Aus der Klinik für Allgemein-, Visceral-, Gefäß- und Thoraxchirurgie der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Regulation der Stabilität der proangiogenen
Transkriptionsfaktoren c-Jun, Id1 und Id3
durch das COP9-Signalosom

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité –
Universitätsmedizin Berlin

von
Matthias Berse
aus Cottbus

Gutachter:
1. Prof. Dr. W. Dubiel
2. Prof. Dr. M. Naumann
3. Prof. Dr. rer. nat. R. Schäfer

eingereicht: 10.05.2005

Datum der Promotion: 30.01.2006

Zusammenfassung

Für die Progression des Wachstums maligner Tumoren und ihre Metastasierung ist die Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden, eine essentielle Voraussetzung. Innerhalb dieses Prozesses spielen Transkriptionsfaktoren eine bedeutende Rolle.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass drei proangiogene Transkriptionsfaktoren, c-Jun, Id1 und Id3, in ihrer Stabilität gegenüber dem Ubiquitin/26S-Proteasom-System, der wichtigsten zellulären Proteinabbaumaschinerie, durch das COP9-Signalosom (CSN) kontrolliert werden. Das COP9-Signalosom bildet einen multimeren Proteinkomplex, der eine deutliche Sequenz- und Strukturhomologie mit dem Lid, einem Subkomplex des 26S-Proteasoms, aufweist. In Immunpräzipitationen, Dichtegradientenzentrifugationen, Far-Western-Blots und Pulldown-Experimenten konnte die Bindung sowohl von c-Jun als auch von Id3 an die Untereinheit CSN5 demonstriert werden. Id3 interagiert zusätzlich mit CSN7.

Rekombinantes c-Jun, ein bekanntes Substrat der CSN-assoziierten Kinasen CK2 und PKD, wird in einem Ubiquitinierungs-Assay durch Curcumin, einen potenten Hemmstoff dieser Kinasen, deutlich destabilisiert. Daneben induziert Curcumin in diesem in vitro-System hochmolekulare Formen von c-Jun. Auch in HeLa-Zellen akkumulieren in Gegenwart von Curcumin hochmolekulare c-Jun-Abkömmlinge, bei denen es sich höchstwahrscheinlich um Ubiquitin-Konjugate handelt. Ferner beschleunigt Curcumin, ebenso wie die CK2- und PKD-Inhibitoren Emdodin, DRB und Resveratrol, in HeLa-Zellen den proteasomalen Abbau von c-Jun. Die c-Jun-abhängige Produktion von VEGF, dem potentesten angiogenen Wachstumsfaktor, wird durch alle vier Kinase-Hemmstoffe signifikant reduziert. Verstärkt wird dieser Effekt noch durch den proteasomalen Inhibitor MG-132, der auch allein die Synthese von VEGF supprimiert, obwohl er c-Jun stabilisiert.

Im Gegensatz zu c-Jun wird Id3 nicht von den CSN-assoziierten Kinasen phosphoryliert. Allerdings hemmt es in einem Kinase-Assay die Phosphorylierung von c-Jun, ICSBP und CSN2. Die Kinase-Inhibitoren Curcumin und Emodin regen in HeLa-Zellen die Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau von transient exprimiertem Id3 an. Die Proteolyse von endogenem Id1 durch das 26S-Proteasom wird in HeLa-Zellen ebenfalls in Anwesenheit dieser beiden Hemmstoffe stimuliert. Mittels Kotransfektion der cDNAs von Id3 und His₁₀-markiertem Ubiquitin in HeLa-Zellen konnte die Ubiquitinierung von Id3 direkt nachgewiesen werden. Curcumin fördert die Bildung von Id3-Ubiquitin-Konjugaten, was durch Western Blots und His-Pull-down-Versuche bestätigt werden konnte. Außerdem wird Id3 durch die Überexpression von CSN2 stabilisiert.

Auf diesen Daten basiert die Schlussfolgerung, dass die CSN-abhängige Phosphorylierung den Abbau von c-Jun und der beiden Id-Proteine über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System inhibiert und dadurch ein interessantes neues Ziel einer antiangiogenen Tumortherapie repräsentiert.

Eigene Schlagworte: COP9-Signalosom; c-Jun; Id1; Id3; Ubiquitinierung; Proteasom; VEGF; Angiogenese.

Summary

Angiogenesis, the formation of new blood vessels from the existing vasculature, is a prerequisite for the progression of solid tumor growth and metastasis. Transcription factors play an important role in this process.

In this study it is shown that the COP9 signalosome (CSN) regulates the stability of the three angiogenic transcription factors c-Jun, Id1 and Id3 towards the ubiquitin/26S proteasome system, the most important protein degradation machinery in cells. The COP9 signalosome constitutes a multimeric protein complex that shares sequence homology and structural similarities with the 26S proteasome lid complex. Immunoprecipitations, separations by density gradients, far Western blots and pull-down experiments revealed that both cJun and Id3 physically interact with the CSN subunit CSN5. In addition, Id3 can bind to CSN7.

In an in vitro ubiquitination assay recombinant c-Jun, a substrate of the CSN-associated kinases CK2 und PKD, is destabilized by curcumin, a potent inhibitor of these two kinases. Furthermore, curcumin induces high molecular weight (HMW) cJun species. The curcumin-induced accumulation of HMW-c-Jun species, most likely ubiquitin conjugates, could be verified in HeLa cells. All tested inhibitors of the CK2 and PKD, emodin, DRB, resveratrol, as well as curcumin accelerate the degradation of c-Jun by the 26S proteasome in HeLa cells. The cJun-dependent expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), the most potent angiogenic factor, is significantly reduced by the four kinase inhibitors. Although it stabilizes c-Jun, MG132, an inhibitor of the 26S proteasome, diminishes the production of VEGF and increases the suppressive effects of the kinase inhibitors.

In contrast to c-Jun, recombinant Id3 is not phosphorylated by the CSN-associated kinases CK2 and PKD. However, it inhibits c-Jun, ICSBP and CSN2 phosphorylation by the isolated CSN complex and by the recombinant CK2. The inhibitors of CSN associated kinases, curcumin and emodin, significantly induce ubiquitination and proteasome-dependent degradation of transiently expressed Id3 in HeLa cells. Proteasome-dependent degradation of endogenous Id1 in HeLa cells is also stimulated by treatment with curcumin or emodin. Ubiquitination of Id3 is shown directly by cotransfection of HeLa cells with the cDNA of Id3 and His₁₀tagged ubiquitin. Curcumin increases Id3-ubiquitin conjugate formation, as shown by Western blotting and His-pull-downs. In addition, overexpression of CSN2 leads to stabilization of Id3 protein.

On the basis of these data it is concluded that CSN-mediated phosphorylation inhibits ubiquitination and proteasome-dependent degradation of c-Jun, Id1 and Id3. The COP9 signalosome thus represents an interesting new target for antiangiogenic tumor therapy.

Keywords: COP9 signalosome; c-Jun; Id1; Id3; ubiquitination; proteasome; VEGF; angiogenesis.

Inhaltsverzeichnis

• 1. Einleitung
  • 1.1. Angiogenese
  • 1.2. Der angiogene Wachstumsfaktor VEGF
    • 1.2.1. Die Biologie von VEGF
    • 1.2.2. VEGF als Angriffspunkt antiangiogener Medikamente
  • 1.3. Das Onkoprotein c-Jun
    • 1.3.1. Struktur und Wirkmechanismus
    • 1.3.2. Physiologische Bedeutung der AP-1-Aktivität
    • 1.3.3. Die Rolle von c-Jun in der Tumor- und Angiogenese
    • 1.3.4. Regulation der AP-1-Aktivität
  • 1.4. Die proangiogenen Faktoren Id1 und Id3
    • 1.4.1. Struktur und Wirkmechanismus
    • 1.4.2. Physiologische Bedeutung der Id-Proteine
    • 1.4.3. Onkogene und angiogene Eigenschaften
    • 1.4.4. Regulation der Id-Proteine
  • 1.5. Das Ubiquitin/26S-Proteasom-System
    • 1.5.1. Architektur des 26S-Proteasoms
    • 1.5.2. Die Ubiquitinierung von Substratproteinen
  • 1.6. Das COP9-Signalosom
    • 1.6.1. Aufbau
    • 1.6.2. Intrinsische und assoziierte Aktivitäten
      • 1.6.2.1.  Die Kinaseaktivität
      • 1.6.2.2. Deneddylase- und Ubiquitin-Isopeptidase-Aktivität
• 2. Fragestellung und Zielsetzung
• 3.  Material und Methoden
  • 3.1. Material
    • 3.1.1. Kits
    • 3.1.2. Plasmide
    • 3.1.3. Proteine und Enzyme
    • 3.1.4. Antikörper
    • 3.1.5. Kinase- und 26S-Proteasom-Inhibitoren
    • 3.1.6. Sonstiges
    • 3.1.7. Geräte
  • 3.2. Methoden
    • 3.2.1. Anzucht von Escherichia coli (E. coli)-Stämmen
    • 3.2.2. Herstellung kompetenter E. coli-Bakterien
    • 3.2.3. Transformation kompetenter E. colimit Plasmid-DNA
    • 3.2.4. Plasmidisolierung („Mini-Präp“ und „Maxi-Präp“)
    • 3.2.5. Verdau von DNA mit Restriktionsenzymen
    • 3.2.6. Agarosegele
    • 3.2.7. Zellkultur
    • 3.2.8. Transiente Transfektion von Id3 oder c-Jun durch Elektroporation
    • 3.2.9. Transiente Kotransfektion von Id3 und Ubiquitin und  transiente Transfektion von CSN2 durch Lipofektion
    • 3.2.10. Lyse der Zellen
    • 3.2.11. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
    • 3.2.12. Coomassie-Färbung von Polyacrylamidgelen
    • 3.2.13. Proteintransfer mittels Western Blot und Ponceau S-Färbung
    • 3.2.14. Immundetektion
    • 3.2.15. Expression und Aufreinigung des GST-Id3-Fusionsproteins
    • 3.2.16. GST-Id3-Pull-down (Fällung von GST-Id3)
    • 3.2.17. Far-Western Blot-Analyse (Filterbindungs-Assay)
    • 3.2.18. His-Pull-down (Fällung His-markierter Proteine) mit Ni-Partikeln
    • 3.2.19. Pull-down mit Dynabeads^® M-280-Tosylactivated
    • 3.2.20. Immunpräzipitation (IP)
    • 3.2.21. Dichtegradientenzentrifugation (Glycerolgradient)
    • 3.2.22. Kinase-Assay
    • 3.2.23. Ubiquitinierungs-Assay
    • 3.2.24. VEGF-ELISA
• 4. Ergebnisse
  • 4.1. Das CSN reguliert den Abbau und die Aktivität von c-Jun
    • 4.1.1. c-Jun bindet an das COP9-Signalosom
    • 4.1.2. Curcumin induziert den Abbau und die Bildung  hochmolekularer Formen von c-Jun in vitro
    • 4.1.3. Curcumin fördert den Ubiquitin-abhängigen Abbau von c-Jun  in HeLa-Zellen
    • 4.1.4. Inhibitoren der CSN-assoziierten Kinasen induzieren den Abbau  und die Ubiquitinierung von c-Jun
    • 4.1.5. Hemmstoffe der CK2 und PKD reduzieren die VEGF-Produktion  in HeLa-Zellen
  • 4.2. Regulation des Ubiquitin-abhängigen Abbaus von Id1 und Id3  durch das COP9-Signalosom
    • 4.2.1. Id3 bindet an das COP9-Signalosom
    • 4.2.2. Id3 hemmt die CSN-abhängige Phosphorylierung
    • 4.2.3. Curcumin induziert hochmolekulare Formen von Id3 in vitro
    • 4.2.4. Curcumin destabilisiert Id3 in HeLa-Zellen und erzeugt HMW-Id3
    • 4.2.5. Hemmstoffe der CSN-assoziierten Kinasen induzieren  die Ubiquitinierung und den Abbau von Id1 und Id3
• 5. Diskussion
  • 5.1. Das COP9-Signalosom kontrolliert den Ubiquitin-abhängigen Abbau des proangiogenen Transkriptionsfaktors c-Jun
    • 5.1.1. c-Jun bindet an das COP9-Signalosom
    • 5.1.2. Inhibitoren der CSN-assoziierten Kinasen induzieren den Abbau  von c-Jun über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System
    • 5.1.3. Modell des CSN-kontrollierten Abbaus von c-Jun
    • 5.1.4. Das COP9-Signalosom reguliert die c-Jun-abhängige VEGF-Synthese
  • 5.2. Das COP9-Signalosom reguliert die Stabilität von Id1 und Id3
    • 5.2.1. Id3 bindet an das COP9-Signalosom
    • 5.2.2. Id3 inhibiert die CSN-assoziierte Kinaseaktivität
    • 5.2.3. Inhibitoren der CSN-assoziierten Kinasen initiieren die Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau von Id1 und Id3
    • 5.2.4. Modell des CSN-abhängigen Abbaus von Id3
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Lebenslauf
• Publikationen
• Eidesstattliche Erklärung

Bilder

• Abbildung 1: Angiogenese – die Bildung neuer Blutgefäße. (A) Endothelzellen werden durch proangiogene Wachstumsfaktoren wie VEGF aktiviert. (B) Proteinasen (Kollagenasen, Plasminogen-Aktivator) bauen die Basalmembran des Blutgefäßes ab. (C) Migration und Proliferation der Endothelzellen in Richtung des angiogenen Stimulus. (D) Umhüllung der noch unreifen Blutgefäße mit einer Basalmembran und Perizyten. (modifiziert nach Wernert et al., 1999).
• Abbildung 2: Transkriptionale und posttranslationale Aktivierung von AP-1. Die AP-1-Aktivität wird durch ein komplexes Netzwerk von Signalwegen stimuliert. Wachstumsfaktoren und Phorbolester führen über vorgeschaltete Kinasestufen zu einer Aktivierung der MAPK-Untergruppe ERK (extracellular signal-regulated kinase), deren Mitglieder ihrerseits TCFs (ternary complex factors) phosphorylieren (Hill et al., 1994) und auf diese Weise eine gesteigerte Transkription von c-fos bewirken. Das neu synthetisierte c-Fos interagiert mit c-Jun und erzeugt über AP-1-Bindungsstellen im c-jun-Promoter auch eine erhöhte c-jun-Transkription (Angel et al., 1988). Zytokine und UV-Strahlung hingegen bedienen sich für ihre Signaltransduktion zweier anderer MAP-Kinasen, p38 und JNK (c-Jun N-terminal kinase). Ihre Substrate, ATF2, MEF2c (monocyte-specific enhancer binder factor 2c) und c-Jun, induzieren auf direktem Weg die Expression von c-jun (Karin, 1995). Posttranslational wird die AP-1-Aktivität durch verschiedene Kinasen reguliert. Ihre Phosphorylierung verändert das Transaktivierungspotential, die DNA-Affinität und die Proteinstabilität von AP-1. Abkürzungen, die nicht im Text vorkommen: CKII=casein kinase 2, GSK-3β=glycogen synthase kinase 3β, MAPKK=MAPK kinase, RSK2=ribosomal S6 kinase 2, SRE=serum response element (aus Eferl & Wagner, 2003)
• Abbildung 3: Funktion der Id-Proteine im Zellzyklus. Während der G1-Phase aktivieren mitogene Signale cyclinabhängige Kinasen (CDK). Diese phosphorylieren sequentiell das Tumorsuppressorprotein pRB, das daraufhin Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie freigibt, die die Expression von S-Phase-Genen induzieren. Id2 und Id4 interagieren mit pRB und bewirken auf diesem Weg die Freisetzung der E2F-Transkriptionsfaktoren. Die Phosphorylierung von Id2, Id3 und Id4 durch die CDK2 verändert ihre Affinität gegenüber verschiedenen bHLH. Durch die Antagonisierung der bHLH-Funktion verhindern die Id-Proteine die Transkription von CDK-Inhibitoren wie p21^Cip1/Waf1. In einer negativen Rückkopplungsschleife hemmen Id-Proteine Komponenten des TCF, der „immediate early genes“ wie egr-1 aktiviert, das seinerseits die Expression der Id-Gene stimuliert (aus Norton, 2000).
• Abbildung 4: Das 26S-Proteasom und seine Subkomplexe. Das 26S-Proteasom setzt sich aus dem 20S-Proteasom und dem 19S-Regulator, der auf einer oder auf beiden Seiten an das 20S-Proteasom bindet, zusammen. Das zylinderförmige 20S-Proteasom besteht aus zwei äußeren und zwei inneren Ringen, den α- bzw. β-Ringen, die jeweils aus sieben Untereinheiten aufgebaut sind. Der 19S-Regulator kann in zwei weitere Subkomplexe untergliedert werden – die als Base bezeichnete Basis und die Lid genannte Kappe.
• Abbildung 5: Die Multi-Enzym-Kaskade der Ubiquitinierung eines Substratproteins. Das E1 katalysiert die Aktivierung von Ubiquitin und dessen kovalente Bindung an ein Cystein des E1. Im nächsten Schritt wird Ubiquitin aus dieser Thioesterbindung auf ein Cystein des E2 übertragen. Schließlich überführt ein E3 es aus dieser zweiten Thioesterbindung auf das Substratprotein. Weitere Ubiquitinmonomere werden an Lys48 (K48) des jeweils letzten Ubiquitins der so entstehenden Polyubiquitinkette geknüpft. Das auf diese Weise markierte Substrat wird vom 26S-Proteasom erkannt und abgebaut (aus Pray et al., 2002).
• Abbildung 6: Struktur des COP9-Signalosoms. (A) 2D-Elektronenmikroskopische Aufnahmen des CSN- und Lid-Komplexes. Eine mögliche Anordnung der CSN-Untereinheiten konnte anhand der Interaktionsstudien zwischen den Untereinheiten vorgenommen werden (Kapelari et al., 2000). Die Anordnung der Untereinheiten im Lid-Komplex wurde aus der Homologie zu den CSN-Untereinheiten abgeleitet. Der Pfeil markiert die zentrale Furche der Komplexe. (B) Modell des CSN-Komplexes basierend auf den elektronenmikroskopischen Aufnahmen (A) und den Studien zur Untereinheiteninteraktion (Kapelari et al., 2000). Die Phosphorylierung (P) von CSN2 und CSN7 ist angegeben (Modifiziert nach Bech-Otschir et al., 2002)
• Abbildung 7: C-Jun bindet an das COP9-Signalosom. (A) CSN5 bindet an c-Jun. Eine Immunpräzipitation wurde mit einem anti-Flag-Antikörper und dem Lysat von HeLa-Zellen, die zuvor mit Flag-markiertem c-Jun transient transfiziert wurden, durchgeführt. Die Präzipitation von c-Jun sowie von an c-Jun gebundenem CSN5 wurde im Western Blot mit den entsprechenden Antikörpern (α c-Jun und α CSN5) nachgewiesen. Zur Bestätigung übereinstimmender Proteinkonzentrationen in beiden Ansätzen wurden auch die Überstände (ÜS) untersucht. (B) C-Jun bindet an CSN5. Mit tosylaktivierten M-280-Dynabeads^® und His₆-markiertem, rekombinantem CSN5 gelang es, aus HeLa-Zelllysat c-Jun zu präzipitieren. In den Überständen beider Ansätze zeigen sich identische Mengen an c-Jun. (C) CSN5 ist in HeLa-Zellen Bestandteil des CSN-Komplexes. Das Lysat von 1x10⁸ HeLa-Zellen wurde in einem Glycerolgradienten (10–40%) aufgetrennt. CSN5 und zwei weitere CSN-Untereinheiten, CSN3 und CSN8, ko-migrieren mit einem Maximum in den Fraktionen 12 und 13. (D) In einer Immunpräzipitation konnte mit einem anti-CSN7-Antikörper im Lysat von HeLa-Zellen die Bindung von endogenem CSN5 an CSN7 gezeigt werden.
• Abbildung 8: Curcumin destabilisiert c-Jun und erzeugt hochmolekulare c-Jun-Formen in vitro. In einem Ubiquitinierungs-Assay wurde rekombinantes c-Jun zusammen mit HeLa-Zelllysat, Ubiquitin in An- bzw. Abwesenheit von 50 µM Curcumin für acht Stunden inkubiert. Zu den angegebenen Zeiten wurden Aliquote entnommen. Nach ihrer elektrophoretischen Auftrennung konnten im Western Blot eine durch Curcumin induzierte Destabilisierung von c-Jun und die Bildung von HMW (high molecular weight)-c-Jun mit einem anti-c-Jun-Antikörper (α c-Jun) nachgewiesen werden. Eine Bande unterhalb von 97 kDa trat in Gegenwart von Curcumin besonders intensiv auf.
• Abbildung 9: Curcumin induziert den Ubiquitin-abhängigen Abbau von c-Junin HeLa-Zellen. HeLa-Zellen wurden transient mit Flag-markiertem c-Jun transfiziert und nach 18 Stunden für weitere vier Stunden mit den angegebenen Konzentrationen Curcumin bzw. MG-132 behandelt. Anschließend wurden die Zellen lysiert. Die Proteine wurden elektrophoretisch aufgetrennt und geblottet. (A) Mit einem anti-c-Jun-Antikörper (α c-Jun) konnte die konzentrationsabhängige Destabilisierung von c-Jun sowie die Induktion hochmolekularer c-Jun-Formen (HMW-c-Jun) durch Curcumin sichtbar gemacht werden. Besonders prägnant erschien eine Bande in der Höhe von  97 kDa. Die kombinierte Inkubation mit 20 µM MG-132 verstärkte diese Effekte von Curcumin noch zusätzlich. (B) Ein anti-Flag-Antikörper (α Flag) bestätigte dieses Ergebnis. (C) Durch einen anti-Ubiquitin-Antikörper (α Ubiquitin) ließ sich nach Proteinauftrennung im 8%-igen SDS-Gel im Western Blot die Bildung hochmolekularer Ubiquitin-Konjugate in Abhängigkeit der Curcumin-Konzentration zeigen.
• Abbildung 10: Die Wirkung von Curcumin auf c-Junin HeLa-Zellen ist reversibel. HeLa-Zellen wurden mit Flag-markierter c-Jun-cDNA (pcDNA3.1-Vektor) transient transfiziert. Nach 18 Stunden Inkubation wurden die Zellen eine Stunde mit 50 µM Curcumin behandelt. Danach wurde das Medium gewechselt und die Zellen mit oder ohne 20 µM MG-132 für weitere sechs Stunden inkubiert. Zu den angegebenen Zeiten erfolgte die Lyse der Zellen. Die Proteine wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend geblottet. (A) Die Untersuchung der Membranen mit einem anti-c-Jun-Antikörper (α c-Jun) veranschaulicht die Induktion hochmolekularer c-Jun-Formen (HMW-c-Jun) durch Curcumin sowie ihren verlangsamten Rückgang unter Einfluss von MG-132. Wieder stellte sich eine Bande in der Höhe von 97 kDa sehr intensiv dar. (B) Etwas deutlicher noch konnten das Auftreten und die zeitabhängige Abnahme von HMW-c-Jun mit einem anti-Flag-Antikörper (α Flag) wiedergegeben werden. (C) Ein anti-Ubiquitin-Antikörper (α Ubiquitin) ließ ein zu HMW-c-Jun analoges Verhalten von langkettigen Ubiquitin-Konjugaten erkennen.
• Abbildung 11: Inhibitoren der CSN-assoziierten Kinasen induzieren den Abbau von c-Jun über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System. HeLa-Zellen, die transient mit Flag-markierter c-Jun-cDNA (pcDNA3.1-Vektor) transfiziert wurden, wurden 18 Stunden nach der Transfektion mit 50 µM Curcumin, 200 µM DRB, 200 µM Emodin, 100 µM Resveratrol oder 20 µM MG-132 behandelt. Nach vier Stunden Inkubation wurden die Zellen lysiert. Die Proteine wurden elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit verschiedenen Antikörpern analysiert. (A) Die Untersuchung mit einem anti-c-Jun-Antikörper (α c-Jun) ergab, dass die Kinase-Inhibitoren c-Jun destabilisieren. Dagegen stabilisiert MG-132 c-Jun. Curcumin induziert hochmolekulare c-Jun-Formen (HMW-c-Jun). (x = unbekannte Reaktivität des Antikörpers auf Höhe von 66 kDa) (B) Mit einem anti-Flag-Antikörper (α Flag) konnten diese Resultate bestätigt werden. (C) Die gleichen Proben wurden in einem 8%-igen SDS-Gel elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit einem anti-Ubiquitin-Antikörper (α Ubiquitin) getestet. Die Behandlung mit Curcumin oder MG-132 führte zu einer verstärkten Bildung von langkettigen Ubiquitin-Konjugaten.
• Abbildung 12: Curcumin supprimiert die VEGF-Produktion in HeLa-Zellen konzentrations-abhängig. In dem in Abschnitt 4.1.3 beschriebenen Experiment wurde parallel zu c-Jun auch die VEGF-Konzentration in den Zellüberständen gemessen. Nach der Inkubation der Zellen mit den angegebenen Curcumin-Molaritäten für vier Stunden wurde jedem Ansatz 1 ml Überstand entnommen. Mit einem ELISA wurde darin die VEGF-Konzentration bestimmt. Die einzelnen Konzentrationen wurden zu dem Wert der unbehandelten Kontrolle (=100%) ins Verhältnis gesetzt. Der Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten und die Standardabweichung wurden in einem Säulendiagramm wiedergegeben. Zusätzlich wurde die einer jeden Curcumin-Konzentration entsprechenden c-Jun-Bande angegeben. Dafür wurde ein vergrößerter Ausschnitt aus Abbildung 9 gewählt.
• Abbildung 13: Inhibitoren der CK2 und PKD reduzieren die VEGF-Produktion in HeLa-Zellen. Es wurden acht Experimente nach dem Schema, wie es in Abschnitt 4.1.4 beschrieben und in Abbildung 11 veranschaulicht wurde, durchgeführt. Unmittelbar vor der Lyse der Zellen wurde jeweils 1 ml Überstand entnommen und bei -70°C eingefroren. Mit einem ELISA wurde die VEGF-Konzentration in jedem Überstand der acht unabhängigen Experimente bestimmt. Die einzelnen Konzentrationen wurden zu dem Wert der unbehandelten Kontrolle (=100%) ins Verhältnis gesetzt. Die Mittelwerte und die Standardabweichung wurden errechnet und in einem Säulendiagramm dargestellt. Ebenso wurde nochmals die jedem Hemmstoff entsprechende c-Jun-Bande aus Abbildung 11A angegeben. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde mit einem t-Test für verbundene Stichproben die Signifikanz überprüft. Alle Inhibitoren, einschließlich MG-132, verminderten signifikant die VEGF-Produktion in HeLa-Zellen. Die Kombination von MG-132 und einem der Kinase-Hemmstoffe zeigte diesbezüglich die größte Wirksamkeit.
• Abbildung 14: Interaktion von Id3 mit CSN5, CSN7 und dem CSN-Komplex. (A) Far-Western Blot-Experimente wurden mit den rekombinanten Untereinheiten CSN5, CSN6 und CSN7, die auf Nitrozellulose immobilisiert worden waren, durchgeführt. Die Membranen wurden mit GST oder GST-Id3 inkubiert und mit einem anti-GST-Antikörper (α GST) untersucht. GST-Id3 bindet an CSN5 und CSN7. Die Interaktion zwischen GST und den Untereinheiten war dagegen nur schwach. (B) Für die Pull-down-Experimente wurden an Glutathion-Agarose gebundenes GST-Id3 oder GST (als Kontrolle) eingesetzt. His₆-markiertes CSN5 und CSN7 (linke Spalte) oder der aufgereinigte CSN-Komplex (rechte Spalte) wurden dazugegeben. Die Western Blots wurden mit anti-His (α His)- oder anti-CSN5 (α CSN5)-Antikörpern untersucht. Wiederum zeigte sich eine Bindung von GST-Id3 an CSN5 und CSN7 sowie an den CSN-Komplex.
• Abbildung 15: Id3 inhibiert die Phosphorylierung von c-Jun durch das COP9-Signalosom. (A) Kinase-Assays wurden, wie unter 3.2.22 beschrieben, mit dem gereinigten CSN-Komplex oder den rekombinanten Kinasen CK2 und PKD sowie rekombinantem c-Jun und GST-Id3 als Substrate durchgeführt. Id3 reduziert signifikant die Phosphorylierung von c-Jun und CSN2 durch den aufgereinigten CSN-Komplex. Die Phosphorylierung durch CK2 war empfindlicher gegenüber Id3 als die durch PKD. (B) Auch in einem Kinase-Assay mit gereinigtem CSN-Komplex, dem rekombinantes ICSBP als Substrat zugefügt wurde, hemmte GST-Id3 die Phosphorylierung des Substratproteins.
• Abbildung 16: Curcumin induziert hochmolekulare Formen von Id3 in vitro. Rekombinantes GST-Id3 wurde mit dem Lysat von HeLa-Zellen, Ubiquitin und mit oder ohne 50 µM Curcumin für acht Stunden inkubiert. Die Bildung von HMW (high molecular weight)-Id3 wurde im Western Blot mit einem anti-Id3 (α Id3)- und einem anti-GST (α GST)-Antikörper nachgewiesen.
• Abbildung 17: Curcumin induziert hochmolekulare Formen von Id3 in HeLa-Zellen. Id3 wurde in einem pcDNA3.1-Vektor transient in HeLa-Zellen transfiziert. Nach 18 Stunden wurden die Zellen für weitere 1–6 Stunden mit 50 µM Curcumin, 20 µM MG-132 oder beiden Hemmstoffen behandelt. Die Bildung von HMW (high molecular weight)-Id3 wurde im Western Blot mit einem anti-Id3-Antikörper (α Id3) nachgewiesen. Diese bildeten sich in Anwesenheit von Curcumin. Zusätzlich erschien in Gegenwart von Curcumin eine sehr deutliche, einer Größe von etwas weniger als 30 kDa entsprechende Bande. Noch klarer waren diese Effekte bei zusätzlicher Inkubation mit MG-132 zu erkennen. Der alleinige Einsatz von MG-132 stabilisierte Id3, ohne nennenswert HMW-Id3 zu erzeugen. (x = unbekannte Reaktivität des Antikörpers zwischen 30 und 45 kDa, dient gleichzeitig als Ladekontrolle)
• Abbildung 18: Die Wirkung von Curcumin und MG-132 auf Id3 ist reversibel. HeLa-Zellen wurden mit Id3-cDNA transient transfiziert. 18 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen für nur eine Stunde entweder mit 50 µM Curcumin oder mit 20 µM MG-132 behandelt. Nach dem Wechsel des Mediums wurden die Zellen für weitere sechs Stunden ohne die jeweiligen Hemmstoffe inkubiert. Im Western Blot konnten mit einem anti-Id3-Antikörper (α Id3) nach einer Stunde Curcuminbehandlung eine Destabilisierung und HMW (high molecular weight)-Formen von Id3 detektiert werden. Eine Bande direkt unterhalb 30 kDa fiel besonders auf. Der 26S-Proteasom-Inhibitor MG-132 stabilisierte dagegen Id3. All diese Effekte normalisierten sich innerhalb der folgenden sechs Stunden ohne Hemmstoffzugabe wieder vollends. (x = unbekannte Reaktivität des Antikörpers zwischen 30 und 45 kDa, dient gleichzeitig als Ladekontrolle)
• Abbildung 19: Inhibitoren der CSN-assoziierten Kinasen induzieren den Ubiquitin- und Proteasom-abhängigen Abbau von Id1 und Id3. (A) HeLa-Zellen wurden transient mit Id3 transfiziert und dann mit 50 µM Curcumin, 200 µM DRB, 200 µM Emodin, 100 µM Resveratrol oder 20 µM MG-132 behandelt. Die Zellen wurden nach vier Stunden Inkubation lysiert, die Proteine in der SDS-PAGE aufgetrennt und im Western-Blot mit einem anti-Id3-Antikörper (α Id3) untersucht. Die Kinase-Inhibitoren destabilisieren, MG-132 stabilisiert Id3 (linker und rechter unterer Quadrant). Curcumin und Emodin lassen hochmolekulare Id3-Formen und eine Bande direkt unterhalb von 30 kDa akkumulieren (linker oberer Quadrant), was durch MG-132 noch verstärkt wird (rechter oberer Quadrant). (x = unbekannte Reaktivität des anti-Id3-Antikörpers, dient gleichzeitig als Ladekontrolle) (B) Die gleichen Proben wurden in einem 8%-igen SDS-Gel elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit einem anti-Ubiquitin-Antikörper (α Ubiquitin) getestet. Besonders die Behandlung mit Curcumin führte zu einer verstärkten Bildung von Ubiquitin-Konjugaten. (C) Die Stabilität von endogenem Id1 wurde unter Einfluss der unter (A) aufgeführten Hemmstoffe beobachtet. Im Western Blot konnten, verglichen mit den Ergebnissen von (A), mit einem anti-Id1-Antikörper (α Id1) ähnliche Auswirkungen der Inhibitoren auf die Stabilität von Id1 nachgewiesen werden.
• Abbildung 20: Das COP9-Signalosom stabilisiert Id3. (A) HeLa-Zellen wurden mit Id3-cDNA (pcDNA3.1-Vektor) oder/und His₁₀-Ubiquitin-cDNA (pEGFP-N3-Vektor) transient transfiziert. Fand keine Kotransfektion statt, wurde zum Ausgleich nur der pcDNA3.1-Vektor (Kontrolle) transfiziert. 18 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit oder ohne 50 µM Curcumin weitere vier Stunden inkubiert. Nach Zelllyse und SDS-PAGE wurden die Proteine im Western Blot mit anti-His (α HIS)- und anti-Id3 (α Id3)-Antikörpern untersucht. In den kotransfizierten Zellen akkumulierten hochmolekulare Ubiquitin- und Id3-Konjugate, was durch Curcumin noch verstärkt werden konnte.   (B) Die selben Lysate wurden auch in einem His-Pull-down-Experiment mit magnetischen Ni-NTA-Agarosepartikeln (Ni-Partikel) eingesetzt. Die weitere Analyse erfolgte mittels SDS-PAGE, Western Blot und immunologischem Proteinnachweis durch einen anti-Id3-Antikörper (α Id3). Id3-Ubiquitin-Konjugate konnten präzipitiert werden, wiederum vermehrt unter Curcumineinfluss. (C) Flag-CSN2-cDNA (pcDNA3.1-Vektor) (+CSN2) oder der pcDNA3.1-Vektor ohne Insert (Kontrolle) wurden in HeLa-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden lysiert, die Proteine auf ein Gel geladen, in der SDS-PAGE aufgetrennt und geblottet. Anschließend wurden die Nitrozellulose-Membranen mit einem anti-Id3-Antikörper (α Id3) behandelt. Id3 wurde durch die Überexpression von CSN2 deutlich stabilisiert.
• Abbildung 21: Regulation des Abbaus von c-Jun durch das COP9-Signalosom. (A) Unter Einfluss des COP9-Signalosoms (CSN) wird die Ubiquitinligase SCF^Fbw7 (SCF) deneddyliert (N8=Nedd8), wodurch sich ihre Affinität gegenüber dem Ubiquitin-konjugierenden Enzym (E2) und ihre Ligaseaktivität vermindern. Die CSN-gebundenen Kinasen CK2 und PKD phosphorylieren (P) andererseits c-Jun und inhibieren dadurch seine Assoziation mit dem SCF-Komplex. Diese beiden Funktionen eines aktiven CSN-Komplexes verhindern, dass c-Jun ubiquitiniert und vom 26S-Proteasom (26S) abgebaut wird. (B) Curcumin und N-ethylmaleimid hemmen die Kinase- bzw. Deneddylaseaktivität des COP9-Signalosoms. Folglich wird weder c-Jun durch die CSN-assoziierten Kinasen phosphoryliert noch wird die Ubiquitinligase SCF^Fbw7 deneddyliert, d. h. sie liegt in ihrer neddylierten und damit aktiven Form vor. In Zusammenarbeit mit einem rekrutierten E2 ubiquitiniert SCF^Fbw7 c-Jun. Dieses wird daraufhin vom 26S-Proteasom erkannt und zu Peptidfragmenten abgebaut. Die Polyubiquitinkette wird in ihre monomeren Bestandteile (Ub=Ubiquitin) zerlegt, die dann für erneute Substrat-Ubiquitinierungen zur Verfügung stehen.
• Abbildung 22: Regulation der Angiogenese durch das COP9-Signalosom (CSN). Die CSN-assoziierten Kinasen CK2 und PKD phosphorylieren die Substratproteine c-Jun und p53, welche daraufhin entweder stabilisiert (c-Jun) oder beschleunigt über das 26S-Proteasom (26S) abgebaut (p53) werden. Die dazwischen liegende Ubiquitinierung ist der Einfachheit halber nicht dargestellt. C-Jun steigert, p53 vermindert die Expression von VEGF, welches als potenter proangiogener Faktor die Bildung neuer Kapillaren induziert. Kinase-Inhibitoren wie Curcumin hemmen die CSN-abhängige Phosphorylierung. Dadurch wird nun p53 stabilisiert und c-Jun vermehrt abgebaut, was zur Folge hat, dass auch die Expression von VEGF absinkt.
• Abbildung 23: Modell eines Regelkreises zwischen c-Jun, VEGF und Id3. C-Jun und Id3 binden an das COP9-Signalosom (CSN). Ersteres induziert die Expression von VEGF, welches seinerseits Id3 stimuliert. Id3 hemmt die CSN-abhängige Phosphorylierung von c-Jun, wodurch sich dessen Abbau über das 26S-Proteasom (26S) beschleunigt. Folglich vermindert sich auch die Synthese von VEGF und der Proteinspiegel von Id3 fällt wieder ab.
• Abbildung 24: Zwei Modelle der Regulation der Stabilität von Id3 durch das COP9-Signalosom. (A) Die CSN-assoziierten Kinasen CK2 und PKD phosphorylieren den Bindungspartner von Id3, das bHLH-Protein E47. Möglichweise fungiert Id3 dabei als Adapter, da es über CSN5 und CSN7 an den CSN-Komplex bindet. Phosphoryliertes E47 besitzt eine größere Affinität gegenüber Id3 und verhindert dadurch dessen Abbau über das 26S-Proteasom (26S). (B) Diesmal phosphorylieren die CSN-assoziierten Kinasen die Ubiquitinligase (E3) von Id3, welche dadurch eine geringe Assoziationsbereitschaft gegenüber ihrem Substrat Id3, und eventuell auch gegenüber dem Ubiquitin-konjugierenden Enzym (E2), aufweist (linke Hälfte). Folglich wird Id3 nicht vom 26S-Proteasom abgebaut. In Anwesenheit eines Inhibitors der CK2 und PKD, z. B. Curcumin, wird die Phosphorylierung des E3 unterdrückt (rechte Hälfte). Das E3 bindet verstärkt Id3 und ubiquitiniert (Ub=Ubiquitin) dieses zusammen mit einem rekrutierten E2. Schließlich wird das so markierte Id3 vom 26S-Proteasom zu Peptidfragmenten abgebaut.