5. Diskussion

▼ 58 (fortgesetzt)

In der vorliegenden Arbeit konnte das Verständnis der komplexen Regulationsmechanismen, über die das COP9-Signalosom verschiedene Zellfunktionen steuert, erweitert werden. Erstmals konnte gezeigt werden, dass Id3, und möglicherweise auch Id1, an den CSN-Komplex binden und dass diese Interaktion die Stabilität von Id1 und Id3 gegenüber dem Ubiquitin/26S-Proteasom-System beeinflusst. Im ersten Teil dieser Studie wurde die schon bekannte Wechselwirkung zwischen dem COP9-Signalosom und c-Jun eingehender untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass der Ubiquitin-abhängige Abbau von c-Jun in entscheidender Weise durch den CSN-Komplex reguliert wird. Über die Steuerung der Stabilität von Id1, Id3 und insbesondere c-Jun besitzt das COP9-Signalosom auch einen großen Einfluss auf die Regulation der Angiogenese. Am Beispiel der Abhängigkeit der VEGF-Produktion von der Kinaseaktivität des CSN-Komplexes konnte dieser Fakt verdeutlicht werden.

5.1. Das COP9-Signalosom kontrolliert den Ubiquitin-abhängigen Abbau des proangiogenen Transkriptionsfaktors c-Jun

5.1.1. c-Jun bindet an das COP9-Signalosom

Bereits vor der ersten Aufreinigung des COP9-Signalosoms aus humanen Erythrozyten (Seeger et al., 1998) war bekannt, dass JAB1 an c-Jun bindet (Claret et al., 1996). Als aber JAB1 als die fünfte Untereinheit des CSN-Komplexes identifiziert werden konnte und sich herausstellte, dass die mit dem Komplex assoziierte Kinaseaktivität auch c-Jun phosphoryliert, bekam diese Interaktion neues Gewicht. Somit war es wichtig, diese Wechselwirkung in HeLa-Zellen zu bestätigen (Abbildung 7). Mit Hilfe einer Immunpräzipitation und eines Pull-down-Experimentes konnte die Bindung zwischen c-Jun und CSN5 in wechselseitiger Richtung demonstriert werden (Abbildung 7A und 7B). Durch eine weitere Immunpräzipitation, die die Interaktion zwischen CSN5 und CSN7 zeigt (Abbildung 7D), sowie eine Dichtegradientenzentrifugation, in der CSN5 mit den Untereinheiten CSN3 und CSN8 ko-migriert und nur zu einem sehr geringen Teil in freier Form vorkommt (Abbildung 7C), wurde in HeLa-Zellen die Inkorporation von CSN5 in den CSN-Komplex nachgewiesen. Zusammengenommen besagen diese Resultate, dass c-Jun nicht nur an CSN5 bindet, sondern über diese Untereinheit auch mit dem COP9-Signalosom interagiert. Diese Bindung bildet die Basis für die Phosphorylierung von c-Jun durch die mit dem CSN-Komplex assoziierten Kinasen.

5.1.2. Inhibitoren der CSN-assoziierten Kinasen induzieren den Abbau
von c-Jun über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System

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Ein gut untersuchtes Beispiel für die Regulation des Proteinabbaus durch Phosphorylierung ist die Steuerung der Stabilität von c-Jun. Die Phosphorylierung von Ser63 und Ser73 innerhalb der δ-Domäne reduziert die Ubiquitinierung von c-Jun und verzögert dadurch seinen Abbau über das 26S-Proteasom (Treier et al., 1994; Fuchs et al., 1996; Musti et al., 1997). Anfangs galten die JNKs als die einzigen Kinasen, die c-Jun in seiner N-terminalen Aktivierungsdomäne phosphorylieren. Gemeinsam mit dem COP9-Signalosom konnte allerdings auch eine Kinaseaktivität isoliert werden, die c-Jun ebenfalls an diesen beiden Serinresten phosphoryliert (Seeger et al., 1998) und hierdurch seinen Abbau verlangsamt (Henke et al., 1999; Naumann et al., 1999). Als die mit dem CSN-Komplex assoziierten Kinasen konnten von unserer Arbeitsgruppe kürzlich die CK2 und PKD identifiziert werden (Uhle et al., 2003). Eine weitere Kinase ist die IP-5/6-Kinase (Sun et al., 2002; Wilson et al., 2001). Bisher konnte aber der genaue Mechanismus, über den die CSN-abhängige Phosphorylierung c-Jun stabilisiert noch nicht aufgedeckt werden.

Zum eingehenderen Studium dieses Regulationsprozesses wurden verschiedene Inhibitoren der CSN-assoziierten Kinasen eingesetzt. Besonderes Interesse galt dabei Curcumin. Frühere Analysen unserer Arbeitsgruppe ergaben, dass Curcumin neben der Reduktion der mit dem CSN-Komplex assoziierten Kinaseaktivität auch eine Destabilisierung des Transkriptionsfaktors c-Jun bewirkt (Henke et al., 1999; Pollmann et al., 2001). In dieser Studie konnte nun ein kausaler Zusammenhang zwischen der Hemmung der CSN-assoziierten Kinasen durch Curcumin und dem beschleunigten Abbau von c-Jun über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System aufgezeigt werden.

Als Erstes ließ sich in einem Ubiquitinierungs-Assay nachweisen, dass Curcumin in vitro den Abbau von c-Jun induziert (Abbildung 8). Dabei fiel auf, dass sich im Verlauf von acht Stunden in Abwesenheit von Curcumin der Proteinspiegel von cJun kaum veränderte. Obwohl die Ubiquitinierung und die Proteolyse im 26S-Proteasm jeweils ATP-abhängige Prozesse sind, ist nicht davon auszugehen, dass das Fehlen eines ATP-regenerierenden Systems die erhöhte Stabilität von
c-Jun erklärt. Neben den eingesetzten 2 mM ATP enthielt der Ubiquitinierungs-Assay HeLa-Lysat, welches zur Regeneration von ATP beitragen könnte. Außerdem fand in Gegenwart von Curcumin auch ohne ATP-regenerierendes System ein suffizienter Proteinabbau statt, und schließlich konnte in einem ähnlichen System p53 ohne zusätzliche ATP-Regeneration erfolgreich abgebaut werden (Bech-Otschir et al., 2001). Andererseits könnte die Ursache der nahezu konstanten Proteinspiegel in einer ausgeprägten Phosphorylierung des rekombinanten cJun liegen. Dadurch würde sich nämlich seine Halbwertzeit von ca. 90 min fast vervierfachen (Lamph et al., 1988; Musti et al., 1997).

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Zweitens führte Curcumin in vitro zu einer Akkumulation hochmolekularer Formen von c-Jun, welche als HMW (high molecular weight)-c-Jun bezeichnet wurden (Abbildung 8). In HeLa-Zellen induzierte Curcumin in Abhängigkeit von seiner Konzentration neben dem Abbau von c-Jun ebenfalls diese hochmolekularen Formen (Abbildung 9). Da sich ihre Ansammlung in Gegenwart des proteasomalen Inhibitors MG-132 weiter verstärkte und sie auch mit einem anti-Ubiquitin-Antikörper kreuzreagierten, scheint es sich bei ihnen mit hoher Wahrscheinlichkeit um Ubiquitin-Konjugate zu handeln. Die Reversibilität des Curcumin-Effektes hinsichtlich der Bildung HMW-c-Juns und der verlangsamte Rückgang dieser c-Jun-Formen in Anwesenheit von MG-132 unterstützen diese These (Abbildung 10).

Als Drittes stabilisierte der 26S-Proteasom-Hemmstoff MG-132 c-Jun in HeLa-Zellen (Abbildung 9 und 11). Auch in Kombination mit Curcumin reduzierte MG132 den Abbau von c-Jun, was darauf hindeutet, dass die durch Curcumin beschleunigte Proteolyse von c-Jun über das 26S-Proteasom läuft.

Leider ist Curcumin kein spezifischer Hemmstoff der CSN-assoziierten Kinasen. Beispielsweise ist es auch als Inhibitor der Proteinkinasen PKC und PKA beschrieben worden (Hasmeda & Polya, 1996). Ebenso hemmt es den JNK-Signalweg (Chen & Tan, 1998), der eine sehr wichtige Rolle bei der Regulation der Stabilität und Aktivität von c-Jun spielt (s. Abschnitt 1.3 und 1.6.2.1). Allerdings konnte in diesem Fall die Kinase, die durch Curcumin inhibiert wird, nicht identifiziert werden. Darüber hinaus sind in Erythrozyten, HeLa-, HL-60 und MCF-7-Zellen die CSN-assoziierten Kinasen konstitutiv aktiv (Seeger et al., 1998; Bech-Otschir et al., 2001), während der JNK-Signalweg inaktiv ist und erst durch extrazelluläre Stimuli aktiviert wird (Dunn et al., 2002). Interessanterweise kann das COP9-Signalosom über seine Untereinheit CSN1 sogar den JNK-Signalweg supprimieren (Spain et al., 1996; Tsuge et al., 2001).

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Eine weitere Fähigkeit von Curcumin stellt möglicherweise auch die Hemmung deubiquitiniernder Enzyme, so genannter Ubiquitin-Isopeptidasen, dar (Mullally & Fitzpatrick, 2002). Die reduzierte Aktivität der Ubiquitin-Isopeptidasen könnte zu der beobachteten Anhäufung von HMW-c-Jun bzw. Ubiquitin-Konjugaten beitragen (Abbildung 8 und 9). Jedoch behaupten die Autoren dieser Arbeit, dass die Hemmung der Ubiquitin-Isopeptidasen irreversibel ist, was mit den in Abbildung 10 präsentierten Ergebnissen nicht vereinbar ist. Weiterhin postulieren sie, dass die verminderte Ubiquitin-Isopeptidaseaktivität das Gleichgewicht zwischen Poly- und Monoubiquitin zugunsten der langkettigen Polymere verschiebt, wodurch der Ubiquitinierung potentieller Substrate das benötigte Monoubiquitin entzogen wird und letztlich die Substrate akkumulieren sollen. Ganz im Gegenteil aber wird c-Jun durch Curcumin deutlich destabilisiert (Abbildung 8, 9 und 10; Henke et al., 1999; Pollmann et al., 2001). Folglich kommt der Inhibition der Ubiquitin-Isopeptidasen durch Curcumin höchstens eine augmentative Funktion bei der Bildung von c-Jun-Ubiquitin-Konjugaten zu.

Auffällig war noch eine andere Eigenschaft von Curcumin. Sowohl c-Jun als auch Id3 bildeten in seiner Gegenwart Proteinverbindungen, die annähernd dem doppelten Molekulargewicht des jeweiligen Proteins entsprechen (Abbildung 8-11 bzw. 17-19). Höchstwahrscheinlich handelt es sich dabei aber nicht um Homodimere von c-Jun bzw. Id3. Zwar sind beide Proteine in der Lage, Homodimere zu formen (s. Abschnitt 1.3; Wibley et al., 1996), doch sind diese Dimere in der Regel nicht kovalent verknüpft. Eine kovalente Bindung wäre aber eine notwendige Voraussetzung für ihren Bestand während der denaturierenden Gelelektrophorese. Zudem weisen Untersuchungen an zuckerkranken Ratten darauf hin, dass Curcumin das Cross-linking von Proteinen eher verhindert als fördert (Sajithlal et al., 1998). Dass im Fall von überexprimiertem Flag-markiertem c-Jun diese Proteine auch mit einem anti-Flag-Antikörper, nicht aber mit einem anti-Ubiquitin-Antikörper (Abbildung 9 und 11) detektiert werden konnten, spricht auf der anderen Seite gegen eine unspezifische Kreuzreaktivität des anti-c-Jun-Antikörpers sowie gegen die Vermutung, dass sich kurzkettige c-Jun-Ubiquitin-Konjugate hinter diesen Proteinverbindungen verbergen. Was die wahre Natur dieser Abkömmlinge von c-Jun und Id3 ist, bleibt noch zu klären.

Ein Weg, die ungenügende Spezifität von Curcumin auszugleichen, führte zu dem Einsatz anderer Inhibitoren der CSN-assoziierten Kinasen. Für die Hemmstoffe der CK2, DRB und Emodin (Battistutta et al., 2000; Zandomeni, 1989), und den Inhibitor der PKD, Resveratrol (Haworth & Avkiran, 2001), konnte bereits in Kinase-Assays gezeigt werden, dass sie die Phosphorylierung von rekombinantem c-Jun durch die CK2, die PKD oder den aufgereinigten CSN-Komplex supprimieren (Uhle et al., 2003). In der vorliegenden Studie wurden diese Ergebnisse auf zellulärer Ebene bestätigt. Über die Hemmung der Phosphorylierung von c-Jun induzierten sie in HeLa-Zellen dessen Abbau (Abbildung 11). Dass dieser über das 26S-Proteasom läuft, kann aus der Stabilisierung von c-Jun durch die zusätzliche Inkubation mit MG-132 geschlossen werden. Anders als Curcumin erzeugen aber weder DRB noch Emodin oder Resveratrol HMW-c-Jun. In vitro-Studien ergaben, dass Curcumin sowohl bezüglich der rekombinanten Kinasen CK2 und PKD als auch in Bezug auf den isolierten CSN-Komplex von allen vier Inhibitoren den kleinsten K i-Wert besitzt (Uhle et al., 2003). Damit einhergehend hemmt es beide Kinasen mit nahezu gleich hoher Potenz. Deshalb ließe sich spekulieren, dass für die den proteasomalen Abbau übersteigende Akkumulation von HMW-c-Jun eine effektive Suppression beider CSN-assoziierten Kinasen notwendig ist.

5.1.3. Modell des CSN-kontrollierten Abbaus von c-Jun

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Das COP9-Signalosom interagiert mit nahezu allen Komplexen, die im Prozess des Proteinabbaus eine zentrale Stellung einnehmen. Zu nennen wären diesbezüglich das 26S-Proteasom (Kwok et al., 1999; Peng et al., 2003) und eine spezielle Klasse von E3s, die Cullin-haltigen Ubiquitinligasen, zu denen beispielsweise die SCF-Komplexe gehören (Peng et al., 2003; Schwechheimer et al., 2001; Wolf et al., 2003). Neben dieser strukturellen Beziehung existiert auch eine funktionelle Wechselwirkung zwischen beiden Proteinkomplexen und dem COP9-Signalosom. Wie bereits in der Einleitung ausgeführt wurde (s. Abschnitt 1.6.2.2), verfügt der CSN-Komplex nicht nur über eine assoziierte Kinaseaktivität sondern auch über eine intrinsische Deneddylasefunktion (Cope et al., 2002), die Nedd8 von Cullin abspaltet und dadurch die Ligaseaktivität der Cullin-haltigen E3s reduziert (Lyapina et al., 2001; Wolf et al., 2003). Mit einer Ubiquitin-Isopeptidaseaktivität, die die Abspaltung von Ubiquitin katalysiert, konnte das Spektrum der CSN-assoziierten Funktionen um eine dritte Position erweitert werden (Groisman et al., 2003; Zhou et al., 2003). Auch diese Aktivität steht mit der Regulation von bestimmten Cullin-haltigen E3s, den SCF-Komplexen, in Verbindung, da sie die Autoubiquitinierung von Komponenten des SCF-Komplexes verhindert und somit den Komplex stabilisiert (Zhou et al., 2003).

Kürzlich konnten gleich drei verschiedene Ubiquitinligasen identifiziert werden, die c-Jun ubiquitinieren. Zum Einen handelt es sich dabei um das zum HECT-Typ der Ubiquitinligasen gehörende Protein Itch/AIP4 (Fang & Kerppola, 2004), welches zuvor schon als E3 von JunB beschrieben worden ist (Fang et al., 2002). Die beiden anderen Ligasen stellen dagegen größere Proteinkomplexe vom RING-Typ dar. Eine von ihnen, SCFFbw7, gehört der im vorhergehenden Absatz erwähnten Klasse der SCF-Komplexe an (Nateri et al., 2004). Indessen repräsentiert der zweite Komplex, der sich aus den Untereinheiten DET1, DDB1, Cullin4A (Cul4A), ROC1 und COP1zusammensetzt und in Analogie zur Nomenklatur der SCF-Komplexe als DCXhDET1 hCOP1(DDB1, Cul4A, X-Box) bezeichnet wird (Wertz et al., 2004), eine andere Klasse von Ubiquitinligasen des RING-Typs. In einer früheren Arbeit konnte bereits die Interaktion von c-Jun mit humanem COP1 aufgedeckt werden (Bianchi et al., 2003), welches in Arabidopsis als E3 des Transkriptionsfaktors HY5 agiert (Osterlund et al., 2000), der wie c-Jun ein Mitglied der Proteinfamilie der basischen Leuzinzipper (bZIP) ist. Da allgemein Cullin-haltige E3s über ihre Cullin-Untereinheit an den CSN-Komplex binden (Wolf et al., 2003) und diese Assoziation für einen mit DCXhDET1-hCOP1 verwandten Proteinkomplex, der die Untereinheiten DDB1, Cul4A und ROC1 beinhaltet, explizit gezeigt werden konnte (Groisman et al., 2003), ist eine Wechselwirkung zwischen DCXhDET1 hCOP1 und dem COP9-Signalosom sehr wahrscheinlich. Ferner wäre auch über COP10, das sowohl an COP1 als auch an das COP9-Signalosom bindet (Suzuki et al., 2002), eine Assoziation von DCXhDET1-hCOP1 mit dem CSN-Komplex vorstellbar. Damit würden gleich zwei der drei Ubiquitinligasen von c-Jun, SCFFbw7 und
DCXhDET1 hCOP1, mit dem COP9-Signalosom interagieren.

Im Lichte der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ergibt sich das folgende Szenario für den CSN-gesteuerten Abbau von c-Jun (Abbildung 21): Das COP9-Signalosom bildet mit dem 26S-Proteasom und bestimmten Ubiquitinligasen wie SCFFbw7, oder möglicherweise auch DCXhDET1-hCOP1 , ein Komplexkonglomerat, in dem die wichtigsten Bestandteile der Abbaumaschinerie für c-Jun vertreten sind. Einerseits reguliert es durch seine Deneddylase- und Ubiquitin-Isopeptidaseaktivität die Ligasefunktion des assoziierten SCF-Komplexes (Schwechheimer et al., 2001; Lyapina et al., 2001; Groisman et al., 2003; Zhou et al., 2003). Nach dem „statischen Modell“ der Neddylierung von Cullin1 (von Arnim, 2003) inhibiert die CSN-abhängige Deneddylierung diese Ligaseaktivität. Auf der anderen Seite ist das COP9-Signalosom auch eine Plattform für die Kinasen CK2 und PKD, die durch ihre Phosphorylierung die Bindung von Substratproteinen an ihre jeweiligen Ubiquitinligasen beeinflussen (Pollmann et al., 2001; Uhle et al., 2003).

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Abbildung 21: Regulation des Abbaus von c-Jun durch das COP9-Signalosom. (A) Unter Einfluss des COP9-Signalosoms (CSN) wird die Ubiquitinligase SCFFbw7 (SCF) deneddyliert (N8=Nedd8), wodurch sich ihre Affinität gegenüber dem Ubiquitin-konjugierenden Enzym (E2) und ihre Ligaseaktivität vermindern. Die CSN-gebundenen Kinasen CK2 und PKD phosphorylieren (P) andererseits c-Jun und inhibieren dadurch seine Assoziation mit dem SCF-Komplex. Diese beiden Funktionen eines aktiven CSN-Komplexes verhindern, dass c-Jun ubiquitiniert und vom 26S-Proteasom (26S) abgebaut wird. (B) Curcumin und N-ethylmaleimid hemmen die Kinase- bzw. Deneddylaseaktivität des COP9-Signalosoms. Folglich wird weder c-Jun durch die CSN-assoziierten Kinasen phosphoryliert noch wird die Ubiquitinligase SCFFbw7 deneddyliert, d. h. sie liegt in ihrer neddylierten und damit aktiven Form vor. In Zusammenarbeit mit einem rekrutierten E2 ubiquitiniert SCFFbw7 c-Jun. Dieses wird daraufhin vom 26S-Proteasom erkannt und zu Peptidfragmenten abgebaut. Die Polyubiquitinkette wird in ihre monomeren Bestandteile (Ub=Ubiquitin) zerlegt, die dann für erneute Substrat-Ubiquitinierungen zur Verfügung stehen.

Im Fall von c-Jun bewirkt die Phosphorylierung eine verminderte Affinität gegenüber seinem E3, wodurch die Ubiquitinierung von c-Jun gehemmt wird. Folglich wird c-Jun stabilisiert. Phosphopeptidanalysen und Vergleiche mit Konsensussequenzen ergaben, dass die CK2 c-Jun höchstwahrscheinlich an Thr62 phosphoryliert (Seeger et al., 1998; Uhle et al., 2003). Ihre Phosphorylierungsstelle ist somit nicht mit den Angriffsorten der JNK, Ser63 und Ser73, identisch. Bisher galt, dass die durch die JNK katalysierte Phosphorylierung den Abbau von c-Jun über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System verlangsamt (Musti et al., 1997). Allerdings kam kürzlich eine Studie genau zu dem entgegengesetzten Resultat, nämlich dass die JNK-abhängige Phosphorylierung eine verstärkte Ubiquitinierung von c-Jun durch SCFFbw7 induziert und dadurch seinen Abbau beschleunigt (Nateri et al., 2004). Daher wäre es denkbar, dass die Position der Phosphorylierung innerhalb des Proteins darüber entscheidet, ob sich die Affinität von c-Jun gegenüber SCFFbw7 erhöht oder verringert, wobei die Phosphorylierung an Thr62 protektiv, die an Ser63/73 destabilisierend wirkt.

5.1.4. Das COP9-Signalosom reguliert die c-Jun-abhängige VEGF-Synthese

Nachdem gezeigt werden konnte, dass das COP9-Signalosom eine wichtige Rolle in der Regulation des Abbaus von c-Jun über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System spielt, stellte sich sogleich die Frage nach den funktionellen Konsequenzen einer veränderten Stabilität von c-Jun. Dabei zeigte sich, dass alle Inhibitoren der CK2 und PKD neben der Destabilisierung von c-Jun auch signifikant die VEGF-Produktion in HeLa-Zellen supprimieren (Abbildung 13). Diese Ergebnisse stehen in Einklang mit früheren Resultaten unserer Arbeitsgruppe, die besagen, dass die Aktivität von AP-1 in HeLa- und HL-60-Zellen für ca. 75% der basalen Transkription des VEGF-Gens verantwortlich ist und dass Curcumin diese c-Jun-abhängige VEGF-Synthese effektiv inhibiert (Pollmann et al., 2001). Nachfolgende in vitro-Untersuchungen (Uhle et al., 2003) sowie die vorliegenden Ergebnisse bestätigen das damals aufgestellte Modell, wonach die CSN-assoziierten Kinasen durch Phosphorylierung c-Jun stabilisieren, welches daraufhin als Bestandteil von AP-1 seinen Beitrag zur zellulären VEGF-Produktion leistet (Abbildung 22).

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Dieser Regulationsmechanismus setzt somit auch die CSN-assoziierten Kinasen CK2 und PKD mit dem Prozess der Angiogenese in einen biologischen Zusammenhang. Interessanterweise wurde eine Beziehung zwischen diesen Kinasen und malignen Tumoren mehrfach beschrieben (Guerra & Issinger, 1999; Van Lint et al., 2002). Die Beteiligung der CK2 und PKD an der Steuerung der VEGF-Produktion durch den CSN-Komplex liefert nun eine kausale Grundlage dieser Beobachtungen.

Andererseits erklärt das Modell der Kontrolle der VEGF-Synthese durch CSN-abhängige Phosphorylierung und Stabilisierung von c-Jun auch sehr gut die bekannten antikarzinogenen und antiangiogenen Effekte im Wirkungsspektrum der verwendeten Kinase-Inhibitoren. Insbesondere Curcumin und Emodin gelten in der fernöstlichen und indischen Kultur als traditionelle Heilmittel. Erste wissenschaftliche Studien in den frühen 70er Jahren konnten eine antiinflammatorische Wirkung des Curcumins aufzeigen (Arora et al., 1971). Seither wurden neben der antioxidativen (Reddy & Lokesh, 1994; Sreejayan & Rao, 1994) auch antitumorgene (Huang et al., 1994; Aggarwal et al., 2003) und antiangiogene (Pollmann et al., 2001; Arbiser et al., 1998) Eigenschaften erforscht. Emodin, das aus Polygonum cuspidatum (Japanischer Staudenknöterich) gewonnen wird, ist ebenfalls antiinflammatorisch, antioxidativ (Malterud et al., 1993), immunsuppressiv (Huang et al., 1992) und antiproliferativ bzw. antitumorgen (Lee, 2001; Zhang et al., 1995) wirksam. Auch Resveratrol, welches erstmals 1940 aus der Wurzel von Veratrum grandiflorum (weiße Nieswurz) isoliert werden konnte und als Bestandteil der Schale der roten Weintraube für die kardioprotektiven Eigenschaften des Rotweins verantwortlich gemacht wird, besitzt antiinflammatorische, antioxidative, antikarzinogene und antiangiogene Effekte (Aggarwal et al., 2004).

Die Hemmung der CSN-assoziierten Kinasen durch diese oder noch spezifischere Inhibitoren stellt damit einen vielversprechenden therapeutischen Ansatzpunkt bei der Unterdrückung der Tumorangiogense dar. Hinzu kommt, dass mit der Herabsetzung der Kinaseaktivität des CSN-Komplexes gleichzeitig eine Stabilisierung des Tumorsuppressorproteins p53 verbunden ist (Bech-Otschir et al., 2001), das neben der Initiation maligner Tumoren auch die Angiogenese im Allgemeinen und die Synthese von VEGF im Speziellen unterdrückt (Bouvet et al., 1998; Kerbel & Folkman, 2002). Analog zu c-Jun wird p53 nach seiner Bindung an CSN5 durch die CSN-gebundenen Kinasen CK2 und PKD phosphoryliert (Uhle et al., 2003). Im Gegensatz zu c-Jun aber wird daraufhin sein Abbau über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System induziert (Bech-Otschir et al., 2001), weshalb eine Inhibition der Kinasen seinen intrazellulären Proteinspiegel erhöht (Abbildung 22).

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Erstaunlicherweise vermindert auch der proteasomale Hemmstoff MG-132 signifikant die VEGF-Produktion in HeLa-Zellen, obwohl er eine Stabilisierung von c-Jun bewirkt (Abbildung 13). Dieser scheinbare Widerspruch löst sich sofort auf, wenn man bedenkt, dass durch die Inhibition des 26S-Proteasoms eine Vielzahl von Proteinen akkumuliert, die auf einem c-Jun-unabhängigen Weg die Synthese von VEGF beinflussen können. Zum Einen induzieren proteasomale Inhibitoren die Apoptose von - vornehmlich malignen - Zellen (Almond & Cohen, 2002). Dadurch sinkt natürlich auch die Menge des von dieser Zellpopulation produzierten Wachstumsfaktors VEGF. Als Zweites verhindern sie den Abbau von IκBα, welches NF-κB im Zytosol sequestriert (Karin & Ben-Neriah, 2000) und auf diese Weise die NF-κB-abhängige Expression von VEGF reduziert (Sunwoo et al., 2001). Des Weiteren legt die Tatsache, dass die Kombination von MG-132 mit einem Kinase-Hemmstoff die Synthese von VEGF in einem Maß verringert, das ungefähr dem Produkt der Einzeleffekte dieser Substanzen entspricht (s. Abschnitt 4.1.5 und Abbildung 12), den Verdacht nahe, dass MG-132 und die Kinase-Hemmstoffe unabhängig voneinander die VEGF-Produktion von HeLa-Zellen supprimieren. Diese Fakten unterstreichen auch die Bedeutung von Proteasom-Hemmstoffen als mögliche Therapeutika im Kampf gegen die Angiogenese maligner Tumoren und weisen auf einen Effizienzgewinn einer Kombinationstherapie mit anderen Angiogense-Inhibitoren hin.

Abbildung 22: Regulation der Angiogenese durch das COP9-Signalosom (CSN). Die CSN-assoziierten Kinasen CK2 und PKD phosphorylieren die Substratproteine c-Jun und p53, welche daraufhin entweder stabilisiert (c-Jun) oder beschleunigt über das 26S-Proteasom (26S) abgebaut (p53) werden. Die dazwischen liegende Ubiquitinierung ist der Einfachheit halber nicht dargestellt. C-Jun steigert, p53 vermindert die Expression von VEGF, welches als potenter proangiogener Faktor die Bildung neuer Kapillaren induziert. Kinase-Inhibitoren wie Curcumin hemmen die CSN-abhängige Phosphorylierung. Dadurch wird nun p53 stabilisiert und c-Jun vermehrt abgebaut, was zur Folge hat, dass auch die Expression von VEGF absinkt.

5.2. Das COP9-Signalosom reguliert die Stabilität von Id1 und Id3

5.2.1. Id3 bindet an das COP9-Signalosom

Den Ausgangspunkt der Erforschung der Wechselwirkung zwischen Id3 und dem CSN-Komplex bildeten Two-hybrid-Analysen der Arbeitsgruppe von Barbara Christy. Diese Untersuchungen ergaben, dass sowohl Id1 als auch Id3, aber nicht die beiden anderen Mitglieder der Id-Familie, Id2 und Id4, mit CSN5 interagieren (Berse et al., 2004). Eine solche Uneinheitlichkeit im Verhalten der verschiedenen Id-Proteine ist nicht besonders überraschend. Auf der einen Seite weisen Id1 und Id3 die ausgeprägteste Sequenzhomologie innerhalb der Gruppe der Id-Proteine auf (Massari & Murre, 2000). Andererseits unterscheiden sich auch Id1 und Id3 in funktioneller Hinsicht teilweise von Id2 und Id4. Beispielsweise spielen die beiden Erstgenannten eine wichtige Rolle in der Tumorangiogenese (Lyden et al., 1999), wogegen die biologische Bedeutung der beiden Letzteren in der Entwicklung von natürlichen Killerzellen bzw. von Oligodendrozyten liegt (Yokota, 2001).

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In dieser Arbeit konnte der Nachweis erbracht werden, dass Id3 an das COP9-Signalosom bindet. Pull-down-Experimente demonstrierten die Interaktion von rekombinantem Id3 mit dem CSN-Komplex (Abbildung 14B). Die spezifischen Untereinheiten konnten mit Hilfe von Far-Western-Blots und weiteren Pull-down-Versuchen identifiziert werden (Abbildung 14A und 14B). Eine Wechselwirkung von Id3 mit CSN5 bestätigte dabei die zuvor beschriebenen Two-hybrid-Ergebnisse. Zusätzlich war auch eine Bindung von Id3 an CSN7 festzustellen. Da innerhalb des CSN-Komplexes auch eine Interaktion zwischen CSN7 und CSN5 besteht (Kapelari et al., 2000; Fu et al., 2001), wäre eine simultane Bindung von Id3 an beide Untereinheiten durchaus denkbar. Interessanterweise repräsentiert CSN5 die Untereinheit des Komplexes, mit der die meisten seiner Substrate wechselwirken (Bech-Otschir et al., 2002). CSN7 dagegen ist eine wichtige Bindungsstelle für die mit dem COP9-Signalosom assoziierte Kinase CK2 (Uhle et al., 2003).

5.2.2. Id3 inhibiert die CSN-assoziierte Kinaseaktivität

Obwohl Id3 wie viele andere Substrate der CSN-gebundenen Kinasen mit CSN5 interagiert (Bech-Otschir et al., 2002), wurde es weder von dem isolierten CSN-Komplex noch von den rekombinanten Kinasen CK2 und PKD, die mit ihm assoziiert sind, phosphoryliert (Abbildung 15). In Übereinstimmung damit konnte im Fall der CK2 auch in einer früheren Untersuchung keine Phosphorylierung von Id1, Id2 oder Id3 durch diese Kinase dokumentiert werden, obgleich alle drei Proteine mindestens zwei Konsensussequenzen der CK2 enthalten (Nagata et al., 1995). Wie Abbildung 15 veranschaulicht, ist Id3 nicht nur kein Substrat der CSN-assoziierten Kinasen, sondern unterdrückte im Gegenteil sogar die CSN-abhängige Phosphorylierung von c-Jun, ICSBP und der Untereinheit CSN2. Zur Zeit ist die Bedeutung der Phosphorylierung von CSN2 noch nicht bekannt. Dagegen ist die Funktion der CSN-gesteuerten Phosphorylierung von c-Jun sehr gut untersucht und in den Abschnitten 4.1 und 5.1 ausführlich dargestellt worden. Dort wurde auch erläutert, dass die Hemmung der CSN-assoziierten Kinasen eine verstärkte Ubiquitinierung und beschleunigte Proteolyse von c-Jun zur Folge hat.

Abbildung 23: Modell eines Regelkreises zwischen c-Jun, VEGF und Id3. C-Jun und Id3 binden an das COP9-Signalosom (CSN). Ersteres induziert die Expression von VEGF, welches seinerseits Id3 stimuliert. Id3 hemmt die CSN-abhängige Phosphorylierung von c-Jun, wodurch sich dessen Abbau über das 26S-Proteasom (26S) beschleunigt. Folglich vermindert sich auch die Synthese von VEGF und der Proteinspiegel von Id3 fällt wieder ab.

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Ob auch die Inhibition dieser Kinasen durch Id3 den Abbau von c-Jun beschleunigt, bleibt noch zu klären. Zumindest konnte ein solcher Effekt in Id3 überexprimierenden HeLa-Zellen nicht nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Jedoch könnte sich dies in einem veränderten zellulären Kontext anders darstellen. Von besonderem Interesse wäre dabei die Wirkung auf c-Jun in Endothelzellen. Es wurde bereits darauf eingegangen, dass der CSN-kontrollierte Abbau von c-Jun auch Einfluss auf die VEGF-Expression von Tumorzellen nimmt (s. Abschnitt 4.1.5 und 5.1.4; Pollmann et al., 2001). Weiterhin sind Id1 und Id3 von essentieller Bedeutung für die VEGF-Rezeptor-abhängige Mobilisierung
von endothelialen Vorläuferzellen aus dem Knochenmark (Lyden et al., 2001)
und für die VEGF-induzierte Aktivierung von humanen Endothelzellen
(Sakurai et al., 2004). Daher wäre ein negativer Rückkopplungsmechanismus der Angiogenese vorstellbar, in dem hohe Proteinspiegel von Id3 den CSN-abhängigen Abbau von c-Jun induzieren, woraufhin sich die Expression von VEGF, das seine biologische Wirkung zum Teil über Id3 entfaltet, reduziert (Abbildung 23).

5.2.3. Inhibitoren der CSN-assoziierten Kinasen initiieren die Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau von Id1 und Id3

In Gegenwart von Curcumin bildeten sich sowohl in einem in vitro-System (Abbildung 16) als auch in HeLa-Zellen (Abbildung 17) hochmolekulare Formen von Id3 (HMW-Id3). Zusätzlich wurde Id3 in dem zellulären Umfeld durch Curcumin destabilisiert (Abbildung 17). Beide Effekte, Induktion von HMW-Id3 und Destabilisierung von Id3, waren reversibel (Abbildung 18). Das zu c-Jun analoge Auftreten einer annähernd dem doppelten Molekulargewicht von Id3 entsprechenden Bande in Anwesenheit von Curcumin (Abbildung 17–19) wurde bereits in Abschnitt 5.1.2 ausführlich diskutiert. Auch die anderen Kinase-Inhibitoren, Emodin, DRB und Resveratrol, verminderten den intrazellulären Proteinspiegel von Id3 (Abbildung 19A). Emodin war analog zu Curcumin in der Lage, HMW-Id3 sowie eine prominente Bande unmittelbar unterhalb 30 kDa zu erzeugen (Abbildung 19A). Unter Einsatz von His-Pull-down-Experimenten gelang es, in Lysaten von HeLa-Zellen, die His10-markiertes Ubiquitin überexprimierten, die hochmolekularen Id3-Formen als Id3-Ubiquitin-Konjugate zu identifizieren (Abbildung 20A und 20B), was aufgrund der allgemeinen Zunahme von Polyubiquitin-Verbindungen in Anwesenheit von Curcumin, und teilweise auch Emodin, bereits vermutet werden konnte (Abbildung 19B). Aus den Beobachtungen, dass MG-132 Id3 deutlich stabilisiert (Abbildung 17, 18 und 19A) und die durch Curcumin und Emodin hervorgerufene Akkumulation von HMW-Id3 verstärkt (Abbildung 19A und 17B), muss gefolgert werden, dass die Hemmung der CSN-assoziierten Kinasen nicht nur die Ubiquitinierung von Id3 induziert, sondern auch seinen Abbau über das 26S-Proteasom beschleunigt.

Andererseits sollte ein aktives COP9-Signalosom Id3 stabilisieren. Dies konnte durch die Überexpression der Untereinheit CSN2 demonstriert werden. Für
eine derartig unphysiologisch gesteigerte Expression von CSN2 war gezeigt
worden, dass sie zu einer de novo-Assemblierung des CSN-Komplexes führt,
welche gleichzeitig mit einer erhöhten Komplexaktivität verbunden ist
(Naumann et al., 1999; Pollmann et al., 2001). Wie erwartet wurde die CSN2-Überexpression von einer Stabilisierung von Id3 begleitet (Abbildung 20C).

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Abbildung 19C ist zu entnehmen, dass die intrazellulären Proteinspiegel von Id1 auf ähnliche Weise von der CSN-vermittelten Phosphorylierung abhängen. Auch Id1 wird durch die vier eingesetzten Kinase-Inhibitoren destabilisiert, wobei wiederum Curcumin, und in geringerem Ausmaß auch Emodin, hochmolekulare Formen von Id1 und eine intensive Bande unterhalb von 30 kDa erzeugen (nicht abgebildet). Für Id1 und Id3 stellt sich somit eine vergleichbare Konstellation wie für c-Jun dar. Die Kinase-Hemmstoffe DRB und Resveratrol besitzen auch im Fall von c-Jun, verglichen mit Curcumin und Emodin, eine geringere Effektivität hinsichtlich der Stimulation der Ubiquitin-abhängigen Proteolyse (s. Abschnitt 4.1.4 und 5.1.2). Im Gegensatz zu c-Jun wird aber Id3 selbst nicht durch die CSN-assoziierten Kinasen phosphoryliert. Daher kommt eine Phosphorylierung von Id3 als Ursache seiner Stabilisierung gegenüber dem Ubiquitin/26S-Proteasom-System in Abwesenheit der Kinase-Inhibitoren nicht in Betracht. Der genaue Mechanismus des CSN-kontrollierten Abbaus von Id1 und Id3 bleibt also vorerst unaufgedeckt. Dennoch lassen sich begründete Hypothesen über seine wahre Natur aufstellen.

5.2.4. Modell des CSN-abhängigen Abbaus von Id3

In der Arbeit, in der der Ubiquitin-abhängige Abbau von Id1, Id2 und Id3 über das 26S-Proteasom erstmals beschrieben wurde, untersuchten die Autoren auch den Einfluss von dem bHLH-Protein E47, einem wichtigen Bindungspartner der Id-Proteine, auf die Abbaurate von Id3 (Bounpheng et al., 1999). Dabei zeigte sich, dass der Abbau von Id3 bei gleichzeitiger Kotransfektion von E47 signifikant vermindert wird, höchstwahrscheinlich infolge eines protektiven Effekts der Heterodimerisierung von Id3 mit E47 (Bounpheng et al., 1999; Deed et al., 1996). Im Gegensatz zu Id3 stellt E47 ein Substrat der CK2 dar (Johnson et al., 1996). Möglicherweise stabilisiert die CK2-abhängige Phosphorylierung von E47 das Id3-E47-Heterodimer, wie auch die Phosphorylierung von E47 durch andere Kinasen seine Affinität gegenüber potentiellen Dimerisierungspartnern erhöht (Lluis et al., 2005). Die Hemmung der CK2 durch spezifische Kinase-Inhibitoren würde demnach der protektiven Heterodimerisierung zwischen Id3 und E47 entgegenwirken und auf diese Weise den Abbau von monomerem Id3 über das Ubiquitin/
26S-Proteasom-System induzieren (Abbildung 24A).

Bemerkenswerterweise ist in Abwesenheit von E47 der Transkriptionsregulator Id3 ausschließlich im Zytoplasma der Zellen lokalisiert (Deed et al., 1996). Erst die Kotransfektion von E47 bewirkt eine Translokation von Id3 in den Zellkern, da E47 ein nukleäres Lokalisationssignal (NLS) besitzt, welches Id3 fehlt (Deed et al., 1996). Der Export von freiem Id3 aus dem Zellkern könnte in Analogie zu p27Kip1 durch das COP9-Signalosom vermittelt werden. Im Zellkern ansässiges p27Kip1, das kein nukleäres Exportsignal (NES) aufweist, ist stabil, während der CSN-abhängige Transport ins Zytoplasma die Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau des Zellzyklus-Inhibitors zur Folge hat (Tomoda et al., 1999). Im Fall von Id3 könnte dieser Prozess durch Phosphorylierung geregelt werden. Allerdings scheint die Bindung von Id3 an E47 von weitaus größerer Bedeutung für seine Stabilisierung gegenüber dem Ubiquitin/26S-Proteasom-System zu sein als seine E47-gesteuerte Translokation in den Zellkern (Deed et al., 1996).

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Darüber hinaus kommt der CSN-abhängigen Phosphorylierung vielleicht noch eine andere Funktion bei der Kontrolle des Abbaus von Id1 und Id3 zu. Die CSN-assoziierten Kinasen könnten die Ubiquitinligase(n) von Id1 und Id3 modifizieren. Dabei würde die phosphorylierte Ligase die inaktive Form repräsentieren. Kinase-Inhibitoren könnten die Proteolyse von Id1 und Id3 beschleunigen, indem sie die Ubiquitinligase in ihren aktiven Zustand überführten (Abbildung 24B). Ähnliche Szenarien der Regulation der Ligaseaktivität durch Phosphorylierung konnten für diverse E3s aus verschiedenen Familien nachgewiesen werden (Hall et al., 2004; Hayami et al., 2005; Yamamoto et al., 2005; Winter et al., 2004). Besonders interessant erscheint hierbei, dass jedes Mal die Phosphorylierung der Ligase zu einer Reduktion ihrer Aktivität führte. Bisher konnte die Ligase, die Id1 und Id3 ubiquitiniert, allerdings noch nicht identifiziert werden.

Kürzlich konnte für Id2 eine außergewöhnliche Form der Ubiquitinierung beschrieben werden (Fajerman et al., 2004). Statt wie gewöhnlich an einer internen ε-NH2-Gruppe eines Lysins zu beginnen, startet die Ubiquitinierung von Id2 an der freien α-NH2-Gruppe des Proteins. Ob diese Variante der Anknüpfung einer Ubiquitinkette auch für andere Id-Proteine eine Rolle spielt und inwieweit sie für den CSN-abhängigen Abbau von Id1 und Id3 von Belang ist, bleibt noch zu klären. Zusätzliche Studien sind somit notwendig, will man den zugrunde liegenden Mechanismus des CSN-kontrollierten Abbaus von Id1 und Id3 besser verstehen.

Abbildung 24: Zwei Modelle der Regulation der Stabilität von Id3 durch das COP9-Signalosom. (A) Die CSN-assoziierten Kinasen CK2 und PKD phosphorylieren den Bindungspartner von Id3, das bHLH-Protein E47. Möglichweise fungiert Id3 dabei als Adapter, da es über CSN5 und CSN7 an den CSN-Komplex bindet. Phosphoryliertes E47 besitzt eine größere Affinität gegenüber Id3 und verhindert dadurch dessen Abbau über das 26S-Proteasom (26S). (B) Diesmal phosphorylieren die CSN-assoziierten Kinasen die Ubiquitinligase (E3) von Id3, welche dadurch eine geringe Assoziationsbereitschaft gegenüber ihrem Substrat Id3, und eventuell auch gegenüber dem Ubiquitin-konjugierenden Enzym (E2), aufweist (linke Hälfte). Folglich wird Id3 nicht vom 26S-Proteasom abgebaut. In Anwesenheit eines Inhibitors der CK2 und PKD, z. B. Curcumin, wird die Phosphorylierung des E3 unterdrückt (rechte Hälfte). Das E3 bindet verstärkt Id3 und ubiquitiniert (Ub=Ubiquitin) dieses zusammen mit einem rekrutierten E2. Schließlich wird das so markierte Id3 vom 26S-Proteasom zu Peptidfragmenten abgebaut.

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Auch wenn man diesen noch nicht exakt rekonstruieren kann, weisen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass das COP9-Signalosom mit Id1 und Id3 neben c-Jun zwei weitere wichtige Angiogene reguliert und deshalb als potentielles Ziel einer antiangiogenen Therapie an Bedeutung gewinnt.


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20.03.2006