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6.  Diskussion

In dieser Arbeit sollte untersucht werden, welche Aminosäurepositionen der VIP-Sequenz für die Rezeptor-Bindung an VPAC1 essentiell sind, welche Aminosäurepositionen für diese Bindung nicht relevant sind und so hinsichtlich der Stabilisierung des Liganden modifiziert werden können. Die Stabilisierung von VIP ist für den Einsatz in der Tumordiagnostik nötig, wobei die Visualisierung des Peptids über einen kovalent gekoppelten Fluoreszenzfarbstoff erfolgen sollte.

Hierfür wurde eine Synthese-Strategie entwickelt, bei welcher die VIP-Derivate unter Erhalt des Fluoreszenzfarbstoffes nach Beendigung der Synthese unter milden Bedingungen von der Membran abgespalten wurden (Licha et al. , 2000a). Diese Methode erlaubt die Herstellung von Peptiden in ausreichender Reinheit und Menge. Auch bei der Synthese längerer Sequenzen wie bei dem 28meren VIP waren diese Kriterien hinreichend. Chadker & Rattan haben gezeigt, daß die vollständige 28mere VIP-Sequenz für die Bindung an VPAC1 und die Aktivierung der nachfolgenden Signalkette notwendig ist (Chadker & Rattan, 1993). Somit ist anzunehmen, daß sich das Auftreten von Abbruchsequenzen für das Screening der VIP-Derivate nicht störend auswirkt, da verkürzte VIP-Peptide nicht an den Rezeptor binden.

6.1. Substitutionsanalyse von VIP-Cy5(1)

Die Charakterisierung des VIP wurde mit Hilfe einer vollständigen Substitutionsanalyse durchgeführt, bei welcher jede Position des 28meren Peptid durch alle übrigen 19 L-Aminosäuren substituiert wurde und so 533 VIP-Derivate resultierten. Da der Farbstoff gegenüber dem in der Synthese zur Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe verwendeten Piperidin nicht stabil ist, wurde das Farbstoffmolekül erst nach Beendigung der Synthese an den N-Terminus der VIP-Derivate gekoppelt.

Die FACS-Untersuchungen der N-terminal mit dem Farbstoff Cy5 markierten Derivate im Zellassay führte zu einem Muster (Abb. 5.10), welches Hinweise über die Relevanz jeder einzelnen Aminosäure bezüglich der Bindung an RIN38(VPAC1 )-Zellen gibt. Das Muster zeigt deutlich die Unterschiede zwischen den für die Zellbindung wichtigen und unwichtigen Aminosäurepositionen, wobei nicht differenziert werden kann, ob die Aminosäuren einen [Seite 70↓] direkten Kontakt mit dem Rezeptor eingehen oder für die Struktur des VIPs am Rezeptor essentiell sind. Solange es jedoch nicht möglich ist, Strukturanalysen von VIP im rezeptorgebundenen Zustand durchzuführen, gibt es keinen direkten Nachweis für die „wirkliche“ Funktion jeder einzelnen Aminosäure.

Bei der Substitutionsanalyse von VIP wurde jede Position der Sequenz durch die 19 übrigen Aminosäuren ausgetauscht. In der Darstellung der Substitutionsanalyse erkennt man in der Cysteinspalte, daß die Substitution mit Cystein an den meisten Positionen erlaubt ist. Es wäre möglich, daß sich zwischen den Thiolgruppen der Cysteine Dilsulfidbrücken ausbilden und die Peptide in dimerisierter Form an den Rezeptor binden, welches in der vorliegenden Arbeit allerdings nicht überprüft wurde. Es wäre aber denkbar, die Dimerisierung von Cy5-markierten VIP-Molekülen absichtlich und kontrolliert durchzuführen, da auf diese Weise vielleicht ein erhöhtes Fluoreszenzsignal erwartet werden kann. Die Substitution mit Cystein kann zudem Informationen darüber geben, an welchen Positionen möglicherweise Farbstoffmoleküle über die Thiolgruppe des Cysteins gekoppelt werden können. Bei der gängigen Farbstoffkopplung wird vor der Schutzgruppenabspaltung der Farbstoff über eine Säureamidbindung an eine Aminogruppe, im Fall der Substitutionsanalyse an die N-terminale Aminogruppe gekoppelt. Der Vorteil der alternativen Kopplungsmethode über einen Cysteinrest besteht darin, daß die selektive Schutzgruppenabspaltung und die Kopplung des Farbstoffes, welcher hierfür entweder Bromacetyl- oder Maleimidofunktionalitäten besitzen sollte (Schelté et al ., 2000), sehr einfach und sicher ist. Verfolgt man diese Strategie, kann der Farbstoff auch erst nach der Schutzgruppenabspaltung an das Peptid gebunden werden, so daß auf eine orthogonale Schutzgruppenchemie vollständig verzichtet werden kann.

In der Darstellung der Substitutionsanalyse (Abb. 5.10) kann man in der Spalte von Prolin erkennen, daß der Austausch durch diese Aminosäure bei fast keiner Position der VIP-Sequenz möglich ist. Auch Glycin ist bei sehr vielen Positionen, vor allem im mittleren Abschnitt der Sequenz, nicht zugelassen. Dies liefert Hinweise, daß VIP eine α -helikale Struktur am Rezeptor einnimmt, da Prolin erfahrungsgemäß einen helix-brechenden Charakter hat. Glycin ist ebenfalls dafür bekannt, Helices zu destabilisieren, da Glycin aufgrund seiner Struktur bezüglich der Konformation sehr flexibel und nicht in der Lage ist, hydrophobe Stabilisierungen auszuführen (Blaber et al. , 1993). Die Vermutung, daß das VIP-Molekül in dem Rezeptor-Liganden-Komplex eine α -helikale Konformation einnimmt, wird auch durch verschiedene Literaturdaten bekräftigt. Es wurden Strukturuntersuchungen von VIP in Lösung mittels NMR und CD durchgeführt (Theriault et al ., 1991, Wray et al ., 1998, Fry et al. , 1989) und ebenfalls helikale Strukturen des VIP ermittelt. In unserer Gruppe wurden „Molecular Modelling-Studien von VIP und VIP-[Seite 71↓] Cy5(1) in freier Form durchgeführt, bei denen gezeigt wurde, daß große Bereiche des Peptids eine helikale Konformation eingehen (Abb. 6.1).

Abb. 6.1: Überlagerung der Strukturen niedrigster Engergie von 5 Faltungssimulationen. Die Rückgratatome erscheinen schwarz (fett), das Cy5-Molekül blau und die Struktur mit der niedrigsten Engergie ist grau dargestellt. Für die Konformationsberechnungen wurde das Software-Paket ICM (MolSoft LLC, La Jolla, USA) (Abagyan et al. , 1994) verwendet.

Die Vorhersage der Sekundärstruktur (Frishman & Argos, 1996) ergab eine α-Helix zwischen Tyr10 und Ser25 , welche mit Hilfe von 5 unabhängigen Computersimulationen bestätigt werden konnte. Hierbei wurde in 66 % aller Strukturen niedriger Energie eine helikale Konformation zwischen Asp8 und Leu23 ermittelt. In diesem Bereich befinden sich auch die Schlüsselaminosäuren für die Bindung an VPAC1 -überexprimierende Zellen. Im N-terminalen Bereich konnte in ca. 15 % der niedrigenergetischen Strukturen eine Helix zwischen Asp3 und Phe6 errechnet werden, wobei Thr7 diese kleinere helikale Untereinheit von dem großen helikalen Abschnitt trennt. Die Simulation von VIP ohne den N-terminal gekoppelten Farbstoff resultiert in virtuell identischen Konformationseigenschaften (Abb. 6.2). Es scheint, daß die [Seite 72↓] Kopplung des Farbstoffmoleküls an das N-terminale Ende der VIP-Sequenz kaum Beeinträchtigungen der helikalen Struktur zur Folge hat.

Abb. 6.2: Überlagerung der Strukturen niedrigster Engergie von 5 Faltungssimulationen. Die Rückgratatome sind schwarz (fett) und die Struktur mit der niedrigsten Engergie ist grau dargestellt.

In der Darstellung der elektrostatischen Ladungsverteilung des VIP-Farbstoff-Moleküls kann man deutlich die hohe Anzahl der positiven Ladungen erkennen (Abb. 6.3). Die Ergebnisse der Substitutionsanalyse des farbstoffmarkierten VIP haben ergeben, daß negativ geladene Aminosäuren nur an den Positionen Asp3 und Asp8 geduldet werden, bei denen in der nativen Sequenz schon eine negativ geladene Aminosäure auftritt. Positiv geladene Aminosäuren werden eher bevorzugt, wobei das Peptid mit den Aminosäurepositionen Arg12 , Arg14 , Lys15 , Lys20 und Lys21 schon stark positiv geladen ist.


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Abb. 6.3: Elektrostatische Ladungsverteilung des nativen VIP-Moleküls mit N-terminal markierten Cy5-Farbstoff mit dem Software-Paket ICM (MolSoft LLC, La Jolla, USA). Positive Ladungen sind blau und negative Ladungen rot gefärbt.

In neuesten Studien von Lins et al . wurden Mutationen an putativen Bindungsstellen des Rezeptors durchgeführt und mittels „Molecular Modelling“ die erste partielle 3D-Struktur der VIP-bindenden Domäne konstituiert (Lins et al ., 2001). Diese 3D-Struktur befindet sich im extrazellulären N-terminalen Bereich des Rezeptors und weist eine negativ geladene Vertiefung auf, in der die Aminosäuren Glu36 und Asp68 eingebettet sind. Darüber liegt eine hydrophobe Domäne mit 3 Tryptophanresten (Trp67 , Trp73 und Trp110 ) (Nicole et al ., 2000a, Nicole et al., 2000b). Die Autoren haben gezeigt, daß der Austausch dieser Aminosäuren mit Alanin die Bindung von nativem VIP drastisch reduziert. Dies wurde auch für die Positionen Pro74 , Pro87 , Phe90 und Gly109 festgestellt. Lins et al . vermuten, daß die negativ geladenen Aminosäuren im Rezeptor mit den positiven Aminosäuren des Liganden einen direkten Kontakt eingehen oder eine starke Anziehung der Aminosäuren zueinander stattfindet (Lins et al. , 2001). Die Unverträglichkeit negativ geladener Aminosäuren, welche bei der Substitutionsanalyse gefunden wurden, könnte die Anziehung zwischen Rezeptor und Ligand mindern, so daß der Austausch mit diesen Aminosäuren zu einer verringerten Zellbindung führt. Die Substitution mit positiv geladenen Aminosäuren kann die Anziehung jedoch verstärken und somit die Bindung zum Rezeptor erhöhen, welches auch die hohe Toleranz gegenüber den positiv geladenen Aminosäuren in der Substitutionsanalyse erklären würde. Da die für die VIP-Bindung essentiellen negativ geladenen Aminosäuren des Rezeptor in einer Vertiefung liegen, wird angenommen, daß die Bindung des Liganden eine dynamische strukturelle Reorganisation der Vertiefung induziert.


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Einen weiteren interessanten Aspekt liefert die Substitution mit Tryptophan, die an den meisten Positionen der VIP-Sequenz möglich ist. Die physikochemisch verwandten Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin werden zwar weniger stark, aber auch bei der Mehrheit der Aminosäurepositionen geduldet. Da die bindende Domäne des VPAC1 eine Gruppe mehrerer Tryptophane enthält, kann man annehmen, daß aromatische Wechselwirkungen zwischen dem Rezeptor und dem Liganden stattfinden (Lins et al. , 2001). In der nativen Form des VIP treten 3 Aromaten (Phe6 , Tyr10 , Tyr22 ) auf, welche basierend auf der Substitutionsanalyse für das Bindungsverhalten von hoher Relevanz und nur wenig substituierbar sind. Es ist möglich, daß diese Aromaten ππ -Interaktionen mit den Tryptophanresten des VPAC1 eingehen. Die Substitution mit Tryptophan kann diesen Effekt noch verstärken, was eine mögliche Begründung für die hohe Toleranz der VIP-Sequenz gegenüber Tryptophan liefert.

Die Positionen Arg12 , Arg14 und Leu23 konnten eindeutig als Schlüsselaminosäuren identifiziert werden, da an dieser Stelle nur die in der nativen Sequenz vorkommende Aminosäure zugelassen ist, um eine mit dem Wildtyp vergleichbare Bindung zu erreichen. Man kann davon ausgehen, daß die Stringenz dieser Aminosäure auf der direkten Beteiligung an der Rezeptorbindung beruht. Es ist beschrieben, daß besonders der C-terminale Bereich der VIP-Sequenz für die Rezeptorbindung und Aktivierung wichtig ist (Wulff et al. , 1997). Dies korreliert gut mit den Ergebnissen der Substitutionsanalyse, da sich die gefundenen Schlüsselaminosäuren im C-terminalen Abschnitt befinden.

Nicole et al . haben kürzlich einen Alanin-Scan von VIP angefertigt, wobei jede Aminosäureposition gegen ein Alanin ausgetauscht wurde (Nicole et al ., 2000a). Die Positionen, bei denen in der nativen VIP-Sequenz schon Alanin vorhanden ist, wurden mit Glycin substitutiert. Auf diese Weise entstanden 28 Alanin-/Glycin-substituierte VIP-Derivate, welche auf die Fähigkeit, radioaktiv markiertes VIP zu vedrängen, getestet wurden. Konjugate, welche ein vermindertes Verdrängungsvermögen aufwiesen, wurden zusätzlich in „Molecular Modelling-Versuchen“ hinsichtlich der Strukturänderungen überprüft. Auf der Basis dieser Studien wurde angenommen, daß die Aminosäuren His1 , Val5 , Arg14 , Lys15 , Lys21 , Leu23 und Ile26 direkt an der Rezeptorbindung beteiligt sind, da Alanin-Substitutionen zu verringerten Verdrängungen des Radioliganden führten, ohne die Struktur des Peptids zu verändern. Substitutionen an Asp3 , Phe6 , Thr7 , Asp8 , Tyr10 , Arg12 , und Lys20 dagegen zeigten beim „Molecular Modelling“ stark veränderte Strukturen und sollten deshalb nur für die Ausbildung der korrekten VIP-Struktur am Rezeptor verantwortlich sein. Zum größten Teil decken sich die Ergebnisse der beiden unterschiedlichen Studien, teilweise weichen die Ergebnisse von Nicole et al . von den hier erzielten Ergebnissen voneinander ab.


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Sicherlich kann man sagen, daß eine Substitutionsanalyse ausführlichere Details über die jeweiligen einzelnen Aminosäurepositionen liefern kann als ein Alanin-Scan. Der Alanin-Scan ist eine gängige Methode für die Charakterisierung von molekularen Erkennungsmechanismen. Dabei wird jede Position eines Peptidliganden mit Alanin substituiert, was im Grunde dazu führt, daß die Seitengruppe einer bestimmten Aminosäureposition zu einer Methylgruppe reduziert wird. Auf diese Weise werden nicht-kovalente Wechselwirkungen verhindert und die Gesamstruktur des Peptids bleibt erhalten (Holst et al ., 1998, Di Cera, 1998). Obwohl diese Methode nur eine relativ geringe Anzahl Peptide benötigt, ist ein Alanin-Scan für die Charakterisierung von Peptidstrukturen nicht sehr effektiv. Man erhält einen tieferen Einblick in die strukturellen Ansprüche für die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen, wenn jede Aminosäureposition systematisch mit den genkodierten Aminosäuren substituiert wird. Dies bietet den Vorteil, daß der Einfluss diverser Aminosäuren, die sich in Größe und Funktion unterscheiden, bei jeder Position der Sequenz überprüft werden kann (Kramer et al ., 1997).

Bei der vorliegenden Arbeit wird der Vorteil der Substitutionsanalyse gegenüber dem Alanin-Scan vor allem bei Position 19 deutlich. Val19 wurde von Nicole et al . als eine für die Struktur und Funktion unwichtige Aminosäure definiert (Nicole et al. , 2000a). Der Austausch mit Alanin in der Substitutionsanalyse bestätigt dies, da hier die Zellbindung ebenfalls nur unwesentlich verringert ist. Die Substitutionsanalyse zeigt, daß bei dieser Position außer Alanin nur die Aminosäuren Isoleucin und Leucin toleriert werden. Dies wird jedoch aus den Daten des Alanin-Scan nicht ersichtlich. Somit sind an dieser Stelle nur aliphatische Aminosäuren in der VIP-Sequenz akzeptabel, welches die Relevanz dieser Position entscheidend steigert.

Weitere Differenzen bestehen auch in Aussagen über die erste Aminosäurepostition der VIP-Sequenz. In den Experimenten von Nicole et al . erweist sich His1 als essentiell, welches auch durch andere Daten aus der Literatur (Goossens et al. , 1997) aber nicht durch die hier angefertigte Substitutionsanalyse bestätigt werden kann. Da in dieser Versuchsreihe jedoch das Farbstoffmolekül an diese Position gekoppelt wurde, sollte auf eine Interpretation der Bindungsdaten für die substituierten Derivate dieser Aminosäure verzichtet werden. Auch bei Tyr22 differieren die Aussagen über die Relevanz der Aminosäuren. Nicole et al . fanden bei der Alanin-Substitution dieser Aminosäure keine verringerte Rezeptorbindung zu VPAC1 (Nicole et al. , 2000a), während in der vorliegenden Arbeit der Austausch mit Alanin zu einem drastisch reduzierten Bindungsverhalten führte. Die Ergebnisse in der Substitutionsanalyse sind bei dieser Position in sich sehr schlüssig. Es wurde gezeigt, daß an Tyr22 nur physikochemisch ähnliche Aminosäuren, nämlich Phenylalanin und Tryptophan, zulässig sind.


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Eine weitere Abweichung gegenüber dem Alanin-Scan von Nicole et al . (Nicole et al. , 2000a) tritt bei Position 8 auf. Bei der Substitution von Asn8 mit Alanin wird bei Nicole et al . die Rezeptorbindung stark eingeschränkt. In der hier angefertigten Substitutionsanalyse dagegen kann jede der natürlichen Aminosäuren außer Prolin an diese Stelle gesetzt werden. Im weiteren Versuchsverlauf wurde ein an Position 8 modifiziertes Derivat, [Arg8 ]-VIP, synthetisiert und in in vitro und in vivo Studien eingehender charakterisiert. Da bei diesen Studien mit dem [Arg8 ]-VIP-Analogon positive Ergebnisse erzielt wurden, wurde so die Bedeutungslosigkeit der Position 8 für die Bindung an VPAC1 gefestigt.

Weitere Unterschiede konnten bei Asp3 festgestellt werden. Nicole et al . konnten für das an Position 3 mit Alanin substituierte Konjugat eine verminderte Rezeptorbindung bestimmen (Nicole et al. , 2000a). In der vollständigen Substitutionsanalyse konnte jedoch gezeigt werden, daß die Mehrzahl der Aminosäuren unter anderem auch Alanin an dieser Stelle zugelassen werden.

Ein ähnliches Phänomen tritt bei Lys15 auf, wobei hier die Substitution einiger Aminosäuren auch zur totalen Reduzierung der Bindung führt. Bei Positionen wie Lys15 ist es schwierig, eine Aussage über die Wichtigkeit des Aminosäurerestes für die Bindung zum Rezeptor zu machen, da an dieser Position die Toleranz gegenüber den substituierten Aminosäuren breit gefächert ist. Die Zuordnung der Wichtigkeitsstufen für Lys15 kann nicht eindeutig erfolgen und somit sollte die Relevanz dieser Aminosäure und derer, die sich ähnlich verhalten, stets kritisch betrachtet werden.

In der hier angefertigten Substitutionsanalyse treten im Gegensatz zu dem Alanin-Scan von Nicole et al. (Nicole et al. , 2000a) deutliche Unterschiede auf. Das kann daran liegen, daß Nicole et al . eine andere Methode verwendet haben, um das Verhalten der VIP-Derivate am Rezeptor zu untersuchen. Während bei Nicole et al . die Bindung der Alanin-substituierten VIP-Derivate aufgrund der Fähigkeit, 125 I-VIP zu verdrängen, bestimmt wurde, sind in der vorliegenden Arbeit die Bindung der VIP-Derivate mit Hilfe der FACS-Analyse untersucht worden.

Überdies wurde die Bindung der Alanin-subtituierten VIP-Derivate von Nicole et al . an Membranpräparationen getestet, während die vollständige Substitutionsanalyse an einem System mit ganzen lebenden VPAC1 -überexprimierenden RIN38-Zellen durchgeführt wurde, die zusätzlich mit eGFP koexprimiert wurden. Des weiteren muß berücksichtigt werden, daß für die Substitutionsanalyse VIP-Derivate verwendet wurden, welche mittels Spotsynthese hergestellt wurden. Nicole et al . dagegen haben für ihre Untersuchungen gereinigte Derivate benutzt, die im präparativen Maßstab synthetisiert wurden. Die Verdrängung eines Radioliganden mit einem nicht markierten Liganden bietet natürlich die Möglichkeit, die Spezifität des Liganden zu [Seite 77↓] ermitteln. Diese Methode ist aber relativ aufwendig, da für die Bestimmung einer Ki eine Vielzahl verschiedener Ligandenkonzentrationen für die Verdrängung erprobt werden müssen. Bei der FACS-Analyse wird die gesamte Fluoreszenzintensität der Zellen gemessen. Das heißt also, daß die totale Bindung der fluorseszenzmarkierten Peptide und deren Internalisierung ermittelt wird, wobei hier nicht unterschieden werden kann, ob es sich dabei um spezifische oder unspezifische Bindung handelt. Diese Technik findet im Screening ihren Einsatz, da die Zellbindung einer großen Anzahl veschiedener Peptid-Konjugate sehr einfach und schnell gemessen werden kann. Die Koexpression von eGFP sollte keinen Einfluß auf das Bindungsverhalten von Liganden haben. Da eGFP an das C-terminale Ende des Rezeptors exprimiert wurde, könnten allenfalls Auswirkungen auf die Signalkette des Rezeptors oder auf Phosphorylierungen innerhalb der Zelle entstehen. Den größten Einfluß auf das Bindungsverhalten der VIP-Derivate zu VPAC1 hat sicherlich das N-terminal gekoppelte Farbstoffmolekül.

Es konnte gezeigt werden, daß Differenzen zwischen dem Alanin-Scan von Nicole et al . (Nicole et al. , 2000a) und unserer VIP-Substitutionsanalyse bestehen. Der Haupteil der Ergebnisse beider Studien korreliert allerdings sehr gut miteinander, insbesondere bei der Bestimmung der Schlüsselaminosäuren.

Für die Verifizierung der Substitutionsanalyse wurden 30 unterschiedliche N-terminal mit Cy5 markierte VIP-Derivate präparativ nachsynthetisiert und ebenfalls am FACS-Gerät gemessen (Abb. 5.12). Hierbei konnte die Mehrzahl der nachsynthetisierten Derivate die Ergebnisse der Substitutionsanalyse bestätigen. Einige Derivate jedoch zeigten bei der Verifizierung ein anderes Bindungsverhalten. Diese Abweichungen treten bei Aminosäuren auf, welche bei der Messung der Subtitutionsanalyse eine sehr hohe Bindung aufwiesen und die bei der Verifikation teilweise eine wesentlich schwächere Bindung zu VPAC1 zeigten. Dieses Verhalten kann wahrscheinlich auf die Qualitätsunterschiede der VIP-Derivate zurückgeführt werden. Es wird angenommen, daß die bindenden VIP-Derivate aufgrund ihrer Verunreiningungen eine stark erhöhte unspezifische Bindung hervorrufen. Konjugate, die in der Substitutionsanalyse wenig oder fast gar nicht gebunden haben, zeigten bei der Verifizierung ein ähnliches Verhalten. Die Kombination von Spotsynthese und FACS-Analyse sollte nur im Vorfeld für den Einsatz in Screeningexperimenten genutzt werden. Für Untersuchungen zur eingehenden Charakterisie-rung einzelner Peptid-Derivate sollte auf jeden Fall auf gereinigte Peptide zurückgegriffen werden.

In der Substitutionsanalyse wurde das Farbstoffmolekül an das N-terminale Ende der VIP-Derivate an His1 gekoppelt. Die Ergebnisse der Substitutionsanalyse haben allerdings gezeigt, [Seite 78↓] daß His1 für die Bindung von VIP an VPAC1 -überexprimierende Zellen nicht ganz unerheblich ist. Aus diesem Grund wurde die Position des Farbstoffes in der VIP-Sequenz variiert, indem der Farbstoff jeweils an jede Position der VIP-Sequenz gekoppelt wurde. Mit Hilfe dieses Farbstoff-Walkes (Abb. 5.13) konnte herausgefunden werden, daß fast sämtliche Aminosäurepositionen des Peptids besser für die Markierung mit dem Farbstoffmolekül geeignet sind als His1 . Vor allem die Positionen 5, 8, 9 und 16 zeigten sich für diese Zwecke gegenüber der Bindung an VPAC1 -überexprimierende Zellen sehr vorteilhaft. Diese Ergebnisse werden auch mit der hier angefertigten Substitutionsanalyse bestätigt, da dort diese Positionen als unwichtig definiert wurden.

Basierend auf den Ergebnissen der Substitutionsanalyse wurde ein VIP-Supermotiv (Abb. 5.11) erstellt. Mit Hilfe dieses Supermotivs kann man sehr schnell und leicht erkennen, wo sich die entscheidenen Schlüsselaminosäuren und die eher unwichtigen Aminosäuren in der VIP-Sequenz befinden. Das Supermotiv kann für das rationelle Design modifizierter VIP-Derivate hinsichtlich einer Stabilisierung genutzt werden, indem die X-Positionen gegen stabilere Substanzen wie zum Beispiel unnatürliche Aminosäuren oder d-Aminosäuren ersetzt werden. Weiterhin dient das Supermotiv dazu, die Positionen zu bestimmen, an welche das Farbstoffmolekül gekoppelt werden kann Die Ergebnisse der Substitionsanalyse bieten die Möglichkeit, gezielte Modfikationen der VIP-Sequenz durchzuführen. So wäre es denkbar, daß an Positionen, bei denen in der Sequenz der nativen Aminosäuren nur physikochemisch verwandte Aminosäuren zugelassen sind, Bausteine mit entsprechenden Strukturen und Funktionen einzusetzen. Zum Beispiel könnte bei der Position Tyr22 , welche zusätzlich nur Phenylalanin oder Tryptophan toleriert, mit den Aromaten Naphtalalanin oder Cyclohexylalanin substitutiert werden. Val19 kann nur durch aliphatische Aminosäuren ersetzt werden, so daß eine Stabilisierung des Peptids an dieser Stelle möglicherweise auch mittels Substitution mit Norleucin, Norvalin oder β-Alanin erreicht werden könnte. Die vielen positiv geladenen Aminosäuren in der VIP-Sequenz könnten beispielsweise mit den ebenfalls positiv geladenen Substanzen Citrullin oder Ornithin substituiert werden. Weiterhin wäre es ebenfalls möglich, mit Hilfe nicht-peptidischer Verbindungen stabile VIP-Mimetika herzustellen. So haben zum Beispiel Olson et al . Ansätze getestet, bei denen durch den Einbau trizyklischer Ringsysteme wie Phenothiazine oder Dibenzazepine mehrere nicht essentielle Aminosäuren parallel substitutiert wurden (Olson et al ., 1993). Die nicht-petidische Substanz fungierte hier als eine Art Abstandhalter zwischen die wichtigen Aminosäurepositionen in der Helix. Mit diesem VIP-Derivat wurde jedoch nur 10 % der Bindung des nativen VIP erreicht, so daß ein weiterer Bedarf an Optimierung besteht.


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6.2.  In vitro Charakterisierung von VIP- und [Arg8 ]-VIP-Konjugaten

Bei der Substitutionsanalyse konnten gegenüber dem Alanin-Scan (Nicole et al. , 2000a) vor allem bei der Position 8 starke Abweichungen gezeigt werden. Während mit Hilfe des Alanin-Scans dem Asn8 eine essentielle Bedeutung zugesprochen wurde, konnte in der hier angefertigten Substitutionsanalyse mit fast jeder Aminosäure an dieser Stelle substituiert werden. Diese Position scheint für die Funktion und die Strukturbildung nicht wichtig zu sein. Zur Überprüfung wurde das [Arg8 ]-VIP-Cy5(1)-Analogon synthetisiert. Dieses VIP-Analogon präsentiert an der Position 8 statt der negativ geladenen Asparaginsäure des Wildtyps eine positive Ladung. [Arg8 ]-VIP-Cy5 hat innerhalb der Substitutionsanalyse eine sehr hohe Bindung an RIN38(VPAC1 )-Zellen gezeigt. In einem Verdrängungsassay wurde die Bindung weiter quantifiziert und auf Spezifität getestet. Aus den Ergebnissen (Tab. 5.3) wurde ersichtlich, daß die gemessenen Konjugate eine spezifische Bindung zum VPAC1 -Rezeptor aufweisen. Die Bindungsaffinität der farbstoffmarkierten VIP-Derivate ist im Vergleich zu unmarkiertem VIP generell vermindert. Während N-terminal markiertes natives VIP die schlechteste Bindung aufweist, bewirkt die Substitution einzelner Positionen mit Arginin oder Tryptophan jeweils einen Affinitätsgewinn. Diese Affinitätssteigerung kann damit zusammenhängen, daß wie oben schon besprochen, positive Ladungen des VIP aufgrund der Anziehungskräfte zu negativ geladenen Aminosäuren der putativen Bindungstasche des Rezeptors die Rezeptorbindung begünstigen. Das Einbringen von Tryptophan kann die Interaktion mit den 3 Aromaten der Rezeptorbindungstasche unterstützen. Zusätzlich wurden weitere Farbstoffpositionen für das native VIP und das [Arg8 ]-Analogon in radioaktiven Kompetitionsstudien untersucht. Von den 3 getesteten Positionen des Farbstoffes zeigte sich, daß jede Position besser für die Farbstoffkopplung geeignet scheint, als der N-Terminus (Tab. 5.3). Für die native VIP-Sequenz ist die Position 16 für den Farbstoff am besten angebracht, hier konnte eine IC50 im höher affinen Bereich (IC50 = 45 nm) gemessen werden. Der Grund für diese unterschiedlichen Rezeptoraffinitäten kann auf Basis dieser Arbeit nicht hinreichend erklärt werden. Hierzu wären weiterführende strukturelle Untersuchungen nötig. Die Ergebnisse zeigen, daß diese Position auch für andere Modifikationen gut zugänglich ist. Gestützt wird dies auch durch Arbeiten von Gourlet et al ., die ein VIP-Analogon entwickelt haben, bei der Position 16 mit Arginin ausgetauscht wurde (Gourlet et al ., 1996). Die Autoren berichten über eine 4fach höhere Bindung des VIP-Analogon an VPAC1 und eine 3fach höhere Produktion von cAMP. Wir konnten diese Steigerung durch die Substitution von Arginin an Position 16 mit Hilfe der Substitutionsanalyse bestätigen. Das [Arg16 ]-VIP ist somit eine interessante Zielstruktur für die Kopplung des Fluoreszenzfarbstoffes und der Testung für [Seite 80↓] diagnostische Zwecke. Da sich in dieser Studie die Position 16 als die bisher beste Position für die Kopplung des Farbstoffmoleküls herausgestellt hat, böte es sich an, eine Substitutionsanalyse des VIP-Cy5(16)-Derivates anzufertigen. Dies konnte in dieser Studie allerdings wegen Zeitmangel nicht durchgeführt werden.

Die Untersuchungen der antagonistischen bzw. agonistischen Funktion der VIP-Farbstoff-Konjugate im cAMP-Assay haben ergeben, daß die Affinitäten und biologischen Aktivitäten weitgehend korrelieren (Abb. 5.21). Derivate, welche eine höhere Affinität zum VPAC1 aufwiesen wie zum Beispiel VIP-Cy5(16), haben im cAMP-Assay ebenfalls eine höhere cAMP-Produktion induziert. N-terminal markiertes Wildtyp-VIP-Konjugat, welches eine sehr niedrige Affinität zum Rezeptor zeigte, hat auch einen sehr geringen Anstieg der cAMP-Konzentration in den Zellen hervorgerufen.

Während die Position des Farbstoffmoleküls in der VIP-Sequenz starke Auswirkungen auf die Rezeptoraffinität und biologische Funktion hat, bleibt die metabolische Stabilität der VIP-Derivate davon überwiegend unabhängig (Abb. 5.24 und Abb. 5.25). Die strukturelle Modifikation des VIP durch die Substitution von Asn8 mit Arginin jedoch führte zu einer merklichen Verzögerung des proteolytischen Abbauprozesses. Daher wird angenommen, daß das native VIP-Farbstoff-Derivat genau an der Position 8 proteolytisch gespalten oder die native Aminosäure Asn8 an einer Erkennungsequenz für Proteasen beteiligt ist, so daß die Degradation an dieser Stelle verzögert oder verhindert wird. In der Literatur wurde die Frage, zwischen welchen Aminosäuren VIP gespalten wird, bislang nicht zufriedenstellend bearbeitet. Einen Zusammenhang zwischen der Stabilität mit der Rezeptoraffinität kann man ausschließen, da das VIP-Derivat VIP-Cy5(16) mit der höchsten Affinität nicht am längsten stabil bleibt. Bolin et al . haben in Stabilitätsuntersuchungen von VIP zwei Spaltstellen identifiziert (Bolin et al ., 1995). Es wurde gezeigt, daß die Amidbindung zwischen Ser25 und Ile26 und die Bindung zwischen Thr7 und Asp8 gespalten wird. Es wäre somit durchaus möglich, daß die Modifikation an Position 8 Veränderungen hinsichtlich der Stabilität hervorrufen kann. Weiterhin wird in der Literatur beschrieben, daß die Degradation von Peptiden häufig an Aspartyl- und Asparaginylresten erfolgt (Nabuchi et al ., 1997, Bongers et al ., 1992). Es wird angenommen, daß die Degradation an dieser Stelle über Deaminierung, Isomerisierung und Racemisierung dieser Aminosäurereste geschieht, wobei ein zyklisches Imid als Zwischenprodukt fungiert. Im Fall des VIP würde sich dieses Imid aus der Carboxylgruppe der Asparaginsäure und der Aminogruppe des Peptidrückgrates bilden und so die Peptidbindung aufbrechen. Es sei angemerkt, daß neben der hier gewählten Methode für eine genauere Bestimmung der Stabilität von Peptidderivaten zusätzlich Untersuchungen der Stabilität in Plasma durchgeführt werden sollten. Dennoch ist ein [Seite 81↓] Vergleich der Substanzen und eine Auswahl möglichst stabiler Derivate auf dieser Basis möglich.

6.3.  In vivo Imaging von [Arg8 ]-VIP-Cy7(1)

Die spezifische Anreicherung farbstoffmarkierter VIP-Derivate in Tumoren wurde mit Hilfe der in vivo Fluoreszenzbildgebung im Tiermodell untersucht. Licha et al . konnten zeigen, daß einige Cyaninfarbstoffe auch ohne einen gekoppelten spezifischen Liganden im Tumor angereichert werden können (Licha et al ., 2000b). Ein annehmbarer Kontrast mit den hier verwendeten Fluoreszenzfarbstoffen wurde jedoch erst 6 – 24 Stunden nach Injektion erreicht. Aufgrund der höheren Eindringtiefe von NIR-Licht im Gewebe wurde der in anderen Experimenten verwendete Cy5-Farbstoff durch Cy7 ersetzt.

Bei den hier durchgeführten Imgaging-Experimenten wurden 12 Nacktmäuse mit VPAC1 -überexprimierenden Tumoren in 3 Gruppen unterteilt, wobei eine Gruppe das Analogon [Arg8 ]-VIP-Cy7(1), eine Gruppe Wildtyp-VIP-Cy7(1) und die letzte Gruppe „scrambled“ VIP-Cy7(1) verabreicht bekam (Abb. 5.28, 5.29 und 5.30). Bei allen Tieren ist auffällig, daß im Bereich der Lunge, Bauchraum und Nieren ein Fluoreszenzsignal zu sehen ist. Dieses Phänomen ist darauf zurückzuführen, daß auch im Normalgewebe von zum Beispiel Lunge, Gastrointerinaltrakt, Leber etc. VPAC1 -Rezeptoren exprimiert werden (Reubi et al ., 2000). Das Signal in den Nieren kommt aufgrund der renalen Ausscheidung der Peptidliganden zustande.

Die Applikation des scr VIP-Cy7(1) verursachte wie erwartet kein spezifisches Fluoreszenz-signal im Tumor. Bei der Applikation des wt VIP-Cy7(1)-Derivates dagegen war eine schnelle Akkumulation des Liganden im Tumor zu sehen, welche zum Zeitpunkt 5 min. nach Applikation das Maximum erreicht hatte. Dies zeigt, daß VIP gekoppelt mit dem Carbocyaninfarbstoff gut für die Bildgebung der VPAC1 -überexprimierenden Tumore verwendet werden kann. Der Kontrast zwischen dem Fluoreszenzsignal im Tumor und dem Signal im normalen Gewebe ist gut sichtbar. Die Kontrastverläufe demonstrieren, daß das native VIP-Konjugat in vivo nicht stabil ist (Abb. 5.31). Im Gegensatz dazu akkumuliert [Arg8 ]-VIP-Cy7(1) langsamer im Tumor und erreicht erst zum Zeitpunkt 30 min. nach Applikation ein Kontrastmaximum, welches jedoch deutlich höher ist als beim wt VIP-Cy7(1) (Abb. 5.32). [Arg8 ]-VIP-Cy7(1) wird somit weniger schnell ausgeschieden und hat eine höhere Halbwertszeit im Tiermodell. Diese erhöhte Stabilität ist auf die Substitution der Position 8 mit Arginin aus den schon oben genannten Gründen zurückzuführen. Es wird angenommen, daß aufgrund der höheren Stabilität gegenüber [Seite 82↓] proteolytischen Abbauprozessen dieses VIP-Derivat vermutlich länger im Blutkreislauf zirkulieren kann und auf diese Weise auch quantitativ mehr Substanz zum Tumor gelangt, welches das höhere Fluoreszenzsignal erklärt. Die Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchungen in Rattenleberextrakt und die in vivo Imaging-Versuche korrelieren sehr gut miteinander. In beiden Versuchen konnte unabhängig voneinander gezeigt werden, daß eine einzige Modifikation in der VIP-Sequenz (Asp8→ Arg8 ) eine höhere Stabilität gegenüber proteolytischen Degradationen bewirkt.

Die unterschiedlichen Ergebnisse bei Applikation desselben VIP-Konjugates in verschiedene Mäuse werden mit verschiedenen Parametern der Tumore in Zusammenhang gebracht. Zum einen ist das Stadium der Nekrose des Tumorgewebes für die Anreicherung von markierten Peptidliganden von großer Bedeutung, zum anderen ist auch die Versorgung der Tumore über Gefäße, also die Gefäßdichte und Duchlässigkeit, sehr wichtig. In diesem Projekt wurden die Tumore durch Inokulation von RIN38(VPAC1 )-Zellen unter die Bauchdecke der Mäuse erzeugt. Folglich wurden die Imaging-Versuche mit Tumoren durchgeführt, welche sehr schnell gewachsen sind und auch relativ früh nekrotisieren. Die Versorgung der Tumore mit Peptidliganden ist bei hochnekrotisiertem Geweben nicht gewährleistet. Für die Untersuchung dieser Eigenschaften wären histologische Untersuchungen des Tumorgewebes notwendig, welche im Rahmen dieser Studie jedoch nicht durchgeführt wurden. Um das Problem der Nekrose zu umgehen, kann möglicherweise die Untersuchung der markierten VIP-Derivate mit langsam wachsenden Tumoren, die sich spontan gebildet haben und keine oder nur eine geringfügige Nekrose aufweisen zu geringeren Fehlerquoten innerhalb der Tierversuchsgruppen führen.

Der Vorteil der VIP-Farbstoff-Derivate ist im Gegensatz zu früheren Bildgebungsstrategien (Folli et al ., 1994; Ballou et al ., 1995; Weissleder et al ., 1999) das schnelle Erreichen der maximalen Fluoreszenzintensität des Tumors innerhalb einer Stunde. Dieser Aspekt ist vor allem für die diagnostischen Zwecke in der Klinik günstig. Im Unterschied dazu hat sich bei der Kopplung von Carbocyaninfarbstoffen an monoklonale Antikörper die hohe Plasmahalbwertszeit der Antikörper als großer Nachteil ausgewirkt, da so ein hohes Hintergrundrauschen der Fluoreszenz erzeugt wurde

Die Expression von VPAC1 -Rezeptoren in gesundem Gewebe verschiedener Organe begrenzen den Einsatz markierter VIP-Derivate in der Tumordiagnostik. Die eindeutige Beurteilung eines Tumors kann nur dort erfolgen, wo im umliegenden Gewebe eine relativ niedrige Rezeptorzahl vorhanden ist, so daß ein ausreichender Kontrast entstehen kann. VIP gekoppelt mit Fluoreszenzfarbstoffen kann aufgrund der geringeren Eindringtiefe des NIR-Lichtes nur für die [Seite 83↓] Bildgebung oberflächlicher Tumore, die mittels endoskopischer Detektion diagnostiziert werden können, verwendet werden. Deshalb sind VPAC1 -exprimierende Tumore wie zum Beispiel die des Pankreas, welcher der Endoskopie nicht zugänglich ist, von diesem Diagnoseverfahren ausgeschlossen. Adenokarzinome im Kolon scheinen aufgrund eines hohen Kontrastes zwischen VPAC1 -Expression in Tumor- und Normalgewebe (Reubi et al ., 1999, Wiedenmann et al ., 1998) und der Möglichkeit der Verwendung endoskopischer Methoden besonders für die Verwendung markierter VIP-Derivate geeignet zu sein. Aber auch Tumore in der Blase, Speiseröhre und Lunge können hierfür in Betracht gezogen werden.


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22.01.2004