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3.  Material

3.1. Chemikalien

Die meisten in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien wurden von Boehringer (Mannheim), Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Millipore (Eschborn), Serva (Heidelberg) und Sigma (München) in analytischer Qualität bezogen. Chemikalien und Reagenzien, die nicht von diesen Firmen stammen, werden mit Herstellernachweis im Methodenteil gesondert aufgeführt. Die für die Zellkultur verwendeten Lösungen und Medien wurden von der Firma Gibco BRL (Karlsruhe) bezogen. Alle Lösungen wurden mit voll entsalztem Wasser (Filteranlage von Millipore) angesetzt.

3.2. Aminosäuren

3.2.1. Fmoc-Aminosäuren für die Verwendung in der Spotsynthese

Es wurden Fmoc-geschützte Aminosäuren der Firmen NovaBiochem (Schweiz) und Bachem (Heidelberg) verwendet.

Der Großteil der Aminosäuren lag bereits als aktivierter Pentafluorphenyl(Pfp)- oder 3-Hydroxyl-2,3-dihydro-4-oxo-benzotriazin(Dhbt)- Ester vor; nicht aktivierte Aminosäuren wurden mit einem Äquivalent HoAt und zwei Äquvalenten DIC in situ aktiviert. Die Aktivester der Aminosäuren konnten als Lösung in NMP bei –20 ° C bis zu drei Wochen aufbewahrt werden. Eine Ausnahme davon war der Aktivester von Arginin, welcher wegen der niedrigen Stabilität vor der Verwendung frisch hergestellt wurde.

3.2.2. Fmoc-Aminosäuren für die Verwendung in der präparativen Synthese

Bei der Synthese von Peptiden an Polystyrolharz wurden Fmoc-geschützte Aminosäuren von NovaBiochem (Schweiz) verwendet. Diese Aminosäure-Derivate besaßen freie C-Termini und wurden in situ mit PyBOP und NMM aktiviert.


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Die Fmoc-geschützten Aminosäuren sowohl für die Spotsynthese als auch die präparative Synthese am Polystyrolharz hatten folgende Seitenschutzgruppen: Triphenylmethyl (Trt) bei Cystein, Histidin, Asparagin und Glutamin, tert. Butyl (tBu) bei Asparaginsäure, Glutaminsäure, Serin, Threonin und Tyrosin, tert. Butoxycarbonyl (Boc), Methoxytrityl (Mmt) oder Alloc bei Lysin, tert. Butoxycarbonyl (Boc) bei Tryptophan und Pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) bei Arginin.

3.2.3. Fmoc-Brompropyl-Aminosäureester

Es wurden Fmoc-3-Brompropyl-Aminosäureester verwendet, welche in der AG Schneider-Mergener hergestellt wurden.

3.3. Cellulose und Harze

Als Cellulosemembrane wurden Whatman® 50-Filterpapiere der Firma Whatman (Maidstone, England) verwendet. Für die Synthese der Peptide am Harz wurde Polystyrolharz Tenta Gel SRAM mit einer Kapazität von 0,25 mmol/g der Firma Rapp Polymere (Tübingen) eingesetzt.

3.4. Carbocyaninfarbstoffe

Es wurden die Farbstoffe Indodicarbocyanin (Cy5) und Indotricarbocyanin (Cy7) verwendet, welche freundlicherweise von Dr. Kai Licha vom Institut für Diagnostikforschung der FU Berlin zur Verfügung gestellt wurden. Dabei wurden für die durchflußzytometrischen Messungen Cy5 und für die Vorversuche der Spotsynthese und In vivo -Imaging-Experimente Cy7 an die entsprechenden Peptide gekoppelt.


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3.5.  Zellen

Aus der Arbeitsgruppe Gastroenterologie und Hepatologie der Charité Berlin von Prof. Dr. Wiedenmann und Dr. Carsten Grötzinger wurden freundlicherweise RIN38(VPAC1 )-Zellen zur Verfügung gestellt. Bei diesen RIN38-Zellen (Poitot et al. , 1996) handelt es sich um Insulin-sekretierende Zellen aus dem Pankreas, welche so transfiziert wurden, daß der Rezeptor VPAC1 in Fusion mit eGFP (Kendall & Badminton, 1998) überexprimiert ist.

Zusätzlich wurde die VPAC1 -überexprimierende Zellinie HT-29 (Couvineau et al. , 1985) von der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig) (No. ACC 299) verwendet. Hierbei handelt es sich um eine humane Adenokarzinomazelllinie, welche aus Primärtumoren im Kolon einer 44-jährigen Frau isoliert wurde.

3.6. Geräte

Analysenwaage Satorius basic

Satorius, Göttingen

  

Analytische HPLC:

 

Waters 66E System Controller

 

Waters 991 Photodiode Array Detector

 

Waters 470 Scanning Fluorescence Detector

 

Waters 717 plus Autosampler

 

Pumpe

Waters, Eschborn

Vydac HPLC-Säulen

Sep/a/ra/tions Group, USA

Auto-Spot Robot ASP 222 XL

Abimed, Langenfeld

CCD-Kamera ICCD-576G-E

Princeton Instruments Inc., USA

FACS-Calibur

Becton Dickinson, Heidelberg

Gammacounter Compugamma 1282

LKB Wallac, USA

LaserTec Benchtop II

PerSeptive Biosystems, USA

Lyophilisator Lyovac GT 2/GT 2-E

Finn-Aqua, München

Mikroskop Axiovert 25

Zeiss, Göttingen

MultiScreen Vakuums-Filtrationssystem

Millipore, USA

MultiScreen Stanze

Millipore, USA

Multipler Peptidsynthesizer AMS 422

Abimed, Langenfeld

pH-Meter GC 840

Schott Geräte, Hofheim

Photometer Ultrospec 3000

Pharmacia Biotech, USA

Präparative HPLC:

 

Waters 486 Tunable Absorbance Detector

 

Waters 625 LC Systems

 

Pumpe

Waters, Eschborn

Vydac HPLC-Säulen

Sep/a/ra/tions Group, USA

SpeedVac Concentrator 5301

Eppendorf, Hamburg,

Zentrifuge Eppendorf 5415C

Eppendorf, Hamburg

Zentrifuge Megafuge 1.0 R

Heraeus, Berlin

3.7. Software

CELLQuest

Becton Dickinson, Heidelberg

ChemDraw

CambridgeSoft Coorporation, USA

Corel Draw 8.0

Corel Corporation, Kanada

Excel 5.0

Microsoft, USA

PRISM 3.0

GraphPad Software, USA

LISA

Jerini Bio Tools GmbH, Berlin

Winview 1.6.2

Princeton Instruments Inc., USA


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22.01.2004