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4.  Methoden

4.1. Peptidsynthese auf Cellulose

Der Syntheseablauf von Peptiden auf Cellulose mit Hilfe der Fmoc-Strategie ist in Abb. 4.1 dargestellt.

Abb. 4.1: Schematische Darstellung der Peptidsynthese an Cellulosemembranen


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Für die Spotsynthese an Cellulose wurde eine mercaptofunktionalisierte Membran hergestellt, an welcher die erste Aminosäure in Form eines Fmoc-Aminosäure-Brompropylesters gekoppelt wurde (Licha et. al ., 2000a). Auf diese Weise konnten nach Beendigung der Synthese die einzelnen Peptide, als Peptide mit authentischen C-Termini, mit einer milden Base von der Cellulose abgelöst werden. Es wurde zuerst eine CAPE-Membran („cellulose-amino-hydroxyl-propylether“) hergestellt (Volkmer-Engert et al ., 1997), eine aminofunktionalisierte Membran, auf der mit β-Alanin die Syntheseorte als Punkte („Spots“) definiert wurden. Um die reaktiven Reste auf diese „Spots“ zu begrenzen, wurde der restliche Bereich der Membran durch Acetylierung blockiert. Die Mercaptofunktion wurde mit Hilfe von Mercaptopropionsäure aufgebracht und nach Aktivierung mit Cäsiumcarbonat konnten die Brompropionsäureester gekoppelt werden

Anschließend wurden alle weiteren Aminosäuren des Peptids sukzessive nach der Fmoc-Strategie in einem fortlaufenden Zyklus (Abb. 4.2) aufgebaut. Nach Beendigung der Synthese wurden die Seitenschutzgruppen abgespalten.

4.1.1. Herstellung einer CAPE-Membran


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4.1.2.  Spotdefinierung

4.1.3. Einführung der Mercaptofunktion

4.1.4. Kopplung der Aminosäuren und des Cyanin-Farbstoffes

Die ersten Aminosäuren des Peptids wurden als 0,6 M Fmoc-Aminosäure-Brompropionester in DMF auf die Membran gebracht. Der Rest des Peptids wurde durch wiederholtes Aufpipettieren [Seite 21↓] von 0,6 M Aminosäurelösungen in NMP auf die „Spots“ und anschließender Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppen (siehe 4.1.2) aufgebaut.

Nach Beendigung der Synthese wurde 0,3 M Indodicarbocyanin-Lösung mit einem Äquivalent TBTU und zwei Äquivalenten DIPA N-terminal an das Peptid gekoppelt.

Die Kopplung des Cyaninfarbstoffes an das C-terminale Ende oder in die Mitte der Sequenz erfolgte an ein Lysin mit einer Mmt-Schutzgruppe. Dafür wurde die letzte Aminosäure am N-terminalen Ende als eine Boc-geschützte Aminosäure gekoppelt. Die Mmt-Schutzgruppe des Lysins konnte mit 3 % TFA in DCM entfernt werden und mit 3 % TFA und 5 % TIPS in DCM abgefangen werden.

4.1.5. Abspaltung der Seitenschutzgruppen

Die Abspaltung der Seitenschutzgruppen erfolgte durch nacheinanderfolgende Behandlung der Membran mit 90 % TFA, 3 % TIBS, 2 % aq. bidest , 1 % Phenol in DCM für 30 min. und 50 % TFA, 3 % TIBS, 2 % aq. bidest , 1 % Phenol in DCM für 2,5 h. Anschließend wurde die Membran 4 x mit DCM, 3 x mit DMF und 2 x EtOH gewaschen und getrocknet.

4.1.6. Abspaltung der Peptide von der Cellulose

Die einzelnen „Spots“ wurden aus der Membran ausgestanzt und in 2 ml-Eppendorf-Gefäßen mit 0,16 M NaOH-Lösung in Acetonitril/aq. bidest (2/1) (v/v) für 30 min. inkubiert. Zur Neutralisierung wurde mit einer Endkonzentration von 2 % Salzsäure zugefügt. Nach Entfernen der ´Spots` wurden die Peptidlösungen in der SpeedVac eingedampft und anschließend in aq. bidest wieder aufgenommen.

Um die Vollständigkeit der Synthese und den Reinheitsgrad der Peptide zu überprüfen, wurden einige Peptide mittels „reversed phase“-HPLC und Laserdesorptions-Flugzeitmassen-spekrome-trie (MALDI-TOF) untersucht. Es wurde ein linearer Gradient 20 % bis 60 % Acetonitril/0,05 % TFA gegen Wasser/0,05 % TFA in 30 min. verwendet. Die Detektion erfolgte photometrisch bei 214 nm und der Wellenlänge des entsprechenden verwendeten Cyaninfarbstoffes.


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4.1.7.  Quantitative Bestimmung der Beladungsdichte

Die analytische Kontrolle über die Beladungsdichte der Membran kann über die Quantifizierung der Fmoc-Schutzgruppe eines Spots erfolgen. Dafür wurde ein einzelner Spot ausgestanzt und mit 1,01 ml 20 %iger Piperidinlösung inkubiert. Nach 20 min. wurde die Fmoc-Schutzgruppe photometrisch bei 302 nm detektiert. Mit Hilfe des Lambert-Beer`schen Gesetzes (Extinktionskoeffizient = 8100 l mol-1 cm-1 ) wurde die Stoffmenge eines Peptids pro Spot berrechnet.

4.2. Peptidsynthese am Polystyrolharz

Die Synthese von löslichen Peptiden wurde mit Hilfe eines Multiplen Peptidsynthezisers (MPS) durchgeführt. Es wurden Ansätze von 50 µmol TentaGel SRAM hergestellt. Als Lösungsmittel wurde DMF verwendet. Ein Synthesezyklus des Automaten bestand aus der Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe mit 20 % Piperidin in DMF für zweimal 15 min. und einer darauffolgenden sechsmaligen Waschprozedur mit DMF. Anschließend wurden die Aminosäuren mit einem Äquivalent PyBOP und zwei Äquivalenten NMM aktiviert und zweimal 15 min. gekoppelt. Danach wurde 6 x mit DMF gewaschen. Für die Kopplung des Cyaninfarbstoffes an das N-terminale Ende des Peptids wurde nach Beendigung der Synthese der Cyaninfarbstoff wie bei der Synthese auf Cellulose aktiviert und im 1,5 fachen Überschuß auf den Polystyrolharz gegeben. Bei der Kopplung des Cyaninfarbstoffes an ein Alloc-geschütztes Lysin in der Sequenzmitte mußte das N-terminale Ende zuerst wieder mit einer Fmoc-Schutzgruppe versehen werden, indem für 2 Stunden mit 200 µM Fmoc-O-Succinimidylester in DMF inkubiert wurde. Die Alloc-Schutzgruppe des Lysins wurde mit 5 %igem N-Methylanilin und einer Spatelspitze Tetrakis(triphenylphosphin)palladium in DCM entfernt. Anschließend konnte der Cyaninfarbstoff wie oben beschrieben gekoppelt werden.

Die Abspaltung der Peptide vom Polystryrolharz und der Seitenschutzgruppen erfolgte durch Inkubation mit 5 % Methylphenylsulfid, 5 % aq. bidest , 2,5 % EDT, 7,5 % (w/v) Phenol in TFA 3 h lang. Im Anschluß wurden die Peptide in eiskaltem tert. Butylmethylether ausgefällt und 2 min. bei 3200 rpm abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde 3 x mit Diethylether gewaschen und abzentrifugiert (2 x 2 min. bei 3200 rpm, 1 x 6 min. bei 5800 rpm). Die trockenen Peptide wurden in Acetonitril/Wasser (1:1) aufgenommen und lyophilisiert.


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Wie bei den Cellulosepeptiden wurde hier ebenfalls der Reinheitsgrad mittels „reversed phase“-HPLC und MALDI-TOF untersucht und, wenn nötig, wurden die Peptide mit der präparativen HPLC gereinigt.

4.3. Zellkultur

Die humane Kolonkarzinomzelllinie HT-29 wurde routinemäßig in McCoy-Medium, welches mit 10 %igen fötalem Kälberserum versetzt wurde, kultiviert, während für die RIN38-Zellen RPMI 1640-Medium verwendet wurde. Die Zellen wurden in einem Brutschrank bei 37 ° C, 5 % CO2 und 96 % relativer Luftfeuchtigkeit aufbewahrt; alle 2 Tage wurde das Kulturmedium zu 50 % ausgetauscht.

Zur Herstellung von Subkulturen wurden die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend 5 min. mit 0,25 % in PBS bei 37 ° C inkubiert. Mittels Abklopfen oder mit einem Zellschaber wurden die Zellen von der Kulturflasche gelöst, in Medium aufgenommen und durch mehrmaliges Aufziehen mit einer Pipette mechanisch vereinzelt. Die Zellsuspensionen wurden mit Medium verdünnt und erneut in Zellkulturflaschen ausplattiert.

4.4. Durchflußzytometrie

Die Durchflußzyometrie ist eine Methode zur statistischen Analyse von Einzelzellen in Suspension auf der Grundlage der Fluoreszenz- und Streulichteigenschaften (Carter et al ., 1992). In der vorliegenden Arbeit wurde ein FACS (fluorescence activated cell sorting)-Gerät der Firma Becton Dickinson (Heidelberg) verwendet, welches Zellen analysiert und aufgrund ihrer unterschiedlichen Eigenschaften sortiert.

In dem FACS-Gerät befindet sich ein ständiger Fluß einer Trägerflüssigkeit, in welcher die zu messende Zellsuspension eingebracht wird. Durch die höhere Geschwindigkeit der Trägerflüssigkeit vereinzeln die Zellen und werden auf diese Weise fixiert an einem Laserlicht vorbeigeführt. Der Laser führt zur Exitation der Fluoreszenzfarbstoffe, welche wiederum Fluoreszenzlicht emittieren. Die Fluoreszenz kann durch exprimierte Proteine wie z.B. GFP, angefärbte Zellbestandteile oder markierte Antikörper hervorgerufen werden. Die Zellen können aufgrund ihrer Fluoreszenzeigenschaften, aber auch wegen morphologischer Zellparameter unterschieden werden. Die Vorwärtsstreuung (FSC= forward scatter) wird von der Größe der [Seite 24↓] Zelle bestimmt, während die Seitwärtsstreuung (SCC = side scatter) die Granularität der Zelle bezeichnet (Abb. 3.3). Die Signale werden mittels Photomultiplier verstärkt, von Detektoren gemessen und zur Auswertung auf einen Computer übertragen.

Abb. 4.2: Schematische Darstellung des FACS-Calibur-Gerätes (Beckton-Dickinson) mit der Auflistung der detektierbaren Farbstofftypen. Neben der Messung der Vorwärts- und Seitwärtsstreuung (FSC, SCC) können 4 verschiedene Fluorseszenz-Parameter (FL1-4) detektiert werden.

Für die durchflußzytometrischen Studien von VIP/VPAC1 wurden 105 RIN38(VAC1 )-Zellen pro Well einer 24-Well-Mikrotiterplatte ausgesät und 3 Tage lang in Medium kultiviert. Vor Inkubation mit farbstoffmarkierten VIP-Konjugaten wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen. Die mit Farbstoff markierten Testsubstanzen wurden mit einer Endkonzentration von 150 nM eingesetzt, wobei die Konzentration photometrisch bei der entsprechenden Wellenlänge des jeweiligen Cyaninfarbstoffes und Extinktionskoeffizienten ermittelt wurde.

Die VIP-Derivate wurden 1 h bei 37 ° C in Bindungspuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 5 mM MgCl2 , 1 mM CaCl2 , 100 mM NCl, 0,2 % BSA in aq. bidest ) in Dreifachansätzen mit den Zellen inkubiert. Um überschüssigen Farbstoff zu entfernen, wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurde den Zellansätzen jeweils 100 µl 0,25 % Trypsin in PBS zugefügt und 2 min. auf Eis inkubiert. Die Trypsin-Lösung wurde abgegossen und die Mikrotiterplatten wurden weitere 5 – 10 min. auf Eis stehen gelassen, so daß sich die Zellen lösen konnten. Die Wirkung des Trypsins wurde mit 100 µl 10% FCS in PBS gestoppt. Die [Seite 25↓] Zellsuspensionen wurden in FACS-Röhrchen überführt und 5 min. bei 377 g und 4 ° C zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und die Zellen in eiskalter Cellfix-Lösung (Becton Dickinson, Heidelberg) resuspendiert.

Die Fluoreszenz-Messung erfolgte am FACS-Calibur bei 633 nm mittels eines Helium-Neon-Lasers, wobei die Fluoreszenzdaten mit dem Programm CELL Quest berechnet wurden.

4.5. Radioliganden-Bindungsstudien

Um die Anzahl von Rezeptoren und deren Bindungsverhalten gegenüber Liganden zu bestimmen werden Bindungsstudien durchgeführt. Als Liganden werden radioaktiv markierte Antagonisten verwendet, welche spezifisch an den Rezeptor binden. In der vorliegenden Arbeit wurden alle Bindungsstudien mit 125 I-VIP (Amersham, Braunschweig) durchgeführt. Man unterscheidet zwei Arten von Bindungsstudien: Sättigungsstudien und Kompetitionstudien.

4.5.1. Sättigungsstudien

Sättigungsstudien werden überwiegend zur Bestimmung der Rezeptorkonzentration verwendet. Dabei werden zu einer definierten Menge Rezeptor ansteigende Konzentrationen des Liganden zugefügt. Nach einer Inkubationszeit wird die Reaktion mittels Filtration gestoppt. Der ungebundene Ligand wird ausgewaschen, während der gebundene Ligand auf dem Filter bleibt und im Gammacounter gemessen werden kann.

Man unterscheidet zwischen der spezifischen und unspezifischen Ligandenbindung. Bei der spezifischen Bindung bindet der Ligand ausschließlich an den Rezeptor, während er bei der unspezifischen Bindung auch anderweitig an unspezifische Membranstrukturen bindet. Die unspezifische Bindung folgt einem linearen Verlauf. Zusammen mit der spezifischen Bindung stellt sie die totale Bindung dar (Abb. 4.3).

Totalbindung

spezifische Bindung

unspezifische Bindung


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Abb. 4.3: Darstellung der spezifischen Bindung

In Abbildung 4.3 kann man sehen, daß die unspezifische Bindung dafür verantwortlich ist, daß die totale Bindung keine Sättigung erreicht. Deshalb wird bei weiteren Berechnungen die spezifische Bindung verwendet, welches die experimentelle Bestimmung der unspefizischen Bindung voraussetzt.

Der Scatchard-Plot ist ein Verfahren zur Linearisierung von Bindungsdaten. Er basiert auf dem Verfahren von Eady und Hofstee (Hofstee et al., 1952) aus der Enzymkinetik und dem von Scatchard (Scatchard, 1949) für die Interaktion von Proteinen mit kleinen Molekülen. Dabei gibt man zu einer definierten Menge Rezeptor zunehmende Konzentrationen des Liganden. Im einfachsten Fall unterliegt die Bindung vom Liganden zum Rezeptor dem Bindungsmechanismus I, wobei ein Ligand an einen Rezeptor bindet.

Dem Scatchard-Plot liegt der folgenden Gleichung zugrunde:

 

 

Gl.1

B = Konzentration an sättigbar gebundenem bwz. spezifischem Liganden

B max = maximal erreichbare Konzentration an sättigbar gebundenem Liganden

L = Konzentration des freien Liganden

K D = Dissoziationskonstante des Liganden am Rezeptor

Den Scatchard-Plot erhält man durch die Auftragung der Konzentration des spezifisch gebundenen Liganden (B) am Rezeptor gegen den Quotienten von spezifisch gebundenem und freien Liganden (B/L) (Abb. 4.4).


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Abb. 4.4: Scatchard-Plot zur Bestimmung der maximalen Rezeptorbindungsstellen Bmax und der Dissoziationskonstante KD

Die Neigung der Geraden ergibt den negativen reziproken Wert der Gleichgewichtsdissoziationskonstante (-1/KD ). Der Schnittpunkt der Geraden mit der Abzisse entspricht der Menge an maximalen Rezeptorbindungsstellen.

4.5.2. Kompetitionsstudien

Kompetitionsstudien werden überwiegend zur Klassifizierung von Rezeptorsubtypen und zur Testung von verschiedenen Antagonisten oder Agonisten eingesetzt. Dabei wird eine bestimmte Menge Rezeptor mit einer konstant bleibenden Menge des Radioliganden inkubiert. Der Radioligand wird in demselben Ansatz durch unterschiedliche Konzentrationen von nicht markierten Liganden verdrängt. Wie bei den Sättigungsstudien werden der gebundene und der nichtgebundene Ligand mittels Filtration voneinander getrennt und der gebundene Ligand am Gammacounter gemessen.

Bildet man die Quotienten aus der Bindung (Bi ) und der Totalbindung (B0 ) Bi /B0 und trägt diesen gegen die Konzentration des kompetitierenden Liganden bzw. Inhibitor auf (Abb. 4.5), läßt sich die Konzentration des Inhibitors (IC50 ) ermitteln, bei der 50 % des Liganden am Rezeptor verdrängt wurde.


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Abb. 4.5: Kompetitive Bindungskurve zur Ermittlung der IC50

Mit Hilfe der Dissoziationskonstante des Liganden (KD ) und der IC50 kann man anhand der Cheng-Prusoff-Gleichung (Cheng & Prusoff, 1973)(Gl.2) die Dissoziationskonstante des Inhibitors einfach berechnet werden.

 

 

Gl. 2

IC 50 = Konzentration des Inhibitors, bei der 50 % eines am Rezeptor gebundenen

Liganden verdrängt wird

L = Konzentration des Radioliganden

K D = Dissoziationskonstante des Liganden am Rezeptor

K i = Dissoziationskonstante des Inhibitors am Rezeptor

Die Cheng-Prusoff-Gleichung ist nur bei einfachen Verdrängungsmechanismen anwendbar. Bei komplizierteren Mechanismen, oder wenn der Inhibitor an mehreren Stellen bindet, erhält man mehrere Konstanten, die sich zu einer scheinbaren Ki zusammensetzen.


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4.5.3.  Sättigungs- und Kompetitionsstudien mit 125 I-VIP

Im Bindungstest wurden 105 vorgekühlte RIN38(VAC1 )-Zellen in 200 µl Bindungspuffer (50 mM Tris/HCl, 5 mM MgCl2 , 1 mM CaCl2 100 mM NaCl, 0,2 % BSA, pH 7,7) in MultiScreen-Filtrationsplatten (HV 0,45 µM) (Millipore, Bedford) gegeben. Bei diesen MultiScreen-Filtrationsplatten handelt es sich um 96-Well-Platten, welche am Boden einen Filter haben, wodurch mittels Vakuum Lösungen wie Puffer, Medium etc. von Zellen getrennt werden können. Steigende Konzentrationen 125 I-VIP der Firma Amersham (Braunschweig) wurden zu den Zellen hinzugefügt und in Abwesenheit (Totalbindung) und Anwesenheit (unspezifische Bindung) von 1 µM unmarkiertem VIP inkubiert. Für den Liganden wurde hierbei ein Konzentrationsbereich zwischen 0,05 und 20 nM gewählt. Nach einer Stunde bei 4 ° C wurde bei den jeweiligen Tests der ungebundene Ligand mit Hilfe der MultiScreen Vakuums-Filtration (Millipore, Bedford) von gebundenem Liganden separiert. Die Zellen wurden gewaschen, indem 3 x Bindungspuffer durch die Filtrationsplatten gesaugt wurde. Anschließend wurden MultiScreen-Einwegstempel (Millipore, Bedford) auf die Filtrationsplatten gesetzt und die Filter mit Hilfe der MultiScreen Stanze (Millipore, Bedford) ausgestanzt. Die Filter wurden in geeigneten Röhrchen aufgefangen und im automatischen Gammazähler gemessen. Die Affinität des Liganden (KD ) und die Anzahl der Bindungsstellen (Bmax ) wurden über den Scatchard-Plot mit dem Programm PRISM 3.0 ermittelt.

Im Verdrängungstest wurden 105 vorgekühlte RIN38(VAC1 )-Zellen in 200 µl Bindungspuffer mit 0,1 nM 125 I-VIP in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen der VIP-Derivate für 1 h bei 4 ° C inkubiert. Das Waschen und Ausstanzen der Filter erfolgte wie beim Bindungstest (siehe oben). Die Berechnung der Konzentration des VIP-Derivates, bei der die Bindung des markierten Liganden auf die Hälfte reduziert (IC50 ) wird, und die Dissoziationskonstante des VIP-Derivates (Ki ) wurde über die Cheng-Prusoff-Gleichung mit dem PRISM 3.0-Programm bestimmt.

4.6. Messung der in vitro Stabilität

Für die Untersuchung der Stabilität farbstoffmarkierter Peptide wurde ein in vitro Testsystem etabliert, das eine Inkubation der Verbindungen in einem enzymatischen Cocktail und deren anschließende Analyse mittels HPLC erlaubt. Zur Gewinnung eines geeigneten Inkubationsmediums wurde homogenisierte Rattenleber extrahiert.


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5 g Rattenleber wurden in 0,25 M Sucrose, 5 mM HEPES, 10 mM EDTA mit einem Ultraturrax auf Eis homogenisiert. Anschließend wurde bei 40000 rpm (AF80-Rotor) und 4 ° C zentrifugiert. Der klare Überstand wurde abgenommen und für die Proteinbestimmung mit einem Bio-Rad Protein Assay KIT #1 (Bio-Rad, USA) verwendet. Hierfür wurden mit einem BSA-Standard (Pierce, USA) Standardkonzentrationen zwischen 0,5 und 30 µg BSA hergestellt, welche im Verhältnis 5:1 mit dem Farbreagenz versetzt wurden. Nach fünfminütiger Inkubationszeit bei RT wurden die Proben bei 595 nm am Photometer gemessen und eine Standardeichreihe erstellt. Das Leberextrakt wurde 1:1000 verdünnt, ebenfalls mit Farbreagenz vermischt und photometrisch gemessen. Es konnte eine Proteinkonzentration von 9,12 mg/ml ermittelt werden.

Für die Messung der Stabilität von VIP-Derivaten wurden 125 µM der jeweiligen Derivate in der Leberextraktlösung bei 37 ° C gehalten, zu unterschiedlichen Zeiten 100 µl abgenommen und sofort in Flüssigstickstoff eingefroren. Zur Kontrolle wurden die VIP-Derivate in PBS bei 37 ° C gehalten, ebenfalls 100 µl zu unterschiedlichen Zeiten abgenommen und eingefroren. Die abgenommenen Proben wurden jeweils mit einem linearen Gradienten bei 25 % bis 95 % Methanol in 30 min. mit Hilfe der HPLC analysiert. Der Gehalt der Ausgangssubstanz wurde bestimmt und als prozentualer Anteil im Gesamtgemisch ermittelt.

4.7. Messung der biologischen Aktivität

Die Bindung von VIP an den entsprechenden Rezeptor bewirkt die Aktivierung des Enzyms Adenylatzyklase, welche ihrerseits Adenosintriphosphat in zyklisches Adenosin-3`,5`-monophosphat umwandelt (Laburthe et al. , 1978). Um die biologische Aktivität der synthetisierten Farbstoffkonjugate im Vergleich zu nativem VIP zu überprüfen, wurde die Produktion von cAMP an der Kolonkarzinom-Zelllinie HT-29 gemessen (Muller et al. , 1985). Dabei entspricht eine hohe cAMP-Konzentration einer agonistischen Wirkung, während bei geringer cAMP-Produktion eher von einem antagonistischen Liganden ausgegangen werden kann.

Dabei wurde ein cAMP-Versuchs-System (BiotrakTM cAMP[125 I], Amersham Pharmacia Biotech., USA) verwendet. Es wurden 3 x 104 HT-29-Zellen in 24Well-Platten mit verschiedenen Konzentrationen VIP oder VIP-Derivat als Doppelansätze 15 min. bei 37 ° C in Inkubationsmedium (10 mM IBMX, 68 mM CaCl2 , 25 mM HEPES in RPMI 1640) inkubiert. [Seite 31↓] Anschließend wurden die Zellen mit Ethanol/HCl über Nacht bei -20 ° C extrahiert. Die Ethanolextrakte wurden in FACS-Röhrchen überführt, unter Vakuum konzentriert und in 0,05 M Acetatpuffer aufgenommen. Es folgte die Inkubation mit einer Lösung bestehend aus radioaktiv markierten cAMP (Adenosin-3´,5´-zyklophoshorsäure 2´-O-succinyl-3-[125 I]-iodotyrosinmethyl-ester) und mit Serum, welches Antikörper gegen cAMP enthielt für 3 h bei 4 ° C. Nach Ablauf der Inkubation wurde ein weiteres Serum mit dem Antikörper Amerlex M, welcher an magnetisierbare Polymerpartikel immobilisert war, hizugefügt und 10 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Mittels 10minütiger Zentrifugation bei 1800 g konnte der gebundene von dem ungebundenen Liganden abgetrennt werden. Die Pellets wurden 10 s im Gammacounter gezählt. Eine Standardreihe, bestehend aus cAMP-Standards zwischen 25 fmol und 1600 fmol, diente für die Bestimmung der cAMP-Konzentrationen, wobei bei sämtlichen gemessenen Werten der Quotient B/B0 (B = cAMP-Konzentration bei Stimulation mit entsprechendem Konjugat/ B0 = cAMP-Konzentration ohne Stimulation) verwendet wurde.

4.8. Bildgebende in vivo Charakterisierung

Die Untersuchung von fluoreszenzmarkierten Peptiden im Tiermodell kann wichtige Indizien für das bildgebende Potential dieser Verbindungen liefern. Eine bewährte Methode besteht darin, die Verteilung des Farbstoffes durch Bestrahlung und Beobachtung der Fluoreszenzverteilung in Nacktmäusen mittels einer CCD-Kamera zu verschiedenen Zeitpunkten nach intravenöser Applikation zu verfolgen (Riefke et al., 1996, Becker et al. , 2001).

Für die Tansfektion tumortragender Nacktmäuse wurden RIN38 (VPAC1 )-Zellen subkutan in die rechte Flanke von Mäusen (NMRI nu/nu) injiziert. Um die Autofluoreszenz der Mäuse, welche durch Pheophorbide in dem Standardfutter hervorgerufen werden, wurden die Tiere 10 - 14 Tage vor dem Experiment einer Diät mit Niedrig-Pheophorbid-Futter (C1039, Altromin GmbH, Lage), unterzogen (Dickson et al. , 1995). Nach ca. 14 Tagen, wenn die Tumore ein Größe von ungefähr 3 - 8 mm erreicht hatten, konnten die Tiere für die folgenden Experimente herangezogen werden. Die Mäuse wurden mit Hilfe einer intraperitonealen Injektion von Ketamin: Hydrochlorid (1:1) anästhesiert. Die unterschiedlichen VIP-Derivate wurden mit einer Konzentration von 0,02 µmol/kg intravenös in eine laterale Schwanzvene injiziert. Die Fluoreszenzverteilung der VIP-Farbstoff-Konjugate wurde mittels einer CCD-Kamera zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation gemessen. Die Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe wurde mit Hilfe eines Nd:YAG-[Seite 32↓] Laser (Coherent Inc., USA) durchgeführt. Hierfür wurde eine experimentelle Anlage der Phyikalisch-Technischen Bundesanstalt Berlin (Dr. B. Ebert, Prof. Dr. H. Rinneberg) verwendet.

Die Fluoreszenzaufnahmen wurden mit dem Programm WinView 1.6.2. (Princenton Instruments Inc., USA) bearbeitet.


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22.01.2004