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5.  Ergebnisse

Für die Entwicklung und Charakterisierung stabiler VIP-Analoga wurden folgende Versuchsschritte durchgeführt (Abb. 5.1).

Abb. 5.1: Schematische Darstellung des Versuchsablaufes. Die Zahlen in den Klammern nach den Farbstoffbezeichnungen Cy5 und Cy7 geben die Position des Farbstoffes in der VIP-Sequenz an.


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5.1.  Spotsynthese von farbstoffmarkierten löslichen Peptidliganden

5.1.1. Modifikation der Cellulose

Im Rahmen dieses Projektes sollten abspaltbare Peptidfarbstoffkonjugate für den direkten Einsatz in Zellversuchen mittels Spotsynthese (Frank, 1992) hergestellt werden. Es wurde eine neue Synthesestrategie (Abb. 5.2) (Licha et al. , 2000a) entwickelt, bei der ein orthogonaler Linker zwischen Cellulose und Peptid eingesetzt wurde, welcher die Freisetzung der Konjugate mit Hilfe einer milden basischen Reaktion ermöglichte. Durch die Behandlung der Cellulose mit Epibromhydrin, Perchlorsäure in Dioxan und Diaminopropan wurde eine sog. CAPE-Membran generiert (Volkmer-Engert et al. 1997), welche anschließend mit Mercaptopropionsäure funktionalisiert wurde. Die Mercaptofunktion wurde mit 10 % Cäsiumcarbonat aktiviert und anschließend wurde die erste Aminosäure als Fmoc-aminosäure-Brompropylester gekoppelt.

Abb. 5.2: Schematische Darstellung der Modifikation der Membran


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Üblicherweise wird die Esterbindung zwischen Cellulose und Peptid mittels Aminolyse getrennt, wobei die Cellulosemembran einer Ammoniakatmosphäre im Exsikkator ausgesetzt wird (Volkmer-Engert et al. , 1997). Die Peptidspots werden ausgestanzt und in geeignete Reaktionsgefäße überführt. Anschließend können die Peptide direkt mit Wasser oder Puffer von der Membran gelöst werden und man erhält somit Peptidcarboxamide. Dieses Verfahren sollte hier jedoch nicht verwendet werden, da zum einen die verwendeten Cyaninfarbstoffe in Gegenwart von Ammoniak stark zersetzt wurde, und zum anderen Peptidkonjugate mit authentischen C-Termini erwünscht waren. Die Farbstoffzersetzung bei trockener Amminolyse führte zu rotgefärbten Lösungen bei eigentlich zu erwartender Blaufärbung.

5.1.2. Modellsynthesen

Es wurden zuerst unterschiedliche 5mere Modellsequenzen synthetisiert und N-terminal mit dem Carbocyaninfarbstoff Cy7 verknüpft. Die Peptide wurden als Spots mit einer Größe von 0,25 cm2 auf die merkaptofunktionalisierte Membran pipettiert. Für die Abspaltung der Peptide von der Membran wurden unterschiedliche NaOH-Konzentrationen mit den entsprechenden Äquivalenten der neutralisierenden Säure und verschiedenen Inkubationszeiten untersucht, wobei sich eine NaOH-Konzentration von 0,16 M mit einer Reaktionszeit von 10 min. als günstigste Bedingungen erwiesen.

In Abb. 5.3 sind zwei typische HPLC-Chromatogramme der Verbindung LAILA-Cy7(1) gezeigt. Die Chromatogramme lassen erkennen, daß das Produkt in guter Reinheit erhalten werden konnte. Die Detektion bei 214 nm ließ noch einen ca. 10 %igen Anteil von freien Peptiden erkennen, was auf eine nicht vollständige Beladung mit dem Farbstoff hinweist. Die gewonnene Stoffmenge wurde mittels Photometrie unter Annahme eines Extinktionskoeffiezienten von 150000 l mol-1 cm-1 bei 750 nm bestimmt und betrug für die 5meren Konjugate ca. 30 – 40 nmol.


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Abb. 5.3: HLPC-Chromatogramm des 5meren Peptides mit der Sequenz LAILA mit N-terminal gekoppeltem Cy7 bei 214 nm (oben) und 750 nm (unten).

Die Modellsequenzen dienten außerdem dazu, den Einfluß unterschiedlicher Aminosäuren auf den Farbstoff bzw. die Ausbeute der Peptid-Farbstoffkonjugate zu überprüfen. Hierfür wurde bei dem Modellpeptid die N-terminale Aminosäure jeweils mit den 20 natürlichen genkodierten Aminosäure substituiert und an diese Aminosäure jeweils das Farbstoffmolekül gekoppelt. Die Peptid-Farbstoff-Konjugate wurden nach der Abspaltung von der Membran photometrisch quantifiziert, wobei zwischen den unterschiedlichen Derivaten kaum Unterschiede bezüglich der Quantität festgestellt wurden.

In dem nächsten Schritt wurden Peptide mit einer Länge von bis zu 11 Aminosäuren synthetisiert. Diese Sequenzen stellen Teilsequenzen der nativen VIP-Sequenz dar. In Abb. 5.4 sind die Chromatogramme der analysierten 11meren VIP-Teilsequenz VIP(14-24) dargestellt. Es ist ersichtlich, daß die Einheitlichkeit im Vergleich zu den 5meren Konjugaten verringert ist. Dennoch ist das gewünschte Produkt als eindeutiges Hauptprodukt zu identifizieren.


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Abb. 5.4: HPLC-Chromatogramm des 11meren VIP-Konjugates (14 – 24) mit N-terminal gekoppeltem Cy7 bei 214 nm (oben) und 750 nm (unten).

Wie zu erwarten verringerte sich die Synthesequalität, d.h. der Anteil an Nebenprodukten steigt an mit zunehmender Sequenzlänge des Peptids.

Abb. 5.5 zeigt ein HPLC-Chromatogramm des 28meren VIP, an welches Cy5 an das N-terminale Ende gekoppelt wurde. Es konnte ein Produktpeak von ca. 30 % bestimmt werden. Dieser Peak konnte mittels massenspektrometrischer Analyse als das Peptid mit der zuvor berechneten Masse identifiziert werden.

AU 650nm


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Abb. 5.5: HPLC-Chromatogramm eines 28meren VIP-Derivates mit N-terminal markierten Cy5-Farbstoff bei 650 nm

5.1.3. Kopplungsausbeute der Aminosäure-Brompropylester

Zur Etablierung der Synthesestrategie wurden die Kopplungsausbeuten der S-Alkylierung für jede Aminosäure mit Hilfe der Fmoc-Bestimmung getestet (Abb. 5.6). Brompropylester der kritischen Aminosäuren wie Cystein, Histidin, Asparagin, Glutamin und Arginin wurden als 0,8 M Lösungen vierfach auf die Membran pipettiert, während die anderen Fmoc-Aminosäure-Brompropylester als 0,6 M Lösungen wie üblich doppelt gekoppelt wurden.


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Abb. 5.6: Kopplungsausbeuten der Reaktion der 3-Brompopylester aller 20 natürlichen Aminosäuren mit der mercaptofunktionalisierten CAPE-Membran

Die Darstellung der Kopplungseffizienzen (Abb. 5.6) zeigen, daß sich die verschiedenen Aminosäure-3-Brompropylester auf der CAPE-Membran der meisten Aminosäuren sehr ähnlich verhalten. Die kritischen Aminosäuren werden weniger gut gekoppelt, was aber durch häufigere Kopplungen verbessert werden kann.

5.1.4. Stabilität der Cyaninfarbstoffe unter Spotsynthesebedingungen

Für die Einsetzbarkeit von Carbocyaninfarbstoffen in der Spotsynthese sollte die Stabilität der Farbstoffe in Trifluoressigsäure/Wasser-Gemischen, mit welchen die Cellulosemembrane zur Abspaltung der Schutzgruppen inkubiert werden, untersucht werden. Hierzu wurden 2,5 µM Lösungen des Cy7-Farbstoffes in verschiedenen TFA/Wasser-Gemischen inkubiert und photometrisch vermessen (Abb. 5.7). Die Ergebnisse zeigen, daß die Stabilität des Farbstoffes in einem TFA/Wasser-Gemisch von 95:5 ausreichend ist und es nur zu geringer Abnahme der Farbstoffabsorption kommt. Dagegen ist bei herabgesetztem Anteil an TFA eine merklich verringerte Stabilität zu beobachten. Das zur Abspaltung der Peptidschutzgruppen einzusetzende Gemisch von 95:5 kann somit ohne Bedenken eingesetzt werden.


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Abb. 5.7: Stabilität des Cy7-Farbstoffes in verschiedenen TFA/Wasser-Gemischen

5.1.5. Aktivierung der Farbstoffkopplung

Für die Kopplung des Farbstoffmoleküls an eine Peptidsequenz bei der Spotsynthese wurden verschiedene Aktivierungsreagenzien, kombiniert mit unterschiedlichen Basen, untersucht (Tab 5.1). Cy5 wurde an das N-terminale Ende eines Modellpeptids mit der Sequenz LAILA gekoppelt. Die Kopplungseffizienz wurde über die Farbstoffquantifizierung bei 650 nm und unter Berücksichtigung des molaren Exktinktionskoeffizienten 150000 l/mol –1 berechnet. Hierbei hat sich gezeigt, daß die Veresterung mit DIC/DIPA und EEDQ zu keiner Farbstoffkopplung und die Verwendung DIC/OPfp zu einer sehr geringen Kopplung führte. Die sonstigen Aktivierungsmethoden ergaben ähnliche Kopplungsausbeuten zwischen 68 und 93 nmol pro Spot. In dem weiteren Versuchen wurde das Farbstoffmolekül mit einem Äquivalent TBTU und zwei Äquivalenten DIPA gekoppelt.

Tabelle 5.1: Kopplungseffizienz des Cy5-Farbstoffes an das N-terminale Ende des Modellpeptides LAILA in Abhängigkeit der Aktivierungsmethode

Kopplungsreagenzien

Ausbeute [nmol/Spot]

1 eq TBTU, 2 eq DIPA

72

1 eq HATU, 2 eq DIPA

71

1 eq DIC, 2 eq DIPA

0

1 eq EEDQ

0

1 eq DIC, 1 eq OPfp

7

1 eq TBTU, 1 eq NMI

68

1 eq HATU, 1 eq NMI

93

5.2. Durchflußzytometrie als Screeningmethode für Farbstoff-Peptidkonjugate

5.2.1. Vorversuche

Die aus der Spotsynthese erhaltenen VIP-Konjugate wurden mit Hilfe der Durchflußzytometrie hinsichtlich ihrer Bindung an VPAC1 -überexprimierende Zellen (RIN38) getestet. Aufgrund der vorhandenen Filter des Durchflußzytometers wurde der Carbocyaninfarbstoff Cy5 an die VIP-Derivate gekoppelt. Die Fluoreszenzfarbstoffe Cy5 und Cy7 unterscheiden sich in der Länge der Polymethinkette nur um 2 C-Atome, so daß davon ausgegangen wird, daß die photophysikalischen Eigenschaften annähernd gleich sind. Da der Farbstoff gegenüber dem in der Spotsynthese zur Abspaltung der Fmoc-Gruppen verwendeten Piperidin sehr instabil ist, wurde die Farbstoffkopplung nach Beendigung der Synthese an das N-terminale Ende der Sequenz durchgeführt.

Anfangs wurde überprüft, wie sich die Peptidkonjugate der Spotsynthese im Zellassay hinsichtlich ihrer Zellbindung verhalten. Hierfür wurden VIP-Cy5(1)-Konjugate, die mittels Spotsynthese hergestellt worden waren, mit präparativ hergestellten VIP-Cy5(1)-Konjugaten verglichen. In Abb. 5.8 sind die gemessenen Fluoreszenzintensitäten dargestellt, wobei erkennbar ist, daß die Peptidkonjugate aus der Spotsynthese stark verringerte Bindungen zu den Zellen aufweisen. Im Vergleich zu präparativ hergestellen VIP-Cy5(1)-Derivaten, welche eine [Seite 42↓] Fluoreszenzintensität von ca. 620 erreichen, zeigen VIP-Cy5-Konjugate der Spotsynthese mit einem FL4-Median von ungefähr 120 nur 1/6 der Fluoreszenzintensität. Da dieser Kontrast sehr groß ist, wurde in Abb. 5.6 nicht die absolute Fluoreszenzintensität der präparativ hergestellten VIP-Cy5-Konjugate dargestellt.

Mit Hilfe der Spotsynthese wurden weiterhin verschiedene N-terminal Cy5-markierte VIP-Fragmente synthetisiert und auf Zellbindung getestet. Es ist erkennbar, daß zwischen den Fluoreszenzsintensitäten der Fragmente und dem nativen VIP-Konjugat eine für ein Screening ausreichender Unterschied bestand.

Abb. 5.8: Vergleich von wtVIP-Cy5(1)-Konjugaten, welche präparativ (VIP(p)1-3 und per Spotsynthese VIP (s) hergestellt wurden. Desweiteren wurden VIP-Cy5(1)-Fragemente und ein „scrambled“ VIP-Cy5(1)-Derivat per Spotsynthese synthetisiert und im Durchflußzyometer gemessen.

Als zusätzliche Kontrolle wurde ein „scrambled“ VIP-Cy5 mit einer Zufallssequenz hinsichtlich der Zellbindung untersucht (siehe S. 51). Das „scrambled“ VIP hat eine Aminosäuresequenz mit demselben Aminosäuregehalt wie die Wildtyp-Sequenz. Die Reihenfolge der Aminosäuren wurde jedoch mit dem Programm Lisa 1.571 zufällig bestimmt. Dieses Peptid wurde als Negativkontrolle verwendet und zeigte bei der Untersuchung im Durchflußzytometer eine ausreichend geringe Zellbindung.

Die Ergebnisse des Vorversuches schienen brauchbar genug, um eine Peptidbibliothek zu generieren, welche aus einer Vielzahl unterschiedlicher VIP-Derivate bestand. Hierfür wurde [Seite 43↓] eine Substitutionsanalyse des 28meren VIP durchgeführt, bei der systematisch jede Aminosäureposition der Peptidsequenz durch alle natürlich vorkommenden Aminosäuren ersetzt wurde. Für das VIP ergaben sich somit 560 Derivate, welche parallel auf einer Cellulosemembran (DIN A4) synthetisiert wurden. Von den 560 Derivaten wurden stichprobenartig einzelne VIP-Konjugate mittels HPLC analysiert und mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert. Ein HPLC-Chromatogramm, welches den typischen Reinheitsgrad für ein Peptid dieser Länge aufweist, wurde schon in Abb. 5.5 gezeigt.

Nach Lösen der VIP-Derivate in Phosphatpuffer wurden die gelösten Substanzmengen jeder Peptidlösung unter Annahme eines mittleren molaren Extinktionskoeffizineten von ca. 150000 l mol-1 cm-1 photometrisch bestimmt. Demnach konnten 30 - 40 nmol Substanzgemisch von der Membran gelöst werden.

Für die Untersuchung der VIP-Derivate mittels Durchflußzytometrie wurden verschiedene Konzentrationen der Peptide bis zu 1 µM überprüft. Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung wurden die verschiedenen Konzentrationen der farbstoffmarkierten VIP-Derivate mit 1 µM nicht markiertem VIP verdrängt. Durch Subtraktion der unspezifischen Bindung von der Gesamtbindung wurde die spezifische Bindung berechnet (Abb. 5.9). Bei einer Konzentration von 0,15 µM VIP-Cy5(1) ist der Gegensatz zwischen spezifischer Bindung und unspezifischer Bindung am größten, so daß im weiteren Versuchsverlauf diese Konzentration verwendet wurde.

Abb. 5.9: Darstellung der Konzentrationsabhängigkeit der Bindung an RIN38(VPAC1 ) von VIP-Cy5(1)


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5.2.2.  Substitutionsanalyse von VIP-Cy5(1)

Es wurde eine komplette Substitutionsanalyse des 28meren VIP mit N-terminal gekoppeltem Cy5 durchgeführt. Hierfür wurden 533 VIP-Derivate auf einer N-modifizierten CAPE-Membran synthetisiert, von der Membran abgespalten und bezüglich ihrer Zellbindung und Internalisierung an RIN38(VPAC1 ) mittels Durchflußzytometrie getestet.

In Abbildung 5.10 ist eine schematische Darstellung der Substitutionsanalyse gezeigt. Die einzelnen Kästchen repräsentieren die Fluoreszenzgesamtintensitäten der einzelnen VIP-Cy5-Derivate. Auf der linken Seite sieht man die native Sequenz des VIP vom N-Terminus (oben) zum C-Terminus (unten) und oben stehen die zu substituierenden Aminosäuren. Jedes einzelne Kästchen stellt ein anderes VIP-Derivat dar, das sich in seiner Sequenz um nur eine Aminosäure gegenüber dem Wildtyp unterscheidet. In jeder Reihe tritt ein Wildtyp-Peptid auf, welches insgesamt 28 Wildtyp-Peptide ergibt. Bei der Untersuchung der 28 Wildtyp-Peptide bezüglich ihrer Bindung an RIN38(VPAC1 ) wurde eine Standardabweichung von 11 % berechnet. Diese relativ geringe durchschnittliche Abweichung vom Mittelwert spricht für eine gleichmäßige Synthese auf der Cellulose-Membran. Aufgrund dieser niedrigen Standardabweichung konnten die Werte der Wildtyp-Peptide auf 100 % gesetzt werden und die Werte anderer Derivate prozentual dem Wildtyp angeglichen werden. Die prozentuale Verteilung kann anhand der Graufärbung der einzelnen Kästchen abgelesen werden. Schwarze Kästchen stehen für eine Bindung, die vergleichbar oder stärker wie der des Wildtyp ist, während weiße Kästchen eine Bindung im unspezifischen Bereich, also keine tatsächliche Bindung, bedeuten. Graue Kästchen repräsentieren ein Bindungsverhalten zwischen unspezifischer und starker Bindung; je dunkler der Grauton, desto stärker die Bindung zu RIN38(VPAC1 ).

Abb. 5.10: Vollständige Substitutionsanalyse von VIP-Cy5(1). Die Grauabstufungen der einzelnen Kästchen stehen für die relative Bindungsstärke der Peptidkonjugate (siehe kleinen Kasten) zu RIN38(VPAC1 ) gegenüber der nativen markierten VIP-Derivat (= 100%).


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Die Substitutionsanalyse kann auf zweierlei Wegen betrachtet werden. Zum einen können einzelne Aminosäurepositionen begutachtet werden, zum anderen können die einzelnen Substituenten und deren Auswirkungen auf das Bindungsverhalten untersucht werden. Analysiert man einzelne Aminosäurepositionen, so fällt auf, daß es Reihen gibt wie zum Beispiel bei Position 8 oder 9, welche fast ausschließlich schwarze Kästchen aufweisen. Bei diesen Positionen ist die Substitution mit fast allen Aminosäuren möglich. In anderen Reihen dagegen, wie z. B. bei Position 22 oder 23, findet man viele weiße Kästchen. Diese Positionen reagieren sehr empfindlich gegenüber Substitutionen und sind für die Bindung zu RIN38(VPAC1 ) von größerer Bedeutung. Leucin bei der Position 23 kann sogar durch keine andere Aminosäure ersetzt werden, so daß man annehmen kann, daß diese Position für die Bindung essentiell ist.

Andere Aminosäurepositionen können nur mit Aminosäuren substituiert werden, welche die gleichen physikochemischen Eigenschaften besitzen. Die Aminosäure Tyrosin z. B. kann in Position 22 nur durch aromatische Aminosäuren wie Phenylalanin und Tryptophan ersetzt werden, um ähnliche Bindungsstärken wie das Wildtyp-Peptid zu bewirken. Valin in Position 19 kann nur mit aliphatischen Aminosäuren wie Alanin, Isoleucin und Leucin ausgetauscht werden. Die positiv geladene Aminosäure Lysin in Position 20 kann vorzugsweise mit der positiv geladenen Aminosäure Arginin substituiert werden. Es gibt allerdings auch Austauschmöglichkeiten, die nicht einfach zu erklären sind. So kann z. B. das Isoleucin in Position 26 sowohl mit Serin als auch mit Tryptophan substituiert werden.

Bei der Untersuchung einzelner Substituenten fällt auf, daß die negativ geladenen Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure bis auf Position 3 und 8 nicht in der VIP-Sequenz toleriert werden. Im Gegensatz dazu ist die Substitution mit positiv geladenen Aminosäuren sehr oft erlaubt. Die Aminosäure Prolin zeigt eine deutliche Reduzierung der Bindung bei sämtlichen Positionen der VIP-Sequenz.

Mit Hilfe der Ergebnisse der Subsitutionsanalyse wurde ein sogenanntes VIP-Supermotiv (Abb.5.11) erstellt, welches ein vereinfachtes Bindungsmotiv von VIP darstellt. Aminosäurepositionen, bei denen mit mehr als 4 Aminosäuren substituiert werden konnten, wurden mit „X“ gekennzeichnet. Die Aminosäure Cystein wurde bei der Erstellung des Supermotives nicht berücksichtigt (siehe Diskussion).


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Abb. 5.11: Schematische Darstellung des VIP-Supermotivs mit den stärksten Schlüsselaminosäuren (rot), X-Positionen (schwarz) und den restlichen Aminosäuren (blau).

Für die Verifizierung der Ergebnisse der Substitutionsanalyse wurden 30 verschiedene VIP-Derivate im präparativen Maßstab synthetisiert, N-terminal mit Cy5 markiert und mittels Durchflußzytometrie analysiert (Abb. 5.12).

Abb. 5.12: FACS-Analyse ausgewählter N-terminal mit Cy5 markierter VIP-Derivate aus der Subsitutionsanalyse, welche in präparativem Maßstab nachsynthetisiert wurden.


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5.2.3.  Farbstoff-Walk

Für die Bestimmung der optimalen Position des Carbocyaninfarbstoffes wurde unter Verwendung der Spotsynthese jede Position der VIP-Sequenz mit Lysin(Mmt) substitutiert. Die Mmt-Gruppe konnte selektiv vor Abspaltung der restlichen Schutzgruppen entfernt werden, so daß an die ε -Aminogruppe des Lysins das Farbstoffmolekül gekoppelt werden konnte. Die Peptidderivate wurden von der Cellulose gelöst und ebenfalls mittels Durchflußzytometrie analysiert (Abb. 5.13).

Abb. 5.13: Darstellung der Zellbindung von VIP-Derivaten, wobei an den Positionen 1-28 der Farbstoff Cy5 über ein Lysin gekoppelt wurde.

Die Darstellung des Farbstoff-Walks zeigt, daß die Substitution mit Lysin-Cy5 im N-terminalen Bereich des VIP-Moleküls, vor allem bei den Positionen 1 - 4 und 6 – 7, zu sehr niedrigen Bindungen führte. Auch im C-terminalen Bereich führte die Farbstoffkopplung (Position 26 und 27) zu geringeren Fluoreszenzintensitäten. Die Positionen 5, 8, 9 und 16 scheinen für die Positionierung des Farbstoffes am besten geeignet zu sein. Wenn nicht anders erklärt, wird die [Seite 49↓] Farbstoffposition bei der Bezeichnung der Konjugate in Klammern hinter dem Farbstoffnamen gestellt.

5.2.4. Varation der Farbstoffposition beim wtVIP und [Arg8 ]-VIP

Der Farbstoff-Walk hat gezeigt, daß die N-terminale Position die für die Kopplung ungünstigste Position der VIP-Sequenz ist, während die Positionen 5, 8, 9 und 16 besser für diesen Zweck geeignet sind. Aus diesem Grund wurden VIP-Derivate mit den verschiedenen Farbstoffpositionen im präparativen Maßstab nachsynthetisiert und mittels Durchflußzytometrie hinsichtlich ihrer Bindungseigenschaften überprüft (Abb. 5.14). In den weiteren Untersuchungen wurde mit dem Analogon [Arg8 ]-VIP gearbeitet. Dieses Derivat wurde ausgewählt, um zu demonstrieren, daß die Position 8 der VIP-Sequenz weder für die Funktion noch die Struktur relevant ist (siehe Diskussion). Auch hier wurde die Position des Farbstoffmoleküls variiert und ebenfalls in FACS-Untersuchungen gemessen (Abb. 5.14).

Abb. 5.14: Untersuchung der Zellbindung an RIN38(VPAC1 ) von wtVIP (links) und [Arg8 ]-VIP mit variierten Positionen des Cy5-Farbstoffes. Als Kontrolle wurde N-terminal Cy5-markiertes scrVIP eingesetzt.

Mit Hilfe dieser Messung konnte bestätigt werden, daß die Positionen 5, 8 und 16 eine höhere Zellbindung induzieren als N-terminal markiertes VIP. Bei dem [Arg8 ]-VIP-Derivat wurde der Farbstoff anstatt an Position 8 an Position 9 gekoppelt. Für die Bindungseffizienz ergaben sich ähnliche Ergebnisse wie bei dem Wildtyp-Peptid.


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5.2.5.  Durchflußzytometrische Bestimmung ausgewählter VIP-Cy5-Konjugate

Bei der Untersuchung der VIP-Cy5-Derivate der Substitutionsanalyse auf Zellbindung an RIN38(VPAC1 ) konnte gezeigt werden, daß die Substitutionen mit Arginin und Tryptophan zu einer merklich höheren Zellfluoreszenz führten. Aus diesem Grund wurden diese Substitutionen in verschiedener Art und Weise kombiniert und erneut ihr Bindungsverhalten mittels Durchflußzytometrie gemessen. Die Position des Farbstoffes wurde hier nicht verändert, sondern war bei jedem Derivat am N-Terminus. In Abb. 5.15 sind die Ergebnisse im Vergleich zum Wildtyp-Peptid und zu einfach substituierten Derivaten gezeigt. Sämtliche Konstrukte zeigten in der Kombination eine gegenüber dem nativen Peptid erhöhte Zellbindung, wobei insbesondere Trp2 mit Arg11 und Arg8 zu einem ca. 8 – 10 fach erhöhten Signal führte.

Abb. 5.15: Durchflußzytometrische Analyse von N-terminal mit Cy5 markierten VIP-Derivaten mit Kombinationen verschiedener Substitutionen

Weiterhin wurde die gesamte VIP-Sequenz verändert, indem das Peptid vollständig mit D-Aminosäuren synthetisiert wurde. Die Sequenz wurde ebenfalls in umgekehrter Reihenfolge und mit L-Aminosäuren hergestellt. Diese Peptide wurden im Zellassay mit RIN38(VPAC1 ) inkubiert, welche jedoch zu keiner nennenswerten Bindung an diese Zellen geführt hat (Abb. 5.16).


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Abb. 5.16: Durchflußzytometrische Analyse von verschiedenen N-Terminal mit Cy5 markierten VIP-Derivaten

5.3.  In vitro Charakterisierung

Für die quantitative Bestimmung der Rezeptoraffinität verschiedener VIP-Derivate wurden Verdrängungsstudien mit radioaktiv markiertem VIP durchgeführt. Bei diesem Assay wurden die Rezeptor-tragenden Zellen mit dem Radioliganden, in diesem Fall 125 I-VIP, und nicht radioaktiv markiertem VIP bzw. VIP-Derivat inkubiert. Nach der Inkubation mußte der nicht gebundene Ligand von dem gebundenen Liganden getrennt werden. In Vorversuchen wurde hierfür mit silikonisierten Eppendorfgefäßen gearbeitet, wobei die Trennung von gebundenen und ungebundenen Liganden mittels Zentrifugation und Abpipettieren des Überstandes erfolgte. Bei dieser Methode wurde jedoch festgestellt, daß 125 I-VIP stark an der Gefäßwand haftete und somit die Auswertung der Ergebnisse bedeutend negativ beeinflußte. Die Verwendung von Multi-Screen-Platten schien für diesen Versuch besser geeignet, da nicht nur die Handhabung entscheidend vereinfacht wurde, sondern auch zwischen speziellen Filtern mit unterschiedlichen Proteinabsorptionseigenschaften gewählt werden konnte. Es wurden Multi-Screen-Platten mit verschiedenen Filtertypen bestehend aus Glasfasern, Nitrocellulose und PVDF-Membranen getestet. Die PVDF-Membran mit einer Porengröße von 0,45 µm haben sich als die Filter herausgestellt, welche radioaktiv markiertes VIP am wenigsten gebunden hatte. Aus diesem Grund wurden dieser Membrantyp im weiteren Versuchsen verwendet.


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5.3.1.  Sättigungsstudien

Als Referenz für den Vergleich verschiedener VIP-Derivate wurde zuerst das Sättigungsverhalten des radioaktiv markierten VIP und dessen unspezifische Bindung studiert. Hierfür wurden steigende Konzentrationen das Radioliganden in Abwesenheit (Totalbindung) und Anwesenheit (unspezifische Bindung) von 1 µM VIP inkubiert. Die spezifische Bindung wurde durch Subtraktion der unspezifischen Bindung von der Totalbindung ermittelt. In Abb. 5.17 sind die Ergebnisse der Sättigungsstudie von 125 I-VIP dargestellt. Unter Verwendung des Programms PRISM 3.0 wurde über einen Scatchard-Plot eine kD von 2,6 nM und die maximale Anzahl der Bindungstellen Bmax von 181300 berechnet.

Abb. 5.17: Darstellung der Sättigungstudie von 125 I-VIP in dem Konzentrationsbereich zwischen 0,05 und 20 nM

5.3.2. Kompetitionsstudien

In einem Kompetitionstest wurde die Konzentration von 125 I-VIP bei 0,1 nmol konstant gehalten und mit mehreren unterschiedlichen Konzentrationen nicht markiertem VIP inkubiert. Die gemessenen „Counts“ wurden über dem Logarithmus der Konzentration des nicht markierten VIP aufgetragen (Abb. 5.18).


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Abb. 5.18: Kompetitionskurve von 125 I-VIP mit verschiedenen Konzentrationen an nicht markiertem VIP

Für die Kompetition mit nicht markiertem VIP konnte eine IC50 von 3,34 nM und eine ki von 2,8 nM ermittelt werden.

Weiterhin wurden 3 N-terminal mit Cy5 markierte VIP-Derivate, welche bei der Untersuchung mittels Durchflußzytometrie eine hohe Bindung zeigten, auf Kompetitionsvermögen gegenüber 125 I-VIP untersucht und mit dem nativen N-terminal markierten VIP-Derivat verglichen (Tab. 5.2).

Tabelle 5.2: Vergleich von verschiedenen VIP-Derivaten mit N-terminal gekoppelten Cy5

VIP-Derivat

IC50 [nm]

ki [nm]

wt VIP

4206

4006

[Trp2]-VIP

2428

2330

[Arg8]-VIP

240

229

[Arg11 ]-VIP

178

171

[Arg16 ]-VIP

154

147


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Das N-terminal markierte Wildtyp-VIP-Derivat zeigte eindeutig die niedrigste Affinität zu RIN38(VPAC1 ). Die Substitution von Ser2 mit Tryptophan bewirkte eine Affinitätssteigerung um ca. 40 %. Die Substitution verschiedener Positionen mit Arginin steigerte die Affinität bei [Arg8 ]-VIP um das ca. 17fache und bis hin zu [Arg16 ]-VIP, welches sogar eine 27fach höhere Affinität als das native VIP-Cy5-Konjugat aufweist.

Als Kontrolle wurde das „scrambled“ VIP-Derivat eingesetzt, welches jedoch bei einer Konzentration von 1 µM keinerlei Verdrängung des radioaktiv markierten VIP aufgwies.

In weiteren Tests wurden VIP-Derivate untersucht, welche an verschiedenen Aminosäurepositionen mit Cy5 markiert wurden. Hierbei wurde das native VIP und das VIP-Analogon [Arg8 ]-VIP mit unterschiedlichen Positionen von Cy5 verglichen (Tab. 5.3). In Abb. 5.19 sind beispielhaft zwei Kompetitionskurven gezeigt.

Abb. 5.19: Verdrängung von 0,1 nM 125 I-VIP mit verschiedenen Konzentrationen VIP-Cy5(16). Links sind die „counts per minute“ über der Peptidkonzentration und rechts das Verhältnis Bi /B0 über dem Logarithmus der Peptidkonzentration aufgetragen.

Tabelle 4 .3: IC50 - und ki -Werte verschiedener VIP-Cy5-Derivate

Farbstoff-Position

IC 50 [nM]

wt-VIP

k i [nM]

wt-VIP

IC 50 [nM]

[Arg 8 ]-VIP

k i [nM]

[Arg 8 ]-VIP

1

4206

4006

240

229

5

247

235

204

194

16

45

42

104

99

Die N-terminale Farbstoffpostition konnte bei dem [Arg8 ]-VIP-Konjugat, vor allem aber bei dem nativen VIP-Derivat, als die am wenigsten optimale Farbstoffposition bestimmt werden. Wie schon vorher erwähnt, konnte die unspezifische Bindung des N-terminal markierten nativen VIP-Derivat durch die Substitution von Asn8 durch Arginin entscheidend erhöht werden. Auch bei der Markierung an Position 5 zeigte das [Arg8 -VIP]-Konjugat gegenüber dem nativen VIP-Derivat eine leicht höhere Afinität zu RIN38(VPAC1 ). Die Position 16 ist bei beiden getesteten Derivaten für die Kopplung des Farbstoffmoleküls am besten geeignet. Allerdings wurde bei dem nativen VIP-Derivat eine mehr als doppelt so hohe Affinität gemessen als bei dem [Arg8 -VIP]-Konjugat.

Im folgenden sind die Sequenzen sämtlicher VIP-Derivate aufgelistet, welche im kompetitiven Verdrängungsassay getestet wurden. Die Farbstoffmarkierung erfolgte am N-terminalen Ende der Sequenz, der Wildtyp-Peptid und das [Arg8 ]-VIP-Konjugat wurden zusätzlich jeweils an den Positionen 5 und 16 markiert.

wt VIP

H

S

D

A

V

F

T

D

N

Y

T

R

L

R

K

Q

M

A

V

K

K

Y

L

N

S

I

L

N

[Trp2]-VIP

H

W

D

A

V

F

T

D

N

Y

T

R

L

R

K

Q

M

A

V

K

K

Y

L

N

S

I

L

N

[Arg8]-VIP

H

W

D

A

V

F

T

R

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Y

T

R

L

R

K

Q

M

A

V

K

K

Y

L

N

S

I

L

N

[Arg11]-VIP

H

W

D

A

V

F

T

D

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Y

R

R

L

R

K

Q

M

A

V

K

K

Y

L

N

S

I

L

N

[Arg16]-VIP

H

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D

A

V

F

T

D

N

Y

T

R

L

R

K

R

M

A

V

K

K

Y

L

N

S

I

L

N

scr VIP

L

N

T

V

N

L

T

K

V

Q

D

A

H

S

N

I

l

R

R

D

S

F

A

Y

Y

M

K

K


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5.4.  Biologische Aktivität nach Stimulation mit VIP-Cy5-Derivaten

Für die Bestimmung der biologischen Aktivität der VIP-Farbstoff-Konjugate wurde die cAMP-Produktion von HT29-Zellen bestimmt. Hierfür wurde eine Standardeichreihe mit 125 I markierten cAMP-Standards erstellt (Abb. 5.20).

Abb. 5.20: cAMP-Standardkurve für die Bestimmung der cAMP-Produktion von HT-29-Zellen zwischen 25 – 1600 fmol

Der cAMP-Assay hat gezeigt, daß die VIP-Farbstoffkonjugate die Produktion von cAMP in HT29-Zellen induziert (Abb. 5.21). Bei nicht markiertem VIP ist schon bei der Stimulation mit der niedrigsten Peptidkonzentration eine sehr hohe cAMP-Produktion zu beobachten, welche mit zunehmender Konzentration stark anstieg. Bei der höchsten eingesetzten VIP-Konzentration ist der cAMP-Gehalt ca. 30 mal so hoch wie bei dem durch die Cy5-markierten VIP-Derivate produzierte cAMP. Bei den VIP-Cy5-Konjugaten scheint die Kopplung des Farbstoffes an die Position 16 einen positiven Einfluß auf die cAMP-Produktion zu haben. N-terminal markiertes natives VIP hatte eine kaum merkliche Induktion der cAMP-Produktion zur Folge, während an Position 16 markiertes natives VIP- und [Arg8 ]-VIP-Derivat die höchste cAMP-Produktion aufwiesen.


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Abb. 5.21: cAMP-Produktion von HT29-Zellen nach Inkubation mit nicht markiertem VIP und unterschiedlichen VIP-Cy5-Konjugaten

5.5. Metabolische Stabilität in Rattenleberextrakt

Für die Untersuchung der Stabilität der VIP-Derivate wurde ein In vitro -Testsystem etabliert, welches die Inkubation der Substanzen in einem enzymatischen Cocktail mit anschließender HPLC-Analyse erlaubt. Zur Gewinnung eines solchen Enzymgemisches wurde homogenisierte Rattenleber extrahiert und mit Hilfe einer BSA-Standardeichkurve (Abb. 5.22) die Proteinkonzentration des Extraktes bestimmt.

Abb. 5.22: Standardeichreihe zur Bestimmung des Proteingehaltes von Leberextrakt mit einer BSA-Standardkonzentration zwischen 0,5 und 20 µg

Tabelle 5.4: Photometrische Bestimmung des Proteingehaltes in Rattenleberhomogenat

Verdünnung

OD bei

595 nm

Protein [µg]

Protein in Ausgangslsg.

[mg/ml]

1:1000

0,432

7,873

9,84

1:1000

0,364

6,623

8,28

1:1000

0,390

7,101

8,88

1:1000

0,417

7,597

9,50

Es konnte ein Leberextrakt mit einer Konzentration von ca. 9 mg/ml gewonnen werden, in welcher die VIP-Farbstoff-Konjugate mit einer Konzentration von 125 µM bei 37 ° C inkubiert wurden. Zu unterschiedlichen Zeiten wurden Proben entnommen und sofort eingefroren. Später wurden diese Proben aufgetaut und mittels HPLC analysiert. Abb. 5.23 zeigt beispielhaft ein HPLC-Diagramm eines VIP-Derivates zu 3 unterschiedlichen Zeitpunkten.

Abb. 5.23: Proteolytischer Abbau eines fluoreszenzmarkierten VIP-Konjugates in Rattenleberhomogenat am Beispiel von VIP-Cy5[1]. Dargestellt sind HPLC-Chromatogramme, welche bei 650 nm ermittelt wurden.


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Der Gehalt an Ausgangssubstanz wurde bestimmt und als prozentualer Anteil im Gesamtgemisch über der Inkubationszeit aufgetragen. Als Zersetzungsprodukte wurden eine Vielzahl von Verbindungen mittels HPLC identifiziert, wodurch der genaue Peak des Ausgangsproduktes oft schwer zu verfolgen war.

Abb. 5.24: Stabilität der Wildtyp-VIP-Konjugate mit unterschiedlichen Positionen des Cy5-Farbstoffes in Abhängigkeit von der Inkubationszeit

Abb. 5.25: Stabilität des [Arg8 ]-VIP-Analogon mit unterschiedlichen Positionen des Cy5-Farbstoffes in Abhängigkeit von der Inkubationszeit


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Es konnte gezeigt werden, daß in enzymatisch aktivem Medium eine Degradation der Konjugate erfolgt. Abb. 5.24 zeigt den Degradationsverlauf von Wildtyp-VIP-Derivaten mit unterschiedlichen Farbstoffpositionen. Die HPLC-Diagramme des VIP-Cy5(8) waren für eine vernünftige Auswertung ungeeignet und werden deshalb hier nicht gezeigt. VIP-Cy5(5) wurde am schnellsten proteolytisch abgebaut, während VIP-Cy5(1) und VIP-Cy5(16) eine leicht höhere Stabilität in Rattenleberextrakt aufwiesen. Mit Hilfe der Substitution von Asn8 gegen Arginin konnte die Stabilität der VIP-Cy5-Derivate erhöht werden. Alle Peptide zeigten gegenüber den Wildtyp-Peptiden eine höhere Stabilität in Rattenleberextrakt, wobei die Kopplung von Cy5 an Position 5 des gekoppelten Farbstoffmoleküls erneut die schnellste Degradation aller hier untersuchten Derivate bewirkte. In Abbildung 5.25 ist der Vergleich der Wildtyp-Derivate und dem [Arg8 ]-VIP-Analogon dargestellt, welche zum einen N-terminal mit Cy5 und zum anderen an Position 16 farbstoffmarkiert waren.

Abb. 5.26:Metabolische Stabilität des Wildtyp-VIP- und [Arg8 ]-VIP-Konjugates mit jeweils N-terminal und an Position 16 markiertem Cy5-Farbstoff im Inkubationszeitraum von 4 h

Bei dem Vergleich des Wildtyp-VIP- und [Arg8 ]-VIP-Konjugates (Abb. 5.26) erkennt man deutlich den Stabilitätsgewinn, der mit der Substitution an Position 8 erreicht worden ist. Während 50% des N-terminal markierten Wildtyp-VIP-Konjugates schon nach ca. 20 min. abgebaut wurden, sind 50% des gleichartig markierten [Arg8 ]-VIP-Derivates noch nach 4 h vorhanden. Die Farbstoffposition 16 zeigte gegenüber der N-terminalen Verknüpfung keine bedeutenden Vorteile hinsichtlich der Stabilität.


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5.6.  In vivo Imaging

Da das [Arg8 ]-VIP-Analogon im Stabilitätsversuch in Rattenleberextrakt eine höhere Stabilität gegenüber proteolytischer Degradation gezeigt hat, sollte dieses Konjugat weiterhin im Tierversuch mit tumortragenden Nacktmäusen untersucht werden. Als Kontrolle wurden natives und „scrambled“ VIP-Derivate herangezogen. Der Fluoreszenzfarbstoff Cy7 weist gegenüber Cy5 eine höhere Eindringtiefe ins Gewebe auf, so daß für die Tierversuche Cy7 an das N-terminale Ende der Konjugate gekoppelt wurde. Den Mäusen wurden RIN38(VPAC1 )-Zellen in die rechte abdominale Flanke inokuliert. Um eine Autofluoreszenz der Versuchstiere zu vermeiden, wurden die Mäuse mit Niedrig-Pheophorbidfutter gefüttert. Nach ca. 10 Tagen hatten die Tumore die gewünschte Größe (Tab. 5.5) erreicht und konnten für den Imagingversuch eingesetzt werden.

Tabelle 5.5: Bestimmung von Gewicht der Mäuse und deren Tumorgröße für die Untersuchung von N-terminal markierten VIP-Cy7-Konjugaten

Tier Nr.

Substanz

Gewicht [g]

Ø Tumorgröße [cm]

1

wt VIP

25,1

0,25 x 0,25

2

wt VIP

29,3

0,3 x 0,3

3

wt VIP

28,5

0,2 x 0,2

4

wt VIP

25,5

0,2 x 0,2

5

[Arg8]-VIP

28,9

0,3 x 0,3

6

[Arg8]-VIP

25,7

0,16 x 0,2

7

[Arg8]-VIP

26,8

0,2 x 0,2

8

[Arg8]-VIP

28,1

0,2 x 0,15

9

scr VIP

25,2

0,33 x 0,35

10

scr VIP

27,4

0,2 x 0,2

11

scr VIP

25,2

0,2 x 0,25

12

scr VIP

27,9

0,25 x 0,12

Abb. 5.27: Nacktmaus mit inokulierten VPAC1 -überexprimierenden Tumor in der rechten VIP-Cy7-Konjugaten abdominalen Flanke


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Abb. 5.28: In vivo Fluoreszenzbildgebung nach Applikation des Derivates VIP-Cy5(1)


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Abb. 5.29: In vivo Fluoreszenzbildgebung nach Applikation des Derivates [Arg8 ]-VIP-Cy5(1)


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Abb. 5.30: In vivo Fluoreszenzbildgebung nach Applikation der Negativkontrolle scr-VIP-Cy5(1)


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Damit die Tiere sich bei den Fluoreszenzaufnahmen nicht bewegen konnten, wurden sie direkt vor dem Versuch narkotisiert, um so verwackelte Bilder zu vermeiden. Den Mäusen wurden die VIP-Derivate mit einer Dosis von 0,02 µmol/kg Köpergewicht in die Schwanzvene injiziert. Es wurden Fluoreszenzaufnahmen vor Applikation und zu unterschiedlichen Zeitpunkten bis zu 24 h nach Applikation der Substanzen gemacht.

Die Abbildungen 5.28, 5.29 und 5.30 zeigen die vollständigen Zeitverläufe der drei verschiedenen applizierten VIP-Konjugate am Beispiel von jeweils einem Tier.

Die in vivo Imaging-Bilder der Mäuse, denen wtVIP-Cy7(1) injiziert wurde, zeigten eine Anreicherung des markierten Peptids im Tumor. Das Peptid wird sehr schnell im Tumor akkumuliert und man kann eine klare Abgrenzung zum Normalgewebe erkennen. Bei der Applikation von [Arg8 ]-VIP-Cy7(1) kann man ebenfalls einen starken Tumorkontrast beobachten, welcher auch längere Zeit nach Applikation anhält. Im Gegensatz zum wtVIP-Cy7(1) und [Arg8 ]-VIP-Cy7(1) zeigt scrVIP-Cy7(1) ein unspezifisches Fluoreszenzsignal im Körper der Maus. Der Tumor wurde jedoch nicht markiert. Bei allen Tieren kann man ein Fluoreszenzsignal in den Lungen, im Bauchraum vor allem in den Nieren sehen.

Um die verschiedenen gemessenen Substanzen im Tiermodell zu vergleichen, wurden die Fluoreszenzaufnahmen der Mäuse wie bei den Abbildungen 5.28 - 5.30 mit Hilfe des WinSpec1.6.2-Programms normiert. Einen eindeutigeren Vergleich erhält man jedoch, wenn man die Kontraste berechnet, die sich aus den Fluoreszenzsignalen des Tumors auf der rechten Flanke der Maus und den Fluoreszenzsignalen des Normalgewebes auf der kontralateralen Seite ermitteln lassen. Die Konstrastverläufe der jeweiligen Substanzen sind im folgenden gezeigt.

Abb. 5.31: Kontrastverläufe von wt VIP-Cy7(1) in n = 4 Mäusen in Abhängigkeit von der Zeit


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Abb. 5.32: Kontrastverläufe von [Arg8 ]-VIP-Cy7(1) in n = 4 Mäusen in Abhängigkeit von der Zeit

Abb. 5.33: Kontrastverläufe von scr VIP-Cy7(1) in n = 4 Mäusen in Abhängigkeit von der Zeit

Die Kontrastverläufe demonstrieren, daß bei den unterschiedlichen untersuchten VIP-Derivaten starke Abweichungen innerhalb der Versuchsgruppen zustande gekommen sind. Zum Teil weichen die Tiere, welche dasselbe Präparat injiziert bekommen haben, stark voneinander ab. Bei den Tieren 1 – 4, denen wtVIP-Cy7(1) verabreicht wurde, kann man erkennen, daß alle Tiere einen sehr ähnlichen Kontrastverlauf haben, wobei bei dem Tier 1 der Verlauf insgesamt [Seite 67↓] wesentlich höher ist. Das Maximum der Fluoreszenzsignale ist bei 5 min. erreicht, danach nimmt die Intensität der Fluoreszenz wieder ab. Bei der Applikation von [Arg8 ]-Cy7(1) ist auffällig, daß die 4 Tiere sich in zwei Gruppen teilen. Tier 5 und 6 zeigen einen ähnlich hohen Kontrastverlauf, während Tier 7 und 8 einen niedrigeren Verlauf aufweisen, der sich jedoch auch wieder stark ähnelt. Allgemein kann man sagen, daß die Anflutung des Peptids in den Tumoren im Gegensatz zum Wildtyp-VIP-Cy7(1) wesentlich langsamer und im höheren Bereich verläuft. Die Berechnung des Kontrastes von Tier 7 zum Zeitpunkt 30 min. nach Applikation war nicht durchführbar, da das Tier offensichtlich nicht ausreichend narkotisiert war und sich während der Aufnahme bewegt hat. Eine Aufnahme von Tier 5 nach 24 h war nicht möglich, da das Tier zu diesem Zeitpunkt bereits tot war. Bei den Tieren, die das scrVIP-Cy7(1)-Derivat verabreicht bekommen haben, ist kaum eine ähnliche Tendenz der Kontrastverläufe festzustellen, außer daß die Fluoreszenzintensitäten im Gegensatz zu den beiden anderen VIP-Konjugaten wesentlich niedriger sind.

Die starke Abweichung, die unter den Tieren auftritt, hängt mit den Tumoren zusammen. Je nachdem, in welchem nekrotischen Stadium sich der Tumor befindet und auch die Versorgung mit Blutgefäßen gewährleistet ist, können die Peptidliganden zum Tumor gelangen. Diese Parameter konnten im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht untersucht werden, so daß für einen direkten Vergleich der Kontrastverläufe der unterschiedlichen Tiere einfach der Mittelwert der Fluoreszenzintensitäten der jeweiligen Substanzgruppen gebildet wurde (Abb. 5.34).

Abb. 5.34: Vergleich der Kontrastverläufe von wtVIP-Cy7(1), [Arg8 ]-VIP-Cy7(1) und scrVIP-Cy7(1). Es ist jeweils der Mittelwert von 4 Tieren dargestellt.


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Beim direkten Vergleich kann man deutlich erkennen, daß die Kurve des scr VIP-Cy7(1) niedrigere Fluoreszenzkontraste erzeugt als wt VIP-Cy7(1) und [Arg8 ]-VIP-Cy7(1). Bei wt VIP-Cy7(1) reicherte sich der Ligand schnell im Tumor an, wobei das Maximum bei 5 min. nach Applikation erreicht ist. Danach nimmt der Kontrast kontinuierlich ab. Das [Arg8 ]-VIP-Cy7(1)-Analogon akkumuliert langsamer im Tumor und erreicht erst bei 30 min. nach Verabreichung das Maximum, welches eindeutig höher ist als das mit dem wt VIP-Cy7(1) erreichte Maximum. Nach 30 min. allerdings nimmt die Fluoreszenzintensität von [Arg8 ]-VIP-Cy7(1) stark ab.


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22.01.2004