Visual pigment evolution and the paleobiology of early mammals

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Dipl.-Biol. Constanze   Bickelmann

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Jan-Hendrik Olbertz

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Andreas Herrmann

Gutachter:
1. Prof. Dr. Johannes Müller
2. PD Dr. Frieder Mayer 
3. Prof. Belinda S.W. Chang 

Tag der mündlichen Prüfung: 30.06.2011

Widmung:

With love, to Leon and Gaia.

Abstract in English

The rise of mammals from premammalian cynodonts during the Late Triassic was an important transition in vertrebrate evolution. The similarities in body size, orbit size, and tooth shape of early mammalian fossils, as e.g. Morganucodon and Megazostrodon, to modern shrews, tenrecs, and hedgehogs led paleontologists to the assumption that the first mammals were nocturnal, living in the shadow of the dinosaurs. For over 30 years, this view has been generally accepted and published in textbooks. Moreover, a nocturnal lifestyle would have gone hand in hand with the evolution of fur and of endothermy, which, among other features, contributed to the origin of this highly diverse and successful animal group.

One of the limitations of paleontology is the lack of soft tissue preservation; because eye tissue is not preserved in early mammalian fossils, nocturnality as the ancestral state in these taxa will always remain an assumption. Fortunately, in recent years there have been major improvements in molecular techniques; e.g. ancestral sequence reconstructions and in vitro expression systems, as well as in selective constraint analyses, allowing certain types of evolutionary questions regarding the evolution of visual systems to be addressed in novel ways. 

This thesis investigates whether early mammals had indeed been nocturnal by combining paleontology and molecular techniques, focusing on the only visual pigment in the vertebrate eye that is responsible for vision at night and/or dim-light; the rhodopsin.

First, for a more reliable taxon sampling, the rhodopsin gene of the echidna, one of the two living families of the most basal mammalian lineage, the monotremes, was sequenced and was successfully expressed in vitro, together with two self-designed mutants with unique substitutions at sites 158 and 169. Biochemical and functional analyses revealed that the echidna rhodpsin displays some cone-like characteristics, likely due to rhodopsin being expressed in cones as well. Furthermore, site 169 was found to affect the strength of photon absorption in the echidna. With the echidna being a nocturnal animal, this thesis comprises the first characterisation of a rhodopsin of a nocturnal animal.

Second, based on a comprehensive alignment of 27 tetrapod rhodopsin sequences, ancestral rhodopsin sequences for the nodes Amniota, Mammalia, and Theria (i.e. marsupials and placentals) were inferred using Maximum likelihood estimates. The most likely of these were successfully expressed in vitro. All expressed pigments were functional and rod-like. Most importantly, meta II half lifes, which specify the time in which rhodopsin is in its active state activating the visual transduction cascade, were found to differ; Amniota shows the same rate as bovine, whereas Mammalia and Theria display a much higher t1/2. A high t1/2 has been said to facilitate better vision at low-light levels. Due to inconsistency in the available data, the result also suggests that, with the visual signaling cascade being such a complex and interconnected system, erecting ecological interpretations based on single biochemical and functional reactions is problematic.

Third, selective constraint analyses that investigate positive selection were completed. Positive selection is characterised by a high number of non-synonymous substitutions that change the subsequent amino acid and, thus, lead to changes in and the adaptation of a protein. These analyses revealed that the branches leading to Theria and marsupials were the only ones that experienced positive selection acting on the rhodopsin. The positive selection found at the therian branch likely reflects the rapid diversification into modern ecological habitats during the Triassic and Jurassic, as indicated by recent additions to the fossil record. Furthermore, it has been found that the branch leading to Mammalia experienced positive selection in synonymous substitutions, which do not change the subsequent amino acid; instead, these silent sites have an effect on mRNA stability and tRNA translation efficiency, increasing the number of rhodopsin molecules. This results in a scenario where the mammalian rhodopsin might have experienced positive selection on synonymous substitutions in order to increase its molecule number as an adaptation to vision at night, followed by later adaptive changes due to ecological diversification.

Though molecular techniques permit valuble insights regarding the nocturnality of the earliest mammals, additional data as well as novel investigative approaches are needed in order to address this fascinating aspect of evolutionary history. Nonetheless, this thesis emphasises the inherent value of paleontology and molecular methods working in tandem.

Abstract in German

Die Evolution der Säugetiere in der späten Trias zählt zu den bedeutendsten Ereignissen in der Wirbeltiergeschichte.

Fossilien belegen, dass die ersten Säugetiere, z. B. Morganucodon oder Megazostrodon, klein, sehr agil und aktiv waren. Sie besaßen große Augen und hatten Zähne, die auf eine insektivore Ernährung hindeuten. Die Ähnlichkeit mit heute lebenden Igeln, Spitzmäusen und Tenreks hat Paläontologen seit über 30 Jahren zu der Annahme verleitet, diese ersten Säugetiere wären nachtaktiv gewesen. Eine nachtaktive Lebensweise hätte bei der Entstehung eines endothermen Metabolismus, einer für die Säugetierevolution entscheidenden Anpassung, unterstützend gewirkt.

Auch wenn der Fossilbericht der ersten Säugetiere in den letzten Jahren massiv an Quantität und auch Qualität zugenommen hat, kann dieser aufgrund fehlender Weichteilerhaltung keine neuen Erkenntnisse bezüglich einer nachtaktiven Lebensweise dieser Tiere liefern. Dank bedeutender Fortschritte in Wissen und Techniken der molekularen Evolutionsbiologie ist es heutzutage jedoch möglich, anzestrale Gensequenzen zu rekonstruieren und im Labor das darausfolgende Protein zu synthetisieren, sowie Selektionsdrücke, die auf Proteine gewirkt haben, genau zu analysieren.

Hier setzt die vorliegende Arbeit an. Sie untersucht das einzige Sehpigment in der Netzhaut von Wirbeltieren, welches für das Sehen bei Nacht und/oder Dämmerung verantwortlich ist: das Rhodopsin.

Zuerst wurde das Rhodopsin der nachtaktiven Echidna, die zu einer der zwei letzten lebenden Familien von Monotrematen, der basalsten lebenden Säugetiere, gehört, sequenziert. Zusammen mit zwei selbstkreierten Mutanten wurde dieses erfolgreich in vitro exprimiert, die biochemischen und funktionellen Eigenschaften analysiert und verglichen mit dem Rhodopsin der tagaktiven Kuh, welches bereits bestens in diversen Studien charakterisiert wurde. Die Untersuchungen ergaben, dass das Rhodopsin der Echidna auch Charakteristika von Farb-Sehpigmenten aufweist, was auf eine Expression von Rhodopsin in Zapfen hindeutet. Tests an Mutante 169 ergaben, dass diese Aminosäure an der Regulierung der Absorptionsstärke des Rhodopsins der Echidna beteiligt war.

Des Weiteren, basierend auf einem umfassenden Alignment von 27 Tetrapoden-Rhodopsinen, wurden anzestrale Proteinsequenzen für die Knotenpunkte Amniota, Mammalia und Theria (d.h. Marsupialia und Plazentalia) mithilfe der Maximum-Likelihood-Methode berechnet und wiederum erfolgreich in vitro synthetisiert: alle Pigmente erwiesen sich funktional und zeigten typische Rhodopsin-Charakteristika.

Ausserdem ergab die Messung der Halbwertszeit von Meta II, einem entscheidenden Aktivatorzustand des Rhodopsins in der visuellen Signalkaskade, einen im Vergleich zum Kuh-Rhodopsin erhöhten Wert, sowohl im hypothetischen Säugetier- als auch im hypothetischen Theria-Rhodopsin. Dies deutet auf eine Anpassung an besseres Sehen bei schwachen Lichtverhältnissen oder bei Dunkelheit hin. Es erwies sich aber als schwierig, aus einzelnen Funktionstests Schlussfolgerungen auf ökologisch-bedingte Anpassungen zu ziehen, da die visuelle Signalkaskade ein sehr komplexes und durch viele Proteine vernetztes System darstellt.

Zuletzt wurden mithilfe der Maximum-Likelihood-Methode Selektionsdrücke, die auf nicht-synonyme Substitutionen des Rhodopsins gewirkt haben, untersucht. Positive Selektion führt dazu, dass ein Protein sich Veränderungen in der Umwelt anpasst, wohingegen negative Selektion die ursprüngliche Funktion des Proteins manifestiert. Starke positive Selektion wurde allein entlang der Linie, die zu den Theria und auch derjenigen, die zu den Marsupialia führt, ermittelt. Entlang der Theria-Linie, im Mesozoikum, sind mehrere Einnischungsevents von Säugetiertaxa in neue Lebensräume im Fossilbericht belegt. Sehr wahrscheinlich spiegeln sich Anpassungen an neue Lebensräume in einem so adaptiven System wie dem der Sehpigmente wider. Des Weiteren wurde gezeigt, dass positive Selektion auf synonyme Substitutionen im Rhodopsin nur entlang der Mammalia-Linie gewirkt hat, was Auswirkungen auf die Stabilität der mRNA sowie die Translation der tRNA hat und weiter zu einer Zunahme der Rhodopsin-Moleküle führt. Diese Ergebnisse beschreiben ein mögliches Szenario, in dem die Säugetiere im Vergleich zu anderen Amnioten zunächst die Anzahl ihrer Rhodopsin-Moleküle gesteigert haben, möglicherweise als Anpassung an das Nachtsehen. Später erfuhr das Rhodopsin adaptive Veränderungen als Antwort auf die starke ökologische Diversifikation.

Die vorliegende Arbeit zeigt mithilfe bioinformatischer und molekularbiologischer Techniken, dass das Säugetier-Rhodopsin einige Veränderungen erfahren hat. Des Weiteren bringt sie zum Ausdruck, dass Paläontologie und Molekularbiologie sich gegenseitig unterstützen können und müssen, um interessante makroevolutionsbiologische Fragen zu lösen.

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der Humboldt-Universität zu Berlin
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28.09.2011