| Behrend, , Anke: Kinetik des Ingestaflusses bei Rehen (Capreolus capreolus) und Mufflons (Ovis ammon musimon) im saisonalen Verlauf |
15
Ziel der Untersuchungen war es, die mittlere Retentionszeit von Flüssigkeit und Partikeln (< 2 mm Partikelgröße) im Ruminoretikulum und im gesamten Gastro-Intestinal-Trakt beim Reh im Vergleich zum Mufflon zu bestimmen. Das Prinzip der Methode besteht darin, daß handzahmen Tieren Marker über eine Vormagenkanüle eingegeben werden. Die Marker werden im Magen-Darm-Kanal nicht resorbiert und über den Kot wieder ausgeschieden. Die Markerkonzentrationen im Kot haben einen bestimmten Zeitverlauf, was die Berechnung der Ingestaverweilzeiten ermöglicht.
Weiterhin wurden die Konzentrationen von kurzkettigen Fettsäuren im Pansensaft von Rehen und Mufflons ermittelt.
Erste Untersuchungen wurden bereits an Jungtieren im Zeitraum Juni - August 1996, 1997 und 1998 durchgeführt. Voruntersuchungen an Tieren mit Pansenfistel fanden im Juli und August 1996 statt. Zur saisonalen Differenzierung der Ingestakinetik (Hauptversuch) wurde der Untersuchungszeitraum von April 1997 bis Juni 1998 gewählt.
Das Tierversuchsvorhaben wurde beim Ministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Forsten des Landes Brandenburg gemäß Tierschutzgesetz in der Fassung der Bekanntmachung vom 17. Februar 1993 angezeigt und durch dieses bestätigt.
Für die Versuche wurden insgesamt 6 Rehe und 5 Mufflons erfolgreich handaufgezogen. Die Mufflonlämmer und zwei Rehkitze wurden auf der Versuchsstation des Instituts für Zoo- und Wildtierforschung (IZW) in Niederfinow geboren. Drei Rehkitze wurden vom Tierpark Stendal und ein Kitz vom Tierpark Bernau erworben (Tab. 2).
Durch die Handaufzucht wurden die Tiere auf den Menschen geprägt. Analysen zu Auswirkungen der Handaufzucht auf das Verhalten von Rehen ( S chmidt-Pauly 1979) und Erfahrungen bei der Aufzucht von Mufflons ( B riedermann 1993) zeigten, daß alle männlichen Tiere, die Prägungserscheinungen aufweisen, meistens ab einem Alter von einem Jahr Aggressionen untereinander und gegenüber Menschen zeigen. So wurden die männlichen Rehkitze im Alter von 10 Wochen und die Mufflonwidder mit 10 Monaten kastriert. Danach konnten keine Probleme im Umgang mit den männlichen Tieren festgestellt werden.
16
Tab. 2: Beschreibung der Versuchstiere
|
Tierart |
Name |
geboren |
gestorben |
Geschlecht |
Herkunft |
|
Reh |
Ali |
25.05.1995 |
31.10.1997 |
männlich |
Niederfinow |
|
|
Bobby |
25.05.1995 |
06.08.1997 |
männlich |
Niederfinow |
|
|
Willi |
04.06.1996 |
13.01.1999 |
männlich |
Stendal |
|
|
Ulla |
04.06.1996 |
|
weiblich |
Stendal |
|
|
Kalle |
06.06.1996 |
|
männlich |
Stendal |
|
|
Fritz |
12.06.1996 |
07.09.1998 |
männlich |
Bernau |
|
Mufflon |
Marie |
11.03.1996 |
|
weiblich |
Niederfinow |
|
|
Sophie |
24.03.1996 |
|
weiblich |
Niederfinow |
|
|
Paul |
24.03.1996 |
|
männlich |
Niederfinow |
|
|
Tom |
17.03.1996 |
|
männlich |
Niederfinow |
|
|
Rocco |
02.04.1996 |
09.04.1998 |
männlich |
Niederfinow |
Erste Untersuchungen zur Verweildauer der Ingesta distal des Vormagens wurden an Jungtieren (Tab. 3) während der Handaufzucht in zwei Altersstufen durchgeführt.
Ein Reh (Kalle) war bereits vor der Operation der Fistel so scheu, daß es nicht operiert wurde und für weitere Versuche nicht einzusetzen war. Vorversuche zur Ingestakinetik erfolgten an zwei Rehen mit Vormagenfistel (Ali, Bobby), an denen aufgrund einer Durchfallerkrankung und anschließendem Tod die Versuche zur saisonalen Veränderung der Ingestakinetik nicht vorgenommen werden konnten. Ein Reh ebenfalls mit Zugang zum dorsalen Pansensack (Fritz) konnte auch nicht in die Hauptversuche einbezogen werden, da es nach der Operation nicht mehr ausreichend vertraut blieb. Es konnten letztlich nur noch zwei Rehe (Willi, Ulla) und fünf Mufflons (ein Mufflon ist zwei Monate vor Versuchsende gestorben) im Alter von einem Jahr für die saisonalen Untersuchungen genutzt werden.
Die Mufflonschafe waren während des ersten Versuches im April 1997 hoch tragend. Nach dem Setzen wurden die Lämmer für weitere Handaufzuchten von den Muttertieren getrennt.
Das Gewicht der Tiere zu Beginn (zur Operation) und zum Ende der saisonalen Versuche ist in Tabelle 4 dargestellt.
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Tab. 3: Alter und Gewicht der Versuchstiere zur Bestimmung der Retentionszeit von Flüssigkeit distal des Vormagens in zwei Altersstufen
|
Tierart |
Name |
Versuch 1 Alter (Tage) |
Versuch 1 Gewicht (kg) |
Versuch 2 Alter (Tage) |
Versuch 2 Gewicht (kg) |
|
Reh |
Ali1 |
26 |
3,2 |
68 |
8,8 |
|
|
Bobby1 |
26 |
3,0 |
68 |
8,7 |
|
|
Willi1 |
26 |
3,9 |
69 |
9,7 |
|
|
Ulla1 |
26 |
3,6 |
69 |
9,1 |
|
|
Kalle1 |
24 |
3,3 |
67 |
8,2 |
|
|
Raja2 |
36 |
5,3 |
75 |
10,0 |
|
|
Nitscha2 |
36 |
5,8 |
75 |
11,0 |
|
|
Jimmy2 |
29 |
3,6 |
68 |
7,2 |
|
Mufflon |
Marie1 |
68 |
11,1 |
154 |
19,8 |
|
|
Sophie1 |
55 |
10,1 |
141 |
20,9 |
|
|
Tom1 |
62 |
11,5 |
148 |
25,5 |
|
|
Paul1 |
55 |
11,0 |
141 |
24,9 |
|
|
Bruno2 |
97 |
15,7 |
154 |
20,0 |
|
|
Flora2 |
96 |
13,6 |
153 |
17,5 |
|
|
Ivan2 |
87 |
11,7 |
144 |
15,0 |
|
|
Moni2 |
83 |
13,0 |
140 |
17,5 |
1selbst handaufgezogen
2aufgezogen durch Frau B. Klein und Frau K. Lason
Tab. 4: Gewichte der Versuchstiere vor und nach den saisonalen Versuchen
|
Tierart |
Name |
Gewicht (kg) Dezember 1996 |
Gewicht (kg) Juni 1998 |
|
Reh |
Willi |
19,0 |
25,0 |
|
|
Ulla |
17,5 |
22,5 |
|
Mufflon |
Marie |
27,5 |
29,5 |
|
|
Sophie |
28,5 |
29,5 |
|
|
Rocco |
32,5 |
|
|
|
Tom |
34,5 |
33,0 |
|
|
Paul |
35,5 |
37,0 |
18
Wildtiere, vor allem Rehe, sind sehr scheu und haben eine große Fluchtdistanz. Um die Wildtiere für ernährungsphysiologische Untersuchungen intensiver und regelmäßig handhaben zu können, war eine Flaschenaufzucht der Jungtiere erforderlich. Nur mit den handzahmen Tieren konnten Untersuchungen zur Ingestakinetik direkt am Tier unter natürlichen Bedingungen und ohne Sedation durchgeführt werden.
Von Mai bis Juli 1995 erfolgte die Handaufzucht von zwei Rehkitzen in der Revierförsterei Störitz. Von März bis Juli 1996 sind fünf Mufflonlämmer und vier weitere Rehkitze in der Versuchsstation des IZW in Niederfinow handaufgezogen worden.
In Abhängigkeit von der Zeit der Prägung erfolgte die Trennung der Mufflonlämmer von den Muttertieren etwa 24 Stunden nach der Geburt, während die Rehkitze erst nach drei bis sechs Tagen von den Ricken getrennt wurden. So hatten die Jungtiere die Möglichkeit, Immunstoffe und Vitamine über die Kolostralmilch aufzunehmen.
Die Jungtiere wurden in kleinen Gehegen (ca. 100 m2) mit einem Zugang zu einer kleinen Holzhütte, in der über dem Heulager eine Wärmequelle (Infrarotlampe) installiert war, untergebracht.
Zur Flaschenfütterung wurden handelsübliche Breisauger mit Ventil und Flaschen zur Säuglingspflege (Nuk) und als Milchnahrung der Milchaustauscher Salvana Lämmermilch (Salvana, Elmshorn-Sparrieshoop, Deutschland; Ansatz: 16 g Milchpulver auf 100 ml abgekochtes Wasser; Inhaltsstoffe: 23 % Rohprotein, 25 % Rohfett, 0,1 % Rohfaser, 8 % Rohasche, 1,9 % Lysin, 1,8 % Mineralien, Vitamin A, D3, E) verwendet. Die Milch wurde mit einer Temperatur von 39 - 40 °C gefüttert. Die täglichen Milchgaben wurden nach Fütterungsvorschlägen ( D rescher-Kaden 1972, B riedermann 1993) und nach dem individuellen Energiebedarf der Tiere in Abhängigkeit vom Gewicht ermittelt. Die angebotene Milchmenge (Tab. 5) wurde schrittweise beim Reh bis auf 1000 ml * Tag-1 * Tier-1 und beim Mufflon bis auf 1680 ml * Tag-1 * Tier-1 - verteilt auf vier Trinkportionen beim Reh und sechs Milchgaben beim Mufflon - erhöht. Ab der 8. Lebenswoche wurden die Jungtiere allmählich von der Milch entwöhnt, da sie genügend feste Nahrung aufnahmen.
Während der gesamten Aufzuchtperiode wurden den Tieren zusätzlich zur Milch Kälberpellets (Märka, Eberswalde, Deutschland; Inhaltsstoffe: 18 % Rohprotein, 2,8 % Rohfett, 9,2 % Rohfaser, 6,6 % Rohasche, 1,8 % Mineralien, Vitamin A, D3, E), Haferflocken, Heu, frisch geschnittene Laubholzzweige, Wasser, frische Erde und ein Salzleckstein angeboten.
Die sonst bei den Kitzen durch die Ricke durchgeführte Nabel- und Analmassage zur besseren Verdauung und zur regelmäßigen Ausscheidung des Kots und Urins wurde nach jeder Milchgabe mit der Hand vorgenommen. Bei den Mufflonlämmern war diese Massage nicht notwendig.
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Tab. 5: Angebotene Milchmengen und Trinkportionen zur Aufzucht von Rehen und Mufflons
|
Lebens- tag |
Lebens-woche |
Reh Trinkportionen je Tag |
Reh Milchmenge (ml * d-1) je Tier |
Mufflon Trinkportionen je Tag |
Mufflon Milchmenge (ml * d-1) je Tier |
|
1 |
1 |
7 |
210 |
7 |
210 |
|
2 |
1 |
7 |
210 |
7 |
350 |
|
3 |
1 |
7 |
210 |
7 |
400-500 |
|
4 |
1 |
7 |
210 |
7 |
500-650 |
|
5 |
1 |
7 |
280 |
7 |
600-800 |
|
6 |
1 |
7 |
280 |
7 |
700-900 |
|
7 |
1 |
7 |
280 |
7 |
800-1000 |
|
|
2 |
7-6 |
280-500 |
6 |
900-1200 |
|
|
3 |
6-5 |
500-700 |
6 |
1100-1400 |
|
|
4 |
5 |
700-900 |
6 |
1300-1500 |
|
|
5 |
5 |
900-1000 |
6 |
1680 |
|
|
6 |
5-4 |
1000 |
6 |
1680 |
|
|
7 |
4 |
1000 |
6 |
1680 |
|
|
8 |
4 |
1000 |
6 |
1680 |
|
|
9 |
4-3 |
1000-750 |
5 |
1400 |
|
|
10 |
3-2 |
750-500 |
4 |
1200 |
20
Den Tieren (4 Rehe und 5 Mufflons) wurde im Alter zwischen 7 und 10 Monaten in der linken Flanke eine Vormagenkanüle (Silikonmaterial: Gummiwerk Ernst Frölich GmbH, Osterode, Deutschland; Innendurchmesser 10 mm, Außendurchmesser 15 mm) zum dorsalen Pansensack dauerhaft implantiert, um einen permanenten Zugang zum Vormagen zu haben (Abb. 2).
Abb. 2: Reh mit implantierter Pansenfistel
Durchführung der Operation:
Die Immobilisation der Tiere erfolgte über eine Injektion von Ketamin (10 %; Albrecht, Aulendorf, Deutschland) und Xylazin (Rompun; Bayer, Leverkusen, Deutschland) als Mischinjektion i.m. (Tab. 6) mit einem Blasrohr (Dan-Injekt). Anschließend werden die Tiere durch Intubation für die Operation in eine Gasnarkose mit Isofluran (Dosierung nach Wirkung 0,5 - 2,0 Vol% in reinem Sauerstoff) überführt.
Tab. 6: Anästhetika für Reh und Mufflon
|
|
Ketamin (mg * kg-1) |
Xylazin (mg * kg-1) |
|
Reh |
3,5 |
1,25 |
|
Mufflon |
3,5 |
2,5 |
Die linke Flanke (hinter den Rippenbogen, ca. 20 cm * 20 cm) wurde geschoren, rasiert und desinfiziert. Ein intravenöser Zugang zu der V. jugularis mittels Braunüle und NaCl-Dauertropf wurde gelegt. Nach der Lokalanästhesie (10 ml Lidokain, 2 %) des Schnittbereiches und dem Abdecken des unsterilen Bereiches mit einem OP-Tuch wurde eine zweite Hautdesinfektion durchgeführt.
21
4 cm hinter dem Rippenbogen und 2 cm unterhalb der Lendenwirbelquerfortsätze beginnend wurden etwa 10 cm senkrecht die Unterhaut, abdominale Muskelschichten, Fascia transversalis und das Bauchfell durchtrennt. Mit Hilfe einer Uterusfaßzange wurde der dorsale Pansensack vorgelagert und mit zwei Darmklemmen ein Pansenabschnitt isoliert. Auf diesem Abschnitt wurde eine Tabaksbeutelnaht (Vicrylfaden) angelegt und anschließend der Vormagen geöffnet. Nach dem Einführen der Pansenkanüle in die Öffnung erfolgte ein einstülpendes Verschließen der Tabaksbeutelnaht und das Anlegen einer zweiten Tabaksbeutelnaht (Vicrylfaden). Zur Stabilisierung der Bauchwand wurde außen auf den Pansen ein mit Penicillin LA getränktes Prostex-Implantat (Durchmesser 4 cm) aufgenäht. Nach der Rückverlagerung des Pansens in die Bauchhöhle wurde der Kanülenschaft durch die Bauchdecke im Winkel zwischen Rippenbogen und Lendenwirbelquerfortsätzen durchgeführt. Das Bauchfell zusammen mit dem Musculus transversalis abdominalis (fortlaufende Kirschnernaht, Catgut 03 metric), die übrigen Muskelschichten (Sultansche Diagonalhefte, Catgut), die Unterhaut (fortlaufende Naht, Catgut) und die Oberhaut (Einzelhefte, Filovet mittelstark) wurden verschlossen.
Die Pansenkanüle wurde durch ein Innenrohr (Gewebe-Kulturröhrchen) mit Schraubverschluß stabilisiert und verschlossen und mit einer Überwurfmanschette mittels Schlauchschelle befestigt (Abb. 3). Nach Wundbehandlung (Pflasterspray) und Infektionsprophylaxe (10 ml Penicillin LA, intramuskulär) wurden die Tiere bis zum Erscheinen erster Stellreflexe mit reinem Sauerstoff versorgt, danach extubiert und, falls in Einzelfällen erforderlich, die 
2-Rezeptorenwirkung des Xylazins mittels Yohimbin (Yohimbine; Sigma, Deisenhofen, Deutschland; 0,3 mg * kg-1; 1%ige Lösung) antagonisiert.
Abb. 3: Implantierte Vormagenfistel
Nach 10 Tagen wurden die Tiere durch Blasrohrinjektion (s.o.) zur Entfernung der Oberhautfäden immobilisiert. Der Sitz der Kanüle wurde während der gesamten Versuchsperiode regelmäßig kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert. Erste Versuche mit den Tieren konnten drei Monate nach der Implantation der Kanüle durchgeführt werden.
22
Die Tiere wurden auf der Versuchsstation des Instituts für Zoo- und Wildtierforschung (IZW) in Niederfinow in Gehegen im Gruppenverband gehalten.
Das Rehgehege unterteilte sich in eine Wildwiese (ca. 4000 m2) mit Obstbäumen (Malus sylvestris, Prunus domestica, Pyrus domestica, Prunus avium), Nadelbäumen (Pseudotsuga menziesii, Pinus sylvestris, Picea abies) und Sträuchern und in ein separates Gehege (ca. 600 m2) mit gleicher Vegetation, in dem die Markereingabe und die Probennahme erfolgte.
Die Mufflons waren auf einer ca. 1400 m2 großen Luzerne-Gras-Wiese (Medicago sativa, Lolium perenne) mit angrenzenden Laubbäumen (Salix alba, Populus tremula) und einem Holzunterstand untergebracht.
Zur Gewährleistung der Versuchsdurchführung auch in der Nacht wurde in beiden Gehegen Licht installiert, das nur bei Dunkelheit während der Probennahme in Betrieb war.
Ergänzend zur natürlichen Vegetation erhielten die Tiere je nach Jahreszeit eine Zusatzfütterung (Tab. 6), die einmal täglich zwischen 500 und 700 Uhr erfolgte. Weiterhin wurden den Rehen zur gesamten Versuchszeit frische bzw. getrocknete Laubzweige (Quercus robur, Betula pendula, Acer platanoides, Salix alba, Populus tremula, Populus nigra) und den Mufflons von November bis April Kiefernzweige (Pinus sylvestris) ad libitum gereicht. Frisches Wasser stand täglich ad libitum zur Verfügung.
Tab. 7: Zusatzfütterung der Rehe und Mufflons
|
Futter |
Rehe Fütterungs- zeitraum |
Rehe Menge (kg * d-1) je Tier |
Mufflons Fütterungs- zeitraum |
Mufflons Menge (kg * d-1) je Tier |
|
Heu |
Dez - Mai |
ad libitum |
Okt - Juni |
ad libitum |
|
Kälberpellet |
Jan - Dez |
0,1 |
Jan - Dez |
0,1 |
|
Hafer |
Jan - Dez |
0,1 |
Jan - Dez |
0,1 |
|
Möhren |
Okt - April |
1 |
März - April |
1 |
|
Futterrüben |
|
|
Okt - Feb |
ad libitum |
|
Apfeltrester |
Nov - April |
0,5 |
|
|
23
Während der Versuchsperioden wurden die maximalen und minimalen Temperaturen und die Niederschläge aufgezeichnet (Tab. 8), damit der Einfluß der Witterung auf das Verhalten der Tiere berücksichtigt werden konnte.
Tab. 8: Witterung während der Versuchsperioden
|
Versuchsperiode |
minimale Temperaturen (°C) |
maximale Temperaturen (°C) |
Niederschlag/ Besonderheiten |
|
01.04.-08.04.1997 |
-4 bis +6 |
+2 bis +13 |
Regen-,Hagel-, Schneeschauer |
|
04.05.-10.05.1997 |
0 bis +11 |
+11 bis +20 |
am 06.05. Gewitter, bedeckt |
|
03.06.-07.06.1997 |
+10 bis +15 |
+22 bis +28 |
Sonne |
|
28.06.-02.07.1997 |
+16 bis +22 |
+22 bis +31 |
Sonne, Gewitter |
|
06.08.-10.08.1997 |
+15 bis +17 |
+23 bis +30 |
Sonne |
|
02.09.-06.09.1997 |
+15 bis +19 |
+20 bis +25 |
Sonne, bedeckt, am 06.09. Schauer |
|
06.10.-10.10.1997 |
+10 bis +15 |
+15 bis +20 |
Sonne, Regenschauer |
|
03.11.-07.11.1997 |
-3 bis +6 |
+3 bis +14 |
Sonne, Regenschauer, Nebel |
|
01.12.-05.12.1997 |
-3 bis +2 |
+1 bis +3 |
bedeckt, Regen- und Schneeschauer |
|
05.01.-10.01.1998 |
+3 bis +9 |
+5 bis +11 |
bedeckt, Dauerregen, Regenschauer, Wind |
|
02.02.-07.02.1998 |
-11 bis +2 |
-4 bis +5 |
8 cm Neuschnee, bedeckt, Tauwetter |
|
02.03.-06.03.1998 |
-3 bis +6 |
+5 bis +15 |
Dauerregen, Regenschauer, Wind |
|
30.03.-04.04.1998 |
+3 bis +10 |
+6 bis +18 |
bedeckt, Dauerregen, Regenschauer, Nebel |
|
04.05.-08.05.1998 |
+5 bis +13 |
+10 bis +20 |
am 04.05. Regen, bedeckt, ab 08.05. Sonne |
|
04.06.-08.06.1998 |
+13 bis +18 |
+21 bis +34 |
Sonne, Gewitter |
24
Aus einer Vielzahl in der Literatur angegebenen Marker wurden die Flüssigkeitsmarker Cr-EDTA und Co-EDTA und der Partikelmarker Chrom markiertes Heu ausgewählt und nach den von B innerts et al. (1968) und U dén et al. (1980) beschriebenen Methoden hergestellt.
25 g Co(II)acetat * 4H2O, 29,2 g EDTA und 4,3g LiOH * H2O wurden in 200 ml Aqua dest. durch Erwärmen gelöst. Nach dem Abkühlen wurde 20 ml H2O2 (30%ig) dazugegeben und bei Raumtemperatur 2-3 Stunden stehen gelassen. Nach der Zugabe von 300 ml 95%igem Ethanol wurde die Lösung über Nacht gekühlt und das auskristallisierte Co-EDTA durch Filtrieren von der Lösung getrennt. Der Filterrückstand wurde mit 80%igem Ethanol gewaschen und getrocknet ( U dén et al. 1980). Die Co-EDTA-Kristalle können nach Bedarf in Aqua dest. gelöst werden. Die Co-Konzentration des verwendeten Flüssigkeitsmarkers betrug 11,5 g * l-1.
143,88 g CrCl3 * 6 H2O und 201 g Na2EDTA * 2 H2O (Titriplex III) wurden getrennt in 1000 ml bzw. 1500 ml Aqua dest. durch Erwärmen gelöst. Die beiden Lösungen wurden zusammengebracht und ca. eine Stunde gekocht. Nach 10-15 Minuten erfolgt ein Farbumschlag der Lösung. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wurde ein eventueller Überschuß an EDTA mit 5,88 g CaCl2 * 2 H2O (40 mmol) gebunden und mit Aqua dest. auf 3000 ml aufgefüllt. 10N NaOH (ca. 110 ml) wurde für die Einstellung des pH-Wertes auf 6,0 verwendet ( B innerts et al. 1968). Die Cr-Konzentration der Cr-EDTA-Lösung betrug 9 g * l-1.
Das getrocknete Heu wurde mit einer Mühle (Retsch Mühle SM1, Haan, Deutschland) zerkleinert (< 2 mm Partikelgröße). Zur besseren Bindung des Markers an die Fasern wurden die löslichen Bestandteile des Heus 4 Stunden bei Zimmertemperatur mit Natrium-lauryl-sulfat (20 g * l-1) gelöst. Über einem Sieb (1 mm Porengröße) wurden die Partikel mit Wasser und Aceton gewaschen und anschließend bei 65 °C im Trockenschrank (Memmert UM 600, Kl.1, Schwabach, Deutschland) getrocknet.
Die Markierung der Partikel erfolgte 24 Stunden bei 100 °C in Na2Cr2O7-Lösung, die ein Cr-Äquivalent von 13 % des Partikelgewichtes hat (ca. 33 g Na2Cr2O7 für 100 g Partikel). Das Gefäß wurde dabei mit Aluminiumfolie abgedeckt. Anschließend wurden die Partikel über einem Sieb (1 mm Porengröße) mit Wasser gewaschen, mit Wasser bedeckt und mit Ascorbinsäure (50 % des Partikelgewichtes) eine Stunde inkubiert. Zum Entfernen des überschüssigen Markers wurden die Partikel erneut mit Wasser gewaschen und bei 65 °C getrocknet ( U dén et al. 1980). Die Cr-Konzentration des Cr-Heus betrug 70 mg * g-1 TS.
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Zur Untersuchung der Verweildauer der Ingesta distal des Vormagens wurde den Jungtieren in zwei verschiedenen Altersstufen zu einer Flaschenfütterung 5 bis 10 ml Cr-EDTA (45 - 90 mg Cr) als Flüssigkeitsmarker vermischt mit dem Milchaustauscher verabreicht. Anschließend wurde von jedem Tier an den drei folgenden Tagen im Intervall von 2 bis 4 Stunden Kot gesammelt und bis zur Markerbestimmung eingefroren.
Die saisonalen Versuche zur Ingestakinetik fanden in einem Zeitraum von 15 Monaten jeweils am Monatsanfang statt. Den Tieren wurde 10 bis 20 ml Co-EDTA (115 - 230 mg Co) als Flüssigkeitsmarker über einen Besamungskatheder und 1 bis 5 g Cr-Heu (70 - 350 mg Cr) in Form einer gefrorenen Stange (_ 10 mm) über die Fistel eingegeben (Abb. 4). Der zur Analyse der kurzkettigen Fettsäuren erforderliche Pansensaft wurde zuvor über die Fistel mit einer Spritze (Vol: 20 ml), die mit einem 30 cm langen Kunststoffrohr (_ 4 mm) mit Bohrungen am unteren Ende verbunden war, entnommen. Nach der Markereingabe wurde über 24 Stunden alle zwei Stunden Pansensaft entnommen und über 5 Tage im Intervall von 2 bis 4 Stunden Kot gesammelt. Pansensaft- und Kotproben wurden bis zur Analyse eingefroren.
Abb. 4: Markereingabe beim Reh
26
Von allen Kotproben wurde der Trockensubstanzgehalt bestimmt. Dazu wurde die gesamte Probe gewogen (Satorius M, Göttingen, Deutschland), bei 80 °C (BSU 100, MLW Labortechnik, Ilmenau, Deutschland) bis zur Gewichtskonstanz getrocknet und wieder gewogen. Die Kotproben wurden mit einer Mühle (Krups, KM 75, Solingen, Deutschland) gemahlen (< 1 mm Partikelgröße) und bis zur Markeranalyse in Tüten trocken aufbewahrt.
Zur Bestimmung der Konzentrationen der wasserlöslichen Flüssigkeitsmarker im Kot wurde ein Aufschluß mit Aqua dest. durchgeführt. Dazu wurden 0,3 g Probenmaterial mit der Analysenwaage (Satorius MC 1, Göttingen, Deutschland) abgewogen und mit 10 ml Aqua dest. (Dispenser Fortuna Optifix basic 10) vermischt (MS 1 Minishaker, IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland). Diese Lösung wurde über Nacht geschüttelt (KS 250 basic, IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland) und anschließend 20 min bei 3000 U * min-1 (1902g) zentrifugiert (Kühlzentrifuge Hettich Rotana/TCR 4401, Tuttlingen, Deutschland). Im Überstand wurden die Cr- bzw. Co-Konzentrationen durch Atom-Absorptions-Spektroskopie (AAS) bestimmt.
Es gibt verschiedene Methoden zur Messung von an organischem Material gebundenem wasserunlöslichen Chrom. Nach U dén et al. (1980) erfolgte die Chrom-Messung durch Neutronenaktivierung (51Cr) in einem Gammaspektrometer. In W elz und Sperling (1997) sind Trocken- und Naßveraschung zur Analyse von Pflanzenmaterial für die Flammen-AAS beschrieben.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Naßveraschung zur Cr-Bestimmung im Kot mit dem Spektrophotometer für Flammen-AAS optimiert. Hierzu wurden verschiedene Testreihen mit Cr-Heu (Einwaagen je Testreihe: 5, 10, 15 und 25 mg Cr-Heu) unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Die Ergebnisse der Naßveraschungen mit den verschiedenen Säuren zeigten, daß Königswasser und HCl Chrom schlechter lösten als HNO3 und H2SO4. Die weiteren Testaufschlüsse wurden mit H2SO4 durchgeführt, da diese Säure einfach einsetzbar ist und keine nitrosen Gase wie HNO3 bildet.
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Alle Messungen der Testreihen ergaben, daß 72%ige H2SO4 für die Naßveraschung am besten geeignet war, wobei 5 ml Reagenz zum Lösen des Chroms genügten und ein Erhitzen während des Aufschlusses nicht erforderlich war.
Zur Optimierung der Methode wurde weiter anhand von Kotproben aus Voruntersuchungen an Rehen getestet, ob sich die Bestimmung von Kobalt im Aqua dest.-”Aufschluß“ von der des Säure-Aufschlusses unterscheidet. Diese Testmessungen zeigten keine Unterschiede zwischen den beiden Methoden zur Probenvorbereitung. So konnten jeweils Cr- und Co-Konzentrationen in der gleichen Säureaufschlußlösung bestimmt werden.
Die Testreihen und die Voruntersuchungen führten zu folgenden Bedingungen für die Analyse der Kotproben:
0,3 - 0,4 g Kot wurde mit 5 ml 72%ige H2SO4 (Dispenser Fortuna Optifix solvents, Roth, Karlsruhe, Deutschland) vermischt (MS 1 Minishaker, IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland) und über Nacht ohne Erwärmung bei 200 U * min-1 geschüttelt (KS 250 basic, IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland). Nach der Zugabe von 40 ml Aqua dest. und intensivem Schütteln wurden 20 ml der Lösung filtriert. In dem Filtrat konnten anschließend die Co- und Cr-Konzentrationen atom-absorbtions-spektrometrisch gemessen werden Für die Doppelbestimmung wurden alle Proben zweimal aufgeschlossen.
Zur Charakterisierung der Methode wurde eine lineare Regression (T-Test) über die gemessenen Cr-Konzentrationen für verschiedene Einwaagen von Cr-Heu durchgeführt (Abb. 5) (t = 65,809, p < 0,0001). Der Variationskoeffizient (VK) betrug für diese 10 Aufschlüsse 6,98 %.
Abb. 5: Cr-Konzentration von Cr-Heu in Abhängigkeit von der Einwaage
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Die Flammen-AAS ist eine instrumentelle Analysenmethode zum quantitativen Nachweis von Metallen und Halbmetallen. Die zu analysierende Flüssigkeit wird durch einen Schlauch abgesaugt und in einer Mischkammer über eine Prallkugel gespritzt. Dabei wird die Flüssigkeit zerstäubt. Die Flamme dissoziiert dieses Aerosol in Atome, die das Licht bei einer bestimmten Wellenlänge der Primärlichtquelle absorbieren ( W elz und Sperling 1997). Diese Absorption wird gemessen und entsprechend der Eichgeraden als Konzentration angezeigt.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Konzentrationen von Co und Cr im Kot mit dem Flammen-Atom-Absorptions-Spektrophotometer (Perkin Elmer AAS 3300, Überlingen, Deutschland) unter Verwendung einer Luft-Acetylen-Flamme und von Einzelelement-Hohlkatodenlampen (Co: 30-40 mA, Cr: 25-30 mA), die Spektrallinien des jeweiligen Elements lieferten, bestimmt.
Vor jeder Meßreihe wurde eine Kalibrierung mit Aqua dest. und vier Standardlösungen (500, 1000, 1500, 2000 µg * l-1) durchgeführt. Die Herstellung der Standards erfolgte durch Verdünnen der Stammlösungen mit Aqua dest.. Die Stammlösungen enthielten eine Konzentration des zu analysierenden Elements von 1 g * l-1 :
Co-Stammlösung: 2,2032 g CoCl2 in 1 l Aqua bidest. lösen
Cr-Stammlösung: 5,1235 g CrCl3 * 6 H2O in 1 l Aqua bidest. lösen.
Der lineare Meßbereich zur Bestimmung von Kobalt und Chrom lag zwischen 0 und 2000 µg * l-1. Lösungen mit Konzentrationen außerhalb des Meßbereiches wurden entsprechend mit Aqua dest. verdünnt. Eine Messung bestand aus drei Meßwiederholungen mit einem Meßabstand von 0,5 s und einer Meßdauer von je 1 s. Die Nachweisgrenzen lagen für Kobalt bei 0,01 mg * l-1 und für Chrom bei 0,003 mg * l-1. Der Variationskoeffizient für drei Meßwiederholungen betrug für die Co-Messungen 1,09 ± 0,80 % und für die Cr-Messungen 3,27 ± 1,19 % (Beispiel: Ulla November 1997, Proben 2 bis 14).
Wegen der möglichen Kontamination durch die Schwefelsäure wurde stets eine Blindprobe (5 ml 72%ige H2SO4, 40 ml Aqua dest.) ohne Probenmaterial angesetzt und gemessen. Bei verdünnten Proben wurde der Blindwert ebenfalls entsprechend verdünnt und gemessen. Die Korrektur mittels Blindprobe und Speicherung der Meßwerte (mg * l-1) erfolgte automatisch durch das Bedienungsprogramm AA Winlab 2.2.
Für die Probenanalyse wurden die in Tabelle 9 aufgeführten Parameter gewählt.
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Tab. 9: AAS-Parameter zur Co- und Cr-Bestimmung
|
Parameter |
Co |
Cr |
|
Wellenlänge (nm) |
240,7 |
357,9 |
|
Spaltbreite (nm) |
0,2 |
0,7 |
|
Luftfluß (l * min-1) |
8 |
10 |
|
Acetylenfluß (l * min-1) |
1,6 |
3,8 |
Die Konzentrationen von Co bzw. Cr im Kot - bezogen auf die Trockensubstanz - wurden wie folgt berechnet:
|
CKot |
= |
Konzentrationen von Co bzw. Cr im Kot (mg * kg-1 TS) |
|
Cgem |
= |
Gemessene Konzentrationen von Co bzw. Cr in der verdünnten Probenlösung (mg * l-1) |
|
df |
= |
Verdünnungsfaktor |
|
V |
= |
Volumen der unverdünnten Aufschlußlösung (ml) |
|
EW |
= |
Probeneinwaage (g) |
Die MRT von Flüssigkeit und Partikeln (< 2 mm Partikelgröße) im gesamten Magen-Darm-Kanal wurde aus dem Integral des Verlaufes der Markerkonzentrationen (Co, Cr) im Kot in Abhängigkeit von der Zeit nach der Markereingabe (Abb. 6) berechnet ( C oombe und Kay 1965, F aichney 1975, T hielemans et al. 1978):
|
MRTGIT |
= |
Mittlere Retentionszeit von Flüssigkeit bzw. Partikeln im GIT (h) |
|
ti |
= |
Zeit der Probennahme nach der Markereingabe (h) |
|
Ci |
= |
Co- bzw. Cr-Konzentration im Kot zur Zeit ti (mg * kg-1 TS) |
|
dti |
= |
Intervall zwischen zwei Probennahmen:  |
30
Abb. 6: Verlauf der Markerkonzentrationen (Beispiel: Co, Reh Ulla, März 1998) im Kot in Abhängigkeit von der Zeit nach der Markereingabe
Die Abnahme des Flüssigkeitsmarkers (Ci in mg * kg-1 TS) im Kot zeigte einen exponentiellen Verlauf in Abhängigkeit von der Zeit ti der Probennahme entsprechend mit der Gleichung
Abb. 7: Verlauf der logarithmischen Markerkonzentrationen (Beispiel: Co, Reh Ulla, März 1998) in Abhängigkeit von der Zeit nach der Markereingabe
31
Da die Analyse von Kobalt und Chrom im Kot durch AAS in den niedrigen Konzentrationsbereichen (C < 0,1 mg * l-1) nicht mehr genau genug war, wurden die Zeiten für Konzentrationswerte nahe Null: C = 1 mg * kg-1 TS (lnC = 0) und C = 0,367 mg * kg-1 TS (lnC = -1) durch die Regressionsanalyse berechnet und als letzte Zeit- und Konzentrationswerte zur Bestimmung der MRT von Flüssigkeit und Partikeln im GIT verwendet.
Beim Wiederkäuer ist die Verweilzeit von Partikeln im gesamten Gastro-Intestinal-Trakt (MRTPart.GIT) aufgrund des Vormagens länger als die der Flüssigkeit (MRTFlüss.GIT). Da nach L echner-Doll (1986), H eller et al. (1986 b) und L echner-Doll und Engelhardt (1989) Partikel und Flüssigkeit distal des RR in gleicher Rate transportiert werden, müssen die Partikel im Ruminoretikulum länger als die Flüssigkeit verweilen. Die MRT der Partikel im RR (MRTPart.RR in h) konnte so aus der Verweilzeit der Flüssigkeit im RR (MRTFlüss.RR in h) plus der Zeit, die die Partikel länger im gesamten Magen-Darm-Kanal verweilen als die Flüssigkeit, berechnet werden:
Die Retentionszeit der Ingesta zwischen RR und Anus (MRTdistalRR in h) bei den Tieren mit Pansenfistel ergab sich aus:
Die MRT der Ingesta distal des Vormagens bei den Jungtieren wurde in gleicher Weise wie MRTGIT nach T hielemans et al. (1978) berechnet.
Der Selektivitätsfaktor (SF) ist das Verhältnis zwischen der MRT der Partikel im RR und der MRT der Flüssigkeit im RR ( L echner-Doll et al. 1991a):
32
Die von jedem Tier während des Versuches pro Tag ausgeschiedene trockene Kotmenge (KotTS24h in kg TS) wurde nach folgender Gleichung ( H olleman und White 1989) für Kobalt und Chrom vergleichend ermittelt:
|
D |
= |
eingegebene Co- bzw. Cr-Menge (mg) |
|
KotTSges |
= |
gesamte Kotmenge während der Versuchszeit tges (kg TS) |
|
tges |
= |
gesamte Versuchszeit (h) |
|
Ci |
= |
Konzentrationen von Co bzw. Cr zur Zeit ti (mg * kg-1TS) |
|
dti |
= |
Intervall zwischen zwei Probennahmen (h) |
Die gesamte Menge an unverdaulichem Material im Magen-Darm-Kanal (UMGIT in kg) sowie im Ruminoretikulum (UMRR in kg) wurde aus der ausgeschiedenen Kotmenge (KotTS24h in h) und der Retentionszeit der Partikel im Gastro-Intestinal-Trakt (MRTPart.GIT in h) bzw. im Ruminoretikulum (MRTPart.RR in h) geschätzt ( H oland 1994):
Der Pansensaft wurde aufgetaut und 20 min bei 3000 U * min-1 (1902g) zentrifugiert (Kühlzentrifuge Hettich Rotana/TCR 4401, Tuttlingen, Deutschland). Es wurden 2 ml des Überstandes für die Bestimmung der Co-Konzentrationen und 3 ml für die Analyse der kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) abgenommen.
Im Überstand wurden die Co-Konzentrationen durch Flammen-AAS mit gleichen Bedingungen wie zur Kotprobenanalyse gemessen.
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Die Konzentrationen von Kobalt im Pansensaft wurden wie folgt berechnet:
|
CPa |
= |
Co-Konzentration im Pansensaft (mg * l-1) |
|
Cgem |
= |
gemessene Co-Konzentration in der verdünnten Probenlösung (mg * l-1) |
|
df |
= |
Verdünnungsfaktor |
Die Co-Konzentration im Pansensaft zeigte einen exponentiellen Abfall (Abb. 8), der mit folgender Funktion beschrieben werden kann:
|
Ci |
= |
Co-Konzentration im Pansensaft zur Zeit t (mg * l-1) |
|
C0 |
= |
Eliminationsrate des Markers aus dem Ruminoretikulum je Zeiteinheit (h-1) |
|
k |
= |
Verdünnungsfaktor |
|
ti |
= |
Zeit der Probennahme nach der Markerinjektion (h) |
Abb. 8: Verlauf der Co-Konzentration im Pansensaft (Beispiel: Mufflon Rocco, August 1997) in Abhängigkeit von der Zeit nach der Markereingabe
Die mittlere Verweildauer der Flüssigkeit im RR (MRTFlüss.RR) wurde aus dem reziproken Wert der Eliminationsrate des Markers aus dem RR bestimmt ( F aichney 1975, H eller et al. 1986 b): MRTFlüss.RR = k-1.
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Das Flüssigkeitsvolumen des RR (VRR in l) wurde durch Division der eingegebenen Co-Menge (MCo in mg) durch die aus der Regressionsanalyse (Abb. 8) extrapolierte Co-Konzentration zur Zeit der Markerinjektion (C0 in mg * l-1) berechnet:
Die Flußrate der Flüssigkeit aus dem RR (FFlüss.RR in l * h-1) wurde aus dem RR-Flüssigkeitsvolumen (VRR in l) und der mittleren Retentionszeit der Flüssigkeit im RR (MRTFlüss.RR in h) ermittelt:
Drei Milliliter des Überstandes (Kapitel 2.7) wurden mit 50 µl HCl (37 %) versetzt, geschüttelt und 15 min bei 10000 U * min-1 (8944g) zentrifugiert (Beckmann GS-15R, München, Deutschland). Der klare Überstand wurde bis zur gaschromatographischen Analyse der SCFA im Kühlschrank aufbewahrt.
Die Bestimmung der kurzkettigen Fettsäuren erfolgte mit dem Gaschromatographen (GC) Perkin Elmer Autosystem (Perkin Elmer, Überlingen, Deutschland) mit automatischem Probengeber (Autosampler) und serieller Schnittstelle PE Nelson 600. Die vorgenommenen Analysen verliefen unter folgenden Bedingungen:
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Die Aufzeichnung der Chromatogramme, die Auswertung der Peakflächen und Angabe der Fettsäurenkonzentration (mmol * l-1) erfolgten mit dem Programm Perkin Elmer Nelson-Turbochrom 4.1. Dabei dienten zwei Fettsäuregemische (Tab. 10) als externe Standards.
Tab. 10: Zusammensetzung der externen Standards (mmol * l-1) für die SCFA-Analyse
|
Fettsäuren (mmol * l-1) |
Standard 1 |
Standard 2 |
|
Essigsäure |
40 |
80 |
|
Propionsäure |
15 |
30 |
|
iso-Buttersäure |
1 |
2 |
|
n-Buttersäure |
7,5 |
15 |
|
iso-Valeriansäure |
1 |
2 |
|
n-Valeriansäure |
1 |
2 |
Die molaren Anteile der verschiedenen SCFA (Mol% CFi) an der Gesamtfettsäurenkonzentration berechnen sich nach:
CFi = Konzentration der Fettsäuren (mmol * l-1)
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Die Datenerfassung erfolgte mit Hilfe des Datenbanksystems Excel 5.0 (1994). Graphiken wurden mit den Programmen SigmaPlot for Windows 2.03 (1986 - 1995) und Excel 7.0 (1995) erstellt. Anhand der Computerprogramme SPSS for Windows 6.1 (1994) und INSTAT Statistics 2.0 (1993) wurden folgende statistische Verfahren verwendet:
Die angewandten Verfahren hatten zum Ziel:
Der Saisonvergleich beim Reh und der Vergleich zwischen den beiden Tierarten Reh und Mufflon konnte aufgrund der geringen Anzahl der untersuchten Rehe (n=2) nicht statistisch geprüft werden.
Mittelwerte (arithmetisches Mittel) und Standardabweichungen (wenn n > 2) für jede Tierart wurden monatsweise berechnet und graphisch dargestellt. Jahresmittelwerte (MWJahr) und Standardabweichungen (SD) je Tierart wurden aus den Ergebnissen von Juli 1997 bis Juni 1998 ermittelt und im Text in der Form MWJahr ± SD angegeben. Der jeweils verwendete statistische Test ist im Ergebnisteil angeführt.
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