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2.  Einleitung

2.1. Signaltransduktion und G-Protein gekoppelte Rezeptoren

Funktion und Leistung von Zellen basieren auf einem komplexen Netzwerk biochemischer Prozesse, wobei jede einzelne Reaktion in einer geordneten Weise stattfindet. Zellen von höherentwickelten Lebewesen sind physikalisch durch eine Zellmembran von ihrer Umgebung abgegrenzt. Dies schafft die Voraussetzung für eine interne Regulierbarkeit chemischer Reaktionen und gewinnt damit für alle Lebensprozesse wie zum Beispiel Zellbewegung, Zellteilung, Stoffwechsel, Morphogenese sowie sensorische Vorgänge eine große Bedeutung. Die Zelle ist allerdings auf den Austausch von Wärme, Sauerstoff, Nahrungs- und Abfallstoffen sowie Informationen angewiesen. Um Informationen mit ihrer Umgebung austauschen können, müssen Zellen über einen Signalübertragungsapparat verfügen. Dieser wurde im Verlauf der Evolution durch den Einbau von Rezeptoren in die zellumgebende Membran entwickelt. Diese Rezeptoren leiten selektiv Signale in das Zellinnere weiter und lösen über die Aktivierung intrazellulärer Signalwege eine biologische Antwort aus. Als Signale dienen dabei chemische Subtanzen, physikalische Signale wie Licht, mechanische Kräfte, Temperaturveränderungen oder elektrochemische Impulse.

Bei der Transduktion von chemischen und physikalischen Signalen in das Zellinnere mittels membranständiger Rezeptoren unterscheidet man ionotrope Rezeptoren, transmembrane Rezeptoren mit Enzymaktivität und G-Protein gekoppelte Rezeptoren. Die G-Protein gekoppelten Rezeptoren bilden die größte Gruppe der membranständigen Rezeptoren, welche sowohl in einzelligen Organismen wie Saccharomyces cerevisae als auch bei höherentwickelten Lebewesen wie Säugern eine wichtige Rolle im Informationsaustausch spielen. In den siebziger Jahren hat die Arbeitsgruppe von Rodbell die G-Protein gekoppelten Rezeptoren entdeckt (Welton et al ., 1977). Seitdem wurden nahezu 2000 G-Protein gekoppelte Rezeptoren kloniert, die unterschiedlichste Liganden binden und verschiedene Zellreaktionen auslösen.

G-Protein gekoppelte Rezeptoren bestehen aus einer Polypeptidkette, welche die Lipid-Doppelschicht der Zellmembran siebenfach in helikaler Gestalt durchspannt. Auf diese Weise bilden sich 3 Exoloops und Cytoloops, wobei sich der N-Terminus der Polypeptidkette extrazellulär und der C-terminus intrazellulär befinden. Diese Polypeptidketten können sich bezüglich ihrer Sequenzlänge stark unterscheiden. Zum Beispiel gibt es Rezeptoren wie der Adenokortikotrophin-Rezeptor, der aus weniger als 300 Aminosäuren besteht, während andere [Seite 3↓] Rezeptoren wie metabotrope Glutamatrezeptoren mehr als 1100 Aminosäuren aufweisen. Die Längen der N- und C-terminalen Segmente können je nach Rezeptortyp variieren. Die extrazellulären Bereiche des Rezeptors sind für die Bindung des Liganden verantwortlich, während der intrazelluläre Bereich an der selektiven Bindung und Aktivierung des G-Proteins beteiligt ist. Das G-Protein ist ein trimeres GTP-bindendes Protein, welches sich aus den Untereinheiten α , β und γ zusammensetzt. Es ist im inaktiven Zustand an den Rezeptor gebunden. Über die βγ -Einheit ist das G-Protein in der Zellmembran verankert, während die α -Einheit an ein GDP gebunden ist. Bindet ein Ligand an den Rezeptor, geben die aktivierten G-Proteine das Signal an Effektormoleküle wie zum Beispiel Adenylatzyklasen, Phospholipasen und cGMP-spezifische Phosphodiesterasen weiter. Diese wiederum lösen die Konzentrationsänderungen intrazellärer Mediatoren aus wie zum Beispiel cAMP, cGMP, Diacylglycerin, Inositoltriphosphat und Ca2+ aus.

Die Signalantworten, bei denen Adenylatzyklase oder Phospholipase C als Effektormoleküle dienen, sind bisher am ausführlichsten untersucht. Bei der Erhöhung des cAMP-Spiegels in der Zelle wird über ein stimulatorisches G-Protein (GS -Protein) die Adenylylzyklase aktiviert, welche ihrerseits ATP zu 3`-5`-zyklischen AMP umsetzt. Erkennt der Rezeptor einen Liganden, bewirkt dies eine Konformationsänderung des Rezeptors und die Affinität zu GDP sinkt, so daß dieses abdissoziiert. Zytosolisches GTP bindet an das stimulatorische G-Protein, welches vom Rezeptor abdissoziiert und in seine Untereinheiten α und βγ zerfällt. Die α -Untereinheit ist somit frei und kann die Adenylatzyklase stimulieren. Gq -Proteine können über GDP/GTP-Austausch die Phospholipase C aktivieren. Die Phospholipase C katalysiert die Freisetzung von Diacylglycerin und Inosit-1,4,5-Trisphosphat aus Phosphatidyl-Inosit-4,5-Bisphosphat.

G-Protein gekoppelte Rezeptoren werden in Familien und Gruppen gegliedert, welche auf Homologie der Sequenzen und Ähnlichkeiten der biochemischen Eigenschaften basieren. Rezeptoren, welche gänzlich unterschiedliche Liganden binden, weisen eine Homologie von 20 -30 % auf. Werden dieselben oder sehr ähnliche Liganden erkannt, besteht eine Sequenzhomologie von 50-80 %. Man unterscheidet sechs Familien der G-Protein gekoppelten Rezeptoren, wobei die Familien I, II und III ausschließlich bei höheren Lebewesen vertreten sind. Die Familien IV und V finden sich in Pilzen wie zum Beispiel Saccharomyces cerevisiea ; Familie VI umfaßt die Rezeptoren des Schleimpilzes Dictyostelium discoideum .

An diese Rezeptoren können unterschiedliche Liganden wie Peptide, Glykoproteine, Lipide, Purine, Eicosanoide, Proteasen und Chemokine binden. In der vorliegenden Arbeit wurde mit VPAC1 , einem Rezeptor der Familie II der G-Protein gekoppelten Rezeptoren gearbeitet. Die [Seite 4↓] Familie II der Rezeptoren erkennt hauptsächlich Peptidhormone wie Glucagon, Calcitonin oder Parathormon und Neuropeptide wie das Growth Hormone Releasing Hormon. Die Rezeptoren weisen einen langen extrazellulären N-terminalen Bereich von 100 bis 170 Aminosäureresten auf, der bei der Ligandenbindung eine große Rolle spielt (Holtmann et al. , 1995). Zusätzlich befinden sich in diesem Bereich konservierte Konsensussequenzen für N-Glykolisierungen und sechs hochkonservierte Cysteinreste (Laburthe et al ., 1996, Ulrich et al ., 1998), welche vermuten lassen, daß ein konserviertes Disulfidmuster vorliegt. Desweiteren kann eine komplexe Anordnung der Gene mit vielen Introns festgestellt werden (Laburthe et al ., 1999). Die Familie III der G-Protein gekoppelten Rezeptoren ist die bisher kleinste Familie der Rezeptoren höherer Lebewesen und schließt unter anderem die G-Protein gekoppelten Glutamatrezeptoren ein.

2.2. Rezeptoren der VIP/PACAP-Familie

Die Rezeptoren VPAC1 und VPAC2 gehören zu der Familie II der G-Protein gekoppelten heptahelikalen Transmembranrezeptoren und werden mit hoher Affinität von den Neuropeptiden VIP (Vasoaktives Intestinales Peptid) und PACAP (pituitary adenylate cyclase activating peptide) erkannt (Gaudin et al. , 1998). Sie weisen die für die Familie II der G-Protein gekoppelten Rezeptoren typischen Attribute auf. VPAC1 zum Beispiel hat bei einer Gesamtlänge von 457 Aminosäuren einen sehr langen extrazellulären N-terminalen Bereich (144 Aminosäuren). In der N-terminalen Region konnten sechs konservierte Cysteinreste (Gaudin et al ., 1996) und zwei N-Glykosylierungsstellen als für den Rezeptortransport zur Plasmamembran als unabdingbar befunden werden (Couvineau et al ., 1996a). VPAC1 wird in unterschiedlichen Geweben wie Beispiel Lunge, Leber, Nieren, Intestinaltrakt und einigen Bereichen im Hirn exprimiert (Ishihara et al ., 1992). VPAC2 dagegen ist in spezifischen Regionen des zentralen Nervensystems, im Suprachiasmatischen Nukleus (SCN), aber auch peripheralen Geweben wie Pankreas, Herz, Nieren, Hoden und Magen (Usdin et al ., 1994, Sheward et al ., 1998) präsent. Neben VPAC1 und VPAC2 existiert auch der Rezeptor PAC1 , welcher im Gegensatz zu den beiden anderen Rezeptoren nur PACAP und nicht VIP bindet und vorwiegend im Hirn und Nebennierenmark vorkommt.

VPAC1 wurde 1992 erstmals aus einer Rattenlunge isoliert und kloniert (Ishihara et al ., 1992). Ein Jahr später erfolgte die Isolierung und Klonierung des humanen Rezeptors (Sreedharan et al ., 1993). VPAC2 wurde nur kurze Zeit später aus dem Riechkolben der Ratte isoliert (Lutz et al ., [Seite 5↓] 1993); gleiche Sequenzen konnten in der Maus und im Menschen identifiziert werden (Harmar et al ., 1998).

Die Klonierung der jeweiligen Rezeptoren eröffnete die Möglichkeit, die Rezeptoren im Hinblick auf ihre Struktur und Funktion eingehender zu untersuchen.

Es stellte sich heraus, daß VPAC1 und VPAC2 eine Homologie von ca. 50 % aufweisen und einige natürlich vorkommende VIP-verwandte Peptide wie Peptide Histidine Isoleucinamid (PHI), Peptide Histidine Valinamid (PHV), PACAP, „growth hormone releasing faktor“ (GRF) und Sekretin als Agonisten erkennen können (Couvineau et al ., 1996b). Die Affinitäten zwischen den verschiedenen Peptiden und VPAC1 und VPAC2 differieren, wobei die höchste Affinität der beiden Rezeptoren gegenüber VIP und PACAP zu beobachten ist (Tab. 1) (Gozes et al ., 1999a).

Humane Rezeptoren und die Rezeptoren aus der Ratte unterscheiden VIP und die Agonisten in ähnlichem Ausmaß mit der Ausnahme von PHI und Sekretin (Couvineau et al ., 1984). PHI zeigt eine hohe Affinität für VPAC1 aus der Ratte (3 nM), aber eine niedrige Affinität für humanes VPAC1 (1000 nM). Die Affinität für Sekretin ist bei humanen VPAC1 (1500 nM) im Vergleich zu VPAC1 aus der Ratte (300 nM) niedriger.

Tabelle 1 : Bindungsaffinitäten (IC50 ) von VIP und weiteren Peptiden der VIP/PACAP-Familie zu den der humanen Rezeptoren VPAC1 und VPAC2

Agonist

VPAC 1

VPAC 2

VIP

1 nM

3-4 nM

PHI

1000 nM

10 nM

PHV

3000 nM

30 nM

PACAP-27

1 nM

10 nM

PACAP-38

1 nM

2 nM

GRF

80 nM

5000 nM

Sekretin

1500 nM

30000 nM

Bindet VIP an VPAC1 oder VPAC2 zeigt sich bei beiden Rezeptoren ein ähnliches Verhalten in der intrazellulären Zellantwort. Es konnte gezeigt werden, daß die Ligandenbindung die Aktivierung der Adenylatzyklase hervorruft, welche ihrerseits ATP in cAMP umwandelt. Daneben konnte zusätzlich der Anstieg intrazellulärer Konzentrationen von Ca2+ und [Seite 6↓] Inositolphosphat (Sreedharan et al ., 1994, Xia et al ., 1996, Van Rampelberg et al ., 1997) und die Aktivierung der mitogenaktivierten Proteinkinase (Lelievre et al ., 1998) beobachtet werden. VPAC1 und VPAC2 unterscheiden sich bezüglich ihrer pharmakologischen Eigenschaften und der Erkennung natürlicher Agonisten der VIP-Peptid-Familie nur wenig, obwohl sie im Gegensatz dazu bei einer Sequenzhomologie von 49 % doch sehr unterschiedliche Aminosäuresequenzen aufweisen. Man vermutet, daß VPAC1 und VPAC2 komplementäre Gewebeverteilungen aufweisen, da VPAC2 vornehmlich in Geweben gefunden werden konnte, in denen VPAC1 gar nicht oder in nur geringem Maße vorkommt (Usdin et al ., 1994). Die Gruppe um Laburthe hat Untersuchungen durchgeführt, bei denen Aminosäurepositionen, welche nur in VPAC1 und VPAC2 aber nicht in den sonstigen Rezeptoren der Klasse II konserviert sind, mutiert wurden. Damit konnten sie zeigen, daß für die beiden Rezeptorsubtypen unterschiedliche Aminosäurereste für die Liganden-Bindung und cAMP- Produktion essentiell sind (Nicole et al ., 1998). Dieselbe Gruppe hat gezeigt, daß für die Bindung von VIP die Aminosäurereste E36 , W67 , D68 , W73 und G109 von VPAC1 entscheidend sind, welche sich um eine Höhle gruppieren, die überwiegend negativ geladen ist (Lins et al ., 2001).

2.3. Vasoaktives Intestinales Peptid: Struktur und Funktion

VIP wurde 1970 von Said und Mutt (Said & Mutt, 1970) aus Schweinepankreas isoliert und als eine vasodilatorische Substanz beschrieben. VIP ist ein 28meres Neuropeptid und besitzt eine große Vielfalt verschiedener biologischer Funktionen in diversen Zellen und Geweben. Es zeigte sich, daß VIP bei vielen anderen physiologischen Prozessen beteiligt ist, wie zum Beispiel bei der Bronchodilation, Immunsuppression, Hormonsekretion und auch bei der Wachstumsregulation von Föten, Tumorzellen und bei der Entwicklung des embryonalen Gehirns (Nicole et al ., 2000). Kürzlich konnte desweiteren bewiesen werden, daß VIP bei der Schmerzempfindung (Dickinson & Fleetwood-Walker, 1999) und Suppression von Entzündungen (Said & Dickman, 1998) eine große Rolle spielt. Und letzlich ist auch denkbar, daß VIP bei Asthma, Lungenverletzungen, Impotenz, bei einer Vielzahl von Tumoren, und neurodegenerativen Krankheiten eingesetzt werden kann (Gozes et al ., 1999b).

VIP gehört einer großen Familie von strukturell ähnlichen Peptiden an, welche das PACAP-27 (pituitary adenylate cyclase-activating peptide) und das C-terminal verlängerte PACAP-38, Sekretin, Glucagon, GLP (glucagon like peptide), GIP (gastric inhibitory peptide), GRF (growth hormone-releasing factor) und Helodermin umfaßt.

Tabelle 2 : Sequenzvergleich von VIP mit ausgewählten Peptide der VIP/PACAP-Familie. Die grau markierten Felder zeigen die Aminosäurepositionen, welche mit VIP übereinstimmen.


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Bezogen auf Struktur und Funktion besitzen VIP und PACAP die größte Ähnlichkeit und zeigen ein Sequenzhomologie von 68 % (Tab. 2) (Vertongen et al ., 1997a). Kürzlich wurden NMR-Spektroskopie-Studien mehrerer Peptide der VIP/PACAP-Familie frei in Lösung durchgeführt und miteinander verglichen. Dabei stellte sich heraus, daß alle Peptide dieser Familie eine reguläre Sekundärstruktur einnehmen, wobei auf eine ungeordnete N-terminale Region von 6-8 Aminosäuren, eine helikale Region von 18 ± 2 Aminosäureresten folgt, welche bei dem konservierten F6 oder T7 beginnt (Wray et al ., 1998). Der N-Terminus des Peptidmoleküls zeigt amphiphatischen Charakter mit geladenen Aminosäureresten auf der einen Seite des Moleküls und hydrophoben Aminosäureresten auf der gegenüberliegenden Seite. Dies läßt vermuten, daß die N-terminale Region membran-bindende Eigenschaften besitzt (Wray et al ., 1998). Struktur-Funktions-Analysen mit VIP-Fragmenten haben gezeigt, daß die gesamte VIP-Sequenz für die biologischen Funktion nötig ist (Bodanszky et al. , 1973, Chadker et al ., 1993); lediglich das Fragment VIP2-28 zeigte ein ähnliches Verhalten wie das Wildtyp-Peptid (Couvineau et al ., 1984).

In der Literatur wurden bisher eine Vielzahl verschiedener VIP-Analoga beschrieben. Hybridisierungen mit ähnlichen Peptiden wie zum Beispiel Sekretin (Vertongen et al , 1997b) oder GRF (Gourlet et al ., 1997) führten zu selektiven VPAC1 -Agonisten. Ferner konnten auch zwei zyklische VIP-Antagonisten, Ro 25-1553 und Ro 25-1392, entwickelt werden, welche selektiv an VPAC2 binden (Xia et al ., 1997).

Obwohl die Struktur-Funktions-Beziehungen von VPAC1 und VPAC2 weitgehend geklärt sind, bleiben die Struktur-Funktions-Beziehungen von VIP immer noch wenig verständlich. Nicole et al. haben vor kurzem VIP-Untersuchungen mit Hilfe von Alanin-Substitutionen und Molekularem Modelling durchgeführt (Nicole et al ., 2000a). Es werden 14 Aminosäuren, welche entweder für die Struktur oder Bindung zu VPAC1 von Bedeutung sind, vorgeschlagen. [Seite 8↓] Weiterhin wurde von dieser Gruppe ein VIP-Derivat entwickelt, welches 3 Ala-Mutationen an den Positionen 11, 22 und 28 hat und selektiv an VPAC1 bindet.

2.4. Tumordiagnostik mit rezeptorspezifischen Liganden

Die Früherkennung von Tumoren ist die wichtigste Maßnahme für die Erhöhung der Überlebensrate bei Krebspatienten. Die operative Entfernung von Primärtumoren verringert die Verbreitung des Krebses erheblich, da sich in diesem Stadium meist noch keine Metastasen in anderen Organen gebildet haben. In den letzten Jahren wurden vielversprechende Diagnoseverfahren wie zum Beispiel die Anwendung von molekularen Sonden, Mikrosatelliten oder der Einsatz von tumorspezifischen Antikörpern entwickelt (Follis et al ., 1994, Ballou et al. , 1995), um das individuelle Krebsrisiko abzuschätzen und Tumore schon im Frühstadium zu erkennen. Der Nachteil bei der Verwendung von Antikörpern liegt in dem Auftreten unerwünschter immunogener Nebeneffekte und einer zu langen Halbwertszeit im Blutplasma, welches zu niedrigen Tumor/Blut-Kontrasten während der ersten Stunden nach der Injektion führt (Goldsmith, 1997). Die Weiterentwicklung erfolgte durch die Anwendung von rekombinanten Antikörperfragmenten, welche von Neri et al. für die Diagnose von Gefäßen in neoplastischen Geweben entwickelt wurde (Neri et al. , 1997). Andere Verfahren zur Früherkennung konzentrieren sich auf Liganden, die an spezifische Rezeptoren auf Tumorzellen binden. Maligne Transformationen von Zellen führen häufig zu einer erhöhten Expression von Rezeptoren auf diesen Zellen. Liganden, welche an diese Rezeptoren binden, können an einen Marker gekoppelt werden und somit als Kontrastmittel für die Tumordiagnostik auf der molekularen Ebene eingesetzt werden. Eine hohe Affinität und Selektivität zum Rezeptor ermöglichen die Verabreichung des Liganden in einer niedrigen Dosis und erlauben zudem ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis. Zudem wirken kleine Peptide nicht immunogen und können somit die Schwächen von Antikörpern oder Antikörperfragmenten umgehen.

Derzeit werden unterschiedliche Liganden, welche spezifisch an Tumorrezeptoren binden, in diversen Laboren untersucht. Die am häufigsten in der Klinik eingesetzten Liganden sind markierte Analoga von Somatostatin, α -Melanozyten-stimulierendes Hormon α -MSH), Neurotensin, Bombesin (BN), Substanz P (SP), Gastrin/Cholecystokinin und VIP (Heppeler et al ., 2000). Diese Peptide werden üblicherweise radioaktiv markiert und für die in vivo Szintigraphie und Radiotherapie untersucht. Die Rezeptorszintigraphie mit Hilfe von radioaktiv markierten Somatostatin-Analoga ist klinisch für die Detektion neuroendokriner Tumoren [Seite 9↓] etabliert (Jensen et al. , 1997). Es wurden einige pharmakologisch optimierte Somatostatin-Analoga mit Rezeptorsubspezifität entwickelt. Beispiele für solche Radiodiagnostika sind das Präparat OctreoscanTM , das an die Somatostatin-Rezeptoren 2 und 5 bindet und das Präparat NeotectTM , welches an die Rezeptorsubtypen 2, 3 und 5 bindet.

VPAC1 wird von diversen Tumorzellen wie zum Beispiel bei Adenokarzinoma, Brustkrebs, Melanoma, Neuroblastoma und gastropankreatischen Karzinoma in hoher Dichte exprimiert (Reubi, 1995), welche nach Bindung von VIP auf dem Weg der rezeptorvermittelten Endozytose in intrazelluläre Kompartimente aufgenommen werden (Luis et al. , 1986). Der VPAC1 -Rezeptor kann somit als System genutzt werden, um Signalmoleküle, die an VIP gebunden werden, direkt in die Tumorzelle zu transportieren. Die Gruppe von Virgolini konnte kürzlich mit Hilfe von 123 I-VIP als Liganden in vivo pankreatische und kolonische Adenokarzinome in Tumorpatienten lokalisieren (Virgolini et al ., 1996, Raderer et al ., 2000). Auch mit 99 Technetium markierten VIP konnten Tumore in vivo detektiert werden (Thakur et al. , 2000, Pallela et al. , 1999). Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß markierte VIP-Analoga oder modifizierte Varianten vielversprechende Kandidaten für die Tumordetektion in vivo sind. Möglicherweise lassen sich mit VIP auch Metastasen detektieren, welche bisher mit den heutigen Bildgebungsverfahren nicht entdeckt werden können. Das Gen für VPAC1 ist auf dem kurzen Arm des Chromosom 3p22 lokalisiert, bei welchem der Allelverlust mit SCLC (small cell lung cancer) und anderen Krebsarten gekoppelt ist (Maruno et al., 19998). Somit wird die Annahme gestützt, daß VPAC1 eng mit Malignität verbunden ist (Sreedharan et al ., 1995). Desweiteren konnte gezeigt werden, daß VIP-Konjugate das Wachstum einer pankreatischen Tumorzelllinie inhibieren können (Zia et al ., 2000), so daß es auch denkbar wäre, VIP-Konjugate nicht nur in der Diagnostik sondern auch in der Krebstherapie einzusetzen.

Als alternatives Verfahren zur Szintigraphie hat sich in den letzten Jahren die Detektion von Fluoreszenzfarbstoffen mit Licht des nahinfraroten Spektralbereiches (650-1000 nm) etabliert (Beaudet et al. , 1998, Weissleder et al. , 1999, Mahmood et al. , 1999). Das Nahinfrarot(NIR)-Licht kann im Gegensatz zum Licht des ultravioletten und sichtbaren Spektrums tiefer in das Gewebe eindringen, da in diesem Bereich die Absorption durch körpereigene Farbstoffe, vorwiegend durch Hämoglobin und Wasser, sehr gering ist (Riefke et al. , 1997). Dieser Bereich der größten optischen Gewebetransparenz wird als diagnostisches Fenster bezeichnet (Abb.1).


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Abb. 1: Optisch-diagnostisches Fenster von Gewebe (Hb = Desoxy-Hämoglobin; HbO2 = Oxy-Hämoglobin).

Als Fluoreszenzfarbstoffe eignen sich Farbstoffe auf Basis der Cyaninstruktur. Indocarbocyanin (Cy3), Indodicarbocyanin (Cy5) und Indotricarbocyanin (Cy7) besitzen eine einzige definierte Position, die für die Kopplung an Peptide oder andere Modifikationen vorgesehen ist (Abb. 2) (Licha et al. , 2001). In Abhängigkeit von der Länge der Polymethinkette (3, 5 oder 7 Atome) kann ein entsprechendes Fluoreszenzemissionsmaximum von 580, 680 oder 780 nm detektiert werden, so daß je nach Detektionssystem der geeignete Farbstoff ausgewählt werden kann. Es wurden bereits Cyaninfarbstoffe als Fluoreszenzmarker für spezifische Biomoleküle, wie zum Beispiel Antikörper (Ballou et al ., 1997) verwendet und diese Konjugate im Tierversuch hinsichtlich ihrer Tumoranreicherung studiert. Die Gruppe von Weissleder hat einen Ansatz entwickelt, bei dem sich selbst quenchende Cyaninfarbstoffe an ein Trägermolekül gekoppelt werden, das von Tumorzellen internalisiert wird (Weissleder et al. , 1999). Tumorproteasen spalten das Molekül so, daß der Quencheffekt aufgehoben wird und das Fluoreszenzsignal detektiert werden kann.


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Abb. 2: Allgemeine chemische Struktur der Carbocyaninfarbstoffe, wobei an Position R weitere Moleküle wie z.B. Peptide gekoppelt werden können.

Die endoskopische Untersuchung von pathologischen Prozessen in Hohlorganen ist eine potentielle Applikation für die fluoreszenz-basierende Diagnostik. Bei epithelialen Tumoren sind die Läsionen oberflächlich lokalisiert und sind somit von der limitierten Eindringtiefe des Lichtes in das Gewebe nicht betroffen. Das Verfahren der Endoskopie ist bereits eine Standardmethode für die Detektion epithelialer Tumore wie zum Beispiel Tumore des Kolon, des Ösophagus oder der Blase. Tumore des Kolons, der Blase und des Ösophagus exprimieren VPAC1 mit hoher Inzidenz (Tab. 3) (Reubi et al ., 1995, Reubi et al. , 2000). Demnach bietet die Verwendung von VIP bzw. VIP-Derivaten gekoppelt mit einem Fluoreszenzfarbstoff ein mögliches Diagnoseverfahren in der fluoreszenzgestützen Endoskopie (Stepp et al. , 1998, Wagnieres et al. , 1998). VPAC1 kann auch als molekularer Marker von Brusttumoren dienen und wäre möglicherweise mit der optischen Mammographie detektierbar. Weiterhin ist denkbar, die Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffe für therapeutische Zwecke in Form der photodynamischen Therapie zu nutzen (Dougherty et al. , 1998).

Tabelle 3 : Expressionhäufigkeit (%) von VPAC1 -Rezeptoren auf den verschiedenen Tumorzellen (Reubi, 1995 und Reubi, 1999). Die Zahlen in Klammern stellen die Anzahl der VPAC1 -rezeptorpositiven Gewebeproben (links) zu den untersuchten Gewebeproben (rechts) dar.

Tumorart

VPAC 1 -Expression

Mögliches optisches Diagnoseverfahren

Kolon

96 % (44/46)

Fluoreszenzgestützte Endoskopie

Blase

100 % (4/4)

Fluoreszenzgestützte Endoskopie

Ösophagus

100 % (4/4)

Fluoreszenzgestützte Endoskopie

Brust

100 % (39/39)

Optische Mammographie


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Die diagnostische Anwendung von VIP als Kontrastmittel ist stark limitiert, da VIP eine kurze Halbwertszeit in vivo zeigt. Die kurze Halbwertszeit wird durch einen schnellen proteolytischen Abbau des Peptides bedingt (Domschke et al ., 1978, Keltz et al ., 1980, Hessenius et al. , 2000). Deshalb ist es also notwendig, in Analogie zu den Somatostatin-bindenden Peptiden, strukturoptimierte VIP-Konjugate zu entwickeln, die eine für die Dauer des Diagnosevorganges genügend hohe Stabilität gegenüber dem proteolytischen Abbau aufweisen.


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2.5.  Aufgabenstellung

Der VIP-bindende Rezeptor VPAC1 wird von Tumorzellen in hoher Dichte exprimiert, so daß VIP gekoppelt mit einem Signalpeptid potentiell für die Verwendung als Kontrastmittel in der rezeptorvermittelten Tumordiagnostik verwendet werden kann. Die optische Bildgebung von Tumoren ist aufgrund der schnellen proteolytischen Degradation von VIP in vivo begrenzt und bedarf strukturell optimierter VIP-Derivate mit höherer Stabilität.

Aufgabe dieser Arbeit war die Entwicklung stabiler VIP-Analoga, welche für die Bildgebung im Nahinfrarot-Bereich mit Carbocyaninfarbstoffen markiert werden sollten. Hierfür war die Etablierung eines Zellassays vorgesehen, bei dem lösliche markierte VIP-Derivate mittels Spotsynthese hergestellt und bezüglich ihrer Bindung/Internalisierung an VPAC1 -überexprimierende Zellen mit den Methoden der Durchflußzytometrie getestet werden sollten. Zuerst sollte für die Spotsynthese der VIP-Farbstoff-Konjugate eine Synthesestrategie entwickelt werden, welche die Abspaltung der Peptide mit authentischen C-Termini von der Zellulose ermöglicht. Zu diesem Zweck sollte die Spotsynthese hinsichtlich der Farbstoffkopplung optimiert werden. Für die Untersuchung der Rezeptor-Liganden-Interaktion sollte dann diese Technik genutzt werden, um eine vollständige Substitutionsanalyse des VIP anzufertigen. Weiterhin sollten ausgewählte VIP-Farbstoff-Konjugate eingehender in vitro charakterisiert werden. Die Charakterisierung der VIP-Farbstoff-Derivate beinhaltete die Untersuchung der Spezifität mit radioaktiven Kompetitionsstudien, die Testung der biologischen Aktivität im cAMP-Assay und die Überprüfung der Stabilität in Rattenleberhomogenat. Abschließend sollte die Verwendung farbstoffmarkierter VIP-Derivate in der Tumordiagnostik mit Hilfe von in vivo Imagingversuchen am Tiermodell überprüft werden. Für die Tierversuche sollten Nacktmäuse mit inokulierten VPAC1 -überexprimierenden Tumoren verwendet werden.


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22.01.2004