proteingröße von Id1 entsprechenden, stark ausgeprägten Bande (nicht gezeigt). Und drittens stabilisierte MG-132 sowohl allein als auch in Kombination mit den Kinase-Hemmstoffen Id1 deutlich (Abbildung 19C, rechte Spalte).

Um die Bildung von Id3-Ubiquitin-Konjugaten zu bestätigen, wurde das Id3-pcDNA3.1-Konstrukt zusammen mit einem Vektor, der für His10-markiertes Ubiquitin (His-Ub) kodiert, in HeLa-Zellen kotransfiziert. 18 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in An- oder Abwesenheit von 50 µM Curcumin für weitere vier Stunden inkubiert. Nach der Lyse der Zellen, der elektrophoretischen Proteinauftrennung und dem Transfer auf Nitrozellulose im Western Blot wurden die Membranen mit einem anti-His- und einem anti-Id3-Antikörper analysiert. Aus Abbildung 20A ist zu entnehmen, dass in den Lysaten aus Zellen, die sowohl
His-Ub als auch Id3 überexprimieren, eine Bildung von hochmolekularen Ubiquitin- und Id3-Konjugaten detektiert werden kann. Unter dem Einfluss von Curcumin formten sich diese Konjugate in einer größeren Zahl.

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In His-Pull-down-Experimenten sollte gezeigt werden, dass es sich bei den hochmolekularen Id3-Formen, die in den Lysaten der kotransfizierten Zellen nachweisbar waren, um Id3-Ubiquitin-Konjugate handelt. Mit magnetischen Ni-NTA-Agarosepartikeln (Ni-Partikel), die His-markierte Proteine binden, konnten hochmolekulare Proteinverbindungen präzipitiert werden, die sich mit einem anti-Id3-Antikörper als Id3-Ubn-Konjugate identifizieren ließen (Abbildung 20B).

Mit Hilfe eines abschließenden Versuches sollte der Einfluss des COP9-Signalosoms auf die Regulation der Stabilität von Id3 noch von einer anderen Seite beleuchtet werden. Naumann et al. hatten gezeigt, dass die Überexpression der COP9-Signalosom-Untereinheit CSN2 zu einer de novo-Assemblierung des CSN-Komplexes führt, welche auch von einer Steigerung der CSN-vermittelten Kinaseaktivität begleitet wird. Letzteres äußert sich beispielsweise in einer Stabilisierung von c-Jun (Naumann et al., 1999).

Abbildung 20: Das COP9-Signalosom stabilisiert Id3. (A) HeLa-Zellen wurden mit Id3-cDNA (pcDNA3.1-Vektor) oder/und His10-Ubiquitin-cDNA (pEGFP-N3-Vektor) transient transfiziert. Fand keine Kotransfektion statt, wurde zum Ausgleich nur der pcDNA3.1-Vektor (Kontrolle) transfiziert. 18 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit oder ohne 50 µM Curcumin weitere vier Stunden inkubiert. Nach Zelllyse und SDS-PAGE wurden die Proteine im Western Blot mit anti-His (α HIS)- und anti-Id3 (α Id3)-Antikörpern untersucht. In den kotransfizierten Zellen akkumulierten hochmolekulare Ubiquitin- und Id3-Konjugate, was durch Curcumin noch verstärkt werden konnte.
(B) Die selben Lysate wurden auch in einem His-Pull-down-Experiment mit magnetischen Ni-NTA-Agarosepartikeln (Ni-Partikel) eingesetzt. Die weitere Analyse erfolgte mittels SDS-PAGE, Western Blot und immunologischem Proteinnachweis durch einen anti-Id3-Antikörper (α Id3). Id3-Ubiquitin-Konjugate konnten präzipitiert werden, wiederum vermehrt unter Curcumineinfluss. (C) Flag-CSN2-cDNA (pcDNA3.1-Vektor) (+CSN2) oder der pcDNA3.1-Vektor ohne Insert (Kontrolle) wurden in HeLa-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden lysiert, die Proteine auf ein Gel geladen, in der SDS-PAGE aufgetrennt und geblottet. Anschließend wurden die Nitrozellulose-Membranen mit einem anti-Id3-Antikörper (α Id3) behandelt. Id3 wurde durch die Überexpression von CSN2 deutlich stabilisiert.

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Unter der Annahme eines ähnlichen Effekts einer solchen Überexpression auf intrazelluläres Id3, wurde die Untereinheit CSN2 in HeLa-Zellen transient transfiziert. In Abbildung 20C ist eindeutig zu erkennen, dass im Vergleich zu den mit einem Leervektor transfizierten Kontrollzellen die Überexpression von CSN2 eine Stabilisierung von endogenem Id3 zur Folge hat.


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20.03.2006