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1.  Einleitung

Die membranumschlossenen Organellen der eukaryontischen Zelle bilden sehr charakteris-tische Strukturen. Das Endoplasmatische Reticulum (ER) formt ein zusammenhängendes Netzwerk aus Membrantubuli und abgeflachten Membranzisternen, das mit der Unter-stützung des Cytoskeletts in der gesamten Zelle verteilt ist (Abb. 1A). Die polygonalen Membrannetzwerke befinden sich vor allem in der Peripherie der Zelle. Der Zellkern ist von einer inneren und einer äußeren Kernmembran umhüllt. Die äußere Kernmembran ist kontinuierlich mit der ER-Membran. Der Abstand von innerer und äußerer Kernmembran sowie die ”Dicke” der abgeflachten Membranzisternen des ER sind in elektronen-mikrokopischen Bildern relativ gleichmäßig, und liegen zwischen 30nm und 70nm (Abb. 1B). Die Kernhülle kann daher auch als eine besondere Form einer abgeflachten Membranzisterne betrachtet werden (Abb. 1C). Der Golgi-Apparat besteht ebenfalls aus abgeflachten Membranzisternen, die als Stapel um das Centrosom der Zelle orientiert sind. An den Übergängen des Golgi-Apparates zu den anderen Kompartimenten der Zelle bilden tubuläre und vesikuläre Membranstrukturen das Cis- und Trans-Golgi-Netzwerk.

Die membranumschlossenen Organellen sind dynamische Strukturen, deren Deassemblierung und Bildung gut während der Mitose beobachtet werden kann. In vielen Zellen zerfallen der Golgi-Apparat und das ER zu Beginn der Mitose in Membranvesikel, die am Ende der Mitose miteinander fusionieren und wieder Membranzisternen und -tubuli bilden (Warren, 1993). Die Deassemblierung und die zufällige Verteilung der Vesikel in der Mitose stellen auf einfache Art sicher, daß beide Tochterzellen einen Anteil der jeweiligen Organellen erhalten. Sowohl für das ER als auch für den Golgi-Apparat ist das Ausmaß der Deassemblierung abhängig vom Zelltyp (Warren, 1993; Stanley et al., 1997). In einigen Zellkulturzellen bleibt die netzwerkartige Struktur des ER in der Mitose nahezu vollständig erhalten. In diesem Fall wird das ER bei der Zellteilung wahrscheinlich als Netzwerk auf die beiden Tochterzellen verteilt (Yang et al., 1997; Ellenberg et al., 1997). Auch die Hülle des Zellkerns deassembliert in der Mitose. Es wird eine mehr oder weniger starke, wahrscheinlich vom Verhalten des ER abhängige, Fragmentierung der Kernhülle beobachtet (Warren, 1993). Bleibt das ER während der [Seite 2↓]Mitose intakt, so verteilt sich die Kernhülle in das Membrannetzwerk des ER (Yang et al., 1997; Ellenberg et al., 1997). Am Ende der Mitose reassembliert die Kernhülle, indem die Vesikel der Kernmembran oder die Membrantubuli des intakt gebliebenen ER mit Hilfe von Chromatin-bindenden Proteinen der inneren Kernmembran an die aufgeteilten Chromosomen binden (Ellenberg et al., 1997; Wiese und Wilson, 1993). Die Fusion der Chromatin-gebundenen Membranvesikel oder Membrantubuli führt danach zur Bildung einer kompletten Kernhülle.


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Abb. 1: Die Struktur des ER und der Kernhülle

Auch in der Interphase ist das ER ein sehr dynamisches Kompartiment, dessen Bildung in lebenden Zellen in Zellkultur mit Hilfe eines hydrophoben, fluoreszierenden Farbstoffes, der relativ spezifisch die ER-Membranen anfärbt, untersucht wurde (Lee und Chen, 1988). Dabei wurden drei Vorgänge unterschieden, die die Bildung der polygonen Membrannetzwerke in der Peripherie der Zelle erklären können (Abb. 1D): 1. Von einem vorhandenen Membrantubulus kann ein neuer abzweigen, länger werden und mit einem anderen Membrantubulus fusionieren. Dieser Vorgang führt zur Bildung neuer Polygone (Ringbildung). 2. Ein Knotenpunkt, an dem drei Membrantubuli zusammentreffen, kann sich relativ zum Rest des Netzwerkes verschieben (Membrantubulus-Gleiten). 3. Durch solch eine Bewegung kann ein Polygon verschwinden (Ringschluß). Die Deassemblierung und Reassemblierung des ER in der Interphase des Zellzyklus könnte zum Beispiel notwendig sein, wenn die Zelle bei der Zellwanderung ihre Form verändert.

Im folgenden werden die Bildung des ER und des Golgi-Apparates einerseits und die Bildung des Zellkerns andererseits näher beschrieben. Während die Funktionen, die diese Organellen wahrnehmen, relativ gut verstanden sind, sind die Mechanismen für die Bildung dieser charakteristischen Membranstrukturen der eukaryontischen Zelle noch weitgehend unbekannt.

1.1. Struktur und Funktion des ER und des Golgi-Apparates

Die charakteristische Struktur des ER könnte durch seine Funktion in der Zelle begründet sein. Sekretorische Proteine müssen während oder nach Beendigung ihrer Translation zum ER gelangen und durch dessen Membran transportiert werden. Durch die gleichmäßige Verteilung des ER in der gesamten Zelle hat jedes neu translatierte Protein ER-Membranen in seiner Nähe und kann diese schnell erreichen. Aufgrund seiner netzwerkartigen Struktur hat das ER eine große Oberfläche und kann viele Bindungs- und Transportstellen für sekretorische Proteine zur Verfügung stellen. Nachdem ein Protein durch die Membran des ER transportiert worden ist, wird es im Lumen gefaltet und kann zu Proteinkomplexen assembliert werden. Oft werden Proteine durch das Anhängen von Oligosacchariden und die Bildung von Disulfidbrücken modifiziert. Diese Reaktionen laufen um so schneller ab, je konzentrierter die beteiligten Reaktionspartner vorliegen, und dies ist der Fall, je kleiner das luminale Volumen des ER ist. Schließlich muß das [Seite 5↓]sekretorische Protein das ER an hierfür spezialisierten Orten verlassen, indem es in Transportvesikel eingeschlossen wird, die vom ER abgeschnürt werden. Ein sekretorisches Protein kann wiederum um so schneller zu diesen ”Ausgängen” des ER gelangen, je kleiner des luminale Volumen ist. Insgesamt ist es also für die Aufgaben des ER bei der Sekretion von Proteinen optimal, ein möglichst großes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen zu haben und in der gesamten Zelle verteilt zu sein.

Auch die Struktur des Golgi-Apparates kann durch seine Funktion bedingt sein. Eine Aufgabe des Golgi-Apparates ist es, die Oligosaccharid-Seitenketten von Proteinen durch schrittweises Abspalten und Anfügen von Monosacchariden zu modifizieren. Für diese Reaktionen ist es wichtig, daß sie in der richtigen Reihenfolge ablaufen. Eine Möglichkeit dies zu gewährleisten ist es, die Enzyme für die aufeinanderfolgenden Reaktionen in aufeinanderfolgenden Zisternen des Golgi-Apparates zu lokalisieren. Die Lokalisation des Golgi-Apparates in der Nähe des Centrosoms ist jedoch für eine effiziente Sekretion nicht erforderlich (Bloom und Goldstein, 1998).

1.2. Die Fusion von Membranvesikeln bei der Bildung des ER und des Golgi-Apparates

Ein wichtiger Schritt bei der Bildung der Membranstrukturen des ER und des Golgi-Apparates, z.B. am Ende der Mitose, ist die Fusion von Membranvesikeln des ER beziehungsweise des Golgi-Apparates miteinander. Diese sogenannten homotypischen Fusionsreaktionen, d.h. Fusionsreaktionen zwischen Membranen des gleichen Kompartiments, scheinen nach ähnlichen Mechanismen wie die gut untersuchten heterotypischen Fusionsreaktionen beim Vesikeltransport entlang des exo- und endocytotischen Transportweges abzulaufen (Wilson, 1995). Die verschiedenen heterotypischen Fusionsreaktionen benutzen eine gleiche allgemeine Fusionsmaschinerie, die aus den Proteinen NSF (”NEM-sensitive factor”) und SNAP (”soluble NSF attachment protein”) besteht (Weidman et al., 1989; Robinson et al., 1997; Rothman und Wieland, 1996). NSF und SNAP sind cytosolische Proteine, die zum Teil membranassoziiert vorliegen. Die Funktion von NSF, und damit die Fusionsreaktion, [Seite 6↓]kann durch N-Ethylmaleimid (NEM), ein Reagenz, das SH-Gruppen alkyliert, gehemmt werden. NSF und SNAP interagieren mit spezifischen Proteinen auf den beiden Membranen, die miteinander fusionieren sollen, den sogenannnten SNAP-Rezeptoren, SNARE´s (Söllner et al., 1993; Rothman, 1994). Da entlang des sekretorischen Transportweges immer Transportvesikel eines Ausgangskompartiments mit der Membran des Zielkompartiments fusionieren, gibt es die SNAREs der Transportvesikel, v-SNAREs (für Vesikel-SNAREs), und die SNAREs des Zielkompartiments, t-SNAREs (engl. für target-SNAREs). Die Proteine der SNARE-Familie sind Membranproteine mit einem Membrananker oder einem Lipidanker. Nach der ”SNARE-Hypothese” wird angenommen, daß jedes Kompartiment der eukaryontischen Zelle, das an Fusionsreaktionen mit anderen Kompartimenten beteiligt ist, mindestens ein spezifisches SNARE besitzt (Rothman und Warren, 1994). Nur die richtigen Paare von v-SNARE und t-SNARE können aneinander binden, dadurch die allgemeine Fusionsmaschinerie rekrutieren und die Fusion auslösen. An der Regulation der Fusionsreaktion sind außerdem die sogenannten ”rab”-Proteine, eine Familie von membranassoziierten Proteinen aus der Superfamilie der kleinen G-Proteine, beteiligt (Gorvel et al., 1991; Sogaard et al., 1994) . Jedes rab-Protein ist an einer ganz bestimmten Fusionsreaktion in der Zelle beteiligt und scheint dort eine ”Proofreading”-Funktion wahrzunehmen (Rybin et al., 1996; Novick und Zerial, 1997). Die Funktion der rab-Proteine, und somit die Fusionsreaktion, kann durch GTPγS inhibiert werden.

Die homotypische Fusion von Vesikeln des Golgi-Apparates wurde mit Hilfe von in vitro Systemen untersucht, in denen der Golgi-Apparat von Zellkulturzellen zunächst in der Mitose oder durch Ilimaquinon, ein Stoffwechselprodukt des Schwammes Hippospongia metachromia, deassembliert wird (Takizawa et al., 1993; Rabouille et al., 1995a). An der Reassemblierung sind sowohl NSF und SNAP als auch ein zu NSF entfernt homologes Protein, p97, beteiligt (Acharya et al., 1995a; Acharya et al., 1995b; Rabouille et al., 1995b). Ein p97-bindendes Protein, p47, ist ebenfalls für die Reassemblierung notwendig (Kondo et al., 1997). Mit Hilfe eines anderen in vitro Systems wurde gezeigt, daß für die homotypische ER-Fusion in S.cerevisiae das zu p97 homologe Hefeprotein CDC48p [Seite 7↓]notwendig ist, nicht aber das direkt homologe Protein von NSF, Sec18p, sowie das zu SNAP homologe Protein, Sec17p (Latterich und Schekman, 1994; Latterich et al., 1995). Kürzlich wurde in beiden Systemen ein t-SNARE entdeckt, das an der homotypischen Fusion beteiligt ist (Patel et al., 1998; Rabouille et al., 1998). Indirekte Befunde lassen vermuten, daß auch ein rab-Protein an der Fusion von ER-Membranen beteiligt ist (Turner et al., 1997). Es ist nicht bekannt, ob irgendeines der erwähnten Proteine an den Fusionsreaktionen bei der Bildung der Zellkernhülle beteiligt ist. Dies ist jedoch naheliegend, da die äußere Kernmembran durch die Membran des ER gebildet ist und die Bildung der Kernhülle durch GTPγS und NEM inhibiert werden kann und somit rab-Proteine und NSF- oder p97-ähnliche Proteine hieran beteiligt sein könnten (Marshall und Wilson, 1997).

1.3. Die Beteiligung von Cytoskelettstrukturen an der Lokalisation und Bildung des ER und des Golgi-Apparates in der Zelle

Mikrotubuli sind polarisierte Cytoskelett-Strukturen mit sogenannten Plus- und Minusenden. In den meisten eukaryontischen Zellen befinden sich die Minusenden eingebettet im Centrosom und die Mikrotubuli erstrecken sich mit ihren Plusenden in die Peripherie der Zelle. Das Centrosom befindet sich im Zentrum der Zelle in der Nähe des Zellkerns.

Werden Zellkulturzellen mit Nocodazol, einem Reagenz, das die Depolymerisation der Mikrotubuli bewirkt, behandelt, so bleibt das ER noch bis zu zwei Stunden intakt und kollabiert dann zum Zentrum der Zelle hin (Terasaki et al., 1986). Wird Nocodazol entfernt, bilden sich vom Centrosom aus Mikrotubuli, und in einem Zeitraum von etwa 15 Minuten auch wieder die Membrantubuli des ER (Lee et al., 1989). Die Dichte der neugebildeten Mikrotubuli in einem gegebenen Ausschnitt der Zelle korreliert dabei gut mit dem Ausmaß der ER-Neubildung. Die Membrantubuli des ER verlaufen zum Teil über viele Mikrometer mit den Mikrotubuli zusammen (Terasaki et al., 1986). Die [Seite 8↓]Depolymerisation der Actin-Filamente durch Behandlung von Zellkulturzellen mit Cytochalasin B hat keinen Einfluß auf die Struktur des ER oder die Neubildung des ER nach Nocodazol-Behandlung (Lee et al., 1989).

Die Bildung und Bewegung von Membrantubuli des ER entlang von Mikrotubuli wurde in mehreren in vitro Systemen beobachtet. Hierbei gibt es unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich der Bewegungsrichtung entlang der Mikrotubuli und des Bewegungsmechanismus. Eine Art der Bewegung erfolgt durch Mikrotubuli-abhängige Motorproteine, die sich spezifisch in eine Richtung entlang der Mikrotubuli bewegen und an die Membran des ER binden können. Es gibt zwei Klassen Mikrotubuli-abhängiger Motorproteine: Die Proteine der Kinesin-Familie, von denen sich die meisten zum Plusende der Mikrotubuli bewegen und das cytoplasmatische Dynein, das sich zum Minusende bewegt. In den verschiedenen in vitro Systemen bewegten sich die Membrantubuli entweder ausschließlich zum Plusende der Mikrotubuli oder ausschließlich zum Minusende (Vale und Hotani, 1988; Allen und Vale, 1991). Die Bewegung zum Minusende wurde in einem in vitro System beobachtet, das einen Extrakt aus den Eiern von X.laevis verwendet. Hier verhindern Antikörper gegen eine Untereinheit von Dynein die Bildung und Bewegung der Membrantubuli entlang von Mikrotubuli, in Übereinstimmung mit der Annahme, daß Dynein an diesem Prozeß beteiligt ist (Steffen et al., 1997). Die Bedeutung der Bewegung von Membrantubuli des ER zum Minusende der Mikrotubuli in der Zelle ist nicht klar. Es könnte sein, daß es sich hierbei um einen Spezialfall in großen Eizellen oder frühen Stadien der Embryonalentwicklung handelt. Dagegen könnten zum Plusende der Mikrotubuli gerichtete Motorproteine aus der Kinesinfamilie, die an spezifische Rezeptoren der ER-Membran binden, die Lokalisation des ER in der Peripherie der Zelle bewirken (Hirokawa, 1998). An den Enden der im Xenopus System gebildeten Membrantubuli, die mit den Mikrotubuli in Kontakt stehen, sind in elektronenmikroskopischen Bildern große, globuläre Domämen zu sehen, die vielleicht eine Anreicherung von Motorprotein-Komplexen darstellen (Allen und Vale, 1994). In vitro wurde außerdem beobachtet, wie Membrantubuli offensichtlich durch das Ziehen eines an die Membran gebundenen Motorproteins entlang von Mikrotubuli entstehen können (Debora und Sheetz, 1988; [Seite 9↓]Hotani und Vale, 1988). Weiterhin wurde beobachtet, wie Membrantubuli miteinander fusionieren und dadurch polygonale Netzwerke bilden können. Diese Vorgänge bei der Bildung polygonaler Membrannetzwerke in vitro haben große Ähnlichkeit mit der Dynamik des ER in Zellen (Abb. 1D).

Ein Motorprotein-unabhängiger Mechanismus der Bildung und Bewegung von Membrantubuli wurde in vitro beobachtet, bei dem Membrantubuli mit den Plusenden der Mikrotubuli über sogenannte ”tip-attachment complexes” verbunden sind und sich mit den verlängernden oder verkürzenden Mikrotubuli bewegen (Waterman-Storer et al., 1995).

Der Golgi-Apparat deassembliert nach der Zugabe von Nocodazol zunächst und mit der Zeit entstehen viele kleine Golgi-Stapel, die in der gesamten Zelle verteilt sind (Cole et al., 1996; Lippincott-Schwartz, 1998; Bloom und Goldstein, 1998). Nach Entfernen von Nocodazol und der Neubildung der Mikrotubuli bewegen sich die Golgi-Stapel wieder in die Nähe des Centrosoms und vereinigen sich dort. Für die Lokalisation des Golgi-Apparates in der Nähe des Centrosoms könnten zum Minusende der Mikrotubuli gerichtete Motorproteine, wie Dynein, verantwortlich sein. Die beste Evidenz für einen solchen Mechanismus kommt aus Untersuchungen von Zellen, in denen das Gen für eine Untereinheit des cytosplasmatischen Dyneins entfernt wurde. In diesen Zellen ist der Golgi-Apparat deassembliert und in der ganzen Zelle verteilt (Harada et al., 1998). Werden Zellkulturzellen mit Brefeldin A, einem Stoffwechselprodukt von Penicillium brefeldianum, behandelt, so bilden die Membranen des Golgi Apparates lange Membrantubuli zum ER aus, über die der Golgi-Apparat vollständig im ER verschwindet (Klausner et al., 1992; Sciaky et al., 1997). Die durch Brefeldin A induzierte Bildung der Golgi-Membrantubuli und das Verschwinden des Golgi-Apparates wird durch Antikörper gegen eine Untereinheit von Kinesin verhindert und ist somit abhängig von einem Motorprotein und damit wahrscheinlich auch von Mikrotubuli (Lippincott-Schwartz et al., 1995).


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Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, daß Mikrotubuli an der Bildung und der Aufrechterhaltung des ER beteiligt sind. In allen bisher bekannten in vitro Systemen sind Mikrotubuli für die Bildung des ER notwendig. Die Aufrechterhaltung der Strukturen des ER in der Zelle kann jedoch nicht allein durch Mikrotubuli zustande kommen, da das Membrannetzwerk des ER nach der Depolymerisation der Mikrotubuli noch für längere Zeit erhalten bleibt. Zwei weitere Befunde deuten darauf hin, daß es Mikrotubuli-unabhängige Mechanismen zum Erhalt der Struktur des ER gibt: Zum einen gibt es Zellinien, in denen wie bereits erwähnt das ER auch während der Mitose als Netzwerk vorliegt (Ellenberg et al., 1997; Yang et al., 1997), obwohl der Großteil aller Mikrotubuli die mitotische Spindel bildet. Zum anderen haben Reagenzien, die die Depolymerisation der Mikrotubuli bewirken, in S.cerevisiae keinen Einfluß auf die netzwerkartige Struktur des peripheren ER (W. Prinz und T.A. Rapoport, unveröffentlichte Ergebnisse). Da es Mikrotubuli-unabhängige Mechanismen für die Aufrechterhaltung des ER gibt, ist es denkbar, daß auch für die Bildung Mikrotubuli-unabhängige Mechanismen existieren, die in den bisherigen in vitro Systemen noch nicht nachgewiesen wurden.

1.4. Die Bildung von Zellkernen im Xenopus in vitro System

Die Kernhülle ist ein Beispiel für eine abgeflachte Membranstruktur der Zelle. Sie hat Ähnlichkeit mit den abgeflachten Membranzisternen des ER und Golgi-Apparates. Bisher sind keine Faktoren bekannt, die direkt an der Bildung der Membranhülle des Zellkerns beteiligt sind, obwohl die Bildung von Zellkernen in einer Reihe verschiedener in vitro Systeme charakterisiert wurde. Am häufigsten wurden die Extrakte der Eier des Krallenfrosches Xenopus leavis verwendet. Im folgenden werden die einzelnen Phasen der Zellkernbildung in diesem System genauer beschrieben.

Bei der Befruchtung der Eizelle von X.laevis gelangt der Zellkern eines Spermiums in die Eizelle. Die Kernhülle des Spermiums wird sehr schnell deassembliert, und die hochkompakte DNA wird dekondensiert. Nach kurzer Zeit formt sich wieder eine Kernhülle um das dekondensierte Spermien-Chromatin, wie auch um das Chromatin der [Seite 11↓]Eizelle, die vor der Befruchtung in der Metaphase der MeioseII arretiert war. Der Spermienpronukleus wandert zum Zentrum der Eizelle und assoziiert dort mit dem Pronukleus der Eizelle. Das Vermischen von Ei- und Spermien-Chromatin geschieht vor oder während der ersten Zellteilung (Longo und Kunkle, 1978).

Wird zu dem Chromatin von X.leavis Spermien ein Extrakt aus den Eiern gegeben, so bilden sich um dieses Chromatin ”Zellkerne”. Diese Kernbildung in vitro entspricht wahrscheinlich der Bildung des Pronukleus um das Spermium-Chromatin bei der Befruchtung der Eizelle. Die in vitro assemblierten Zellkerne besitzen eine Kernhülle aus einer inneren und einer äußeren Kernmembran, Kernporen und eine Kernlamina und zeigen viele der Eigenschaften ”wahrer” Zellkerne, wie Kernimport durch die Kernporen, semi-konservative, einmalige Replikation der DNA und Deassemblierung unter mitotischen Bedingungen (Lohka und Masui, 1984; Blow und Laskey, 1986; Newport und Forbes, 1987). Der Eiextrakt kann in ein oder mehrere Membranfraktionen und Cytosol aufgetrennt werden (Vigers und Lohka, 1991; Wilson und Newport, 1988). Der Prozeß der Kernbildung kann in diesem in vitro System in mehrere Schritte unterteilt werden: Als erstes dekondensiert das Spermien-Chromatin, danach können Membranvesikel an das Chromatin binden, die miteinander fusionieren und schließlich eine geschlossene Kernhülle bilden. Die resultierenden kleinen Zellkerne vergrößern ihren Durchmesser im weiteren Verlauf der Reaktion um ein mehrfaches.

1.4.1. Die Dekondensation des Chromatins

Zu Beginn der Reaktion hat das Spermien-Chromatin eine S-förmige Gestalt mit einer Länge von etwa 10µm und einem Durchmesser von 1µm. In dieser Struktur ist der haploide Chromosomensatz des Spermiums dicht zusammengepackt. Wird Spermien-Chromatin zu einem Eiextrakt oder der cytosolischen Fraktion des Eiextraktes gegeben wird, dekondensiert das Chromatin in 5-10 Minuten. Die Dekondensation läßt sich als einfache Vergrößerung des Spermium-Chromatins auf eine Länge von etwa 30μm und [Seite 12↓]einen Druchmesser von etwa 3μm beschreiben. Auf molekularer Ebene ist die Dekondensation nur zum Teil verstanden. Die dichte Packung der DNA im Spermium wird durch basische Proteine gewährleistet. Die basischen Proteine im Spermien-Chromatin der Säuger sind die Protamine. In X.laevis sind es die Proteine X und Y, die entfernte Homologie zu den Histonen haben (Philpott und Leno, 1992). Während der Dekondensation werden die Proteine X/Y abgelöst und die Histone H2A und H2B an die bereits im Spermium-Chromatin vorliegenden Histone H3 und H4 gebunden. Dabei bilden sich Nukleosomen, in denen die DNA um Histonoktamere gewunden ist (Kleinschmidt et al., 1990). Benachbarte Nukleosomen eines DNA-Stranges sind durch das Histon H1 verbunden und die so gepackte DNA erscheint im elektronen-mikroskopischen Bild (EM-Bild) als eine sogenannte 30nm-Chromatin-Faser. Diese 30nm-Chromatin-Faser ist wahrscheinlich noch weiter verpackt, z.B. durch die Bildung von Schleifen um ein zentrales Gerüst. Es ist nicht bekannt, ob solche Strukturen höherer Ordnung im Xenopus in vitro System gebildet werden. Jedoch findet man in X.laevis ein zum Histon H1 ähnliches Histon am dekondensierten Spermiumchromatin, das Histon B4 genannt wird (Dimitrov et al., 1994). Außerdem assemblieren einige HMG (high mobility group) Proteine an das Chromatin. HMG Proteine sind kleine, in ihrer Sequenz nahe verwandte Chromatinproteine, von denen z.B. HMG14 und 17 die Nukleosomen von transkriptionell aktivem Chromatin binden (Trieschmann et al., 1991).

Für die Dekondensation des Spermium-Chromatins im Xenopus Eiextrakt ist das Protein Nucleoplasmin essentiell (Philpott et al., 1991). Wird Nucleoplasmin aus dem Extrakt immunodepletiert so findet keine Vergrößerung des Spermium-Chromatins statt und die Proteine X/Y werden nicht abgelöst. Gereinigtes Nucleoplasmin zusammen mit Histonen bewirkt die Vergrößerung des Spermium-Chromatins, die Dissoziation von X/Y und die Assemblierung von Nukleosomen (Philpott und Leno, 1992).

Die Vergrößerung des Spermien-Chromatins kann auch einfach durch die Zugabe von Polyglutamat mit einem Molekulargewicht von 30-80 kDa erreicht werden (Pfaller et al., 1991). Polyglutamat bindet wahrscheinlich die basischen Proteine X und Y und löst sie so vom Chromatin ab. Dies wiederum scheint ausreichend zu sein, um die kompakte Packung des Spermium-Chromatins zu zerstören. Interessanterweise besitzt [Seite 13↓]Nucleoplasmin einen 12 Aminosäuren langen Abschnitt aus Glutamat-Resten (Dingwall et al., 1987). Da Kernmembranvesikel gleich gut an durch Eiextrakt dekondensiertes Chromatin wie an nur durch Polyglutamat vergrößertes Chromatin binden, scheinen Chromatin-Proteine aus dem Eiextrakt in diesem System für die Bindungsreaktion nicht notwendig zu sein.

1.4.2. Die Bindung von Membranvesikeln an das dekondensierte Chromatin

Nach der Dekondensation des Spermien-Chromatins können Membranvesikel binden. Die gebundenen Membranvesikel haben einen Durchmesser von etwa 70nm (Newport und Dunphy, 1992). An der Bindung von Kernmembranvesikeln an das dekondensierte Spermien-Chromatin im Xenopus-System sind sowohl Proteine der Membranvesikel als auch des Chromatins beteiligt, da die Behandlung jeder einzelnen Komponente mit der Protease Trypsin die Bindung verhindert (Wilson und Newport, 1988; Newport und Dunphy, 1992). Die Bindung benötigt kein Cytosol und keine Energie in Form von ATP. Die unter diesen Bedingungen an das Chromatin gebundenen Membranvesikel stellen ein funktionelles Intermediat der Kernassemblierung dar, da die nachträgliche Zugabe von Cytosol, ATP und GTP die Fusion der gebunden Kernvesikel und die Bildung einer Kernhülle bewirkt (Newport und Dunphy, 1992). Membranvesikel, die aus einem Eiextrakt hergestellt wurden, der sich in einem mitotischen Zustand befindet, binden das dekondensierte Spermien-Chromatin nicht. Dies zeigt, daß mindestens eine an der Bindung der Membranvesikel beteiligte Membrankomponente im Zellzyklus reguliert ist (Vigers und Lohka, 1992). Chromatin-gebundene Membranvesikel werden durch mitotisches Cytosol vom Chromatin abgelöst (Pfaller et al., 1991; Pfaller und Newport, 1995).Ein Experiment deutet darauf hin, daß die Chromatin-bindenden Membranvesikel Mischvesikel sind, d.h. aus Proteinen und Lipiden sowohl der inneren als auch der äußeren Kernmembran bestehen (Wilson und Newport, 1988). Es wurden Membranvesikel mit einem Überschuß an Spermien-Chromatin inkubiert, um alle Chromatin-bindenden Membranvesikel an das Chromatin zu binden. Daraufhin wurde [Seite 14↓]das Chromatin mit den gebundenden Membranvesikeln von den ungebundenen abgetrennt und bestimmt, wie sich ein ER-Markerprotein auf die gebundene und der ungebundene Fraktion verteilt. Es stellte sich heraus, daß unter diesen Bedingungen 20% eines ER-Markerproteins in der Chromatin-bindenden Fraktion zu finden sind. Dies ist in Übereinstimmung mit der Existenz von mindestens zwei ER-Vesikelpopulationen, von denen die eine Proteine der inneren Kernmembran enthält, die es dieser Vesikelpopulation ermöglichen, ans Chromatin zu binden.

Mehrere integrale Membranproteine der inneren Kernmembran wurden identifiziert, die in vitro an Chromatin binden, und somit geeignet wären, die Bindung von Kernmembranvesikeln ans Chromatin zu bewirken. Eines dieser Proteine ist der Lamin B Rezeptor (LBR). Er gehört zu den mengenmäßig häufigsten Proteinen der inneren Kernmembran, und bindet in vitro Lamin B, DNA und Chromatin (Worman et al., 1988; Smith und Blobel, 1994; Ye und Worman, 1994). In einem in vitro System wurde gezeigt, daß der LBR für den Großteil der beobachteten Bindung von Kernmembranvesikeln an Chromatin verantwortlich ist (Pyrpasopoulou, 1996). Hierzu wurden die Zellkernhüllen von Rattenleberzellen oder Truthahn-Erythrozyten mit Detergens solubilisiert und nach dem Entfernen des Detergens durch Dialyse rekonstituierte Membranvesikel erhalten, die an Chromosomen aus Metaphasen-CHO- (Chinese hamster ovary) Zellen binden konnten. Wenn nach dem Solubilisieren der Membranvesikel der LBR immunodepletiert wurde, verringerte sich die Bindungsaktivität. Durch die Zugabe von gereinigtem LBR wurde die Bindungsaktivität wieder erhalten. In einem anderen in vitro System, das einen Extrakt aus Seeigel-Eiern und Seeigel-Spermien verwendet, wurden die Chromatin-bindenden Membranvesikel mit Antikörpern, die gegen das zum LBR aus H.sapiens homologe Seeigel-Protein gerichtet sind, vorinkubiert. Dies führte ebenfalls dazu, daß diese Membranvesikel nicht mehr binden konnten (Cameron und Poccia, 1994; Collas et al., 1996).

Interessanterweise wird der LBR sowohl durch die mitotische CDC2-Kinase als auch durch eine weitere Kinase phosphoryliert, die mit dem LBR in einem Komplex vorliegt (Courvalin et al., 1992; Simos und Georgatos, 1992). Eine Zellzyklus-abhängige [Seite 15↓]Phosphorylierung des LBR könnte mit den im Xenopus-System beobachteten Bindungseigenschaften der Membranvesikel im Zellzyklus korrelieren (Appelbaum et al., 1990). Darüberhinaus wurde eine Interaktion der nukleoplasmatischen, N-terminalen Domäne des LBR mit einem Protein des Heterochromatins, HP-1, in einem Hefe-”Two-Hybrid-Screen” entdeckt (Ye und Worman, 1996). Diese Befunde lassen den LBR sehr geeignet erscheinen, für die im Zellzyklus regulierte Bindung von Membranvesikeln und der Kernhülle ans Chromatin verantwortlich zu sein. Überraschenderweise ist die die Bindung des LBR an Lamin oder die Kernlamina nicht für die Bindung der Membranvesikel an das Chromatin notwendig, da Lamine während der Bindungsreaktion entweder nicht vorhanden waren (Pyrpasopoulou et al., 1996) oder erst zu einem späteren Stadium der Kernassemblierung in den sich bildenden Zellkern eingebaut wurden (Collas et al., 1996). Möglicherweise ist also die Bindung des LBR an das Chromatin die entscheidende Interaktion für die Bildung der Kernhülle.

Es ist auffällig, daß alle bisher identifizierten Proteine der inneren Kernmembran zumindest in vitro Lamin binden können. Die Bindung von Proteinen an die Kernlamina könnte die Proteine der inneren Kernmembran stabil verankern, und somit der Sortierung dieser Proteine dienen. Hiermit ist in Übereinstimmung, daß der LBR in der Interphase keine meßbare Diffusion in der inneren Kernmembran zeigt, im Gegensatz zu Membranproteinen des ER, weil er wahrscheinlich fest gebunden an die Kernlamina vorliegt (Ellenberg et al., 1997).

1.4.3. Die Fusion der Chromatin-gebundenen Membranvesikel

Nach der Bindung an das Chromatin fusionieren die Membranvesikel miteinander und bilden mit der Zeit eine kontinuierliche Hülle um das Chromatin. Die Fusionsreaktion benötigt ATP und GTP und kann durch GTPγS inhibiert werden (Boman et al., 1992). Die Behandlung der Membranvesikel mit NEM inhibiert ebenfalls die Fusion, aber nicht die Bindung an Chromatin (Vigers und Lohka, 1991; Newport und Dunphy, 1992). Es ist daher gut möglich, daß an der Fusion der Chromatin-gebundenen Membranvesikel bereits [Seite 16↓]bekannte Proteine, wie das NEM-sensitive NSF oder p97, sowie kleine G-Proteine aus der Familie der rab-Proteine beteiligt sind.

Eine partielle Fusion zwischen den Chromatin-gebundenen Membranvesikeln findet bereits ohne Cytosol statt. Das bedeutet, daß wenigstens ein Teil aller für die Fusion notwendigen Proteine membranassoziiert ist. Die partielle Fusion in Abwesenheit von Cytosol führt jedoch nicht zur Bildung einer kontinuierlichen Kernhülle (Wiese und Wilson, 1993). Eine mögliche Erklärung hierfür ist, daß das Cytosol die Fusionsreaktionen der Chromatin-gebundenen Membranvesikel stimuliert oder daß zusätzlich zur Cytosol-unabhängigen Fusion eine Cytosol-abhängige Fusionsreaktion für die Bildung einer kontinuierlichen Kernhülle notwendig ist. Eine andere Möglichkeit ist, daß eine nicht an der Fusion beteiligte Aktivität aus dem Cytosol gebraucht wird.

Wird die Kernbildung im Eiextrakt durchgeführt, so verändert sich mit der Fusion und der Bildung einer kontinuierlichen Kernhülle die ursprünglich zylindrische Form des Chromatins zu einer runden Form. In dieser Phase werden auch die Kernporen in der Kernhülle assembliert (Powers et al., 1995). Einige Untereinheiten der Kernporen sind integrale Membranproteine, während andere vor der Assemblierung als lösliche Proteine in dem Cytosol vorliegen. Die Kerne sind zunächst noch klein und vergrößern ihren Durchmesser in der nächsten Phase bis zu fünffach. Für diese Größenzunahme ist Kernimport essentiell, da Inhibitoren des Kernimports wie ”Wheat germ agglutinin” oder dominant negativ wirkendeVarianten von Kernimportfaktoren die Größenzunahme verhindern (Kornbluth et al., 1994; Dasso et al., 1994). Wie können die kleinen Zellkerne, die bereits eine kontinuierliche Kernhülle besitzen, größer werden? Eine Möglichkeit ist, daß Membranvesikel mit der äußeren Kernmembran fusionieren. Die innere Kernmembran müßte dann Lipide und Membranproteine über die Verbindungsstelle an den Kernporen von der äußeren Kernmembran zugeführt bekommen (Gerace und Burke, 1988). Es ist denkbar, daß verschiedene Vesikelpopulationen an der frühen und der späten Fusion beteiligt sind, z.B. Vesikel mit Proteinen der inneren Kernmembran zum einen, und reine ER-Membranvesikel zum anderen.


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1.4.4.  Die Kernlamina

Der Kernhülle ist eine Kernlamina unterlegt. Die Kernlamina ist ein 2-dimensionales Netzwerk vom Typ der Intermediärfilamente und besteht aus den verschiedenen Laminen einer Zelle (Aebi et al., 1986). Die Rolle der Lamine bei der Bildung der Kernmembran ist nicht eindeutig geklärt, da die verschiedenen in vitro Systeme unterschiedliche Ergebnisse zeigen (siehe weiter unten). Eine generelle Aufgabe der Intermediärfilamente ist es, Zellstrukturen Stabilität gegen mechanische Beanspruchung zu verleihen. Beispiele hierfür sind die Neurofilamente in den Axonen von Nervenzellen und Keratinfilamente in den Zellen der Haut. Die Lamine unterscheiden sich von den anderen Intermediärfilament-Proteinen durch das Vorhandensein einer Kernlokalisationssequenz. Durch ihre C-terminale Isoprenylierung sind die Lamine, und damit auch die von ihnen gebildete Kernlamina, mit der inneren Kernmembran assoziiert (Kitten und Nigg, 1991). Die Kernlamina unterscheidet sich auch durch ihre Fähigkeit zur schnellen und vollständigen Deassemblierung in der Mitose von allen anderen Intermediärfilamenten (Nigg, 1992). Drei verschiedene Lamine werden in Säugern unterschieden: TypA, B und C. Die Lamine A und C sind Splice-Varianten desselben Gens (Krohne und Benavente, 1986). Bei ihnen wird der isoprenylierte C-Terminus nach der Assemblierung in die Kernlamina abgeschnitten. Daher werden die Lamine A und C bei der Deassemblierung der Kernlamina in der Mitose löslich, während Lamin B membrangebunden bleibt. Lamin B könnte somit bei der Reassemblierung des Zellkerns den Ausgangspunkt für die Bildung der Kernlamina darstellen. Lamin B ist das einzige Lamin, das in allen Zellen, die eine Kernlamina besitzen, vorkommt. Lamin A bindet spezifisch Chromatin und könnte somit den Kontakt zwischen der Kernlamina und dem Chromatin herstellen (Schmidt und Krohne, 1995; Pugh et al., 1997).

In der Xenopus-Eizelle sind drei Lamine bekannt, die sämtlich vom B-Typ sind, Lamin I, II und III (Lourim et al., 1996). Lamin III ist das häufigste der drei Lamine (molare Verhältnisse I:II:III=10:1:100). Es ist im Gegensatz zu Lamin B in Säugern nicht membranassoziiert. Von Lamin I und II sind 5-15% mit Membranen assoziiert (Lourim und Krohne, 1993). Alle drei Lamine werden im Xenopus in vitro System in die Kernlamina assembliert, scheinen jedoch nicht für die Bindung von [Seite 18↓]Kernmembranvesikeln an das Chromatin, für die Fusion und die Bildung einer geschlossenen Kernhülle notwendig zu sein.Wird Lamin III aus dem Eiextrakt immunodepletiert, werden Zellkerne gebildet, die allerdings nur halb so groß wie sonst und sehr fragil sind. Sie besitzen keine detektierbare Kernlamina und sind nicht zur DNA-Replikation in der Lage (Newport et al., 1990; Meier et al., 1991). Darüberhinaus wurde beobachtet, daß eine kleine Zahl der Kernporen falsch orientiert in der Kernhülle eingebaut war (Goldberg et al., 1995). Da Lamin I und II in diesen Experimenten nicht depletiert wurden, kann nicht ausgeschlossen werden, daß in diesem System Lamine an der beobachteten Kernassemblierung beteiligt sind. Die Zugabe von Lamin I, dem die N-terminale Domäne fehlt, verhindert die Bildung einer Kernlamina in einer Kernassemblierungsreaktion und hat die gleichen Effekte wie die Immunodepletion von Lamin III (Ellis et al., 1997). Im Seeigel in vitro System wurde durch die Immunodepletion der in diesem System bekannten Lamine gezeigt, daß die Lamine für die Bildung der Kernhülle nicht notwendig sind, wohl aber für die Größenzunahme des Zellkerns (Collas, 1995).

Dies ist anders in Experimenten, in denen ein Extrakt aus Drosophila melanogaster-Embryos mit Xenopus Spermien-Chromatin beziehungsweise ein Homogenat aus CHO-Zellen in der Metaphase der Mitose benutzt wurde (Ulitzur et al., 1992; Ulitzur et al., 1997; Burke und Gerace, 1986). Hier verhindern Antikörper gegen das D.melanogaster Lamin beziehungsweise gegen LaminA/C oder Lamin B die Bindung von Kernmembranvesikeln an das Chromatin. Es ist demnach denkbar, daß es zwei verschiedene Arten der Bindung von Kernmembranvesikeln an das Chromatin gibt, die eine abhängig, die andere unabhängig von Laminen. Bei der Lamin-abhängigen Bindung im Säugersystem könnte das Chromatin-bindende Lamin A mit dem Membran-gebundenen Lamin B zusammenwirken, während bei der Lamin-unabhängigen Bindung der LBR und Chromatinproteine wie das HP-1 eine Rolle spielen könnten.


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1.4.5.  Die Deassemblierung des Zellkerns

Die Deassemblierung des Zellkerns in der Mitose ist, wie auch die Assemblierung, ein vielschrittiger Prozeß. Ein Auslöser der Mitose ist die Aktivierung der CDC2-Kinase durch ihre Bindung an Cyclin B. Cyclin B akkumuliert in der vorhergehenden Interphase. Wird eine bestimmte Konzentration an Cyclin B in der Zelle überschritten, so resultiert durch positive Rückkopplungsmechanismen die plötzliche Aktivierung der CDC2/CyclinB-Kinase. Am Ausgang der Mitose wird Cyclin B ubiquitiniert und vom Proteasom abgebaut, so daß die CDC2/CyclinB-Kinaseaktivität verschwindet (Nishimoto et al., 1992). Die CDC2/CyclinB-Kinase steht an der Spitze einer Kaskade von Aktivierungs- und Deaktivierungsreaktionen, die schließlich die zahlreichen Schritte der Mitose bewirken. Häufig erfolgt die Regulation der Aktivität der beteiligten Proteine durch ihre Phosphorylierung oder Dephosphorylierung. Die Lamine gehören zu den in der Mitose regulierten Proteinen, die an der Deassemblierung des Zellkerns beteiligt sind. Ihre Phosphorylierung zu Beginn der Mitose löst die Deassemblierung der Kernlamina aus (Luscher et al., 1991; Dessev et al., 1991). Weiterhin werden einige Kernporenproteine spezifisch in der Mitose phosphoryliert (Macaulay et al., 1995). Die Bindung von Kernmembranvesikeln an das Chromatin wird wahrscheinlich durch die bereits erwähnte Phosphorylierung und Dephosphorylierung eines Chromatin-bindenden Membranproteins reguliert (Pfaller et al., 1991). Möglicherweise ist eine MAP-Kinase (Mitogen-aktivierte Proteinkinase) an der Regulation der Assemblierung/Deassemblierung des Zellkerns im Zellzyklus beteiligt. Die Expression einer konstitutiv aktiven Form der MAP-Kinase-Kinase (MEK), deren Substrat die MAP-Kinasen p42/p44 sind, verhindert die Bildung eines Pronukleus in befruchteten Mäuse-Eizellen (Moos et al., 1996).

Die im Xenopus-System gebildeten Zellkerne können durch die Zugabe eines mitotischen Extraktes deassembliert werden (Lohka und Maller, 1985; Newport und Spann, 1987). Um einen mitotischen Extrakt zu erhalten, macht man sich zunutze, daß das Ei in der Metaphase der MeioseII arretiert ist. Dieser Zustand ist einem mitotischen Zustand sehr ähnlich und läßt sich bei der Herstellung des Eiextraktes konservieren (Murray, 1991). [Seite 20↓]Alternativ kann ein Eiextrakt, der in der Interphase vorliegt, durch die Zugabe einer Cyclin B-Variante, die nicht ubiquitiniert wird und daher nicht durch das Proteasom abgebaut werden kann, stabil in einen mitotischen Zustand überführt werden (Murray et al., 1989; Holloway et al., 1993). Wird ein solcher ”mitotischer” Extrakt zu isolierten Rattenleberzellkernen oder zu im Xenopus Eiextrakt hergestellten Zellkernen gegeben, so deassemblieren diese Zellkerne ganz ähnlich wie es bei Zellkernen intakter Zellen beobachtet wird. Die Kernmembran und die Kernlamina deassemblieren und das Chromatin wird zu Chromosomen verpackt. Im Xenopus System wurde festgestellt, daß die Deassemblierung der Kernlamina unabhängig von der Deassemblierung der Kernmembran und der Bildung der Chromosomen ablaufen kann und die Deassemblierung der Kernmembran unabhängig von der Chromosomenbildung ist (Newport und Spann, 1987). In diesem System geht die Deassemblierung der Kernlamina der Deassemblierung der Kernhülle voraus, es ist jedoch nicht bekannt, ob dies eine Voraussetzung für die Deassemblierung der Kernhülle ist (Miake-Lye und Kirschner, 1985).

1.5. Projektbeschreibung

Das ER und der Zellkern sind Beispiele für charakteristische Membranstrukturen der eukaryontischen Zelle. In dieser Arbeit sollten Mechanismen der Bildung der Zellkernhülle und des ER untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden in vitro Systeme etabliert, die einen Extrakt aus den Eiern von Xenopus laevis verwenden, der hierfür ausgezeichnet geeignet scheint. Dieser Extrakt muß besonders reich an Komponenten für die Bildung zellulärer Kompartimente, wie z.B. des Zellkerns, des ER oder der Plasmamembran sein, da nach der Befruchtung der Eizelle durch ein Spermium zwölf nahezu synchrone Zellteilungen ablaufen, durch die ein paar tausend neue Zellen in kürzest möglicher Zeit (etwa 30min pro Zellteilung) und ohne die Synthese von Membranen oder strukturellen Proteinen entstehen.

Um die Bildung der Zellkernhülle zu untersuchen wurde ein vereinfachtes in vitro System etabliert. Die in diesem System gebildeten Zellkerne bleiben klein und werden nicht kugelförmig, bilden aber eine geschlossene Kernhülle mit innerer und äußerer [Seite 21↓]Kernmembran. Die Phasen bei der Bildung der Kernhülle wurden mit Hilfe einer hochauflösenden Kamera verfolgt. Die miteinander fusionierenden Membranvesikel bilden zunächst kleine Flächen auf der Oberfläche des Chromatins, die größer werden und schließlich eine kontinuierliche, abgeflachte Kernhülle formen. In Abwesenheit von Cytosol können die Chromatin-gebundenen Membranvesikel miteinander fusionieren, flachen jedoch nicht auf der Oberfläche des Chromatins ab und bilden keine Kernhülle, sondern große, kugelförmige Membranvesikel. Eine oder mehrere cytosolische Aktivitäten sind demnach bei der Bildung der Zellkernhülle für das Abflachen der fusionierenden Membranvesikel auf der Oberfläche des Chromatins notwendig. Für die Identifizierung dieser Aktivitäten durch die Fraktionierung des Cytosols schafft das vereinfachte in vitro System die Voraussetzung.

Mit Hilfe des in dieser Arbeit entwickelten in vitro Systems zur Bildung der polygonen Membrannetzwerke des ER konnten zwei Schritte bei diesem Prozeß unterschieden werden. Die Fusion kleiner Membranvesikel miteinander braucht Energie in Form von ATP und GTP, ist sensitiv gegenüber dem Alkylierungsreagenz NEM und benötigt kein Cytosol. Sie ähnelt damit anderen homotypischen Fusionsreaktionen der Zelle. In Gegenwart von Cytosol führt die Fusion zur Bildung dünner Membrantubuli und der polygonen Membrannetzwerke. Ohne Cytosol entstehen durch die Fusion lediglich große, kugelförmige Membranvesikel. Eine cytosolische Aktivität ist demnach für die Bildung der Membrantubuli und der Netzwerke des ER notwendig.

Im Gegensatz zu allen bisher beschriebenen in vitro Systemen sind für die ER-Bildung in diesem in vitro System Mikrotubuli nicht notwendig. Es muß daher Mikrotubuli-unabhängige Mechanismen für die Bildung der tubulären Membranstrukturen des ER geben. Erste Fraktionierungen des Cytosols durch Gelfiltration und Anionenaustauscher-Chromatographie deuten darauf hin, daß es mit Hilfe dieses in vitro Systems möglich ist, die für die Mikrotubuli-unabhängige ER-Bildung notwendigen cytosolischen Faktoren zu identifizieren.


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Die ER-Bildung in vitro wirddurch Ca2+ gehemmt und findet unter verschiedenen mitotischen Bedingungen zu einem unterschiedlichen Ausmaß statt. Diese Eigenschaften der ER-Bildung in vitro könnten mit den ähnlichen Eigenschaften des ER in Zellen in Zusammenhang stehen.


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12.02.2004